专利名称：生物合成靛蓝的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物合成靛蓝的方法。
背景技术：
靛蓝(indigo)是人类所知最古老的染料之一，其作为织物染料的应用至少可追溯到公元前2500年(Sandberg G，1989，Indigo TextilesTechnique andHistory，LondonA & C Black)。古埃及木乃伊穿着的一些服装和我国马王堆出土的蓝色麻织物等都是由靛蓝所染成的(吴祺，2001，化学通报，8527-529)，我国瑶族的一支其生产靛蓝而得名“蓝靛瑶”[巩继贤，李辉芹，2002，北京纺织，23(5)25-27]。靛蓝也是最重要的染料，需求量占全部染料总量的10％。据田利明[2006，精细与专用化工，14(7)24-]报道，我国2005年出口的靛蓝量为23785.1吨。
靛蓝不仅被广泛应用于印染业上，也广泛应用于医药业和食品工业。在传统医学中，中医、印度医和南美医等都利用产靛蓝植物的叶和/或根来治疗诸多的疾病，从子宫癌、胃痛、癫痫和其它神经系统病(特别是“忧郁症”)、气管炎、大出血到脾、肺和肾失调等。产靛蓝植物的叶和/或根还被用于治疗感冒、心脏和泌尿系统不调、少年白发和脱发等(http://www.plantcultures.org/plants/indigo_traditional_medicine.html)。在印度的一些地区，产靛蓝植物被用于治疗狂犬病，由此得名“狗咬木”(thedog-bite shrub)。在现代医学中，产靛蓝植物叶、茎和/或根的醇提取物用于保护肝脏免受象四氯化碳等化学剂的伤害、降低血压和抗病毒等。产靛蓝植物叶的提取物含有类鱼藤酮，具有杀灭蚊子幼虫的作用(http://www.plantcultures.org/plants/indigo_traditional_medicine.html)。在食品工业中，靛蓝以其磺酸钠盐或其铝化的形式等用作食用色素，我国称之为“亮蓝”(GB7655.1-1996)和亮蓝铝淀(GB7655.2-1996)，在美国等以其磺酸钠盐形式为主(FD&C Blue No.2，USA)，被称之为“indigotine”(“靛蓝素”)。此外，靛蓝磺酸钠盐还作为硝酸盐和氯酸盐的有色指示剂用于肾功能检测和奶检测。
靛蓝的生产，直到18世纪后期，一直主要靠产靛蓝植物中提取。人们将这些产靛蓝植物统称为“蓝草”，其中重要的有菘蓝(Isatis indigotica，＝Indigoferasumatrgna)、欧洲菘蓝(Isatis tinctoria)、蓼蓝(Polygonum tinctorum)、马蓝(Strobilanthes cusia，＝Baphicanthus cusia，Goldfusia cusia，Ruelliaindigotica)、木蓝(槐蓝，Indigofera tinctorum)、野青树(Indigoferasuffruticosa)和纳塔尔木蓝(Indigofera arrecta)等。人们将蓝草放入发酵池中，加水浸泡发酵，发酵时间充足后捞出残渣，加入生石灰充分搅拌直至手捧液体查看时有丝状靛蓝沉淀出现即可，如此就得到了靛蓝。我国瑶族的一支蓝靛瑶，他们在种植靛蓝、制作靛蓝和应用靛蓝染色方面有着独特的技术。这一传统技术，独特传统处方的靛蓝染色工艺及设备列入了《中华人民共和国禁止出口、限制出口的技术目录》，自2002年1月1日起禁止出口。
尽管传统的靛蓝生产方法被应用了几千年，但是其生产效率低、所生产的靛蓝的纯度不高，同时又受到蓝草茎叶贮藏条件和贮藏期的限制，不能满足人们的需要，特别是不能满足19世纪中页纺织工业革命带来的印染业的需要，尽管当时印度尤其是孟加拉一带开辟了数十万英亩的良田以种植靛蓝植物(吴祺，2001，化学通报，8527-529)。因此，当1883年德国化学家拜尔(Adolf V.Baeyer)鉴定了靛蓝的结构式并且发明、由德国BASF公司生产的化学合成靛蓝于1897年问世后，因其原料充足、生产简便、纯度高、易贮运、使用方便等而迅速普及，使得具有几千年历史的植物靛蓝黯然失色，在很短的时间内，几乎完全将植物靛蓝赶出了市场。本20世纪60年代之后，天然靛蓝终于销声匿迹，退出了历史舞台。现在，几乎所有的靛蓝产品都是化学合成的。
化学合成靛蓝的主要方法是以苯胺为原料，先与氯乙酸合成苯胺基乙酸，再用氨基钠与其共熔氧化得到二氢吲哚，进一步氧化，生产吲哚酚，最后缩合成靛蓝(顾毓刚等，2001，上海化工，1612-14)。这类方法合成靛蓝的原料充足、生产简便、合成的靛蓝纯度高、稳定性好，易贮运和使用方便。但是在化学合成过程中，使用的苯胺和邻苯二甲酸能导致人体急性和慢性中毒，对呼吸道和中枢神经及肝脏均有一定损害，甚至能诱导产生癌症；在缩合过程中产生的铁盐废水pH＝4.5左右，COD高达3-3.5万mg/L，含盐量为13％。此外，还有大量的漂洗废水，它含有大量的氯化铁、硫酸铁、硫酸钠、氯化钠、苯胺和硝基苯等有毒物质等(顾毓刚等，2001，上海化工，1612-14)。这些有毒物质不仅对化学合成生产者的身体健康造成危害，而且对环境造成严重的污染。进入上世纪80年代后，随着社会现代化程度的日益提高，环境保护和劳动保护意识的增强和逐渐普及，人们认识到了化学合成靛蓝对人体和环境的一系列严重危害，开始探求不会产生有毒副产品的靛蓝生产方法。
