细小病毒b19的诊断测试的制作方法

专利名称：细小病毒b19的诊断测试的制作方法
技术领域：
本发明总的涉及病毒诊断。具体而言，本发明涉及以核酸为基础的用于准确诊断细小病毒B19感染的试验和用于此试验的引物、探针。
背景技术：
人细小病毒B19是细小病毒科、Erythrovirus属的成员，是一种小的22nm二十面体、无包膜病毒，为线性单链DNA分子，约有5600个核苷酸。其病毒基因组编码3种主要的蛋白，VP1、VP2和NS1。可参见Shade等，J.Virol.(1986)，58921-936和本文的

图1。VP1(83kDa)和VP2(59kDa)是衣壳的结构蛋白。这两种蛋白分别在约第2444-4789位和约第3125-4789位核苷酸的重叠的开放读框中编码。VP2构成了衣壳的95％，较大的VP1蛋白仅占衣壳的5％。病毒的成熟构型需要VP1。NS1(77kDa)是一种非结构蛋白，仅存在于感染细胞的核组分中，不存在于细胞质和血清中的完整病毒粒子中。
细小病毒B19在正常的献血者的血清中被首次发现，是已知人类致病原细小病毒家族中的唯一成员。该病毒与广泛的疾病表现有关。人细小病毒B19通常引起儿童无症状或轻度的自限性感染(self-limiting infection)。对于成年人，细小病毒B19会引起快速的、短暂的对称性多发性关节痛(symmetrical polyarthralgia)和关节炎。细小病毒B19与患潜在性溶血性疾病患者的短暂性再生障碍危象(TAC)相关。业已报道，在患急性白血病、先天性免疫缺陷、AIDS以及骨髓移植后的免疫力低下力低下患者中存在慢性B19感染和持久性贫血。细小病毒B19还与怀孕妇女的胎儿死亡相关。
在大多数国家中，B19病毒感染通常发生在孩童，大约50％的儿童到15岁时才会具有抗B-19抗体。在整个生命过程中，B19抗体可能会进一步增加，老年个体中此值达到90％以上。
据信，在人细小病毒B19感染中，病毒的最初复制发生在呼吸道中。然后，病毒靶向骨髓中的细胞。这导致大规模的病毒复制，据报道为102-1014个粒子/ml的病毒血症发生在感染后7-10天，但在症状发作之前。病毒血症的停止与测到的特异性IgM抗体的检测相一致，IgM的升高会持续2-3个月。IgM抗体出现几天后可检测到抗B19-IgG抗体，它将持续终生。
脂质包膜的缺乏和有限的DNA含量使得细小病毒B19极能抵抗理化性灭活。尤其是在高浓度时，细小病毒B19能抵挡血制品的常规热处理。并且，也有文献报道，B19可通过溶剂-去污剂处理的因子VIII和蒸汽或干热处理的因子VIII和IX制品的给予而传播。
人细小病毒B19不能在常规的细胞培养中生长，这使得该病毒的实验室检测和分离非常困难。因而，多年来，唯一的抗原来源是病毒血症患者获得的血清。在解决这些问题的尝试中，已生产了用于血清学检测的重组抗原。可参见Sisk和Berman，Biotechnology(1987)，51077-1080；美国专利6204044。也已采用免疫酶学IgM俘获试验来检测抗B-19抗体和诊断近来的B19感染。但是，许多可获得的商业化试剂的诊断性能都不相同。此外，基于IgM的诊断试验也不能检测到感染时病毒血症期中的病毒，而且，一旦合成IgM抗体，它们可在病毒血症结束后几个月中保留在循环中。
B19抗体在正常人群中的高度流行，以及高病毒血症通常持续仅1周的事实，使得使用基于血清学的试验不切实际。此外，在免疫力低下患者中，血清学诊断可能是不可靠的。
已将基于核酸的杂交试验用于B19检测，如斑点印迹和原位杂交。这些试验的检测限度通常为1-0.1pg病毒DNA(～104-105病毒粒子)。PCR具有较高的灵敏度(～100基因组拷贝)。但是，DNA杂交技术费时，并且用途有限，而PCR对于筛选大量的样品也是不实用。
因此，仍需要开发出一种可靠的诊断试验，用于检测病毒血症样品中的细小病毒B19，以预防病毒通过血液和血浆衍生物或者通过人与人之间的亲密接触而传播。
发明概述本发明的基础是，发现了可用于核酸试验的独特引物和探针，以及开发了用于检测可能受感染个体的生物学样品中细小病毒B19 DNA的灵敏、可靠的核酸试验。本文所述的技术利用抽提的样品DNA为模板，采用转录介导的扩增(TMA)，以及用5′核酶试验测中(如TaqManTM技术)进行B19序列保守性基因组区域的扩增。这些方法允许检测病毒效价低至103病毒粒子/ml的病毒血症样品中的B19DNA。因此，可鉴别出被感染的样品，并将其排除于输血以及血制品之外。本文所述的探针和引物也可用于如标准杂交方法以及基于PCR的技术、基于核酸序列的扩增(NASBA)和利用分支DNA-分子的试验中。
因此，在一个实施例中，本发明涉及一种检测生物学样品中的人细小病毒B19感染的方法。该方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分离得到的细小病毒B19核酸与第一寡核苷酸反应，该第一寡核苷酸含有第一引物，该第一引物含有与所述RNA靶序列的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，其中，所述第一引物还含有一DNA依赖性RNA聚合酶5′的启动子，该启动子操作性连接于所述复合序列，所述反应在能形成寡核苷酸/靶序列复合物和启动DNA合成的条件下进行；(c)以所述RNA靶序列为模板，在延伸反应中使所述第一引物延伸，产生与所述RNA靶序列互补的第一DNA引物延伸产物；(d)用能选择性降解所述RNA靶序列的酶将所述第一DNA引物延伸产物从所述RNA靶序列中分离；(e)在形成寡核苷酸/靶序列复合物和启动DNA合成的条件下，用第二寡核苷酸处理所述DNA引物延伸产物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，该第二引物含有与所述DNA引物延伸产物的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列；(f)在DNA延伸反应中延伸所述第二引物的3′末端，产生第二DNA引物延伸产物，从而产生DNA依赖性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和能识别所述启动子序列的DNA依赖性RNA聚合酶产生所述靶序列的多个RNA拷贝；和(h)使用步骤(g)的RNA拷贝，自身催化性地重复步骤(b)到步骤(g)，以扩增所述靶序列。
在某些实施例中，该方法还包括
(i)在使探针与靶序列杂交形成探针靶标复合物的条件下，将一标记的寡核苷酸探针加到步骤(h)的产物中，其中，所述寡核苷酸探针与该靶序列的一部分互补；(j)检测标记物是否存在，作为靶序列存在与否的指示。
在另一实施例中，所述标记物是吖啶酯(acridinium ester)。
在又一实施例中，用于上述方法的第一、第二引物以及探针衍生自人细小病毒B19基因组的VP1区域，如衍生自图2A-2U或11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在另一实施例中，本发明涉及一种检测生物学样品中的人细小病毒B19感染的方法。该方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分离得到的细小病毒B19核酸与第一寡核苷酸反应，该第一寡核苷酸含有第一引物，该第一引物含有与所述RNA靶序列的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，其中，所述第一引物还含有一DNA依赖性RNA聚合酶5′的启动子，该启动子操作性连接于所述复合序列，所述第一引物含有衍生自图2A-2U或图11A-11Z任一所示的多核苷酸序列的序列，所述反应在能形成寡核苷酸/靶序列复合物形成和启动DNA合成的条件下进行；(c)以所述RNA靶序列为模板，在延伸反应中使所述第一引物延伸，产生与所述RNA靶序列互补的第一DNA引物延伸产物；(d)用能选择性降解所述RNA靶序列的酶将所述第一DNA引物延伸产物从所述RNA靶序列中分离；(e)在形成寡核苷酸/靶序列复合物和启动DNA合成的条件下，用第二寡核苷酸处理所述DNA引物延伸产物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，该第二引物含有与所述DNA引物延伸产物的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，其中，所述第二引物衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(f)在DNA延伸反应中延伸所述第二引物的3′末端，产生第二DNA引物延伸产物，从而产生DNA依赖性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和能识别所述启动子序列的DNA依赖性RNA聚合酶，产生所述靶序列的多个RNA拷贝；和(h)使用步骤(g)的RNA拷贝，自身催化性地重复步骤(b)到步骤(g)，以扩增所述靶序列。
(i)在使探针与靶序列杂交形成探针靶标复合物的条件下，将一吖啶酯标记的寡核苷酸探针加到步骤(h)的产物中，其中，所述寡核苷酸探针与该靶序列的一部分互补，所述探针衍生自图2A-2U中任一所示的多核苷酸序列；(j)检测标记物是否存在，作为靶序列存在与否的指示。
在又一实施例中，本发明涉及一种扩增靶细小病毒B19核苷酸序列的方法，该方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，该核酸含有RNA靶序列；(b)加入一种或多种能与所述RNA靶序列杂交的引物，其中，所述一种或多种引物衍生自图2A-2U和图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(c)加入相对于所述一种或多种引物而言能与所述RNA靶序列3′杂交的寡核苷酸探针；(d)用聚合酶延伸所述一种或多种引物。
在某些实施例中，步骤(a)的RNA靶序列被反转录，以提供cDNA。并且，该方法还可包括用聚合酶链式反应(RT-PCR)或不对称缺口连接酶链式反应(RT-AGLCR)扩增所述cDNA。在另一实施例中，所述聚合酶是热稳定性聚合酶，例如(但不限于)Taq聚合酶或Vent聚合酶。在其它实施例中，所述聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段或T4 DNA聚合酶。
在上述各方法的某些实施例中，提供了一种内部对照物。所述内部对照物可从图12的序列(SEQ ID NO92)获得。在其它实施例中，所述内部对照物含有SEQ IDNO90。
在其它实施例中，本发明涉及一种检测生物学样品中人细小B19感染的方法，所述方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，所述核酸含有靶序列；(b)使分离得到的人细小病毒B19核酸与可检测的标记探针反应，该探针与所述靶序列充分互补并能与之杂交，其中，所述探针衍生自图2A-2U和图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列，且该反应在形成探针/靶序列复合物的条件下进行；(c)检测标记物存在与否，作为靶序列存在与否的指示。
在又一实施例中，本发明涉及一种多核苷酸，它含有图2A-2U或图11A-11Z中所述的任一核苷酸序列。
在其它实施例中，本发明涉及一种如上所述的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列由图2A、2B、2C、2D、2E、2F、2G、2H、2I、2J、2K、2L、2M、2N、2O、2P、2Q、2R、2S、2T、2U、11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I、11J、11K、11L、11M、11N、11O、11P、11Q、11R、11S、11T、11U、11V、11W、11X、11Y或11Z中所述的核苷酸序列组成。
在又一实施例中，本发明涉及一种多核苷酸，它含有图3A-3C或4A-4C中所述的任一核苷酸序列。
在其它实施例中，本发明涉及一种如上所述的多核苷酸，其中，所述核苷酸序列由图3A-3C或图4A-4C中所述的序列组成。
在另一实施例中，本发明涉及一种寡核苷酸引物，它由被DNA依赖性RNA聚合酶识别的、操作性连接于人细小病毒B19特异性复合序列的启动子区域组成，长约10-75个核苷酸。在某些实施例中，该启动子区域是T7启动子，所述聚合酶是T7 RNA聚合酶。此外，人细小病毒B19特异性序列可衍生自人细小病毒B19基因组的VP1区域，如衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在又一实施例中，本发明涉及一种寡核苷酸引物，它由操作性连接于人细小病毒B19特异性复合序列的T7启动子组成，长约10-75个核苷酸。其中，所述人细小病毒B19特异性复合序列衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在另一实施例中，本发明涉及一种寡核苷酸探针，该探针含有连接于吖啶酯标记物的细小病毒B19特异性杂交序列，长约10-50个核苷酸。在某些实施例中，所述人细小病毒B19特异性杂交序列衍生自人细小病毒B19基因组的VP1区域，如衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
在又一实施例中，本发明涉及一种诊断试剂盒，它含有本文所述一种或多种寡核苷酸引物以及进行诊断试验的用法说明书。在某些实施例中，所述试剂盒还含有一寡核苷酸探针，该探针含有连接于吖啶酯标记物的细小病毒B19特异性杂交序列，其长度约为10-50个核苷酸。
在结合以下详细的描述以及附图之后，对本发明上述这些方面以及其它方面的内容将会更明了。
附图的简要说明图1是人细小病毒B19基因组图，它描述该病毒的各编码区域。其中描述了3个PCR片段，一个片段长约700bp，对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的细小病毒B19基因组的第2936-3635位核苷酸；一个片段长约370bp，它在该700bp片段之内，对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的细小病毒B19基因组的第3073-3442位核苷酸；还有一个片段长约214bp，对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的细小病毒B19基因组的第4728-4941位核苷酸。
图2A到2U(SEQ ID NO1-21)描述从各种细小病毒B19分离物获得的DNA序列，包括对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的细小病毒B19基因组的第2936-3635位核苷酸的序列(图1的700bp片段)。图2A(SEQ ID NO1)是从分离物CH47-26获得的相应序列；图2B(SEQ ID NO2)是从分离物CH48-29获得的相应序列；图2C(SEQ ID NO3)是从分离物CH33-2获得的相应序列；图2D(SEQ ID NO4)是从分离物CH33-3获得的相应序列；图2E(SEQ ID NO5)是从分离物CH33-4获得的相应序列；图2F(SEQ ID NO6)是从分离物CH42-7获得的相应序列；图2G(SEQ ID NO7)是从分离物CH42-18获得的相应序列；图2H(SEQID NO8)是从分离物CH42-19获得的相应序列；图2I(SEQ ID NO9)是从分离物CH46-23获得的相应序列；图2J(SEQ ID NO10)是从分离物CH1-1获得的相应序列；图2K(SEQ ID NO11)是从分离物CH1-6获得的相应序列；图2L(SEQ ID NO12)是从分离物CH2-8获得的相应序列；图2M(SEQ ID NO13)是从分离物CH2-10获得的相应序列；图2N(SEQ ID NO14)是从分离物CH2-11C获得的相应序列；图2O(SEQ ID NO15)是从分离物CH5-13获得的相应序列；图2P(SEQ ID NO16)是从分离物CH7-22获得的相应序列；图2Q(SEQ ID NO17)是从分离物CH13-27获得的相应序列；图2R(SEQ ID NO18)是从分离物CH14-33获得的相应序列；图2S(SEQ ID NO19)是从分离物CH62-2获得的相应序列；图2T(SEQ ID NO20)是从分离物CH64-2获得的相应序列；图2U(SEQ ID NO21)是从分离物CH67-2获得的相应序列。
图3A-3C(SEQ ID NO22)显示图1所示细小病毒B19克隆2-B1的大约4.7kbp的PCR片段的序列。该序列为长4677个核苷酸的片段，对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。该序列含有细小病毒B19全长开放读框和额外的5′和3′非翻译序列，该读框编码NS1、VP1和VP2。
图4A-4C(SEQ ID NO23)显示图1所示细小病毒B19克隆2-B1的大约4.7kbp的PCR片段的序列。该序列为长4677个核苷酸的片段，对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。该序列含有细小病毒B19全长开放读框和额外的5′和3′非翻译序列，该读框编码NS1、VP1和VP2。
图5A(SEQ ID NO24)和5B(SEQ ID NO25)分别显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的NS1核苷酸和蛋白质序列。
图6A(SEQ ID NO26)和6B(SEQ ID NO27)分别显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP1核苷酸和蛋白质序列。
图7A(SEQ ID NO28)和7B(SEQ ID NO29)分别显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP2核苷酸和蛋白质序列。
图8A(SEQ ID NO30)和8B(SEQ ID NO31)分别显示从细小病毒B19克隆2-B6获得的NS1核苷酸和蛋白质序列。
