专利名称：一种生物反应过程在线检测系统的取样稀释装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物反应过程在线检测系统的取样稀释装置，与生物传感器和微机相配套以实现生物反应过程中物质浓度的在线检测，具体涉及包括微量取样装置和级联稀释装置。
现有技术当今的发酵工业除了传统酿造之外，已向抗生素、氨基酸、核酸等的发酵生产方向发展。近年来，正在研究利用微生物重组和细胞培养等技术生产生物活性物质。伴随着上述的发展过程，发酵过程的控制和最优化也已从靠经验管理向用微机自动化管理的方向发展。
各种各样的物理和化学传感器广泛地用于过程的控制中。检测温度、pH、溶解氧、一氧化碳、压力、流量、搅拌功能等参数的传感器和微机连接，构成了用于生化和发酵过程中的控制系统。但是它只能间接地对生化反应进行控制，并不能直接了解复杂的生化过程中物质的变化情况。而生物传感器解决了许多过去难以进行的物质分析，可以测定直接代表发酵过程进行状态的原料和发酵产物的浓度。经过20多年的研究开发，生物传感器已形成一个独特的门类，与物理传感器和化学传感器并列起来，看作是传感器的第三个类别。
生物传感器具有专一性好、酶可以多次重复使用、分析速度快、准确度高、操作系统比较简单等特点，为微机直接控制生物反应过程准备了可行的传感器条件。但是，至今还未见报道能在一般生物反应过程中实现在线检测生物、化学量的分析系统。生物、化学量无法实现在线检测，究其根源是生物传感器与复杂的生物反应过程的检测接口技术无法过关，这已成为生物传感器实现在线检测的“瓶颈”技术。
生物反应过程在线检测系统示意图如图1所示，包括微量取样器、稀释器、微型生物传感器组、生物工程数据处理分析软件和微机。而微量取样器和稀释器正是本发明要解决的技术问题。
在科研工作中，实验人员采用全自动小型发酵罐进行发酵工艺条件的优化，普遍使用2-30L体积的小罐，而取样体积高达15ml，多次取样造成发酵液体积减少，对发酵过程带来较大的影响，会导致过程优化的误差增大。所以迫切需要设计一种微量取样装置，减少取样体积，尽量降低取样对检测的干扰。
目前已有的稀释装置，如机械臂，流动注射分析在线稀释技术，为高浓度样品的在线测定提供了有效的方法之一；然而需要时间控制器、计算机控制阀和精度较高的蠕动泵，因而机械加工要求高，价格昂贵，稀释比的控制不灵活，严重影响了生物传感器在生物反应过程的在线检测应用。
发明内容
(1)要解决的技术问题提供一种生物反应过程在线检测系统的微量取样装置，要求解决从罐外对发酵罐内进行微量取样的技术问题，既克服了生物传感器不耐热的特点，以及克服氧浓度和温度对生物电极的影响，又减少了取样体积，尽可能降低取样对检测的干扰，保持在线连续取样、间歇测量的需要。
还提供一种生物反应过程在线检测系统的级联稀释装置，要求解决可以进行在线连续稀释的技术问题。采用缓冲液对样品进行几十到几百倍的稀释，灵活控制稀释率，以达到生物传感器检测的线性范围。稀释的另一作用是调节样品pH值，使之符合传感器工作pH值，减少干扰。
(2)技术方案微量取样装置图2为微量取样装置结构示意图，它由一个取样探头和样品流量控制部分组成。探头末端为膜过滤部分，另一端为渗透液引出管和与罐连接密封部分。取样探头由探头园柱体(1)、膜过滤件(2)、膜外导流夹套(3)、导流接插件(4)、引出管(5)、套管(6)组成。流量控制部分由针状阀(7)、计量阀(8)共同进行流量控制。
膜过滤件(2)采用陶瓷膜件，膜件为管状，膜层在内壁，支撑层在外，内径为6-10mm，外径为10-14mm。膜件长8-12mm，膜孔径0.1-0.2μm。