产生较少或者不产生有毒副产品的方法之一是由微生物生物合成靛蓝。早在1928年人们就观察到假单胞菌(Pseudomonas indoloxidaes)能够氧化吲哚合成靛蓝，1956年观察到真菌Schisophyllum commune能够在有葡萄糖和胺盐的培养基上直接合成靛蓝，但其机制在当时还不清楚。1983年，Ensley等发现，来源于从土壤细臭腐菌假单胞菌(Pseudomonas putida)的一种可传递质粒的DNA片段稳定转化的大肠杆菌后，转化子能够在有吲哚或色氨酸的条件下合成靛蓝(Ensley等，1983，Science，222167-169)。Ensley等推测，作为培养基添加剂加入的或由色氨酸的酶促代谢而产生的吲哚，被假单胞菌DNA编码的多组分双加氧酶---NDO转化成顺一吲哚-2，3-二氢二醇和3一羟基吲哚(吲哚酚)。所产生的3一羟基吲哚在接触空气后被氧化成靛蓝(Ensley等，1982，J Bacteriol，149948-954)。1986年，Mermod等(1986，Bio/Technology，4321-)报道，假单胞菌菌株Pseudomonas putidamt-2中含有能够降解甲苯-二甲苯或甲苯其它衍生物的酶的基因，这种基因位于TOL质粒上。二甲苯氧化酶的释放产生脱氢和单加氧化作用，使吲哚直接在C3发生羟化形成吲哚酚，后者再经过空气氧化，自动二聚化形成靛蓝。上述2项工作揭示，含有双加氧酶或单加氧酶基因的细菌能够分别以色氨酸(或吲哚)和芳香族化合物为原料合成靛蓝，从而开创了利用基因工程微生物生产靛蓝的先河。此后，有诸多的关于利用不同的单加氧酶和双加氧酶基因重组微生物生产靛蓝的报道和专利。报道的单加氧酶类主要有苯乙烯(styrene)单加氧酶(Kevin E et al，1997，Appl EnvironMicrob，63(11)4287-4291)、2-羟二苯-3-单加氧酶(Meyer A et al，2002，J BiolChem，227(37)34161-34167)和二苯并噻吩(dibenzothiophene，DBT)单加氧酶(Furuya T et al，2004，Biochem Biophys Res Commune，313570-575)等；双加氧酶类主要有萘(naphthalene)双加氧酶[NDO；Grund A and Gunsalus IC，1983，J Bacteriol，156(1)89-94；Gibson DT et al，1995，J Bacteriol，2615-2621；Bushan B et al，2000，Lett Appl Microb，315-9；Berry A et al，2002，J IndustMicrol & biotechnol，28127-133；Kim JY et al，2003，Let Appl Microb，36343-348]、甲苯(Toluene)双加氧酶(Stephens GM et al，1989，FEMS Microb Lett，57295-300；Kim JY et al，2003，Let Appl Microb，36343-348)、苯(benzene)双加氧酶(Tan HM et al，1990，FEMS Microb Lett，72259-264)和其它双加氧酶(Itoh K et al，1999，JSDC，115234-235；Alemayehu D et al，2004，FEMSMicrob Lett，239285-293；Royo JL et al，2005，J Biotechnol，116113-124)。此外，还有多酚氧化酶类(Doukyu N et al，2003，Appl Microb Biotechnol，60720-725；Kim JY et al，2005，Leet Appl Microb，41163-168)和环单或双加氧酶类(Harper JB et al，2003，Tetrahedron Lett，445815-5818；PinyakongO et al，2004，FEMS Microb Lett，238297-305)。我国科技工作者孙国萍等[1995，微生物学报，35(3)161-165]也克隆并且表达了2-萘酸加氧酶基因；吴云等[1989，遗传学报，16(4)318-324]将萘质粒(含有NDO基因)导入大肠杆菌后获得能够合成靛蓝的转化子；李晖和吴云(1989，食品与发酵工业，24(2)7-10)还将萘质粒导入能够产生与类胡萝卜素的分枝杆菌(Mycobacterium sp)菌株Cr-1-2-39和节杆菌(Arthrobacter sp)菌株2-3中，获得同时产生类胡萝卜素和靛蓝的转化菌株。
细胞色素P450基因经过重组后导入大肠杆菌也能氧化吲哚生成靛蓝。ElizabethMJ等于1999年报道[Biochem Biophys Res Commune，265(2)469-472]，他们将人类细胞色素P450基因重组后导入大肠杆菌，转化子能够将外加到培养基中的吲哚转化成靛蓝。随后，他们阐明是由于重组人类细胞色素P450酶对外加吲哚的氧化作用导致靛蓝的形成(Elizabeth MJ et al，2000，Biochem，39(45)13817-13824)。Katsunori N等(2001，Arch Biochem Biophys，395(1)25-31)从随机突变人类细胞色素P450 2A6基因中筛选出能够将吲哚转化成靛蓝的基因。Li QS等报道(2000，J Chem Euro，61531-1536)，通过定向突变巨型杆菌(Bacillus megaterium)作为脂肪酸羟化酶的细胞色素P450 BM-3，使之转变成能够催化吲哚羟化的酶，即能够氧化吲哚形成吲哚酚从而形成靛蓝的酶。我国科技工作者李红梅等、陆燕等进一步定向突变了细胞色素P450 BM-3，获得了能够更高效率地将吲哚转化成靛蓝的突变体(李红梅等，2005，生物化学与生物物理进展，32(7)1-6；2006，生物加工过程，24(2)7-10；陆燕等，2006，自然科学进展，16(8)1047-1050)。