图9A(SEQ ID NO32)和9B(SEQ ID NO33)分别显示从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP1核苷酸和蛋白质序列。
图10A(SEQ ID NO34)和10B(SEQ ID NO35)分别显示从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP2核苷酸和蛋白质序列。
图11A到图11Z(SEQ ID NO62-87)描述从各种细小病毒B19分离物获得的DNA序列，包括对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的细小病毒B19基因组的第2936-3635位核苷酸的序列(图1的700bp片段)。图11A(SEQ IDNO62)是从分离物CH80-1获得的相应序列；图11B(SEQ ID NO63)是从分离物CH81-3获得的相应序列；图11C(SEQ ID NO64)是从分离物B19SCL1-4获得的相应序列；图11D(SEQ ID NO65)是从分离物B19SCL2-1获得的相应序列；图11E(SEQ ID NO66)是从分离物B19SCL3-1获得的相应序列；图11F(SEQ ID NO67)是从分离物B19SCL4-3获得的相应序列；图11G(SEQ ID NO68)是从分离物B19SCL5-2获得的相应序列；图11H(SEQ ID NO69)是从分离物B19SCL6-2获得的相应序列；图11I(SEQ ID NO70)是从分离物B19SCL7-3获得的相应序列；图11J(SEQ ID NO71)是从分离物B19SCL8-2获得的相应序列；图11K(SEQ ID NO72)是从分离物B19SCL9-1获得的相应序列；图11L(SEQ ID NO73)是从分离物B19SCL9-9获得的相应序列；图11M(SEQ ID NO74)是从分离物B19SCL10-2获得的相应序列；图11N(SEQ ID NO75)是从分离物B19SCL11-1获得的相应序列；图11O(SEQ ID NO76)是从分离物B19SCL12-1获得的相应序列；图11P(SEQ IDNO77)是从分离物B19SCL13-3获得的相应序列；图11Q(SEQ ID NO78)是从分离物B19SCL14-1获得的相应序列；图11R(SEQ ID NO79)是从分离物B19SCL15-3获得的相应序列；图11S(SEQ ID NO80)是从分离物B19SCL16-2获得的相应序列；图11T(SEQ ID NO81)是从分离物B19SCL17-1获得的相应序列；图11U(SEQID NO82)是从分离物B19SCL18-1获得的相应序列；图11V(SEQ ID NO83)是从分离物B19SCL19-1获得的相应序列；图11W(SEQ ID NO84)是从分离物B19SCL20-3获得的相应序列；图11X(SEQ ID NO85)是从分离物B19SCL21-3获得的相应序列；图11Y(SEQ ID NO86)是从分离物B19SCL22-11获得的相应序列；图11Z(SEQ ID NO87)是从分离物B19SCL2-14获得的相应序列。
图12(SEQ ID NO92)描述一示范性序列，从该序列可产生用于靶标俘获和扩增的内部对照物(IC)。
发明详述除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、重组DNA技术和病毒学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见，如《基础病毒学》(Fundamental Virology)，第二版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.最新版)；Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloninga LaboratoryManual)，第二版，1989；《酶学方法》(Methods in Engymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)〔N.Gait编辑，1984〕；《分子克隆实用指南》(A Practical Guide to MolecularCloning)(1984)。
必须注意的是，如本说明书中和权利要求书中使用的，单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数，除非该内容另有明确说明。因此，“一种抗原”包括两个或多个抗原的混合物等。
文中使用了下列氨基酸缩写丙氨酸Ala(A) 精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E) 甘氨酸Gly(G)组氨酸His(H) 异亮氨酸Ile(I)亮氨酸Leu(L) 赖氨酸Lys(K)甲硫氨酸Met(M)苯丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P) 丝氨酸Ser(S)苏氨酸Thr(T) 色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y) 缬氨酸Val(V)I.定义在本发明的描述中，使用了下列术语，并如下定义。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，并不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在该定义中。全长的蛋白质及其片段都包括在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，为了本发明的目的，“多肽”指包括天然序列的修饰的蛋白质，例如缺失、添加和取代(通常性质保守)，只要蛋白质保持了所需活性。这些修饰可以是精心设计的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主的突变，或由于PCR扩增引起的错误。
细小病毒B19多肽是一种如上所定义的多肽，它衍生自B19基因组编码的蛋白质，如衍生自非结构蛋白NS1和NS2以及形成病毒衣壳的蛋白VP1(长约781个氨基酸)或VP2(长约544个氨基酸)。代表性的NS1、VP1和VP2序列在图5-10中有所描述。该多肽不需要以物理的方式从细小病毒B19获得，但是可合成或重组产生。而且，该多肽可衍生自各种细小病毒B19株和分离物。在这些病毒株和分离物之间有一些保守区和可变区是已知的，并且，通常，衍生自这些区域的各表位的氨基酸序列将具有高度的序列同源性，例如，当对两条序列进行排列对比时，氨基酸序列具有30％以上的同源性，较佳40％以上。因而，例如，术语“VP1”多肽指各种细小病毒B19株和分离物的天然VP1。许多细小病毒B19株和分离物的上述蛋白质的完整基因型和序列也是已知的。可参见Shade等，J.Virol.(1986)，58921-936；Gallinella等，J.Virol.Methods(1993)，41203-211。此外，这些区域的细小病毒B19的表位也是已知的。例如，可参见美国专利5436127；和国际出版物WO 91/12269。
术语“类似物”和“突变蛋白”指参照分子的生物活性衍生物，或这些衍生物的保留所需活性(如在诊断检测中具有免疫反应性)的片段。通常，术语“类似物”指具有天然多肽的序列和结构、并与天然分子相比具有一个或多个氨基酸添加、取代(通常性质保守)和/或缺失(只要这种修饰不破坏免疫活性)的化合物。术语“突变蛋白”指具有一种或多种肽模拟物(“类肽”)的肽，如国际出版物WO91/04282中所述。优选此种类似物或突变蛋白至少具有与天然分子相同的免疫活性。制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的，以下将进一步描述。
特别优选的类似物包括保守性取代，即这些取代发生在与它们的侧链有关的一类氨基酸中。具体而言，氨基酸一般被分成四类(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷极性—一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸对氨基酸进行类似的保守性取代，将不会其对生物活性有重要影响。例如，感兴趣的多肽可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸取代，甚至多达约15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数的取代，只要该分子的所需功能仍保持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，不难确定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。
当用于多肽时，“分离的”指所修饰的分子与它天然存在于其中的整个生物体相分离和分开，或者基本上不存在同一生物体的其它生物大分子。“分离的”多核苷酸指全部或部分没有通常在天然条件下与其结合的序列的核酸分子；或者指一种以其天然形式存在但与异源序列结合的序列；或者指从染色体脱离下来的分子。
“衍生自”或“特异于”一指定序列的多核苷酸，指含有对应于(即与之相同或互补)所指定核苷酸序列某区域一段连续序列的多核苷酸序列，该连续序列长至少约6个核苷酸、较佳至少约8个核苷酸、更佳至少约10-12个核苷酸、还更佳至少约15-20个核苷酸。该衍生的多核苷酸并不一定衍生自感兴趣的核苷酸序列物理，它可以任何方式产生，包括但不限于化学合成、复制、反转录或转录，这取决于衍生获得该多核苷酸的区域的碱基序列所提供的信息。同样地，它可以是原始多核苷酸的有义取向或反义取向。
“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分之间的相似性百分数。两条DNA或两条多肽序列在确定的分子长度内，当序列显示有至少约50％，优选至少约75％、更佳至少约80-85％、尤其佳至少约90％、最佳至少约95-98％序列相似性时，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指与特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。
通常，“同一性”指两条多核苷酸或多肽序列上核苷酸和核苷酸或者氨基酸和氨基酸准确相对应。通过排列其序列，可比较两个分子之间的序列信息，计算两条对比序列之间匹配的准确数量，将其除以最短序列的长度，然后乘以100，即可测定同一性百分数。
使用易于获得的计算机程序可有助于同源性和同一性分析，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas of Protein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5 Suppl.，3353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它采用了Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(Advances in Appl.Math.，2482-489，1981)。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，从GeneticsComputer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。采用制造者建议的和参照Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性百分数。
本发明建立同源性百分数的另一方法是采用版权属于爱丁堡大学、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH程序包。可采用这套程序包中的Smith-Waterman算法，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分＝12，间隔延伸罚分＝1，间隔＝6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列同源性”。计算序列间的同一性百分数或相似性百分数的其它合适的程序通常在本领域中是已知的，例如，另一种排列对比程序是BLAST，也使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP基因编码＝标准；过滤＝无；链＝两；截留＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝HIGH SCORE；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。在http//www.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上可查到这些程序的详细描述。
或者，在同源区域之间形成稳定的双链体条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化片段的大小，从而测出同源性。在如(为具体的系统所定义的)严格条件下进行的Southern杂交实验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
“操作性连接”指元件的排列，其中所述组分被排成一定的构形而执行它们所需的功能。因而，给定的操作性连接于核酸序列的启动子能影响转录，对于编码序列而言，当存在适当的转录因子等时，该启动子能使该编码序列表达。该启动子不需要与该编码序列邻接，只要它能指导该序列转录和/或表达即可。因此，例如，与转录的内含子一样，不参与翻译但转录的序列可存在于启动子序列和编码序列之间；并且仍可认为该启动子序列“操作性连接”于该编码序列。
本文的用于描述核酸分子的“重组子”指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作的缘故，该多核苷酸与与其天然相关的多核苷酸完全或部分不相关。用于蛋白质或多肽的术语“重组子”指通过重组多核苷酸表达产生的多肽。通常，克隆感兴趣的基因，然后在转化的生物体中表达(如下所述)。宿主生物体在表达条件下表达外源基因，从而产生该蛋白。
“控制元件”指帮助与其连接的核苷酸序列转录和/或反义的多核苷酸序列。该术语包括启动子、转录终止序列、上游调节结构域、聚腺苷酸化信号、非翻译区域(包括5′-UTR和3′-UTR)，适当时还有前导序列和增强子，这些序列共同提供了编码序列在宿主细胞中的转录和翻译。
“启动子”在本文中指能结合聚合酶并启动与之操作性连接的下游(3′方向)核苷酸序列转录的调节区域。用于本发明的启动子序列包括以高于背景值的可检测水平启动感兴趣基因的转录所必需的最小数量的碱基或元件。在该启动子序列中有转录启始位点以及负责RNA或DNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。例如，启动子可以是被DNA依赖性RNA聚合酶(转录酶)识别在特定位点与核酸结合并开始RNA转录的核酸序列。为了结合，这种转录酶通常需要在含有启动子序列及其互补序列的部分中为双链的DNA，模板部分(将被转录的部分)不需要是双链的。各种DNA依赖性RNA聚合酶可识别各种不同的启动子序列，它们在促进转录方面的效率可能明显不同。当RNA聚合酶与启动子序列结合以启动转录时，该启动子序列并是被转录的序列的一部分。因而，由此产生的RNA转录产物将不包括该序列。
当RNA或DNA聚合酶与启动子序列结合并转录毗邻的序列时，控制序列指导核苷酸序列转录。
“DNA依赖性DNA聚合酶”是一种能从DNA模板合成互补性DNA拷贝的酶。例子大肠杆菌的DNA聚合酶I和噬菌体T7 DNA聚合酶。所有已知的DNA依赖性DNA聚合酶需要互补的引物，以启动合成。在适当的条件下，DNA依赖性DNA聚合酶可从RNA模板合成互补性DNA拷贝。
“DNA依赖性RNA聚合酶”或“转录酶”是能从具有(通常为双链的)启动子序列的双链或部分双链的DNA分子合成多个RNA拷贝的酶。RNA分子(“转录子”)是以5′到3′方向合成，合成开始于紧靠启动子下游的特定位置。转录酶的例子是大肠杆菌的DNA依赖性RNA聚合酶和噬菌体的T7、T3和SP6。
“RNA依赖性DNA聚合酶”或“反转录酶”是从RNA模板合成互补性DNA拷贝的酶。所有已知的反转录酶还具有从DNA模板制得互补性DNA拷贝的能力。因而，它们是RNA依赖性和DNA依赖性的DNA聚合酶。用RNA模板和DNA模板启动合成都需要启动子。