膜外导流夹套(3)，在垂直放置的探头园柱体(1)的末端上水平钻孔，即为夹套(3)。在夹套(3)内壁做成螺纹状，用于导流，螺纹大径和小径之差小于2mm。膜件(2)置于探头园柱体(1)的夹套钻孔中，夹套内螺纹和膜件(2)外壁接触，夹套(3)和膜件(2)采用过盈配合，配合处两端用硅胶密封。探头园柱体选用聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯材质。
在探头园柱体的一端园面中间开一锥形头园柱形小孔，小孔园柱部分有内螺纹，小孔与导流夹套(3)中部相通，在小孔内置导流接插件(4)。导流接插件(4)为一带锥形头的小园柱，小园柱的园柱部分设外螺纹，导流接插件(4)和探头园柱体(1)以螺纹配合，导流接插件(4)的锥形头紧靠膜外导流夹套(3)以减少死体积。在导流接插件(4)柱锥体中间开孔，插入引出管(5)。导流接插件(4)选用聚四氟乙烯材质。
引出管(5)为塑料弹性管，选用聚硅酮弹性管或聚偏二氟乙烯弹性管。
套管(6)一头设有内螺纹和探头园柱体(1)一端的外螺纹以螺纹配合。套管(6)选用不锈钢材质，以保护引出管(5)。
取样采用错流过滤渗透技术，用在原位的过滤器让反应液流过膜件，直接在罐中过滤，利用膜件实现发酵液与固体的分离，膜件外采用螺纹导流，引出滤液后直接处理，连续过滤。用阀控制渗透液流量，稳定状态时膜的扩散量与渗透液流量相等，使渗透液连续引出。每隔一定时间取渗透液作为测量样品，即间歇测量，不作为测量样品的渗透液直接排掉。
设计参数为渗透液流量0.4ml/min，滞后时间小于1min，取样器管路体积≤0.7ml，取样量10-1000μl/min。
级联稀释装置图3在线检测系统中三级级联装置的接口流程示意图。级联稀释装置由缓冲液溢流部分和带溢流腔的垂直三级级联稀释板组成。缓冲液溢流部分包括缓冲液储罐、恒流泵、三个缓冲液溢流槽，缓冲液流量由缓冲液流路上的缓冲液流量调节阀(14)控制。图4为带溢流腔的垂直三级级联稀释板的结构示意图。结构为由带溢流腔(9)的样品流路(10)和缓冲液流路(15)汇合成稀释混合流路(16)，作为一级稀释器，将三个一级稀释器垂直串联组成三级级联稀释板，将第一级稀释混合流路和第二级溢流腔接通，将第二级稀释混合流路和第三级溢流腔接通。将第一级稀释混合液作为第二级的样品继续稀释，将第二级的稀释混合液作为第三级的样品再稀释，将第三级的稀释混合液作为检测样品进行检测。溢流腔底部设置有排液阀(12)，溢流腔顶部设置有通气孔(13)。样品流量由样品流路上的样品流量调节阀(11)控制，级联稀释板选用有机材料，如聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯。流体流路采用与微全分析系统(μ-TAS)相适应的微全流结构，充分缩短样品的停留时间，但又不致形成液滴，流体流动依赖流体自身的重力，既充分保持流体的静压，尽可能少产生动压，所有操作必须是连续稳定流动、连续取样、连续稀释、采用间歇测量。
流体流路管径为0.1-1mm，稀释混合流路长度为5-10cm，溢流腔腔深为3-6mm。单级稀释比控制在4-10，稀释误差不大于1％，三级稀释比最高为1000，稀释误差不大于2.5％。
(3)有益效果本发明设计的微量取样装置、三级级联稀释装置最大的特点是微量取样、微量稀释，以供微型生物传感器的微量检出，其样品用量为10-100μL/min，发酵100小时，连续取样的样品损失量也仅为60-600ml，能满足小型发酵罐取样检测的要求。
微量取样装置以自动取样方式取代手动取样方式，采用错流过滤技术，利用膜件实现发酵液与固体的分离，膜件外侧采用螺纹导流，只要反应液在膜件管内流过，就会由滤膜层渗透流入夹套螺纹内，形成错流渗透，实现液体的先进先出，即有反应液流进膜件管内，就会见到渗透液引出。