综上所述，传统的从靛蓝植物(或产靛蓝植物)中直接提取靛蓝的方法因其生产效率低、所生产的靛蓝的纯度不高同时又受到蓝草茎叶贮藏条件和贮藏期的限制等早已经退出历史舞台；化学合成靛蓝方法因其合成过程中所用的有毒物质和产生的废水废料不仅对化学合成生产者的身体健康造成危害并且对环境造成严重的污染而无法满足现代人们对健康和环保的要求；通过基因工程改良的微生物生物合成靛蓝则需要专门的设备和装置并且涉及转基因而难以消除公众对转基因生物安全性的忧虑。
发明内容
本发明的目的是提供一种在常温下不使用有毒物质、不产生有毒副产品和废水的体外生物合成靛蓝的方法。
本发明所提供的生物合成靛蓝的方法，是利用活体植物的器官和/或组织的体外分泌物、和/或活体植物的器官和/或组织的细胞破碎物的体外分泌物作为催化剂，在体外以吲哚为底物合成靛蓝。
所述的体外分泌物均能将吲哚氧化成吲哚酚。
所述植物器官和/或组织及其细胞破碎物可来自于任何一种或多种植物，包括(产)靛蓝植物和非(产)靛蓝植物。
所述(产)靛蓝植物是指在自然状态下或者人工改良后能够自身合成靛蓝及其衍生物的植物，包括但不限于菘蓝、欧洲菘蓝、蓼蓝、马蓝、木蓝(槐蓝)、纳塔尔木蓝和野青树等。
所述的非(产)靛蓝植物是指在自然状态下或者人工改良后自身不能够合成靛蓝及其衍生物的植物，包括但不限于被子植物和裸子植物、单子叶植物和双子叶植物、草本植物、藤本植物和木本植物、常绿植物和落叶植物、园林园艺植物和农作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物、陆生植物以及有性和无性繁殖植物。在非(产)靛蓝的双子叶植物中，优选为藜目苋科苋属和鸡冠花属植物；伞形目伞形科植物；十字花目十字花科植物，特别是芸苔属和萝卜属植物；茄目茄科植物，特别是烟草、矮牵牛、茄子、番茄和曼陀罗；葫芦目葫芦科植物，特别是西瓜、甜瓜和黄瓜等；豆目豆科植物，特别是黄豆(大豆)、绿豆、豌豆、豇豆和紫藤等；忍冬科忍冬属植物；在非(产)靛蓝的单子叶植物中，优选为禾本目禾本科植物，特别是水稻、小麦、玉米、谷子、稗子和高梁等。
所述植物的器官可为种子和/或根和/或茎和/或叶；优选器官为种子和/或叶。该种子在自然或在人工条件下能够吸水发芽；根和叶选自正常生长和发育植株的生活根、茎和叶。
所述种子的体外分泌物是通过种子的发芽培养得到的，根、茎和叶的体外分泌物是通过将根、茎和叶切成小区段或片段后的保湿培养得到的。
所述活体植物的器官和/或组织的细胞破碎物的体外分泌物是通过将活体植物的器官和/或组织的细胞破碎物进行保湿培养得到的。
所述植物种子的体外分泌物是植物种子发芽过程中分泌到体外的分泌物；该体外分泌物按照如下方法获得将植物种子置于能够吸水、保水且能够吸附靛蓝并且所吸附的靛蓝容易被洗脱的培养衬质上进行发芽，收集所述培养衬质，得到所述植物种子发芽过程中产生的体外分泌物；所述植物根、茎和叶的体外分泌物是这些器官及其细胞破碎物在离体培养过程中分泌到体外的分泌物；该体外分泌物按照如下方法获得将根、茎和叶切成小片段或者捣碎，置于能够吸水、保水且能够吸附靛蓝并且所吸附的靛蓝容易被洗脱的培养衬质上保湿1-5天，收集所述培养衬质，得到所述植物根、茎和叶及其细胞破碎物的体外分泌物。
植物种子发芽所需的外界条件是本领域技术人员公知的，如充足的水分，适宜的温度，足够的氧气，有些种子还需要光暗条件。供种子发芽用的水可为自然水、自来水、蒸馏水或去离子水，优选为蒸馏水，经济的为自然水或自来水。如在常温或室温下，在有吸水纸(如，滤纸)或类似衬质上使种子吸水发芽。
植物根和茎的保湿培养是将其切成长0.3-2cm的片段，放置在吸水纸(如，滤纸)或类似衬质上在室温下使其保湿；植物叶的离体培养是将其切成长0.3-2cm和宽0.1-0.5cm的条段，或者切成直径为0.1-1.5cm的圆盘(常称为“叶盘”)，放置在吸水纸(如，滤纸)或类似衬质上在室温下使其保湿。供根、茎和/或叶片段保湿用的水可为自然水、自来水、蒸馏水或去离子水，优选为蒸馏水，经济的为自然水或自来水。
将植物的活体根段和/或茎段和/或叶段置于能够吸水、保水且能够吸附靛蓝并且所吸附的靛蓝容易被洗脱的培养衬质上保活的方法是本领域技术人员公知的，如充足的水分，适宜的温度，足够的氧气，有些还需要光暗条件。
所述的种子发芽衬质、根段与叶段(叶盘)等培养衬质是指垫在种子、根段与叶段(叶盘)等之下作支撑而对种子、根段与叶段(叶盘)等培养物没有毒性的物质，其具有一定的吸水和保水性能，又能够吸附靛蓝并且所吸附的靛蓝很容易被洗脱。优选为吸水纸，更优选为滤纸。
所述活体植物的器官和/或组织的体外分泌物、和/或活体植物的器官和/或组织的细胞破碎物的体外分泌与吲哚按照如下方法混合将吲哚溶液加到所述培养衬质上。
所述反应温度为室温，可为10-37℃。
所述底物吲哚可为化学合成或生物合成的吲哚，优选为价格低廉但不含对种子有毒物质的吲哚。所述吲哚可溶解于氯仿或者N，N-二甲基甲酰胺等溶剂中。
本发明利用活体植物器官和/或组织，和/或其细胞破碎物的体外分泌物作为催化剂，在常温下将吲哚氧化成吲哚酚(3-羟基吲哚)，吲哚酚在空气氧的作用下聚合生成靛蓝。
本发明的方法不涉及转基因、不需要任何专门的设备和装置，不使用任何有毒物质、不产生任何有毒副产品，任何具有劳动能力的人都可以实施。本发明的方法完全排除了化学合成靛蓝中所使用的有毒物质和产生的有害有毒副产品和废水，排除了对劳动者健康的不利影响和对环境的污染。本发明的方法所用的种子来源广泛，贮运方便容易，成本低，既可以直接利用粮食作物(如小麦、玉米、水稻和谷子等)的种子和蔬菜等作物的种子，也可以利用一些作物的副产品，如西瓜、甜瓜和番茄等的种子；种子在作为“催化剂”使用后，仍然可以作为蔬菜(如黄豆芽、绿豆芽、萝卜苗、菘蓝苗)食用、作为工业原料使用(如麦芽、玉米芽等)或作为饲料使用(可食用植物)。本发明所用的植物材料来源广泛而且价格低廉，合成靛蓝的效率高、所合成的靛蓝的纯度高，几乎不需要纯化。本发明的方法是一种简单、方便、经济、高效和环保的绿色生产靛蓝的方法。