“RNA酶H”是降解RNA:DNA复合物的RNA部分的酶。这些酶可以是内切核酸酶或外切核酸酶。大多数反转录酶除了具有它们的聚合酶活性外，通常还具有RNA酶H活性。但是，其它来源的RNA酶H并没有相关的聚合酶活性。降解可导致RNA从RNA:DNA复合物中分离。或者，RNA酶H可简单地在不同位置上将RNA切断，将RNA的这些部分解链，或使酶能解旋该RNA的这些部分。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中包括任何长度的核苷酸聚合形式，不论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。此术语仅仅指分子的结构。因而，此术语包括三链、双链和单链DNA以及三链、双链和单链RNA。它还包括修饰，如甲基化和/或加帽修饰，以及多核苷酸的未修饰形式。更具体而言，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其它类型的多核苷酸，含有非核苷酸骨架〔如多胺(如肽核酸(PNA)和聚吗啉聚合物(商业上可从Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，asNeugene获得)〕的其它聚合物，以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是这些聚合物含有核酸碱基(nucleobase)，它们的碱基配对和碱基堆积构型(如在DNA和RNA中所看到的那样)。并没有试图地区别“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间的长度，这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因而，这些术语包括，例如3′-脱氧-2′，5′-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3′P5′氨基磷酸酯、2′-O-烷基-取代的RNA、双链和单链DNA，以及双链和单链RNA、DNA:RNA杂交物、PNA与DNA或RNA之间的杂交物。这些术语还包括已知类型的修饰，如本领域已知的标记物；甲基化；“加帽”；一个或多个天然核苷酸被类似物的取代；以及核苷酸之间的修饰，如不带电的连接(如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电的连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、带正电的连接(如氨烷基氨基磷酸酯、氨烷基磷酸三酯)；含有侧链部分的分子，如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等)；具有嵌入剂如吖啶、补骨脂素等的分子，；含有螯合剂如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等的分子；含有烷基化剂的分子；具有修饰的连接(如α端基异构的核酸等)的分子；以及多核苷酸或寡核苷酸的非修饰形式。尤其是，DNA是脱氧核糖核酸。
在本文中，术语“靶核酸区域”或“靶核酸”指具有被扩增“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是单链或双链形式，可包括除了靶序列之外的其它不被扩增的序列。术语“靶序列”指靶核酸的将被扩增的具体核苷酸序列。靶序列可包括含于靶分子中的探针杂交区域，在所需条件下探针将与此区域形成稳定的杂交物。“靶序列”还可包括寡核苷酸引物能与之复合、且以该靶序列为模板而被延伸的复合序列。当靶核酸一开始就是单链时，术语“靶序列”还指与存在于靶核酸中的“靶序列”互补的序列。如果“靶核酸”最初是双链，则术语“靶序列”包括正链和负链。
术语“引物”或“寡核苷酸引物”在本文中指当被放置在诱导引物延伸产物合成的条件下(即在核苷酸和诱导聚合反应的制剂如DNA或RNA聚合酶的存在下，以及在适当的温度、pH、金属浓度和盐浓度的条件下)启动互补性DNA链的合成的寡核苷酸。引物较佳是单链的，以获得最大的扩增效率，但也可是是双链的。如果是双链，首先处理该引物，以在用其制备延伸产物之前将其链分离。这一变性步骤通常通过加热实现，但也可使用碱处理，接着进行中和。因此，“引物”与模板互补，并通过氢键或杂交作用与模板复合，形成引物/模板复合物，以启动由聚合酶执行的合成。在DNA合成方法中，通过在其与模板互补的3′端加入共价联接的碱基，从而使得该引物得以延伸。
在本文中，术语“探针”或“寡核苷酸探针”指含有如上所述多核苷酸的结构，该多核苷酸含有与靶核酸分析物中存在的核酸序列互补的核酸序列。探针的多核苷酸区域可由DNA和/或RNA和/或合成的核苷酸类似物组成。当在5′核酶试验(如TaqManTM技术)中使用“寡核苷酸探针”时，该探针将含有至少一种荧光剂和至少一种猝灭剂。为了检测任何扩增的靶寡核苷酸序列，该探针将由反应中使用的聚合酶的5′内切核酸酶活性所消化。在本文中，寡核苷酸探针在毗邻其5′端将具有足量的磷酸二酯键，这样所使用的5′到3′核酶活性可有效地降解所结合的探针，以将荧光剂和猝灭剂分离。当在TMA技术中使用寡核苷酸探针时，探针将如下位所述被适当标记。
易于理解，杂交序列并不需要具有优异的互补性，以提供稳定的杂交物。在许多情况下，当少于约10％的碱基错配时，将形成稳定的杂交物，而4个或多个核苷酸的成环可忽略不计。因此，在本文中，“互补”指在试验条件下寡核苷酸与其互补物(通常有约90％或更高的同源性)形成稳定的双倍体。
术语“杂交”指充分互补的核酸序列之间通过Watson-Crick碱基配对形成复合物。当引物与靶标(模板)“杂交”时，这些复合物(或杂交物)足够稳定，以起到如DNA聚合酶启动DNA合成所需的引导作用。
在本文中，术语“结合对”指相互间特异性结合的第一分子和第二分子，如能形成核酸双链体的互补多核苷酸对。通过样品中结合对的第一成员与第二成员(或者第二成员与第一成员)以比其它组分更高的亲和力和特异性相结合，可以证明该样品中该结合对的第一成员与其第二成员之间的“特异性结合”。结合对的各成员之间的结合通常是非共价的。除非本文另有明确指出，否则术语“亲和分子”和“靶分析物”在本文中分别指结合对的第一成员和第二成员。
术语“特异性结合分子”和“亲和分子”在本文中可互换使用，指能通过化学或物理方法选择性地与样品中存在的可检测物质结合的分子。“选择性结合”指分子优选与感兴趣的靶标结合，或者以大于与其它分子结合时的亲和力与靶标结合。例如，DNA分子将基本上与互补的序列结合，而不与无关的序列结合。
双链DNA的“解链温度”或“Tm”指双链DNA由于加热或碱基对之间的氢键断裂(如通过酸处理或碱处理等等)而有一半的螺旋结构丢失时的温度。DNA分子的Tm取决于其长度和碱基组成。富含GC碱基对的DNA分子，其Tm高于富含AT碱基对的DNA分子。当温度低于其Tm时，DNA的分离的互补链自发地重新结合或退火形成双链DNA。核酸杂交的最高速率出现在约25℃(低于Tm)。可使用下述关系估算TmTm＝69.3+0.41(GC)％(Marmur等，1962，J.Mol.Biol.，5109-118)。
在本文中，“生物学样品”指分离得到的受检者的组织和液体样品，通常包括该受检者产生的抗体。包括这种抗体的典型样品在本领域中是已知的，包括但不限于血液，血浆，血清，粪便排泄物，尿，骨髓，胆汁，脊髓液，淋巴液，皮肤样品，皮肤、呼吸道、肠和泌尿生殖道的分泌物，眼泪，唾液，乳，血细胞，器官，活检组织，以及体外细胞培养组成物的样品，包括但不限于用培养基培养的细胞或组织产生的条件培养基(conditioned media)，如重组细胞和细胞成分。
术语“标记物”和“可检测的标记物”在本文中指能被检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、辅酶、酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶液、配体(如生物素、亲和素、链霉亲和素或半抗原)等等。术语“荧光剂”指能显示可检测范围内的荧光的物质或其部分。
II.实施本发明的方式在详细描述本发明之前，应理解本发明并非局限于特定的制剂或加工参数，显然，它们是可以变化的。还应理解本文所用的术语仅用于说明本发明的具体实施例，而并非对其限制。
虽然与本文所述类似或相等的许多组合物和方法可用于实施本发明，但本文描述的是优选的材料和方法。
如上所述，本发明的基础是发现了用于准确检测生物学样品中细小病毒B19感染的新颖引物和探针以及诊断方法。这些方法依赖于以核酸为基础的灵敏检测技术，这些检测技术使得含有少量病毒的样品中的细小病毒B19靶核酸序列得以鉴别。
具体而言，本发明者在本文中特征分析了细小病毒B19基因组中作为诊断试验靶标的诸区域。从这些区域衍生得到的引物和探针对于生物学样品中细小病毒B19感染的检测非常有用。
上述细小病毒B19引物和探针可用在核酸中，用于检测生物学样品中人细小病毒B19感染。具体而言，这些试验中使用的引物和探针较佳衍生自细小病毒B19基因组的长约4.7kb的片段，该片段对应于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的第217-4678位核苷酸。本文的图3A-3C和图4A-4C描述了从两个不同的细小病毒B19分离物获得的此区域的核苷酸序列。如上述，此片段含有NS1、VP1和VP2编码区域。
用于本发明试验的特别优选的引物和探针是根据细小病毒B19基因组的高度保守区设计的，以使得可对各种分离物引起的细小病毒B19感染进行检测。如本文所述，发现细小病毒B19基因组的高度保守区位于跨越第2936-3635位核苷酸〔相对于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的细小病毒B19基因组的编号〕的区域中(700bp)。这个区域在该基因组的VP1区域内。图2A-2U显示了从21种不同的细小病毒B19分离物获得的此区域的序列。本文图11A-11Z显示了从其它26种分离物获得的序列。序列比较显示，各分离物的此区域具有约98-99.5％的序列同源性，使得该区域是个非常理想的靶序列。在引物和探针的设计中也能满足要求的是在VP1中发现的370bp区域以及图1所述的214bp片段，前一区域跨越第3073-3442位核苷酸〔相对于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)的序列编号〕，后一片段出现在所述4.7kb片段的3′部分，跨越第4728-4941位核苷酸〔相对于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)的序列编号〕。
使用在这些特殊区域中发现的细小病毒B19序列的部分作为PCR反应引物，如本文以及美国专利4683195、4683202和4889818所述，以及根据本文所提供的序列，不难获得其它分离物的4.7kb、700bp和370bp区域。获得具有所需的序列的核苷酸序列的另一方法是，在常规自动化多核苷酸合成仪中产生重叠合成寡核苷酸的退火性互补组，接着用适当的DNA连接酶连接，并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。可参见，如Jayaraman等(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，884084-4088。一旦制得或分离到序列，可将它们克隆到任何合适的载体或复制子中。本领域熟练的技术人员已知道许多克隆载体，而选择适当的克隆载体则成了问题。合适的载体包括但不限于在与适当的控制元件结合时能进行复制的质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或病毒。采用本领域已知的技术以及下文实施例所述的技术，通过限制酶分析和聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳不难鉴别出重组的克隆。
用于本文试验的引物和探针衍生自这些序列，并不难用标准技术合成，如通过亚磷酰胺化学物质进行的固相合成，如美国专利4458066和4415732、Beaucage等(1992，Tetrahedron，482223-2311)和第13号《应用生物学系统用户公告》(AppliedBiosystems User Bulletin，1987年4月1日)所述。其它化学合成方法包括，例如Narang等(Meth.Enzymol.，1979，6890)所述的磷酸三酯法，和Brown等(Meth.Enzymol.，1979，68109)所述的磷酸二酯法，或可采用这些相同的方法将聚(A)或聚(C)或者其它非互补核苷酸延伸物掺入探针中。可采用本领域已知的方法使六乙基氧(hexaethylene oxide)延伸物与探针偶联。Cload等，1991，J.Am.Chem.Soc.，113，6324-6326；Levenson等的美国专利4914210；Durand等，1990，Nucleic AcidRes.，186353-6359；和Horn等，1986，Tet.Lett.，274705-4708。通常，引物序列的长度在10-75个核苷酸的范围内，如15-60，20-40等，更通常是在18-40个核苷酸的长度范围内，以及为所述范围内的任何长度。典型的探针长度在10-50个核苷酸范围内，如15-40、18-30等，和其长度可为所述范围内的任何长度。
此外，探针可与用于检测的标记物偶联。有几种已知的方法可用于衍生具有反应性官能团、且允许加入标记物的寡核苷酸。例如，可采用几种方法使探针生物素化，这样，可通过亲和素结合放射性、荧光性、化学发光性、酶或者电子致密的标记物。例如，可参见Broken等，Nucl.Acids.Res.，1978，5363-384，此文献公开了铁蛋白-亲和素-生物素标记物的使用；Chollet等，Nucl.Acids Res.，1985，131529-1541，此文献公开了通过氨烷基磷酰胺连接臂使寡核苷酸的5′端生物素化。也有几种方法可用于合成氨基衍生的寡核苷酸，这类寡核苷酸易于被荧光性的或衍生有氨基反应性基团的其它类型的化合物(如异硫氰酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺等)标记。例如，可参见Connolly，1987，Nucl.Acids Res.，153131-3139；Gibson等，1987，Nucl.Acids Res.，156455-6467；和Miyoshi等美国专利4605735。也有合成巯基衍生的寡核苷酸的方法，这类寡核苷酸可与硫醇特异性标记物反应。例如，可参见Fung等的美国专利4757141；Connolly等，1985，Nucl.Acids.Res.，134485-4502和Spoat等，1987，Nucl.Acids Res.，154837-4848。Matthews等(Anal.Biochem.，1988，1691-25)提供了标记DNA片段方法学的全面综述。
例如，可通过将荧光分子连于探针的非连接末端，从而使探针被荧光标记。选择适当的荧光标记物的指南可参见Smith等，Meth.Enzymol.，1987，155260-301；Karger等，Nucl.Acids Res.，1991，194955-4962；Haugland，1989，《荧光探针和研究化学手册》(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals)(Molecular Probes.Inc.，Eugene，OR)。优选的荧光标记物包括荧光素及其衍生物〔如美国专利4318846和Lee等(Cytometry，1989，10151-164)所述〕、6-FAM、JOE、TAMRY、ROX、HEX-1、HEX-2、ZOE、TET-1或NAN-2等。
此外，可采用以下所述的技术用吖啶酯(AE)标记探针。目前的技术允许将AE标记物置于探针内的任何位置上。例如，可参见Nelson等(1995)，《用化学发光剂检测吖啶酯》(Nonisotopic Probing，Blotting and Sequenceing，Krica L.J.(编)，Academic Press，San Diego，CA；Nelson等(1994)，《杂交保护检测(HPA)在PCR中的应用》(The Polymerase Chain Reaction，Mullis等(编)，Birkhauser，Boston，MA)；Weeks等，Clin.Chem.(1983)，291474-1479；Berry等，Clin.Chem.(1988)，342087-2090。可采用非核苷酸连接臂化学物直接将AE分子连接到探针上，该化学物允许将标记物置于探针内的任何位置上。例如，可参见美国专利5585481和5185439。
某些实施例加入了内部对照物(IC)或内部标准物，将其作为靶标俘获和扩增的对照。较佳的是，IC包含与靶序列不同的序列，能与用于分离样品中的生物体特异性寡核苷酸的探针序列杂交，并能扩增。IC的使用得以控制分离过程、控制过程以及检测系统，并得以监控试验的性能和定量测试样品。从中可获得IC的代表性序列显示在图12中。IC可以包含在任何合适的位点，例如，在裂解缓冲液中。在一个实施例中，IC包含M13 ssDNA，该DNA含有从细小病毒B19获得的核苷酸序列和与探针杂交的独特序列，例如，含有从VP1区域获得的序列，其中，靶序列通过取代或删除5-20个或更多个碱基(较佳是5-15个碱基，例如5，10或15个，或这些范围之内的任意数量的碱基)而被修饰。被取代或删除的碱基较佳位于在靶序列的整个长度范围内，这样仅有2条或3条连续的序列被替换。因而，例如，如果靶序列是CTACTTGCTGCGGGAGAAAAACACCT(SEQ ID NO91)，则在IC中该序列可以被取代成如AGCTAGACCTGCATGTCACTG(SEQ IDNO90)。
固相载体可另外包括对该内部标准物(IC探针)特异的探针，从而当使用该IC探针有利于捕获。IC探针可任选地与不同于用于靶序列的可检测标记物的可检测标记物偶联。在可检测标记物是荧光团的实施例中，可通过分光光度分析和检测研究所设界限来定量测定IC。通常，通过用靶标的固定IU进行滴定(较佳是在较低端)，可确定不干扰靶标检测的IC拷贝数，并通过稀释国际上接受的IU的样品产生标准曲线。对于细小病毒B19的定量测定，可采用8000-125IU的八元组(eightmember panel)。
在另一实施例中，如本文所述，采用本文所述本领域技术人员已知的标准技术使IC与从样品中分离的RNA混合。然后用反转录酶反转录该RNA，以提供DNA拷贝。可任选地用标记的引物扩增cDNA序列(如采用PCR)。通常采用电泳的方法分离扩增引物。测定放射活性的量(与扩增产物的量成正比)。然后与已知标准品产生的信号相比计算出样品中的mRNA量。
上述引物和探针可用于聚合酶链式反应(PCR)技术中，用于检测生物学样品中的细小病毒B19感染。PCR是一种用于扩增核酸分子或分子混合物中所含的所需靶核酸序列的技术。在PCR中，使用一对过量的引物与靶核酸的互补链杂交。聚合酶用该靶核酸为模板，分别延伸引物。延伸产物从起初的靶链上解离下来后自身变成靶序列。然后使新的引物杂交，并用聚合酶进行延伸。重复该循环，以使靶序列分子的数量成几何级数增加。用于扩增样品中靶核酸序列的PCR方法在本领域中是周知的，并在以下文献中描述如，Innis等(编)，PCR Protocols(AcademicPress，NY 1990)；Taylor(1991)，《聚合酶链式反应基本原理和自动化》(PCRA Practical Approach，McPherson等(编)，IRL出版社，牛津)；Saiki等(1986)，Nature，324163；以及美国专利4683195、4683202和4889818。
