专利名称：β－丙氨酸的生物合成方法
技术领域：
本发明涉及β-丙氨酸的生物合成方法，特别是在微生物酶的作用下合成β-丙氨酸的合成方法。
背景技术：
β-丙氨酸，又名β-氨基丙酸。1972年由Ross和Monroe在尿嘧啶的降解产物中发现。它是一种非蛋白质的氨基酸，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸主要的生理活性作用是合成泛酸、辅酶A。现代医学研究发现，在哺乳动物的神经系统中，它可作为大脑中神经传递者；具离子通道的激活作用；可治疗由组织缺氧引起的肝损伤。
在精细化工领域β-丙氨酸用于合成聚合β-丙氨酸，电镀缓冲剂，染料等生产。聚合β-丙氨酸在水处理工业中用作絮凝剂；在医药工业中，β-丙氨酸是可用作许多药物的中间体，例泛酸钙，系维生素b族物质，是多种代谢环节中，包括碳水化合物、蛋白质、脂肪及上皮功能维持正常所必需的辅酶a的组分部分。肌肽是一种十分有效的伤口愈合剂。N-(2，5-二氯-4-氰硫基苯)-β-丙氨酸是一种有效的抗真菌剂，β-丙氨酸具有较宽广的应用领域和市场前景。
目前β-丙氨酸采用化学合成法生产。化学合成法有三种工艺(1)丙稀腈法此法丙稀腈经与氨在二苯胺和叔丁醇溶液中反应，生产β-氨基丙腈，再进行碱解即得；此法的缺点是产物中存在有40％以上的NaCl和杂质，需要反复纯化，反应过程中产生的NH3污染大气；(2)β-氨基丙腈法β-氨基丙腈与氢氧化钡反应生成β-氨基丙酸钡和氮气，通入CO2，钡盐析出，产生β-氨基丙酸，钡离子用树脂去除，此法的缺点是生产成本高；(3)琥珀酰亚胺降解法琥珀酰亚胺在碱性氯酸钠溶液中生成β-氨基丙酸，反应液用盐酸调pH，用3倍量的95％乙醇使无机盐析出，滤液用4倍量的蒸馏水稀释，离子交换树脂交换，交换液脱色，浓缩结晶，此法需大量的乙醇，生产成本高，生产场地安全性要求高。总之化学合成法的原料、中间体及副产物有毒，对环境污染严重。
发明内容本发明的目的是提供一种β-丙氨酸的生物合成方法，以克服现有β-丙氨酸的化学合成方法对环境易造成污染且成本高的不足。
本发明达到发明目的所采用的技术方案是一种β-丙氨酸的生物合成方法，所述的方法是用可产生氨基化酶的微生物分别在含丙烯酸的种子培养基和含丙烯酸的发酵培养基中培养出相应的氨基化酶，将所述的氨基化酶加入转化液中，所述的转化液为含有1％～50％(g/ml)丙烯酸的氨水溶液，在酶的作用下合成β-丙氨酸，经脱氨、纯化得β-丙氨酸产品。转化液的pH保持在2.0～9.6，在20～80℃条件下搅拌转化反应2-40小时，然后转化液经脱氨、离子交换、纯化得到β-丙氨酸纯品。
所述的转化反应器在密闭环境下进行。
所述的微生物为藤黄八叠球菌或大肠杆菌。
所述的种子培养基为终浓度百分含量(g/ml)0.01～10％丙烯酸，0.1～10％牛肉膏，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5；所述的发酵培养基为终浓度百分含量(g/ml)0.01～10％丙烯酸，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5。
所述的转化液可以是氨水及下式之一①磷酸缓冲液；②柠檬酸缓冲液；③醋酸缓冲液；④蒸馏水。
通常选用0.2M磷酸缓冲液，pH5.7～8.0；0.1M柠檬酸缓冲液，pH3.0～6.6；0.2M醋酸缓冲液，pH3.6～5.8。
所述的方法按如下步骤进行(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，25～40℃，150～300r/min摇床培养16～40小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，20～60℃，100～300r/min发酵16～60小时；(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度1％～50％(g/ml)，用氨水控制转化液的pH为2.0～9.6，25～40℃下搅拌转化4～20小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；(3)反应后转化液经脱氨、离子交换，纯化得β-丙氨酸产品。
所述的所述的方法中的步骤(3)具体为反应后转化液3000r/min25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。
所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为蒸馏水，用氨水调pH7.2～7.5。
所述的所述的方法按如下步骤进行(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30～35℃，200～300r/min摇床培养16～20小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，150～300r/min发酵16～20小时；(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度(g/ml)1％～50％，用氨水控制转化液的pH为4.0～8.0，30～35℃下搅拌转化6～10小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应。