图1为(产)靛蓝植物菘蓝发芽种子催化吲哚形成靛蓝照片。
图2为非(产)靛蓝单子叶植物发芽种子催化吲哚形成靛蓝照片。
图3为非(产)靛蓝双子叶植物发芽种子催化吲哚形成靛蓝照片。
图4为非(产)靛蓝双子叶植物的种子在发芽过程中催化吲哚形成靛蓝照片。
图5为非(产)靛蓝双子叶植物红苋菜的种子发芽的滤纸吸附物催化吲哚形成靛蓝照片。
图6为双子叶植物(红苋菜)的根催化吲哚形成靛蓝照片。
图7为双子叶草本植物(红苋菜)的叶催化吲哚形成靛蓝照片。
图8为双子叶藤本植物金银花(常绿)和紫藤(落叶)的叶切碎后催化吲哚形成靛蓝照片。
图9为双子叶木本植物大叶黄杨(常绿)和美国红栌(落叶)的叶催化吲哚形成靛蓝照片。
图10为以氯仿为溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽催化合成的靛蓝与靛蓝标样及靛玉红标样的吸收光谱比较。
图11为以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝与靛蓝标样的吸收光谱比较。
图12为用甲醇清洗后再用DMF溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝与靛蓝标样以及甲醇洗脱物的吸收光谱比较。
图13A为以氯仿为溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝与靛蓝标样和靛玉红标样氯仿溶液的薄层层析图，展开剂是苯∶氯仿∶丙酮(5∶4∶1)。
图13B为以氯仿为溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝与靛蓝标样和靛玉红标样氯仿溶液的薄层层析图，展开剂是氯仿∶乙醇(9∶1)。
具体实施例方式
本发明利用数十种植物之一的器官和/或组织，在常温下在体外将吲哚氧化形成靛蓝。
按照本发明的方法，在能够保水的容器底部铺放1-3层充分吸水的滤纸(或类似物)，将(产)靛蓝植物或非(产)靛蓝植物的成熟种子或具有发芽能力的种子置于滤纸(或类似物)上，在常温或者室温下保湿使种子在暗处或自然条件发芽。在种子发芽过程中或待85％以上的种子发芽后，除去或不除去发芽种子，在该吸水纸(滤纸)或类似衬质上加入溶解于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等溶剂的吲哚，在常温或者室温下放置24-72小时，当滤纸(或类似物)变成蓝色时，将其取出，剪切成小块后置于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中在常温或室温下漂洗，待靛蓝完全洗脱时(滤纸或类似物不再呈蓝色)，取出滤纸或类似物。
按照本发明的方法，在能够保水的容器底部铺放1-3层充分吸水的滤纸(或类似物)，将(产)靛蓝植物或非(产)靛蓝植物的活体根段、茎段和叶段(叶盘)等置于滤纸(或类似物)上，在常温或者室温下保湿使根段、茎段和叶段(叶盘)等保活。也可以将(产)靛蓝植物或非(产)靛蓝植物的活体叶等捣碎，置于滤纸(或类似物)上，在常温或者室温下保湿。经过1-3天后，除去或不除去培养物，在该吸水纸(滤纸)或类似衬质上加入溶解于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺等溶剂的吲哚，在常温或者室温下放置12-72小时，当滤纸(或类似物)变成蓝色时，将其取出，剪切成小块后，置于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中在常温或室温下漂洗，待靛蓝完全洗脱时(滤纸或类似物不再呈蓝色)，取出滤纸或类似物。
溶解于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中的靛蓝可按照常规方法(如，加热循环蒸馏)析出，回收氯仿或N，N-二甲基甲酰胺，重复循环使用。为了鉴定合成的靛蓝，可以在其析出前直接取氯仿或N，N-二甲基甲酰胺洗脱的靛蓝液，以氯仿或N，N-二甲基甲酰胺作为负对照，以靛蓝标准样作为正对照，用紫外-可见光分光光度计进行扫描，比较吸收光谱和最大吸收峰波长。也可以以氯仿或N，N-二甲基甲酰胺等靛蓝溶剂作为负对照，以靛蓝标样作为正对照进行薄层层析，比较斑点的颜色和迁移率。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例中的室温是指10-37℃。
实施例1、(产)靛蓝植物种子的体外分泌物常温下催化合成靛蓝一、合成靛蓝1、吲哚溶液的配制称取0.06g吲哚固体粉末(北京化学试剂公司产品，分析纯)，溶于1ml的氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中，相应形成0.5mmol/ml的吲哚氯仿溶液或吲哚N，N-二甲基甲酰胺溶液，装入1.5ml离心管或棕色指形管中，室温存放，备用。
2、种子的发芽在培养皿(直径9cm)中放入3层滤纸，加约4ml左右蒸馏水使滤纸充分吸湿，以滤纸表面看不到流动的水为度。将(产)靛蓝植物菘蓝的种子均匀地铺在培养皿滤纸上，盖盖。每次做5个培养皿。将含有种子的培养皿置于暗处在室温或常温下培养。1-2天后，85％以上的种子发芽。