具体而言，PCR使用相对短的寡核苷酸引物，该引物侧接待扩增的靶核苷酸序列，引物的3′端是面对面取向，各引物向对方延伸。抽提得到多核苷酸样品，将其变性(较佳采用热处理)，然后使其与过量的第一和第二引物(以摩尔计)杂交。使用引物和模板依赖性多核苷酸聚合试剂或模板依赖性多核苷酸聚合试剂〔如能产生引物延伸产物的酶，如大肠杆菌DNA聚合酶I，DNA聚合酶I的Klenow片段，T4 DNA聚合酶，从栖热水生菌(Thermus aquaticus，Taq，可从各来源获得，如Perkin Elmer)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus，United States Biochemicals)、Bacillus stereothermophilus(Bio-Rad)或Thermococcus litoralis(“Vent”聚合酶，NewEngland Biolabs)分离得到的热稳定性DNA聚合酶〕，在4种脱氧核苷三磷酸(dNTP——dATP、dGTP、dCTP和dTTP)的存在下催化聚合作用。这将产生两种“长产物”，在它们的5′末端含有共价连接于新合成的原始链的互补链的各自引物。然后将反应混合物返回到聚合条件，即，降低温度、灭活变性剂，或者加入更多的聚合酶，从而启动另一轮循环。第二轮循环提供两条原始链、第1轮的两条长产物、从原始链复制得到的两条新的长产物，以及从所述长产物复制得到的两条“短产物”。此短产物具有靶序列的序列，在其各端有引物。在每增加一轮循环中，产生另外两条长产物，短产物的数量等于前轮结束时留下的长产物和短产物的数量。因而，含有靶序列的短产物的量在每一轮中呈指数增长。较佳的是，用商业上可获得的热循环仪如Perkin Elmer进行。
可通过将mRNA反转录成cDNA，然后如上述进行PCR(RT-PCR)，从而扩增RNA。或者，如美国专利5322770所述，在两个步骤中都使用单一的酶。也可将mRNA反转录成cDNA，接着如Marshall等(1994，PCR Meth.App.，480-84)所述进行不对称缺口连接酶链式反应(RT-AGLCR)。
荧光性5′核酶试验，又称为TaqManTM试验(Perkin-Elmer)是一种用于核酸靶标的强大和通用的PCR检测系统。因此，从本文所述细小病毒B19基因组衍生得到的引物和探针可用于TaqManTM分析中，用于检测生物学样品中存在的感染。结合热循环，通过监测荧光信号的产生进行分析。该试验系统省去凝胶电泳分析，并能产生定量数据，从而可测定靶标的拷贝数。
可使用如具有内源性5′核酶活性的AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶方便地进行此荧光性5′核酶试验，将内源性5′核酸酶能消化标记了荧光报道染料和猝灭剂的内部寡核苷酸探针〔参见，Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)，887276-7280；和Lee等，Nucl.Acids Res.(1993)，213761-3766)。通过测量扩增循环中荧光产生的变化(随着荧光探针被消化、染料和猝灭剂标记物被释放并引起与靶DNA的扩增成正比例的荧光信号的增加)，可检测试验结果。
可检测溶液中扩增产物，或者使用固相载体。在此方法中，需设计能与所需的PCR产物内的靶序列杂交的TaqManTM探针。该TaqManTM探针的5′端含有荧光报道染料。该探针的3′端被封闭，以防止探针延伸，并且该3′端含有将使5′荧光团的荧光猝灭的染料。在随后的扩增过程中，如果在反应中存在具有5′核酸外切酶活性的聚合酶，该5′荧光标记物将被切下。5′荧光团的切除导致荧光增加，这可被检测到。
具体而言，构建寡核苷酸探针，使其在未杂交时以至少单链的构型存在，其中猝灭剂分子离该报道分子足够近，以猝灭报道分子产生的荧光。当与靶多核苷酸杂交时，寡核苷酸探针还具有至少一种构型，即猝灭剂分子不位于离报道分子足够近的地方，以不让其猝灭报道分子产生的荧光。通过采用这些杂交和非杂交构型，当探针处于杂交和非杂交状态时，它上面的报道分子和猝灭剂分子显示不同的荧光信号强度。结果，可根据报道分子、猝灭剂分子或者它们的组合所产生的荧光强度的变化，测定探针是否杂交或未杂交。此外，因为可将探针设计成当它未杂交时猝灭剂分子将猝灭报道分子，所以也可将探针设计成除非它被杂交或被消化否则报道分子显示有限的荧光的形式。
因此，本发明涉及使用具有5′到3′核酶活性的核酸聚合酶、一种或多种能杂交到该靶B19序列上的引物、以及相对于所述引物能与该靶B19序列杂交的3端的探针扩增靶细小病毒B19核苷酸序列的方法。在扩增过程中，当寡核苷酸探针与靶序列杂交时，聚合酶将其消化，从而使报道分子与猝灭剂分子分离。随着扩增的进行，监测报道分子的荧光，这些荧光对应于所发生的核酸扩增。报道分子较佳是荧光染料，猝灭剂分子较佳是若丹明染料。
虽然可改变引物和探针的长度，但是可选择探针序列，以使它们的解链温度低于引物序列的解链温度。因此，引物序列通常长于探针序列。通常，引物序列长约10-75个核苷酸，更通常在20-45个核苷酸范围内。通常的探针长度在10-50个核苷酸范围内，更通常在15-40个核苷酸范围内。
如果使用了固相载体，可以各种方法将寡核苷酸探针连接到固相载体上。例如，可通过使探针的3′端或5′端核苷酸与固相载体结合，从而使探针结合于固相载体上。更佳的是，通过使探针与固相载体远离的连接物将探针连接到固相载体上。通常，连接物长至少15-30个原子，更佳在至少15-50个原子的长度范围内。所需的连接物长度将取决于具体使用的固相载体。例如，当使用高度交联的聚苯乙烯作为固相载体时，6原子的连接物通常已足够。
本领域已知各种各样的连接物，它们可用于将寡核苷酸探针连接到固相载体上。连接物可由各种不显著干扰靶序列与连接于固相载体上的探针杂交的化合物形成。连接物可以由均聚寡核苷酸形成，可通过自动合成将所述寡核苷酸容易地加到连接物上。或者，可使用聚合物如功能化的聚乙二醇作为连接物。这类聚合物比均聚的寡核苷酸优选，因为它们不明显干扰探针与靶寡核苷酸的杂交。特别优选的是聚乙二醇。
较佳的是，在碱性以及高温条件下除去碱基保护基团的过程中，固相载体、连接物以及探针之间的连接键不被断裂。优选的连接键的例子包括氨基甲酸酯键和酰胺键。
用于固定寡核苷酸探针的固相载体的优选类型，包括可控制孔玻璃(poreglass)、玻璃板、聚苯乙烯、亲和素包被的聚苯乙烯珠、纤维素、尼龙、丙烯酰胺凝胶和活化的葡聚糖。
关于TaqManTM试验、试剂以及其所用条件的详细描述，可参见如Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，887276-7280；美国专利5538848、5723591和5876930。
也可将本文所述的细小病毒B19序列用作转录介导控制(TMA)试验的基础。TMA提供了一种鉴别生物学样品中存在的极少量靶核酸序列的方法。这些序列可以是采用直接的检测方法难以或不可能检测到的。具体而言，TMA是一种等温的、自动催化的靶核酸扩增系统，它可提供靶序列的10亿以上的RNA拷贝。可定性地进行该检测，以准确检测生物学样品中靶序列的存在与否。该检测还可提供定量的测量，用于测量超过几个数量级的浓度范围内靶序列的量。TMA提供一种自动催化合成多个靶核酸拷贝而不需对反应条件(如温度、离子强度和pH)进行重复操作的方法。
通常，TMA包括以下步骤(a)从怀疑被细小病毒B19感染的感兴趣的生物学样品中分离出核酸，包括RNA；(b)将其混合入反应混合物中，该混合物含有(i)所述分离的核酸，(ii)第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，该第一引物具有与RNA靶序列(如果存在，比如正链)的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，该第二引物具有与RNA靶序列的互补序列(如果存在，比如负链)的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，其中，所述第一寡核苷酸还含有一相对于该复合序列的5′序列，它含有一启动子，(iii)反转录酶或RNA和DNA依赖性DNA聚合酶，(iv)能选制性降解RNA-DNA复合物的RNA链的酶(如RNA酶H)和(v)能识别该启动子的RNA聚合酶。
可将该反应混合物的各组分逐步混合，或者一次性混合。在形成寡核苷酸/靶序列，包括DNA延伸和核酸合成条件(包括核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸)的条件下培育该反应混合物一段时间，使其足以产生多个靶序列拷贝。有利的是，该反应在适合于维持反应组分(如组成的酶)的稳定性而不需要改动或操作扩增反应时的反应条件的情况下进行。因此，该反应可在热基本上稳定、和离子强度和pH基本上恒定的条件下进行。该反应常规上不需要变性步骤来将第一DNA延伸反应所产生的RNA-DNA复合物分离。
合适的DNA聚合酶包括反转录酶，如鸟成髓细胞增多症病毒(AMV)的反转录酶(可从如Seikagaku America，Inc.获得)和莫洛尼鼠类白血病病毒(MMLV)反转录酶(可从如Bethesda Research Laboratories获得)。
适合掺入引物中的启动子或启动子序列是RNA聚合酶特异性识别的核酸序列(天然的、合成产生的或者是限制性消化的产物)，该聚合酶能识别并结合于该序列并启动转录过程，从而产生RNA转录物。该序列可任选地包含延伸到RNA聚合酶实际识别位点以外的核苷酸碱基，这些碱基可能赋予对降解过程的额外的稳定性或易感性，或者赋予增加的转录效率。有用的启动子例子包括被某些噬菌体聚合酶(如从噬菌体T3、T7或SP6获得的聚合酶)识别的启动子，或者从大肠杆菌获得的启动子。这些RNA聚合酶可容易地从商业来源获得，如从New EnglandBiolabs和Epicentre获得。
适用于本文所述方法的一些反转录酶具有RNA酶H活性，如AMV反转录酶。但是，即使当使用AMV反转录酶时，仍可以优选地加入RNA酶H，如大肠杆菌RNA酶H。可从Bethesda Research Laboratories容易地获得RNA酶H。
这些方法产生的RNA转录子均可作为模板，通过上述机制产生靶序列的额外拷贝。该系统是自身催化系统，且自身催化地进行扩增，不需要重复修改或改变反应的条件，如温度、pH、离子强度等。
可采用各种方法进行检测，包括直接测序、与序列特异性寡聚物杂交、凝胶电泳和质谱。这些方法可利用异源的或同源的格式、同位素或非同位素标记物以及根本不用标记物。
一种优选的检测方法是使用靶序列特异性寡核苷酸探针，该探针衍生自上述4.7kbp、700bp、340bp和214bp片段。该探针可用于杂交保护试验(HPA)，在一个实施例中，可方便地用吖啶酯(AE，一种高化学发光的分子)标记该探针。例如，可参见Nelson等(1995)，《用化学发光剂检测吖啶酯》(Nonisotopic Probing，Blottingand Sequenceing，Krica L.J.(编)，Academic Press，San Diego，CA；Nelson等(1994)，《杂交保护试验(HPA)在PCR中的应用》(The Polymerase Chain Reaction，Mullis等(编)，Birkhauser，Boston，MA)；Weeks等，Clin.Chem.(1983)，291474-1479；Berry等，Clin.Chem.(1988)，342087-2090。可采用非核苷酸连接臂化学物质直接将AE分子连接到探针上，该化学物允许将标记物置于探针内的任何位置上。例如，可参见美国专利5585481和5185439。通过与碱性过氧化氢反应可触发化学发光，该碱性过氧化氢产生激发的N-甲基吖啶酮，该酮发射光子，然后恢复到基态。此外，AE引起酯水解，产生非化学发光的甲基吖啶羧酸(methyl acridiniumcarboxylic acid)。
当AE分子共价连接于核酸探针时，在温和的碱性条件下快速水解。当AE标记的探针与靶核酸准确互补时，AE水解的速度极大地减小。因而，可直接检测溶液中杂交和未杂交的AE标记的探针，而不需要进行物理分离。
HPA通常由以下步骤组成(a)使AE标记的探针与溶液中的靶核酸杂交约15-30分钟。然后加入温和的碱性溶液，偶联于未杂交探针的AE被水解。这个反应大约费时5-10分钟。检测留下的与杂交物结合的AE，作为对所存在的靶数量的衡量。此步骤费时约2-5秒。较佳的是，在与杂交步骤的温度相同的温度下进行差分水解(differential hydrolysis)，通常是在50-70℃下进行。或者，可在室温下进行第二差分水解。这可使用较高的pH，例如在10-11范围的pH，在此范围内，杂交的和未杂交的AE标记探针之间的水解速率将产生较大的差异。关于HPA的详细描述，可参见美国专利6004745、5948899和5283174。
关于TMA的详细描述，可参见如美国专利5399491。在典型试验的一个实施例中，将怀疑含有细小病毒B19靶序列的分离的核酸样品与含有缓冲液、盐、镁、核苷三磷酸、引物、二硫赤藓糖醇和亚精胺的浓缩缓冲液混合。反应任选地在约100℃培育约2分钟，以使二级结构变性。冷却至室温后，加入反转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H，使混合物在37℃培育2-4小时。然后可通过使产物变性、加入探针溶液、在60℃培育20分钟、加入溶液来选择性水解未杂交的探针、在60℃培育该反应混合物6分钟，并在发光计下测量残余的化学发光物质，从而对该反应进行检测。
本发明的寡核苷酸分子还可用于核酸序列扩增(NASBA)中。此方法是一种启动子指导的酶学方法，包括诱导特异的核酸在体外进行连续的均一的和热温度的扩增，以提供该核酸的RNA拷贝。用于进行NASBA的试剂包括5′尾具有含有启动子的第一DNA引物、第二DNA引物、反转录酶、RNA酶H、T7 RNA聚合酶、NTP和dNTP。采用NASBA，可从单链RNA或DNA或者双链DNA产生大量的单链RNA。当要扩增RNA时，将ssRNA作为模板，通过延长含有RNA聚合酶识别位点的第一引物而合成第一DNA链。此DNA链进而又可作为合成第二互补DNA链的模板，通过第二引物的延伸产生双链活性RNA聚合酶启动子位点。而在RNA聚合酶的帮助下，该第二DNA链又可作为合成大量第一模板(ssRNA)的模板。NASBA技术是本领域已知的，在以下文献中有描述例如，欧洲专利329822、国际专利申请WO 91/02814和美国专利6063603、5554517和5409818。
还可将本文所述的细小病毒B19序列用于利用分支DNA分子的核酸杂交和扩增技术中。在一个基本的核酸杂交试验中，将单链分析物核酸杂交到标记的单链核酸探针上，然后检测所获得的标记的双链体。已发展了此基本方案的各种改进，以促进待检测的双链体与外来物质相分离，和/或扩增要检测的信号。扩增信号的一个方法是使用扩增多聚体，该多聚体是具有与分析物核酸或结合于该分析物的核酸的链特异性杂交的第一片段和特异性与标记的探针杂交的第二片段的重复子(iteration)的多核苷酸。扩增产物在理论上与所述第二片段的重复子的量成正比的。多聚体可以是直链的，也可以是分支的。两种通常类型的分支多聚体，即分叉型的和梳子型的，可用于这些技术。制备和使用分支核酸分子的方法在本领域中是已知的，在如美国专利5849481中有描述。
在本发明的另一方面，实施上述两种或多种试验，以证实生物体的存在。例如，如果第一个试验使用转录介导的扩增(TMA)来扩增核酸，以进行检测，则采用如本文所述的PCR扩增、RT PCR等进行另一核酸测试试验(NAT)。因而，即使当样品中含有其它生物体如HIV和乙型肝炎病毒时，仍可特异性地和选择性地检测细小病毒B19。
不难明白，本文所述试验的设计将会有许多变化，而许多形式都是本领域已知的。以上描述仅仅提供了一个向导，本领域熟练技术人员采用本领域已知的技术不难修改上述方案。
上述试验的试剂，包括引物、探针、结合有探针的固相载体以及其它检测试剂，可提供在试剂盒中，这类试剂盒具有适当的说明书和其它必需的试剂，以进行上述试验。通常，在试剂盒分开的容器中含有引物和探针的组合(已结合于固相基质上，或者与将它们结合于基质上的试剂分开)、对照制剂(阳性的和/或阴性)、标记的试剂(当试验形式需要该试剂时)和产生信号试剂(如酶底物，如果标记物不直接产生信号)。通常，试剂盒中将包括指导实施试验的说明书(如书写的纸张、磁带、VCR、CD-ROM等)，这取决于所用的具体的试验、其它的包装试剂和材料(如洗涤缓冲液等)。可使用这些试剂盒进行标准的试验(如上面所述)。
III.实验以下是实施本发明的具体实施例。这些实施例仅仅用于阐述性的目的，不能认为它们以任何方式限定了本发明的范围。
已作出努力来确保所使用数字(如数量、温度等)的准确性，但是一些实验误差和偏差当然应允许存在。
在下述实施例中，从商业来源购得酶，并根据制造商的建议使用。硝基纤维素滤纸等也从商业来源购得。
除非另有说明，否则，在DNA片段的分离中，所有的DNA操作都根据标准方法进行。可参见，Sambrook等，同上。可从商品供应商购得限制酶、T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段和其它生物学试剂，并根据制造商的建议使用。在琼脂糖凝胶上分离双链DNA片段。
实施例1用于PCR的细小病毒B19核酸抽提物从商业来源获得先前已通过IgM或PCR试验测定为人细小病毒B19阳性的人血清样品，并将其用于分离后面的PCR实验所用的DNA。样品保存在-80℃，直至使用。
根据制造商提供的说明书以及下述考虑，使用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)从0.2毫升的血清中抽提DNA。将载体DNA加到裂解缓冲液中，以增强核酸结合和产率。具体而言，加入5.6μg/样品的聚腺苷酸5′(Sigma，St.Louis，MO)或聚-dA(Roche，Indianapolis，IN)。此外，用200微升的AE缓冲液代替水洗脱细小病毒B19 DNA。
实施例2