采用在原位的过滤器，直接在罐中过滤，取出滤液作为样品，其优点是不增加罐的复杂性，在罐安装探头处装过滤膜件，不会增加染菌机会，膜件和管路易于清洗，且均为标准件，可以及时更换。
级联稀释装置设计了依赖流体自身重力的运行，即溢流来控制稀释样品和缓冲液流量的稳定性，无需时间控制器、计算机控制阀和高精度的蠕动泵，操作方便、灵活，适合生物反应过程在线检测的样品稀释要求。其三级稀释和流体流路的微全流结构，使样品形成稳定的连续流动，稀释率不随样品或缓冲液流量的改变而改变或变化很小。
在线检测系统采用连续自动取样、稀释、间歇测量的方法。连续取样稀释的流程是让样品依此流径取样管路和稀释管路，样品处于连续流动，其流量容易控制，不需要排空死样，且记忆效应小，对样品代表性影响小。连续取样、稀释系统制造简单、廉价、样品代表性好，非常适合于在线分析检测用。可进一步降低生物反应控制成本，提高生物传感器检测的精度。
图1生物反应过程在线检测系统示意图。
图2微量取样装置结构示意图。
图3在线检测系统中三级级联装置的接口流程示意图。
图4带溢流腔的垂直三级级联稀释板的结构示意图。
附图中1探头园柱体，2膜过滤件，3膜外导流夹套，4导流接插件，5引出管，6套管，7针状阀，8计量阀，9溢流腔，10样品流路，11样品流量调节阀，12排液阀，13通气孔，14缓冲液流量调节阀，15缓冲液流路，16稀释混合流路。
具体实施例方式
实施例1微量取样装置膜过滤件采用某公司的陶瓷膜件。膜件为管状，膜层在内壁，支撑层在外，内径d1＝8mm，外径d2＝12mm。过滤时压强降约为10KPa，膜孔径为0.2μm，要求滤液流量为0.4ml/min，取膜件长为10mm，根据相关公式计算，能满足渗透液流量要求。
实施例2膜过滤件的膜孔径为0.1μm，其余条件同实施例1，也能满足渗透液流量要求。
实施例3三级级联稀释板流体流路总长为90mm，流路管径为1mm，则总体积为0.09ml，以0.1ml/min流量考虑其停留时间仅为0.9min，取样10-1000L/min，单级稀释比控制在4-10，单级稀释误差不大于1％，三级稀释比最高为1000，稀释误差不大于2.5％。样品用葡萄糖，其原始浓度为278.54g/l，进行三级稀释试验，其稀释精度测试结果为表1三级级联稀释精度的测试结果一级稀释 二级稀释三级稀释总稀释比误差率％平均浓度52.23 10.89 2.45稀释倍数5.33 4.804.44 113.69 0.6平均浓度47.42 6.650.94稀释倍数5.87 7.137.07 296.32 1.2平均浓度28.83 3.300.45稀释倍数9.66 8.747.33 618.98 1.8平均浓度28.83 2.880.28稀释倍数9.66 10.00 10.35 10002.权利要求
1.一种生物反应过程在线检测系统，包括微量取样装置，其特征是由一个取样探头和样品流量控制部分组成，探头末端为膜过滤部分，另一端为渗透液引出管和与罐连接密封部分，取样探头由探头园柱体(1)、膜过滤件(2)、膜外导流夹套(3)、导流接插件(4)、引出管(5)、套管(6)组成，流量控制部分由针状阀(7)、计量阀(8)共同进行流量控制；膜过滤件(2)采用陶瓷膜件，膜件为管状，膜层在内壁，支撑层在外，内径为6-10mm，外径为10-14mm。