3、底物---吲哚的加入和靛蓝的合成当种子芽的下胚轴长到2cm左右时(发芽后1-2天)，随机在第一个培养皿中滴加10μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加10μl吲哚溶液(溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF))以合成靛蓝，在第三个培养皿中加10μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加10μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于(室温)下放置1-3天，观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明在加入底物吲哚(溶于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺---DMF)的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(图1中A)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化(图1中B)。图1中A为加入吲哚溶液(以氯仿作为溶剂)的培养皿，图1中B为加入10μl氯仿的培养皿。
实施例2、非(产)靛蓝单子叶植物种子的体外分泌物常温下催化合成靛蓝吲哚溶液的配制同实施例1。
在培养皿(直径9cm)中放入3层滤纸，加约4ml左右蒸馏水使滤纸充分吸湿，以滤纸表面看不到流动的水为度。将非(产)靛蓝单子叶植物小麦(品种“扬麦158”和“农大170”)、水稻(品种“越富”)和玉米等(见表1)的种子分别均匀地铺在培养皿滤纸上，盖盖。每次每种植物种子做5个培养皿。将含有种子的培养皿置于暗处在25℃下培养。1-2天后，90％以上的种子发芽。
当种子芽的下胚轴长到约2cm左右时(发芽后1-2天)，与实施例1一样，随机在第一个培养皿中滴加20μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加20μl吲哚溶液(溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF))以合成靛蓝，在第三个培养皿中加20μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加20μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明在加入不论是氯仿还是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂的吲哚溶液的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(表1，图2中A)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化(表1，图2中B)。图2中A为加入底物吲哚溶液(以N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂)的培养皿，图2中B为加入20μl溶剂N，N-二甲基甲酰胺的培养皿。图2中A和B中的三个培养皿从左至右依次为水稻、小麦和玉米。
表1、非(产)靛蓝单子叶植物种子发芽体外常温氧化吲哚生成靛蓝(衬质滤纸的蓝色反应)
实施例3、非(产)靛蓝双子叶植物种子的体外分泌物常温下催化合成靛蓝吲哚溶液的配制同实施例1。
在培养皿(直径9cm)中放入3层滤纸，加约4ml左右蒸馏水使滤纸充分吸湿，以滤纸表面看不到流动的水为度。将非(产)靛蓝双子叶植物大豆(黄豆)、绿豆、豇豆、苋菜、油菜、大白菜、白萝卜、胡萝卜、芹菜、茄子、烟草和鸡冠花等(见表2)的种子分别均匀地铺在培养皿滤纸上，盖盖。每次每种植物种子5个培养皿。将含有种子的培养皿置于暗处在室温下培养。
含有种子的培养皿置于暗处在室温下培养1-2天后，90％以上的种子发芽。当种子芽的下胚轴长到约2cm左右时(发芽后2天)，与实施例1一样，随机在第一个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF))以合成靛蓝，在第三个培养皿中加50μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加50μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明在加入不论是氯仿还是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂的吲哚溶液的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(表2，图3中A)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化(表2，图3中B)。图3中A为加入底物吲哚溶液(以N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂)的培养皿，图3中B为加入50μlN，N-二甲基甲酰胺的培养皿。图3中A和B中的六个培养皿从左至右依次为红苋菜、油菜、萝卜、西瓜、大豆和绿豆。
表2、非(产)靛蓝双子叶植物种子发芽体外常温氧化吲哚生成靛蓝(衬质滤纸的蓝色反应)
实施例4、非(产)靛蓝双子叶植物种子的体外分泌物常温下催化合成靛蓝——种子发芽过程中加入吲哚吲哚标准品溶液配制方法与种子发芽方法同实施例3。
分别将含有红苋菜(品系农大红)、大白菜和曼陀罗等种子的培养皿置于暗处在20℃培养24小时后，可以看见有些种子开始萌芽。此时，随机在第一个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为DMF)以合成靛蓝，在第三个培养皿中加50μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加50μl的DMF作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明在加入底物吲哚溶液(以氯仿或DMF作为溶剂)的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(图4中A)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化(图4中B)。图4中A为加入吲哚溶液(以氯仿作为溶剂)的培养皿，图4中B为加入50μl氯仿的培养皿。图4中A和B中的三个培养皿从左至右依次为大白菜、曼陀罗和红苋菜。