采用PCR检测细小病毒19核酸阳性样品采用两种不同的PCR方法扩增细小病毒B19片段。如下文详细描述，一种方法用于扩增大约700bp、370bp和214bp的片段(见图1)。采用高保真度延伸PCR(Roche)扩增大约4.7kb的片段。该大约700bp的片段对应于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的细小病毒B19基因组的第2936-3635位核苷酸。所述约370bp的片段位于该700bp片段内，对应于第3073-3442位核苷酸。所述约4.7kb的片段是长4677个核苷酸的片段，对应于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的第217-4893位核苷酸。
为了扩增长约700bp、370bp和214bp的片段，使用下表1所示的引物。
表1引物序列 PCR产物基因组区域VP-5 AGGAAGTTTGCCGGAAGTTC(SEQ ID NO36) 370bpVP1VP-3 GTGCTGAAACTCTAAAGGTG(SEQ ID NO37) 370bpVP1VP2-5 GACATGGATATGAAAAGCCTGAAG(SEQ ID NO38) 214bpVP1/VP2VP2-3 GTTGTTCATATCTGGTTAAGTACT(SEQ ID NO39) 214bpVP1/VP2K-1sp ATAAATCCATATACTCATT(SEQ ID NO40) 700bpVP1/VP2K-2sp CTAAAGTATCCTGACCTTG(SEQ ID NO41) 700bpVP1/VP2在此实验中，PCR在最终体积为100微升的溶液中进行，使用到2微升纯化的细小病毒B19 DNA(如上所述进行纯化)、0.2mM的各种脱氧核苷三磷酸和1.25Pfu单位的DNA聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)。扩增过程包括94℃变性2分钟，37℃引物退火3分钟，72℃延伸3分钟，共进行35轮。在该35轮中，分别94℃3分钟预培育，以确保最初的变性，和72℃最后7分钟培育，以确保所先前的和随后的片段的完全延伸。将PCR产物在7％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，溴乙锭染色，UV源下观察。使用QiaQuick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化扩增的片段。
当在聚丙烯酰胺凝胶上看不到700bp条带时，进行嵌套式PCR，以扩增370bp的B19片段。将700bp DNA用于嵌套式PCR，其中使用到表1所示的引物。
如下采用高保真度延伸PCR(Roche)扩增细小病毒B19的4.7kb片段。根据卖主的建议使用高保真度延伸PCR试剂盒(Roche)和引物Hicks-5(5′-CCCGCCYYAYGCAAAYGGGCAG3′)(SEQ ID NO42)和Hicks-3(5′TTGTGTTAGGCTGTCTTATAGG3′)(SEQ ID NO43)。扩增条件是94℃1分钟，50℃2分钟，68℃4分钟，进行35或45轮。还包括在94℃进行2分钟的预培育，和在75℃进行7分钟的后培育。在1％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，使用PCR纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)进行纯化。
实施例3细小病毒B19 DNA片段的克隆将PCR片段克隆到TOPO-TA载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，当扩增的DNA在其3′端含有一个的脱氧腺苷(A)时，极大地有利于将PCR产物克隆到载体中。因此，采用催化反应加入3′(A)头。反应混合物含有1.25mM的dATP、0.5单位的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Boston，MA)，反应在72℃进行15分钟。
使用Invitrogen的TA克隆试剂盒(TOPOTMTA CloningR试剂盒，具有One ShotTOP10 Electrocompetent Cells)，并根据制造商的说明书，将PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO载体中。在含有100μg/ml的氨苄青霉素、0.66mM IPTG和0.033％X-Gal的Luria肉汤平板上孵育细菌细胞。将大量的白色菌落接种到4毫升含有氨苄青霉素(100μg/ml)的Luria肉汤中，37℃摇动培养过夜培养。用3毫升过夜培养物制备质粒DNA，其中使用到QIAprep Miniprep试剂盒(QIAGEN)。用EcoRI(NewEngland and Biolabs)进行限制酶分析，并如上所述进行7％聚丙烯酰胺凝胶电泳或1％琼脂糖凝胶电泳，鉴别出重组的克隆。
为了测定这些克隆的DNA序列，如上所述制备重组克隆的大量的质粒，并将DNA以0.2mg/ml悬浮在TE(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)中。使用AppliedBiosystems 373型(或377型)DNA测序系统进行细小病毒B19片段的核苷酸序列测定。
图2A到2U(SEQ ID NO1-21)描述了从21种细小病毒B19分离物中得到的DNA序列，这些DNA序列已如上述被纯化、扩增和测序。这些序列对应于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)上述的细小病毒B19基因组的第2936-3635位核苷酸(即图1所示的700bp片段)。图2A(SEQ ID NO1)是从分离物CH47-26获得的序列；图2B(SEQ ID NO2)是从分离物CH48-29获得的序列；图2C(SEQ ID NO3)是从分离物CH33-2获得的序列；图2D(SEQ ID NO4)是从分离物CH33-3获得的序列；图2E(SEQ ID NO5)是从分离物CH33-4获得的序列；图2F(SEQ ID NO6)是从分离物CH42-7获得的序列；图2G(SEQ ID NO7)是从分离物CH42-18获得的序列；图2H(SEQ ID NO8)是从分离物CH42-19获得的序列；图2I(SEQ ID NO9)是从分离物CH46-23获得的序列；图2J(SEQ ID NO10)是从分离物CH1-1获得的序列；图2K(SEQ ID NO11)是从分离物CH1-6获得的序列；图2L(SEQ ID NO12)是从分离物CH2-8获得的序列；图2M(SEQ ID NO13)是从分离物CH2-10获得的序列；图2N(SEQ ID NO14)是从分离物CH2-11C获得的序列；图2O(SEQ ID NO15)是从分离物CH5-13获得的序列；图2P(SEQ ID NO16)是从分离物CH7-22获得的序列；图2Q(SEQ ID NO17)是从分离物CH13-27获得的序列；图2R(SEQ IDNO18)是从分离物CH14-33获得的序列；图2S(SEQ ID NO19)是从分离物CH62-2获得的序列；图2T(SEQ ID NO20)是从分离物CH64-2获得的序列；图2U(SEQ IDNO21)是从分离物CH67-2获得的序列。
图11A到图11Z(SEQ ID NO62-87)描述从另外26种细小病毒B19分离物获得的DNA序列，这些序列如上述被纯化、扩增和测序，包括对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的细小病毒B19基因组的第2936-3635位核苷酸的序列(图1的700bp片段)。图11A(SEQ ID NO62)是从分离物CH80-1获得的序列；图11B(SEQ ID NO63)是从分离物CH81-3获得的序列；图11C(SEQ ID NO64)是从分离物B19SCL1-4获得的序列；图11D(SEQ ID NO65)是从分离物B19SCL2-1获得的序列；图11E(SEQ ID NO66)是从分离物B19SCL3-1获得的序列；图11F(SEQID NO67)是从分离物B19SCL4-3获得的序列；图11G(SEQ ID NO68)是从分离物B19SCL5-2获得的序列；图11H(SEQ ID NO69)是从分离物B19SCL6-2获得的序列；图11I(SEQ ID NO70)是从分离物B19SCL7-3获得的序列；图11J(SEQ ID NO71)是从分离物B19SCL8-2获得的序列；图11K(SEQ ID NO72)是从分离物B19SCL9-1获得的序列；图11L(SEQ ID NO73)是从分离物B19SCL9-9获得的序列；图11M(SEQ ID NO74)是从分离物B19SCL10-2获得的序列；图11N(SEQ ID NO75)是从分离物B19SCL11-1获得的序列；图11O(SEQ ID NO76)是从分离物B19SCL12-1获得的序列；图11P(SEQ ID NO77)是从分离物B19SCL13-3获得的序列；图11Q(SEQ ID NO78)是从分离物B19SCL14-1获得的序列；图11R(SEQ IDNO79)是从分离物B19SCL15-3获得的序列；图11S(SEQ ID NO80)是从分离物B19SCL16-2获得的序列；图11T(SEQ ID NO81)是从分离物B19SCL17-1获得的序列；图11U(SEQ ID NO82)是从分离物B19SCL18-1获得的序列；图11V(SEQ IDNO83)是从分离物B19SCL19-1获得的序列；图11W(SEQ ID NO84)是从分离物B19SCL20-3获得的序列；图11X(SEQ ID NO85)是从分离物B19SCL21-3获得的序列；图11Y(SEQ ID NO86)是从分离物B19SCL22-11获得的序列；图11Z(SEQ IDNO87)是从分离物B19SCL2-14获得的序列。
序列比较揭示，各分离物之间的这700bp序列有大约98-99.5％的序列同源性。
图3A-3C(SEQ ID NO22)显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的图1所示的大约4.7kbp的PCR片段的序列。该序列为长4677个核苷酸的片段，对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。该序列含有细小病毒B19全长开放读框和额外的5′和3′非翻译序列，该读框编码NS1、VP1和VP2。测序的该片段在5′非编码区含有一个额外的核苷酸，位于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所报道的B19序列的第367位到第368位核苷酸之间。
图4A-4C(SEQ ID NO23)显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的图1所示的大约4.7kbp的PCR片段的序列。该序列为长4677个核苷酸的片段，对应于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所述的第217-4893位核苷酸。该序列含有细小病毒B19全长开放读框和额外的5′和3′非翻译序列，该读框编码NS1、VP1和VP2。测序的片段在5′非编码区含有额外的核苷酸，位于Shade等〔J.Virol.(1986)，58921-936〕所报道的B19序列的第367位和第368位核苷酸之间。
实施例4细小病毒B19 NS1、VP1和VP2重组蛋白的克隆和表达使用克隆于pCR2.1-TOPO(如上述)中的细小病毒B19的4.7kb片段扩增编码NS1、VP1和VP2的片段。具体而言，设计PCR引物(见下文)，以采用PCR扩增细小病毒B19的NS1、VP1和VP2区域。为促进这些区域被克隆到酵母表达载体中，根据需要在引物中引入XbaI、HindIII和SalI限制性位点。
用于克隆和扩增细小病毒B19片段以在酵母中表达NS1、VP1和VP2重组蛋白的引物以上述获得的序列为基础，显示如下NS1-5(有义引物)5’ATACTCTCTAGACAAAACAAAATGGAGCTATTTAGAGGGGTGCTTCAAGTTTCT3’(SEQ ID NO44)NS1-3(反义引物)5’GAGTATGTCGACTTACTCATAATCTACAAAGCTTTGCAATCCAGACAG3’(SEQ ID NO45)VP1-5SN(有义引物)5’ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGAGTAAAGAAAGTGGCAAATGGTGGGAAAGT3’(SEQ ID NO46)VPALL-3(反义引物)5’GAGTATGTCGACTTACAATGGGTGCACACGGCTTTTGGCTGTCCACAATTC3’(SEQ IDNO47)VP-25SN(有义引物)5’ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGACTTCAGTTAATTCTGCAGAAGCCAGCACT3’(SEQ ID NO48)合成、纯化PCR引物，使其悬浮在300微升的dH2O中，测定它们在260nm的光密度。此反应混合物含有0.25ng的模板、100pmol的各引物、10微升1.25mM的各dNTP和1单位的Taq聚合酶(Perkin Elmer，Boston，MA)，最终体积为50微升。扩增条件是94℃1分钟、50℃2分钟、68℃4分钟，共35轮。还增加7分钟75℃的后培育，以确保各片段完全延伸。用5微升等份在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，以检查PCR合成。然后电泳分离完整的PCR产物，使用PCR纯化试剂盒(Promega)，根据卖主的推荐，从凝胶中纯化得到具有所期望大小的片段。用适当的限制酶(Roche)37℃消化大约0.8微克纯化的PCR DNA 3小时，然后用Promega的PCR纯化试剂盒进一步纯化所得产物。
将质粒pBS24.1用于细小病毒B19重组蛋白的异源表达。这种酵母表达载体含有2μ序列和用于在酵母中自身复制的反向重复序列(IR)、用于确保转录终止的α-终止子，以及用于选择的酵母leu2-d和URA3。复制的ColE1起点和β-内酰胺酶基因也同样存在，用于在大肠杆菌中繁殖和选择〔Pichuantes等，1996，《异源基因产物在酵母中的表达》，“Protein EngineeringA Guide to Design andproduction”，第5章，J.L.Cleland和C.Craik编辑，Wiley-Liss，Inc.，纽约，N.Y.，第129-161页〕。用BamHI/SalI消化质粒pBS24.1，并在卖主推荐的条件下，用10单位的牛小肠碱性磷酸酶(Boheringer Manheim，Indianapolis，IN)去磷酸化。将经消化和纯化的PCR片段与BamHI/SalI消化的质粒pBS24.1以及含有用BamHI/SfuI或BamHI/HindIII消化的酵母杂交启动子ADH2/GAPDH(Cousens等，Gene，1987，61265-275)的DNA片段混合，这取决于待克隆的PCR片段中存在的限制性位点。用Roche快速连接试剂盒及其方案进行连接。然后用连接混合物转化大肠杆菌HB101感受态细胞，37℃培养过夜后，选出在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤平板中的转化子。检出分别转化的几个菌落，接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤中，37℃摇动培养过夜。
用1.5毫升培养物和QIAprep Miniprep试剂盒(QIAGEN)制备质粒DNA。使用BamHI-SalI进行分析限制酶分析，鉴别重组克隆。大规模制备重组质粒，以进行测序，确证克隆的细小病毒B19片段的核苷酸序列。
如下将具有所期望的NS1、VP1和VP2序列的酵母表达质粒用于酵母转化。用编码NS1、VP1或VP2的质粒DNA(如上所示克隆获得)转化感受态酿酒酵母菌AD3细胞〔Mat a，trp1+，ura3-52，prb1-1122，pep4-3，pr从-407c，[cir0]，∷pDM15(pGAP/ADR1∷G418R)]，leu2(ΔAD)〕。30℃培养48-72小时后，通过两轮尿嘧啶缺陷平板筛选，以及接着的一轮亮氨酸缺陷平板筛选，可实现酵母重组子的选择。然后使培养物在亮氨酸缺陷的培养基中生长，接着在检查重组蛋白表达之前在补充了2％葡萄糖的YEP中培养〔Pichuantes等，ProteinStruct.Funct.Genet.，1989，6324-337〕48小时。
图5-10显示了从两种不同的分离物获得的各种蛋白质的序列。具体而言，图5A(SEQ ID NO24)和5B(SEQ ID NO25)分别显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的NS1核苷酸和蛋白质序列。图6A(SEQ ID NO26)和6B(SEQ ID NO27)分别显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP1核苷酸和蛋白质序列。图7A(SEQ ID NO28)和7B(SEQ ID NO29)分别显示从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP2核苷酸和蛋白质序列。图8A(SEQ ID NO30)和8B(SFQ ID NO31)分别显示从细小病毒B19克隆2-B6获得的NS1核苷酸和蛋白质序列。图9A(SEQ ID NO32)和8B(SEQ IDNO33)分别显示从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP1核苷酸和蛋白质序列。图10A(SEQ ID NO34)和10B(SEQ ID NO35)分别显示从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP2核苷酸和蛋白质序列。