所述方法按如下步骤进行(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30℃，200r/min摇床培养24小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，200r/min发酵16～20小时；(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，30～35℃下搅拌转化8小时，每2小时测一次pH值，用氨水调至pH7.2～7.5，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；(3)反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。
上述步骤中，所述的种子培养基为终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，0.5％的牛肉膏，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；所述的种子培养基为终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03％的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为水，用氨水调pH7.2～7.5。
培养基中采用MgSO4.7H2O，可提高菌体产酶的活性。
本发明所述的β-丙氨酸的生物合成方法的有益效果主要体现在(1)用微生物酶做催化剂，反应效率高，且无污染；(2)反应原料易得，步骤简单，成本低；(3)产物纯度高。
图1为α-丙氨酸标准样品高效液相色谱图；图2为β-丙氨酸标准样品高效液相色谱图；图3为实施例1制得β-丙氨酸样品高效液相色谱图；图4为实施例1所得样品红外图谱；图5为Aldrich Condensed Phase数据库对样品红外图谱的匹配图；图6为β-丙氨酸标准样品核磁共振图谱；图7为实施例1所得样品核磁共振图谱；图8、图9为纸层析结果示意图。其中a1、a2分别代表大肠杆菌产生的酶转化的结果；d1、d2分别代表藤黄八叠球菌产生的酶转化的结果；d3为实施例1发酵液离心后的上清液；α代表α-丙氨酸标样；β代表β-丙氨酸标样。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述实施例1β-丙氨酸的生物合成种子培养基玉米浆1.1g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.1g，氯化钠0.145g，牛肉膏0.5g，水100mL 121℃灭菌20min，丙烯酸0.8g，氢氧化钠调pH7.0；发酵培养基玉米浆1.1g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.1g，氯化钠0.145g，水100mL121℃灭菌20min，丙烯酸0.8g，氢氧化钠调pH7.0；转化液丙烯酸15g，MgSO4.7H2O 0.11g，氨水调pH7.5，0.2M磷酸缓冲液定容500mL。
藤黄八叠球菌斜面菌种接入种子培养基，200r/min，30℃摇床培养24h。以20％的接种量转入发酵培养基，30℃，200r/min摇床培养18小时得发酵液。发酵液按50％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度3％，用氨水控制转化液的pH为7.5，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在30℃条件下搅拌转化8小时，反应后转化液3000r/min25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度90％的β-丙氨酸样品。转化率达60％。
实施例2β-丙氨酸的生物合成种子培养基玉米浆0.5g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.05g，氯化钠0.10g，牛肉膏0.8g，水100mL121℃灭菌20min，丙烯酸0.08g，盐酸调pH6.5；发酵培养基玉米浆0.5g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.05g，氯化钠0.10g，水100mL 121℃灭菌20min，丙烯酸0.08g，盐酸调pH6.5；转化液丙烯酸10g，MgSO4.7H2O 0.10g，氨水调pH4.8，0.2M醋酸缓冲液定容500mL。
藤黄八叠球菌斜面菌种接入种子培养基，100r/min，25℃摇床培养20h。以15％的接种量转入发酵培养基，25℃，100r/min摇床培养16小时。发酵液按40％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度2％，用氨水控制转化液的pH为4.8，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在25℃条件下搅拌转化10小时，反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度95％的β-丙氨酸样品。转化率达54％。
实施例3β-丙氨酸的生物合成种子培养基玉米浆1.8g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.05g，氯化钠0.45g，牛肉膏6.5g，水100mL121℃灭菌20min，丙烯酸7.5g，盐酸调pH5.5；发酵培养基玉米浆1.8g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.05g，氯化钠0.45g，水100mL 121℃灭菌20min，丙烯酸7.5g，盐酸调pH5.5；转化液丙烯酸200g，MgSO4.7H2O 0.12g，氨水调pH6.0，0.1M柠檬酸缓冲液定容500mL。