实施例5、非(产)靛蓝双子叶植物种子的体外分泌物常温下催化合成靛蓝——将种子芽苗移走后加入吲哚吲哚标准品溶液配制方法与种子发芽方法同实施例3。
含有红苋菜(品系农大红)种子的培养皿置于暗处在室温下培养1-2天后，90％以上的种子发芽。当种子芽的下胚轴长到约2cm左右时(发芽后1-2天)，将芽苗取出，留下滤纸。然后，随机在第一个培养皿中滴加30μl吲哚溶液(以氯仿为溶剂)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加30μl吲哚溶液(以DMF为溶剂)以合成靛蓝，在第三个培养皿中加30μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加30μl的DMF作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明，无论以氯仿还是以DMF为吲哚的溶剂，在加入底物吲哚溶液的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(图5中A)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化(图5中B)。图5中A为加入吲哚溶液(以DMF作为溶剂)的培养皿，图5中B为加入50μlDMF的培养皿。
实施例6、双子叶植物的根的体外分泌物常温下催化合成靛蓝吲哚标准品溶液配制方法同实施例3。
取红苋菜(品系农大红)等田间苗或室内室温或常温下种子芽苗的根(田间苗的根用自来水洗净，用吸水纸吸干表面的水)，在培养皿中充分吸湿的2-3层滤纸上切成长0.5-0.8cm的片段，培养皿加盖后于暗处在室温或常温下培养1-2天。然后，随机在第一个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为DMF)以合成靛蓝，在第三个培养皿中加50μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加50μl的DMF作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明田间苗的根或种子芽苗的根在加入吲哚溶液(不论以氯仿还是以DMF作为溶剂)的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(图6)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化。图6示田间苗的根催化合成的靛蓝。
实施例7、双子叶植物的叶片的体外分泌物常温下催化合成靛蓝吲哚标准品溶液配制方法同实施例3。
取红苋菜(品系农大红)田间苗或无菌苗(试管苗)的伸展叶。田间苗的叶用自来水洗净，用吸水纸吸干表面的水。
将叶切成长0.3-1.5cm、宽0.2-0.5cm的长条，或者用打孔器切成直径为0.3-0.5cm的圆盘，将其放置培养皿中充分吸湿的2-3层滤纸上，培养皿加盖后于暗处在室温或常温下培养1-2天。然后，随机在第一个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为DMF)以合成靛蓝，在第三个培养皿中加50μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加50μl的DMF)作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明在加入不论是氯仿还是DMF作为溶剂的吲哚溶液的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(图7)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化。图7是田间苗的叶催化合成的靛蓝。
实施例8、双子叶藤本植物的叶片细胞破碎物常温下催化合成靛蓝吲哚标准品溶液配制方法同实施例3。
分别取常绿藤本植物金银花(忍冬)和落叶藤本植物紫藤田间苗伸展叶，用自来水洗净，再用蒸馏水清洗2-3次，用吸水纸吸干表面的水。叶片清洗完后，迅速捣碎，放在培养皿中充分吸湿的2-3层滤纸上，培养皿加盖后于暗处在室温或常温下培养1-2天。然后，随机在第一个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为DMF)以合成靛蓝，在第三个培养皿中加50μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加50μl的DMF作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果显示在加入底物吲哚溶液(以氯仿或DMF作为溶剂)的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(图8)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化。图8为双子叶木质藤本植物的叶片细胞破碎物催化合成的靛蓝。图中，A为金银花(忍冬)，B为紫藤。
实施例9、双子叶木本植物的叶片常温下催化合成靛蓝吲哚标准品溶液配制方法同实施例3。