实施例5使用TaqManTM检测和定量测定细小病毒B19 DNA如下设计了用于检测细小病毒B19感染的灵敏诊断方法。具体而言，采用TaqManTMPCR技术检测和定量测定细小病毒B19 DNA。定量PCR需要对核酸进行有效的抽提。用于DNA抽提的血浆/血清的体积也会影响检测的灵敏度。采用两种方法从0.5毫升的血浆/血清中分离得到核酸。具体而言，通过(a)结合于硅石和(b)退火到靶特异性寡核苷酸，从而抽提得到DNA。
(a)通过结合于硅石分离核酸在高浓度的离液盐(如异硫氰酸胍)存在下，核酸与硅石结合。在酸性pH的条件下，小尺寸的核酸能更有效地与硅石结合。在低盐、碱性pH缓冲液和高温条件下，结合的核酸能被有效地洗脱。用磁化硅石取代常规硅石可极大地促进核酸分离的洗涤和洗脱步骤。使用磁性基底捕获结合了核酸的硅石颗粒，从而勿需进行常规硅石颗粒沉降所需的离心。
所使用的裂解缓冲液从Organon-Teknika(Durham，NC)购得。这种裂解缓冲液含有异硫氰酸胍，用于使蛋白质和灭活的RNA酶和DNA酶增溶。去污剂TritonX-100进一步促进细胞结构和核蛋白的增溶作用和分解作用，从而释放出核酸。将裂解试剂酸化，以增强核酸结合，并用50微升的碱性洗脱缓冲液洗脱结合的核酸。在分离核酸后，如下所述进行TaqManTMPCR，以确定细小病毒DNA的存在。
(b)通过退火到靶特异性寡核苷酸而分离核酸虽然使用磁化的硅石极大地促进洗涤和洗脱步骤过程中的处理，使得这些处理变得快速和简单，但是核酸的分离仍然费时和费力。因此，使用磁珠从血浆或血清中一步俘获特异性核酸靶标的方法被加以采用。为了使这种方法可用于各种病毒核酸俘获试验，使用偶联于寡dT的通用磁珠。将具有长14聚体寡dT的Sera-Mag磁性寡(dT)珠(Seradyn，Indianapolis，IN)和其3′端毗邻于所使用的细小病毒特异性序列(在下面的序列的末端将指出)含有20聚A的俘获寡核苷酸一同使用。
所使用的反义俘获寡核苷酸衍生自所述700bp的片段，具体如下
VSPC1-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCTTAACAGCAATTTCTGATA(nt 3492-3514)(*)(SEQ ID NO49)VSPC2-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCCCTGTAGTGCTGTCAG(nt 3549-3568)(SEQ ID NO50)VSPC3-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATACCCAAATAGGAAGTTCTG(nt 3639-3660)(SEQ ID NO51)VSPC4-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAATGCTGATTCTTCACTTGC(nt 3737-3759)(SEQ ID NO52)VSPC5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCTGTACCTCCTGTACCTA(nt 3789-3808)(SEQ ID NO53)VSPC6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCCTCTAAATTTTCTGGG(nt 3838-3857)(SEQ ID NO54)VSPC7-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCCTAATGTGTCAGGAACC(nt 3910-3929)(SEQ ID NO55)(*)核苷酸的编号是依照Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的编号将磁珠悬浮在Novagen裂解缓冲液(Madison，WI)中，然后分别或联合测定一组7种俘获寡核苷酸(上述VSPC1-VSPC7)，以俘获从生物学评估和研究FDA中心(美国健康和人类服务部，FDA-CBER)获得的一组(标准品)中的细小病毒B19DNA。
(c)用洗涤缓冲液洗涤珠在俘获后，用含有10mM Hepes缓冲剂(pH7.5，在0.3M NaCl中)和0.5％NP-40的缓冲液洗涤珠。在用裂解缓冲液处理血清、杂交、珠的磁性吸附以及除去裂解缓冲液后，将1.5毫升的洗涤缓冲液加到珠中。在常规的涡流震荡、磁性吸附和去除洗涤缓冲液后，在0.5毫升相同的缓冲液中第二次洗涤珠，这样，这些磁珠可被压缩，以易于悬浮在含有Taqman试验所有试剂的100毫升通用PCR缓冲液中。将俘获了DNA的珠转移到TaqManTM平板中，用于如下所述的TaqManTMPCR检测。如TaqManTM试验所检测的那样，几种寡核苷酸组合在俘获B19方面是有效的。
具体而言，采用TaqManTM技术扩增俘获的靶核酸，将其作为DNA扩增子。另一选择是将俘获的靶标扩增为RNA。对此，扩增的寡核苷酸由细小病毒B19特异性引物与T7启动子序列组成，以使用T7 RNA聚合酶产生RNA扩增子。测定了从所述700bp序列(对应于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的细小病毒B19基因组的第2936-3635位核苷酸〕衍生得到的3个扩增引物(如下所述VSA1-A3)的扩增能力。所述引物如下有义链扩增引物VSA1-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCATATACTCATTGGACTGT(nt 2942-2961)(SEQ ID NO56)VSA2-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAGAGCACCATTATAA(nt 3272-3288)(SEQ ID NO57)VSA3-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACAATGCCAGTGGAAA(nt 3317-3333)(SEQ ID NO58)VSP2-GTGCTGAAACTCTAAAGGT(反义引物 nt 3424-3442)(SEQ ID NO59)使用RNamplifire试剂盒(Qiagen)的试剂，以50拷贝的细小病毒DNA为靶标(最终体积为20毫升)，检验扩增效率。使用VSP2为第二引物，分别或联合测试了扩增引物。如制造商推荐的那样于42℃培养1小时后，将一等份扩增材料稀释100倍，用于TaqManTM试验，以评估扩增引物的效率。两种扩增引物的组合，即VSA2和VSA3与VSP2，在产生RNA复制子方面非常有效。
使用含有上述4.7kb片段的质粒DNA确定TaqManTM试验的灵敏度、PCR引物的适合性以及最佳反应条件。这个片段包含VP1区以及NS1区和VP2区(参见图1)。使用衍生自VP1区的PCR扩增引物(如下所述)。序列的编号相当于Shade等(J.Virol.，1986，58921-936)所述的编号。X代表5′-荧光素亚磷酰胺，Z代表DABCYL-dT，两者都是从Glen Research Corporation，Sterling VA获得。序列右侧所给出的数字指从细小病毒B19序列获得的引物的核苷酸。
VSP1-GGAGGCAAAGGTTTGCA(有义引物nt 3334-3350)(SEQ ID NO60)VSP2-GTGCTGAAACTCTAAAGGT(反义引物nt 3424-3442)(SEQ ID NO59)VSPPR1-XCCCATGGAGATATTTAGATTZ(探针-nt 3379-3398)(SEQ ID NO61)Vpara 8TCCATATGACCCAGAGCACCA(nt 3262-3460)(SEQ ID NO88)Vpara 9TTTCCACTGGCATTGTGGC(反义引物-nt 3313-3331)(SEQ ID NO89)Vpara10X AGCTAGACCTGCATGTCACTG Z，其中，X是Fam，Z是Tamra(nt3286-3310)(SEQ ID NO90)采用分光光度法评估质粒DNA的浓度，进行连续稀释，获得5000-10拷贝/20微升。最终体积为50微升的反应混合物含有20微升的样品、1X Gold Taq扩增缓冲液(Perkin Elmer)和3.2mM MgCl2、300μM的各种dNTP、1pmol各种扩增引物、0.4pmol探针以及1单位AmpliTaq酶。反应条件包括95℃反应10分钟，以激活酶，接着95℃30秒，或者在ABI 7700测序仪中在60℃在进行45轮。
使用产生109bp PCR产物的引物对VSP1和VSP2、探针VSPPR1，可检测到少至10拷贝/试验。由于样品的体积在最终50微升体积中是20微升，这表明可抽提含有少至50个拷贝/毫升的细小病毒B19 DNA的血浆样品，并被TaqManTM技术检测。由于细小病毒是一种高效价病毒，因此可抽提50微升的血浆/血清并用于分析。
使用FDA-CBER细小病毒B19 DNA阳性样品(106拷贝/毫升)，采用TaqManTM技术进行检测，每次试验可检测到少至50拷贝。在使核酸和免疫效价相关的尝试中，定量测量了几个抗体阳性样品中的病毒DNA负荷。
因此，本文公开了新颖的人细小病毒B19序列和使用这些序列进行进行的检测试验。从前述内容可以理解，虽然为了阐述的目的，本文对本发明的具体实施例进行了描述，但是在不偏离本文所述的精神和范围的情况下，可对本发明进行各种改变。
序列表<110> 希龙公司<120> 细小病毒B19的诊断测试<130> 2301-17194.40<140>
<141>
<160> 92<170> PatentIn Ver.2.0<210> 1<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH47-26<400> 1ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaatttg 480tttttttcac ctttagagtt tcagcattta attgaaaact atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggagtacaag ttactgacag cactaccggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 2<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH48-29<400> 2ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaacaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgcc tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 3<211> 700<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH33-2<400> 3ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaacaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgct tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 4<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH33-3<400> 4ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaca 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgcc tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 5<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH33-4<400> 5ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggtggc 240agtaatcctg ccaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttactgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ctagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aactccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcaccta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gatttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgcc tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 6<211> 700<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH42-7<400> 6ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccaggcagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 7<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH42-18<400> 7ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 8<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH42-19<400> 8ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 9<211> 700
<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> misc_feature<222> (76)<223> 人工序列的描述分离物CH46-23<400> 9attaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaancaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccaggcagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 10<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH1-1<400> 10ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 11<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH1-6<400> 11ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700
<210> 12<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH2-8<400> 12ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 13<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH2-10<400> 13ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacag aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 14<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH2-11C<400> 14ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600
ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 15<211> 699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH5-13<400> 15ctaaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaaag aggcaaaggt ttgcactatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggcagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccaa tgtgttaggg caaggtcagg atactttag699<210> 16<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH7-22<400> 16ataaatccat gtactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaatttg 480tttttttcac ctttagagtt tcagcattta attgaaaact atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggagtacaag ttactgacag cactaccggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 17<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH13-27<400> 17ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaattctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgctaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag cgagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatc 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480
tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 18<211> 699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH14-33<400> 18ataaatccat atactcattg gactgtggca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg agggggggga 240gtaatcctgt taaaagcatg tggagtgagg gggccacttt tagtgccaac tctgtaactt 300gtacattttc cagacagttt ttaattccat atgacccaga gcaccattat aaggtgtttt 360ctcccgcagc aagtagctgc cacaatgcca gtggaaaaga ggcaaaggtt tgcaccatta 420gtcccataat gggatactca accccatgga gatatttaga ttttaatgct ttaaatttat 480ttttttcacc tttagagttt cagcacttaa ttgaaaatta tggtagtata gctcctgatg 540ctttaactgt aaccatatca gaaattgctg ttaaagatgt tacagacaaa actggagggg 600gggtacaggt tactgacagc actacagggc gcctatgcat gttagtggac catgaataca 660agtacccata tgtgttaggg caaggtcagg atactttag699<210> 19<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH62-2<400> 19ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcaat taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacakttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ccagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggc cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 20<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH64-2<400> 20ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tcgcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420
agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatacttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 21<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH67-2<400> 21ataaatccat atactcattg gactgtggca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggg 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaaag aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaagatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtacagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtgga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 22<211> 4678<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B1获得的4.7kbp的PCR片段<400> 22cccgccttat gcaaatgggc agccatctta agtgttttac tataatttta ttggtcagtt 60ttgtaacggt taaaatgggc ggagcgtagg caaggactac agtatatata gcacagcact 120gccgcagctc tttctttctg ggctgctttt ttcctggact tacttgctgt tttttgtgag 180ctaactaaca ggtatttata ctacttgtta acatactaac atggagctat ttagaggggt 240gcttcaagtt tcttctaatg ttctggactg tgctaacgat aactggtggt gctctttact 300ggatttagac acttctgact gggaaccact aactcatact aacagactaa tggcaatata 360cttaagcagt gtggcttcta agcttgactt tactgggggg ccactagcag ggtgcttgta 420cttttttcaa gtagaatgta acaaatttga agaaggctat catattcatg tggttattgg 480ggggccaggg ttaaacccca gaaacctcac agtgtgtgta gaggggttat ttaataatgt 540actttatcac cttgtaactg aaaatctgaa gctaaaattt ttgccaggaa tgactacaaa 600aggcaaatac tttagagatg gagagcagtt tatagaaaac tatttaatga aaaaaatacc 660tttaaatgtt gtatggtgtg ttactaatat tgatggacat atagatacct gtatttctgc 720tacttttaga aagggagctt gccatgccaa gaaaccccgc atcaccacag ccataaatga 780tactagtact gatgctgggg agtctagcgg cacaggggca gaggttgtgc catttaatgg 840gaagggaact aaggctagca taaagtttca aactatggta aactggttgt gtgaaaacag 900agtgtttaca gaggataagt ggaaactagt tgactttaac cagtacactt tactaagcag 960tagtcacagt ggaagttttc aaattcaaag tgcactaaaa ctagcaattt ataaagcaac 1020taatttagtg cctactagca catttttatt gcatacagac tttgagcaag ttatgtgtat 1080taaaaacaat aaaattgtta aattgttact ttgtcaaaac tatgaccccc tattagtggg 1140gcagcatgtg ttaaagtgga ttgataaaaa atgtggcaag aaaaacacac tgtggtttta 1200tgggccgcca agtacaggga aaacaaactt ggcaatggcc attgctaaaa gtgttccagt 1260atatggcatg gttaactgga ataatgaaaa ctttccattt aatgatgtag caggaaaaag 1320cttggtggtc tgggatgaag gtattattaa gtctacaatt gtagaagctg caaaagccat 1380tttaggcggg caacccacca gggtagatca aaaaatgcgt ggaagtgtag ctgtgcctgg 1440agtacctgtg gttataacca gcaatggtga cattactttt gttgtaagcg ggaacactac 1500aacaactgta catgctaaag ccttaaaaga gcgcatggta aagttaaact ttactgtaag 1560atgcagccct gacatggggt tactaacaga ggctgatgta caacagtggc ttacatggtg 1620taatgcacaa agctgggacc actatgaaaa ctgggcaata aactacactt ttgatttccc 1680
tggaattaat gcagatgccc tccacccaga cctccaaacc accccaattg tcacagacac 1740cagtatcagc agcagtggtg gtgaaagctc tgaagaactc agtgaaagca gcttttttaa 1800cctcatcacc ccaggcgcct ggaacactga aaccccgcgc tctagtacgc ccatccccgg 1860gaccagttca ggagaatcat ctgtcggaag cccagtttcc tccgaagttg tagctgcatc 1920gtgggaagaa gccttctaca cacctttggc agaccagttt cgtgaactgt tagttggggt 1980tgattatgtg tgggacggtg taaggggttt acctgtctgt tgtgtgcaac atattaacaa 2040tagtggggga ggcttgggac tttgtcccca ttgcattaat gtaggggctt ggtataatgg 2100atggaaattt cgagaattta ccccagattt ggtgcgatgt agctgccatg tgggagcttc 2160taatcccttt tctgtgctaa cctgcaaaaa atgtgcttac ctgtctggat tgcaaagctt 2220tgtagattat gagtaaagaa agtggcaaat ggtgggaaag tgatgataaa tttgctaaag 2280ctgtgtatca gcaatttgtg gaattttatg aaaaggttac tggaacagac ttagagctta 2340ttcaaatatt aaaagatcat tataatattt ctttagataa tcccctagaa aacccatcct 2400ctttgtttga cttagttgct cgtattaaaa ataaccttaa aaactctcca gacttatata 2460gtcatcattt tcaaagtcat ggacagttat ctgaccaccc ccatgcctta tcatccagta 2520gcagtcatgc agaacctaga ggagaagatg cagtattatc tagtgaagac ttacacaagc 2580ctgggcaagt tagcgtacaa ctacccggta ctaactatgt tgggcctggc aatgagctac 2640aagctgggcc cccgcaaagt gctgttgaca gtgctgcaag gattcatgac tttaggtata 2700gccaactggc taagttggga ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc 2760ttttaaaaaa tataaaaaat gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta 2820ctttaaaagg tgcagctgcc cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg 2880cttacaacgc ctcagaaaaa tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca 2940ctggtgcagg aggggggggc agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt 3000ttagtgccaa ctctgtaact tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag 3060agcaccatta taaggtgttt tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg 3120aggcaaaggt ttgcaccatt agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag 3180attttaatgc tttaaattta tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt 3240atggaagtat agctcctgat gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg 3300ttacggacaa aactggaggg ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca 3360tgttagtaga ccatgaatat aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcaa gatactttag 3420ccccagaact tcctatttgg gtatactttc cccctcaata cgcttactta acagtaggag 3480atgttaacac acaaggaatt tctggagaca gcaaaaaatt ggcaagtgaa gaatcagcat 3540tttatgtttt ggaacacagt tcttttcagc ttttaggtac aggaggtaca gcaactatgt 3600cttataagtt tcctccagtg cccccagaaa atttagaggg ctgcagtcaa cacttttatg 3660aaatgtacaa ccccttatac ggatcccgct taggggttcc tgacacatta ggaggtgacc 3720caaaatttag atctttaaca catgaagacc atgcaattca gccccaaaac ttcatgccag 3780ggccactagt aaactcagtg tctacaaagg agggagacag ctctagtact ggagctggaa 3840aagccttaac aggccttagc acaggtacct ctcaaaacac tagaatatcc ttacgccctg 3900ggccagtgtc tcagccgtac caccactggg acacagataa atatgtcaca ggaataaatg 3960ccatttctca tggtcagacc acttatggta acgctgaaga caaagagtat cagcaaggag 4020tgggtagatt tccaaatgaa aaagaacagc taaaacagtt acagggttta aacatgcaca 4080cctactttcc caataaagga acccagcaat atacagatca aattgagcgc cccctaatgg 4140tgggttctgt atggaacaga agagcccttc actatgaaag ccagctgtgg agtaaaattc 4200caaatttaga tgacagtttt aaaactcagt ttgcagcctt aggaggatgg ggtttgcatc 4260agccacctcc tcaaatattt ttaaaaatat taccacaaag tgggccaatt ggaggtatta 4320aatcaatggg aattactacc ttagttcagt atgccgtggg aattatgaca gtaaccatga 4380catttaaatt ggggccccgt aaagctacgg gacggtggaa tcctcaacct ggagtgtatc 4440ccccgcacgc agcaggtcat ttaccatatg tactatatga ccccacagct acagatgcaa 4500aacaacacca cagacatgga tatgaaaagc ctgaagaatt gtggacagcc aaaagccgtg 4560tgcacccatt gtaaacactc cccaccgtgc cctcagccag gatgtgtaac taaacgccca 4620ccagtaccac ccagactgta cctgccccct cctataccta taagacagcc taacacaa 4678<210> 23<211> 4678<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B6获得的4.7kbp的PCR片段<400> 23cccgccttat gcaaatgggc agccatctta agtgttttac tataatttta ttggtcagtt 60ttgtaacggt taaaatgggc ggagcgtagg caaggactac agtatatata gcacagcact 120gccgcagctc tttctttctg ggctgctttt ttcctggact tacttgctgt tttttgtgag 180ctaactaaca ggtatttata ctacttgtta acatactaac atggagctat ttagaggggt 240