大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，300r/min，55℃摇床培养18h。以15％的接种量转入发酵培养基，55℃，300r/min摇床培养16小时。发酵液按50％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度45％，用氨水控制转化液的pH为6.0，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在55℃条件下搅拌转化3小时，反应后转化液3000r/min25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度80％的β-丙氨酸样品。转化率达50％。
实施例4β-丙氨酸的生物合成种子培养基玉米浆1.0g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.04g，氯化钠0.30g，牛肉膏8.5g，121℃灭菌20min，丙烯酸4.5g，水100mL氢氧化钠调pH9.0；发酵培养基玉米浆1.0g，MgSO4.7H2O 0.02g，KH2PO40.04g，氯化钠0.30g，121℃灭菌20min，丙烯酸4.5g，氢氧化钠调pH9.0；转化液丙烯酸90g，MgSO4.7H2O 0.10g，氨水调pH9.0蒸馏水定容500mL。
大肠杆菌斜面菌种接入种子培养基，250r/min，20℃摇床培养50h。以20％的接种量转入发酵培养基，20℃，250r/min摇床培养45小时。发酵液按30％的比例加入转化液，转化液中丙烯液浓度18％，用氨水控制转化液的pH为8.5，为防止丙烯酸和氨水的挥发，转化反应器密闭，在20℃条件下搅拌转化36小时，反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，得纯度98％的β-丙氨酸样品。转化率达58％。
实施例5β-丙氨酸含量测定(1)高效液相色谱分别取实施例1所得冷冻干燥结晶样品、β-丙氨酸标准样品(1mg/ml)、a-丙氨酸标准样品，进行高效液相色谱分析柱型号SB-804柱温30℃梯度方式恒流0.5ml/min检测器蒸发光计算方法面积归一法实施例1所得冷冻干燥结晶样品色谱图如图3所示，β-丙氨酸标准样品色谱图如图2所示，a-丙氨酸标准样品色谱图如图1所示。结果分析分别见表1、表2、表3表1 a-丙氨酸标准样品高效液相色谱图分析结果
表1
比较例1-4选用市面上销量大且使用广的商品Reactive Black B、Reactive BlueBRF及Reactive Navy Blue FBN等染料，做为本发明染色特性试验比较对照使用。
比较例1-4的制备方法皆与实施例1相同，其使用原料和原料组成比例如下表2所示表2
比较例3使用100％的式(II-1)染料作为比较染料，以试验无添加式(I-1)染料时的染色特性。而比较例4使用100％Reactive Navy Blue FBN染料作为对照用比较染料，以证明本发明的染料组成物在极浅色颜色混色下具有优异耐汗光坚牢度效果。
试验例1以浸染法(Exhaustion dyeing)试验耐日光坚牢度将本发明实施例1与比较例1-4的染料组成物，进行单色与由黄、红、蓝三原色所组成混合颜色的耐光坚牢度试验，其试验步骤与试验结果如下。
表2 β-丙氨酸标准样品高效液相色谱图分析结果
表3实施例1所得冷冻干燥结晶样品色谱图分析结果
(2)红外光谱取实施例1所得样品进行红外光谱分析，红外图谱如图4所示，图5为Aldrich Condensed Phase数据库对样品红外图谱的匹配图；分析结果见表4表4实施例1所得样品红外分析结果
(3)核磁共振谱分别取实施例1所得样品、β-丙氨酸标准样品进行核磁共振谱检测；β-丙氨酸标准样品核磁共振图谱如图6所示，实施例1所得样品核磁共振图谱如图7所示。
(4)纸层析分别取实施例1～4所得样品进行纸层析，以α-丙氨酸和β-丙氨酸标准样品为对照，实验结果见图8、图9。其中a1、a2分别代表实施例3、4大肠杆菌产生的酶转化的结果；d1、d2分别代表实施例1、2藤黄八叠球菌产生的酶转化的结果；d3为实施例1发酵液离心后的上清液，α代表α-丙氨酸标样；β代表β-丙氨酸标样。结果表明a1、a2中含β-丙氨酸，d1、d2中也含β-丙氨酸，而d3中不含β-丙氨酸。
(5)结论根据以上检测数据，分析表明所制得产物成分为β-丙氨酸。
权利要求
1.一种β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的方法是用可产生氨基化酶的微生物分别在含丙烯酸的种子培养基和含丙烯酸的发酵培养基中培养出相应的氨基化酶，将所述的氨基化酶加入转化液中，所述的转化液为含有1％～50％丙烯酸的氨水溶液，在酶的作用下合成β-丙氨酸，经脱氨、纯化得β-丙氨酸产品。
2.如权利要求1所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的转化液的pH保持在2.0～9.6，在20～80℃条件下搅拌转化反应2～40小时，然后转化液经脱氨、离子交换、纯化得到β-丙氨酸纯品。