分别取常绿木本植物大叶黄杨和落叶木本植物美国红栌田间苗伸展叶，用自来水洗净，再用蒸馏水清洗2-3次，用吸水纸吸干表面的水。叶片清洗完后，将叶切成长0.3-1.5cm、宽0.2-0.5cm的长条，或者用打孔器切成直径为0.3-0.5cm的圆盘，将其放置培养皿中充分吸湿的2-3层滤纸上，培养皿加盖后于暗处在室温或常温下培养1-2天。然后，随机在第一个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为氯仿)以合成靛蓝，第二个培养皿中滴加50μl吲哚溶液(溶剂为DMF)以合成靛蓝，在第三个培养皿中加50μl的氯仿作为溶剂对照，在第四个培养皿中加50μl的DMF作为溶剂对照，第五个培养皿加蒸馏水以作为空白对照。处理后，将培养皿在暗处于室温下放置1-3天，然后观察培养皿中滤纸颜色的变化。结果表明在加入不论是氯仿还是DMF作为溶剂的吲哚溶液的培养皿中，滤纸均呈蓝色或有蓝色斑块(图9)，而不加吲哚溶液的所有培养皿中，滤纸的颜色没有任何变化。图中，A为大叶黄杨；B为美国红栌。
实施例10、植物催化体外常温合成靛蓝的提取方法1、直接提取分别将实施例1-9中显蓝色或蓝色斑块滤纸室温自然晾干后，剪切成碎片，分别置于氯仿溶剂或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温下放置以洗脱蓝色物质，期间白天每隔1小时轻轻摇动3-5分钟，以在滤纸上看不见蓝色为度(一般2-12小时)。此时，溶液变成蓝色。当滤纸退去蓝色后，将其取出，得到合成靛蓝的氯仿溶液或DMF溶液。
方法2、用甲醇漂洗后再提取将实施例1-9中显蓝色或蓝色斑块滤纸室温自然晾干后，剪切成大片(6-8份/张)，置于甲醇(北京化学试剂公司产品，分析纯)中于室温下漂洗1-12小时，取出滤纸，室温下晾干，然后剪切成碎片，分别置于氯仿溶剂或DMF中，室温下放置以洗脱蓝色物质，期间白天每隔1小时轻轻摇动3-5分钟，以在滤纸上看不见蓝色为度(一般2-12小时)。此时，溶液变成蓝色。当滤纸退去蓝色后，将其取出，得到合成靛蓝的氯仿溶液或DMF溶液。
实施例11、植物催化体外常温合成靛蓝的分光光度计吸光谱鉴定1、标准品靛蓝溶液的配制准确称取靛蓝和靛玉红标准品(中国药品生物制品检定所产品)各1mg，分别定溶于50ml的氯仿(北京化学试剂公司产品，分析纯)或N，N-二甲基甲酰胺(DMF，北京化学试剂公司产品，分析纯)中，相应形成0.02mg/ml的标准靛蓝氯仿溶液和靛蓝DMF溶液，装入棕色试剂瓶中，室温存放，备用。
2、靛蓝的分光光度计吸光谱扫描将标准品靛蓝溶液(以及标准品靛玉红溶液)和实施例1-9中所合成按照实施例10中方法1和方法2所提取的靛蓝的溶液(以氯仿或DMF为溶剂)用紫外-可见光分光光度计(双光束紫外可见分光光度计，型号TU-1901，购自北京普析通用仪器有限责任公司)在190-800nm波长范围内以1nm为单位进行吸光扫描，相应以溶剂氯仿或DMF为空白对照。将扫描的吸光值用微软Excell软件作曲线图，然后比较标准品靛蓝溶液和合成靛蓝的吸光谱与最大吸光波长(或波峰)。
结果表明实施例1-9中合成的所有靛蓝与标准品靛蓝的吸光谱与最大波峰完全一致，这也被在紫外光区和可见光区最大吸光值所肯定。由此表明，由植物器官(种子、根和叶片)催化吲哚形成的蓝色物质为靛蓝。图10显示的是以氯仿为溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝与靛蓝标样及靛玉红标样的吸收光谱比较；图中，1为氯仿提取的靛蓝样品中的吸收光谱，2为靛蓝标准样品的吸收光谱，3为靛玉红标准样品的吸收光谱。图11显示的是以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝与靛蓝标样的吸收光谱比较；图中，4为DMF提取的合成靛蓝样品，5为DMF溶解的靛蓝标准样品。图12显示的是用甲醇清洗后再用DMF溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝与靛蓝标样以及甲醇洗脱物的吸收光谱比较；图中，6为DMF溶解的靛蓝标准样品，7为甲醇清洗后，DMF提取的靛蓝样品，8为甲醇提取物。表3给出了标准品靛蓝与红苋菜种子发芽的分泌物催化吲哚形成的靛蓝在不同溶剂(氯仿或DMF)经过甲醇清洗前后在紫外光区和可见光区的最大吸收峰的波长。
表3、标准品靛蓝与红苋菜种子发芽的分泌物催化吲哚形成的蓝色物质的最大吸收峰波长(nm)比较
实施例12、植物催化体外常温合成靛蓝的薄层层析鉴定标准品靛蓝溶液和标准品靛玉红溶液的配制同实施例11。薄层层析所用的硅胶板为“银龙”牌“薄层色谱硅胶预制板”(烟台化学工业研究所产品)，尺寸10×2.5×0.25cm；质量标准鲁Q/YT257-85，涂层厚度0.2mm±0.03mm，SX＝3；硅胶粉粉度8±2μm。Ph＝6.2-6.8。
在层析板的一端距离边沿2.5cm处用铅笔在硅胶板上轻轻划一条线，然后用毛细管在线上点开三个小孔(直径大约0.1mm)，分别取标准品靛蓝溶液、标准品靛玉红溶液和的样品靛蓝的溶液(实施例1-9中所合成、按照实施例10中途径1的方法提取，以氯仿或DMF为溶剂)3-5μl，依次加入3个小圆孔中。将硅胶板置于层析缸中在室温下进行层析(展开剂深度为1.5cm左右)，直至展开剂上升到距上边缘1-0.5cm时，将硅胶板取出，沿展开剂所到达的最上边缘用铅笔轻轻划一条直线。计算迁移率Rf＝(半点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂前沿与原始样点之间的距离)，并照相保存结果。