膜件长8-12mm，膜孔径0.1-0.2μm，膜外导流夹套(3)，在垂直放置的探头园柱体(1)的末端上水平钻孔，即为夹套(3)，在夹套(3)内壁做成螺纹状，用于导流，膜件(2)置于探头园柱体(1)的夹套钻孔中，夹套内螺纹和膜件(2)外壁接触，夹套(3)和膜件(2)采用过盈配合，配合处两端用硅胶密封，在探头园柱体的一端园面中间开一锥形头园柱形小孔，小孔园柱部分有内螺纹，小孔与导流夹套(3)中部相通，在小孔内置导流接插件(4)，导流接插件(4)为一带锥形头的小园柱，小园柱的园柱部分设外螺纹，导流接插件(4)和探头园柱体(1)以螺纹配合，导流接插件(4)的锥形头紧靠膜外导流夹套(3)，在导流接插件(4)柱锥体中间开孔，插入引出管(5)，套管(6)一头设有内螺纹和探头园柱体(1)一端的外螺纹以螺纹配合，取样采用错流过滤渗透技术，反应液流过膜件，直接在罐中过滤，利用膜件实现发酵液与固体的分离，膜件外采用螺纹导流，引出滤液，连续过滤，连续引出，每隔一定时间取渗透液作为测量样品，即间歇测量，不作为测量样品的渗透液直接排掉。
2.如权利要求1所述的在线检测系统微量取样装置，其特征是设计参数为渗透液流量0.4ml/min，滞后时间小于1min，取样器管路体积≤0.7ml，取样量10-1000μl/min。
3.如权利要求1所述的在线检测系统微量取样装置，其特征是探头园柱体(1)选用聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯材质，导流接插件(4)选用聚四氟乙烯材质，引出管(5)选用聚硅酮弹性管或聚偏二氟乙烯弹性管，套管(6)选用不锈钢材质。
4.一种生物反应过程在线检测系统，包括级联稀释装置，其特征是由缓冲液溢流部分和带溢流腔的垂直三级级联稀释板组成，缓冲液溢流部分包括缓冲液储罐、恒流泵、三个缓冲液溢流槽，缓冲液流量由缓冲液流路上的缓冲液流量调节阀(14)控制，带溢流腔的垂直三级级联稀释板由带溢流腔(9)的样品流路(10)和缓冲液流路(15)汇合成稀释混合流路(16)，作为一级稀释器，将三个一级稀释器垂直串联组成三级级联稀释板，将第一级稀释混合流路和第二级溢流腔接通，将第二级稀释混合流路和第三级溢流腔接通，将第一级稀释混合液作为第二级的样品继续稀释，将第二级的稀释混合液作为第三级的样品再稀释，将第三级的稀释混合液作为检测样品进行检测，溢流腔底部设置有排液阀(12)，溢流腔顶部设置有通气孔(13)，样品流量由样品流路上的样品流量调节阀(11)控制，流体流路管径为0.1-1mm，稀释混合流路长度为5-10cm，溢流腔腔深为3-6mm，流体流动依赖自身重力连续稳定流动、连续取样、连续稀释、间歇测量。
5.如权利要求4所述的在线检测系统级联稀释装置，其特征是设计参数单级稀释比控制在4-10，稀释误差不大于1％，三级稀释比最高为1000，稀释误差不大于2.5％。
6.如权利要求4所述的在线检测系统级联稀释装置，其特征是级联稀释板选用有机材料，如聚偏二氟乙烯或聚四氟乙烯。
全文摘要
一种生物反应过程在线检测系统的取样稀释装置，具体涉及微量取样装置和级联稀释装置。取样稀释采用连续流动、间歇测量的方式。微量取样装置主要在取样探头末端放置一陶瓷膜过滤件，反应液在罐中膜件中原位过滤，错流渗透，渗透液由膜外导流夹套螺纹导流引出，实现从罐外对罐内自动微量取样。级联稀释装置由带溢流腔的垂直三级级联稀释板为主所组成，流体流动依赖流体自身重力，靠有机材料的微全流路结构，使样品和稀释液的流动保持稳定。本装置样品取用量很少，不会影响生物反应过程的优化控制，稀释比容易控制，操作方便、灵活，制造简单，价格低廉。主要构件均可制作为标准件，易于清洗和更换。样品代表性好，适用于生物反应过程在线检测和微全分析(μ－TAS)的应用。
文档编号G01N1/10GK1402009SQ0213837
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月27日 优先权日2002年9月27日
发明者杨海麟, 王武, 吕霞付 申请人:江南大学