3.如权利要求2所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的转化反应器在密闭环境下进行。
4.如权利要求1～3之一所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的微生物为藤黄八叠球菌或大肠杆菌。
5.如权利要求4所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的种子培养基为终浓度百分含量(g/ml)0.01～10％丙烯酸，0.1～10％牛肉膏，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5；所述的发酵培养基为终浓度重量百分含量0.01～10％丙烯酸，0.1～2.0％玉米浆，0.1～10％蛋白胨，0.0.1～0.1％KH2PO4，0.011～0.15％MgSO4，0.05～0.5％NaCl，调pH3.0～9.5。
6.如权利要求5所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，25～40℃，150～300r/min摇床培养16～40小时，然后以1～20％的接种量转入发酵培养基，20～60℃，100～300r/min发酵16～60小时，得发酵液；(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度1％～50％(g/ml)，用氨水控制转化液的pH为2.0～9.6，25～40℃下搅拌转化4～20小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；(3)反应后转化液经脱氨、离子交换，纯化得β-丙氨酸产品。
7.如权利要求6所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的方法中的步骤(3)为反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。
8.如权利要求6所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为蒸馏水，用氨水调pH7.2～7.5。
9.如权利要求6所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述的所述的方法按如下步骤进行(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30～35℃，200～300r/min摇床培养16～20小时，然后以1～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，150～300r/min发酵16～20小时；(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，转化液中丙稀酸浓度1％～50％(g/ml)，用氨水控制转化液的pH为4.0～8.0，30～35℃下搅拌转化6～10小时，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应。
10.如权利要求8所述的β-丙氨酸的生物合成方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行(1)将藤黄八叠球菌或大肠杆菌菌种接入种子培养基中，30℃，200r/min摇床培养24小时，然后以1％～20％的接种量转入发酵培养基，30～35℃，200r/min发酵16～20小时；(2)发酵液按1％～50％的比例加入转化液，30～35℃下搅拌转化8小时，每2小时调一次pH值，用氨水调至pH7.2～7.5，用高锰酸钾滴定丙烯酸含量，当丙烯酸量保持1～4小时不变时终止反应；(3)反应后转化液3000r/min 25分钟，离心去除菌体，上清液减压脱氨浓缩，进行离子交换分离纯化，分步收集的液体用茚三酮显色，显色的收集液再脱色浓缩结晶，即可得β-丙氨酸样品。所述的种子培养基为终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，0.5％的牛肉膏，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；所述的种子培养基为终浓度(g/ml)为1.1％的玉米浆，0.02％的MgSO4.7H2O，0.1％的KH2PO4，0.145％的氯化钠，121℃灭菌20min，0.8％的丙烯酸，余量为水，用氨水调pH7.0；所述的转化液为终浓度(g/ml)为0.03％的丙烯酸，0.22×10-3的MgSO4.7H2O，余量为水，用氨水调pH7.2～7.5。
全文摘要
本发明提供了一种β－丙氨酸的生物合成方法，特别是在微生物酶的作用下合成β－丙氨酸的合成方法，所述的方法是用可产生氨基化酶的微生物分别在含丙烯酸的种子培养基和含丙烯酸的发酵培养基中培养出相应的氨基化酶，将所述的氨基化酶加入转化液中，所述的转化液为含有1％～50％(g/ml)丙烯酸的氨水溶液，在酶的作用下合成β－丙氨酸，经脱氨、纯化得β－丙氨酸产品。这种方法用微生物酶作催化剂，反应效率高，且无污染；反应原料易得，步骤简单，成本低；产物纯度高。
文档编号C12P13/06GK1626665SQ200310109379
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者裘娟萍, 沈寅初, 姚燕来, 韩建娜, 黄海婵, 汪琨 申请人:浙江工业大学