结果显示，用氯仿溶解靛蓝标准品、靛玉红标准品和洗脱合成的靛蓝，当展开剂为苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1(体积比)[程力惠，2005，“板蓝根中靛玉红提取方法研究”，亚热带植物科学，34(2)46-47]时，在可见光下靛蓝标样和实施例1-9中合成的所有靛蓝样品都呈蓝色扁椭圆形斑点，而靛玉红标样呈紫红色扁椭圆形斑点；靛玉红标样的迁移率比靛蓝标样和提取靛蓝样品的低得多，而靛蓝标样和提取的靛蓝样品的迁移率相等(靛蓝标准样品Rf＝0.8013，靛玉红标准样品Rf＝0.4697，蓝色样品Rf＝0.8013)，见图13A。在相同的条件下，当展开剂为氯仿∶乙醇＝9∶1(体积比)时，在可见光下靛蓝标样和实施例1-9中合成的所有靛蓝样品都呈蓝色长扁椭圆形斑点，而靛玉红标样呈紫红色长扁椭圆形斑点；靛蓝标样和提取的靛蓝样品的迁移率仍然相等，但靛玉红标样的迁移率与靛蓝标样和提取靛蓝样品迁移率的差距缩小(靛蓝标准样品Rf＝0.9615，靛玉红标准样品Rf＝0.9385，蓝色样品Rf＝0.9615)，见图13B。图13A和13B显示的是以氯仿为溶剂洗脱吸附在滤纸上的红苋菜种子发芽的分泌物催化合成的靛蓝、与以氯仿为溶剂配制的靛蓝和靛玉红标准样品的薄层层析图，其中，图13A中展开剂是苯∶氯仿∶丙酮(5∶4∶1)；图13B中展开剂是氯仿∶乙醇(9∶1)；图13A和13B中，从左至右依次为靛蓝标准样品、靛玉红标准样品与合成的靛蓝。
从图10-13B可以看出，本发明用植物器官和/或组织在体外在常温下催化吲哚氧化形成的蓝色物质与靛蓝标准品的吸收光谱及其最大吸收峰波长完全一致，颜色完全相同，而且层析的迁移率相等。因此，本发明用植物器官和/或组织在体外在常温下催化吲哚氧化形成的蓝色物质的确是靛蓝。从薄层层析图(图13A和13B)可以看出，无论用经典的展开剂(图13A)还是用新的展开剂(图13B)，本发明用植物器官和/或组织在体外在常温下催化吲哚氧化形成的蓝色物质与靛蓝标准品一样，都只有一个蓝色的斑点，绝对不含靛玉红等杂质。证明，本发明用植物器官和/或组织在体外在常温下催化吲哚氧化形成的靛蓝是高度纯净的靛蓝。
权利要求
1.一种生物合成靛蓝的方法，是利用活体植物的器官和/或组织的体外分泌物、和/或活体植物的器官和/或组织的细胞破碎物的体外分泌物作为催化剂，在体外以吲哚为底物合成靛蓝。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的体外分泌物均能将吲哚氧化成吲哚酚。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物为单子叶植物与双子叶植物；所述植物优选为陆生种子植物；尤其优选为菘蓝、欧洲菘蓝、蓼蓝、马蓝、木蓝、纳塔尔木蓝、野青树、金银花、紫藤、黄杨、红栌、烟草、矮牵牛、茄子、番茄、曼陀罗、油菜、大白菜、小白菜、苋菜、萝卜、胡萝卜、茴香、芹菜、西瓜、甜瓜、黄瓜、黄豆、绿豆、豌豆、豇豆、水稻、小麦、玉米、谷子、稗子和高梁；所述苋菜包括叶用和籽用的苋菜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述植物为烟草、油菜、苋菜、黄豆、绿豆、豌豆、萝卜、小麦、玉米、谷子和高梁；所述苋菜为籽用的苋菜。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物的器官为种子和/或根和/或茎和/或叶；优选器官为种子和/或叶。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征之在于所述植物种子的体外分泌物是植物种子发芽过程中分泌到体外的分泌物；该体外分泌物按照如下方法获得将植物种子置于能够吸水、保水且能够吸附靛蓝并且所吸附的靛蓝容易被洗脱的培养衬质上进行发芽，收集所述培养衬质，得到所述植物种子发芽过程中产生的体外分泌物；所述植物根、茎和叶的体外分泌物是这些器官及其细胞破碎物在离体培养过程中分泌到体外的分泌物；该体外分泌物按照如下方法获得将根、茎和叶切成小片段或者捣碎，置于能够吸水、保水且能够吸附靛蓝并且所吸附的靛蓝容易被洗脱的培养衬质上保湿1-5天，收集所述培养衬质，得到所述植物根、茎和叶及其细胞破碎物的体外分泌物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述培养衬质为吸水纸或滤纸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述活体植物的器官和/或组织的体外分泌物、和/或活体植物的器官和/或组织的细胞破碎物的体外分泌与吲哚按照如下方法混合将吲哚溶液加到所述培养衬质上。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应温度为10-37℃，反应时间为1-6天。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述吲哚溶液是将吲哚溶解于氯仿或者N，N-二甲基甲酰胺等有机溶剂中，优选溶剂为氯仿或者N，N-二甲基甲酰胺。
全文摘要
本发明公开了一种生物合成靛蓝的方法。该方法是利用活体植物的器官和/或组织的体外分泌物、和/或活体植物的器官和/或组织的细胞破碎物的体外分泌物作为催化剂，在体外以吲哚为底物合成靛蓝。利用该方法合成靛蓝不需要任何特殊的和专门的仪器和设备，操作极其简单方便，并且不产生任何污染物。所合成的靛蓝很容易用常规方法提取，纯度高，几乎不需要再纯化。此外，作为催化剂的植物器官，在完成催化后仍然可以作为食物(可食用植物)或工业原料(非可食用植物)利用。
文档编号C09B61/00GK1970642SQ20061011448
公开日2007年5月30日 申请日期2006年11月10日 优先权日2006年11月10日
发明者肖兴国, 刘建兵, 袁利娟, 高兆建, 韩晓红 申请人:中国农业大学