gcttcaagtt tcttctaatg ttctggactg tgctaacgat aactggtggt gctctttact 300ggatttagac acttctgact gggaaccact aactcatact aacagactaa tggcaatata 360cttaagcagt gtggcttcta agcttgactt tactgggggg ccactagcag ggtgcttgta 420cttttttcaa gtagaatgta acaaatttga agaaggctat catattcatg tggttattgg 480ggggccaggg ttaaacccca gaaacctcac agtgtgtgta gaggggttat ttaataatgt 540actttatcac cttgtaactg aaaatctgaa gctaaaattt ttgccaggaa tgactacaaa 600aggcaaatac tttagagatg gagagcagtt tatagaaaac tatttaatga aaaaaatacc 660tttaaatgtt gtatggtgtg ttactaatat tgatggacat atagatacct gtatttctgc 720tacttttaga aagggagctt gccatgccaa gaaaccccgc atcaccacag ccataaatga 780tactagtact gatgctgggg agtctagcgg cacaggggca gaggttgtgc catttaatgg 840gaagggaact aaggctagca taaagtttca aactatggta aactggttgt gtgaaaacag 900agtgtttaca gaggataagt ggaaactagt tgactttaac cagtacactt tactaagcag 960tagtcacagt ggaagttttc aaattcaaag tgcactaaaa ctagcaattt ataaagcaac 1020taatttagtg cctactagca catttttatt gcatacagac tttgagcaag ttatgtgtat 1080taaagacaat aaaattgtta aattgttact ttgtcaaaac tatgaccccc tattagtggg 1140gcagcatgtg ttaaagtgga ttgataaaaa atgtggcaag aaaaacacac tgtggtttta 1200tggaccgcca agtacaggga aaacaaactt ggcaatggcc attgctaaaa gtgttccagt 1260atatggcatg gttaactgga ataatgaaaa ctttccattt aatgatgtag caggaaaaag 1320cttggtggtc tgggatgaag gtattattaa gtctacaatt gtagaagctg caaaagccat 1380tttaggcggg caacccacca gggtagatca aaaaatgcgt ggaagtgtag ctgtgcctgg 1440agtacccgtg gttataacca gcaatggtga cattactttt gttgtaagcg ggaacactac 1500aacaactgta catgctaaag ccttaaaaga gcgcatggta aagttaaact ttactgtaag 1560atgcagccct gacatggggt tactaacaga ggctgatgta caacagtggc ttacatggtg 1620taatgcacaa agctgggacc actatgaaaa ctgggcaata aactacactt ttgatttccc 1680tggaattaat gcagatgccc tccacccaga cctccaaacc accccaattg tcacagacac 1740cagtatcagc agcagtggtg gtgaaagctc tgaagaactc agtgaaagca gcttttttaa 1800cctcatcacc ccaggcgcct ggaacactga aaccccgcgc tctagtacgc ccatccccgg 1860gaccagttca ggagaatcat ctgtcggaag cccagtttcc tccgaagttg tagctgcatc 1920gtgggaagaa gccttctaca cacctttggc agaccagttt cgtgaactgt tagttggggt 1980tgattatgtg tgggacggtg taaggggttt acctgtctgt tgtgtgcaac atattaacaa 2040tagtggggga ggcttgggac tttgtcccca ttgcattaat gtaggggctt ggtataatgg 2100atggaaattt cgagaattta ccccagattt ggtgcgatgt agctgccatg tgggagcttc 2160taatcccttt tctgtgctaa cctgcaaaaa atgtgcttac ctgtctggat tgcaaagctt 2220tgtagattat gagtaaagaa agtggcaaat ggtgggaaag tgatgataaa tttgctaaag 2280ctgtgtatca gcaatttgtg gaattttatg aaaaggttac tggaacagac ttagagctta 2340ttcaaatatt aaaagatcat tataatattt ctttagataa tcccctagaa aacccatcct 2400ctttgtttga cttagttgct cgtattaaaa ataaccttaa aaactctcca gacttatata 2460gtcatcattt tcaaagtcat ggacagttat ctgaccaccc ccatgcctta tcatccagta 2520gcagtcatgc agaacctaga ggagaagatg cagtattatc tagtgaagac ttacacaagc 2580ctgggcaagt tagcgtacaa ctacccggta ctaactatgt tgggcctggc aatgagctac 2640aagctgggcc cccgcaaagt gctgttgaca gtgctgcaag gattcatgac tttaggtata 2700gccaactggc taagttggga ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc 2760ttttaaaaaa tataaaaaat gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta 2820ctttaaaagg tgcagctgcc cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg 2880cttacaacgc ctcagaaaaa tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca 2940ctggtgcagg aggggggggc agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt 3000ttagtgccaa ctctgtaact tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag 3060agcaccatta taaggtgttt tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg 3120aggcaaaggt ttgcaccatt agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag 3180attttaatgc tttaaattta tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt 3240atggaagtat agctcctgat gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg 3300ttacaaacaa aactggaggg ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca 3360tgttagtaga ccatgaatat aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcaa gatactttag 3420ccccagaact tcctatttgg gtatactttc cccctcaata cgcttactta acagtaggag 3480atgttaacac acaaggaatt tctggagaca gcaaaaaatt ggcaagtgaa gaatcagcat 3540tttatgtttt ggaacacagt tcttttcagc ttttaggtac aggaggtaca gcaactatgt 3600cttataagtt tcctccagtg cccccagaaa atttagaggg ctgcagtcaa cacttttatg 3660aaatgtacaa ccccttatac ggatcccgct taggggttcc tgacacatta ggaggtgacc 3720caaaatttag atctttaaca catgaagacc atgcaattca gccccaaaac ttcatgccag 3780ggccactagt aaactcagtg tctacaaagg agggagacag ctctagtact ggagctggaa 3840aagccttaac aggccttagc acaggtacct ctcaaaacac tagaatatcc ttacgccctg 3900ggccagtgtc tcagccgtac caccactggg acacagataa atatgtcaca ggaataaatg 3960ccatttctca tggtcagacc acttatggta acgctgaaga caaagagtat cagcaaggag 4020tgggtagatt tccaaatgaa aaagaacagc taaaacagtt acagggttta aacatgcaca 4080cctactttcc caataaagga acccagcaat atacagatca aattgagcgc cccctaatgg 4140
tgggttctgt atggaacaga agagcccttc actatgaaag ccagctgtgg agtaaaattc 4200caaatttaga tgacagtttt aaaactcagt ttgcagcctt aggaggatgg ggtttgcatc 4260agccacctcc tcaaatattt ttaaaaatat taccacaaag tgggccaatt ggaggtatta 4320aatcaatggg aattactacc ttagttcagt atgccgtggg aattatgaca gtaaccatga 4380catttaaatt ggggccccgt aaagctacgg gacggtggaa tcctcaacct ggagtgtatc 4440ccccgcacgc agcaggtcat ttaccatatg tactatatga ccccacagct acagatgcaa 4500aacaacacca cagacatgga tatgaaaagc ctgaagaatt gtggacagcc aaaagccgtg 4560tgcacccatt gtaaacactc cccaccgtgc cctcagccag gatgtgtaac taaacgccca 4620ccagtaccac ccagactgta cctgccccct cctataccta taagacagcc taacacaa 4678<210> 24<211> 2049<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B1获得的NS1<400> 24atactcttcg aacaaaacaa aatggagcta tttagagggg tgcttcaagt ttcttctaat 60gttctggact gtgctaacga taactggtgg tgctctttac tggatttaga cacttctgac 120tgggaaccac taactcatac taacagacta atggcaatat acttaagcag tgtggcttct 180aagcttgact ttactggggg gccactagca gggtgcttgt acttttttca agtagaatgt 240aacaaatttg aagaaggcta tcatattcat gtggttattg gggggccagg gttaaacccc 300agaaacctca cagtgtgtgt agaggggtta tttaataatg tactttatca ccttgtaact 360gaaaatctga agctaaaatt tttgccagga atgactacaa aaggcaaata ctttagagat 420ggagagcagt ttatagaaaa ctatttaatg aaaaaaatac ctttaaatgt tgtatggtgt 480gttactaata ttgatggaca tatagatacc tgtatttctg ctacttttag aaagggagct 540tgccatgcca agaaaccccg catcaccaca gccataaatg atactagtac tgatgctggg 600gagtctagcg gcacaggggc agaggttgtg ccatttaatg ggaagggaac taaggctagc 660ataaagtttc aaactatggt aaactggttg tgtgaaaaca gagtgtttac agaggataag 720tggaaactag ttgactttaa ccagtacact ttactaagca gtagtcacag tggaagtttt 780caaattcaaa gtgcactaaa actagcaatt tataaagcaa ctaatttagt gcctactagc 840acatttttat tgcatacaga ctttgagcaa gttatgtgta ttaaaaacaa taaaattgtt 900aaattgttac tttgtcaaaa ctatgacccc ctattagtgg ggcagcatgt gttaaagtgg 960attgataaaa aatgtggcaa gaaaaacaca ctgtggtttt atgggccgcc aagtacaggg 1020aaaacaaact tggcaatggc cattgctaaa agtgttccag tatatggcat ggttaactgg 1080aataatgaaa actttccatt taatgatgta gcaggaaaaa gcttggtggt ctgggatgaa 1140ggtattatta agtctacaat tgtagaagct gcaaaagcca ttttaggcgg gcaacccacc 1200agggtagatc aaaaaatgcg tggaagtgta gctgtgcctg gagtacctgt ggttataacc 1260agcaatggtg acattacttt tgttgtaagc gggaacacta caacaactgt acatgctaaa 1320gccttaaaag agcgcatggt aaagttaaac tttactgtaa gatgcagccc tgacatgggg 1380ttactaacag aggctgatgt acaacagtgg cttacatggt gtaatgcaca aagctgggac 1440cactatgaaa actgggcaat aaactacact tttgatttcc ctggaattaa tgcagatgcc 1500ctccacccag acctccaaac caccccaatt gtcacagaca ccagtatcag cagcagtggt 1560ggtgaaagct ctgaagaact cagtgaaagc agctttttta acctcatcac cccaggcgcc 1620tggaacactg aaaccccgcg ctctagtacg cccatccccg ggaccagttc aggagaatca 1680tctgtcggaa gcccagtttc ctccgaagtt gtagctgcat cgtgggaaga agccttctac 1740acacctttgg cagaccagtt tcgtgaactg ttagttgggg ttgattatgt gtgggacggt 1800gtaaggggtt tacctgtctg ttgtgtgcaa catattaaca atagtggggg aggcttggga 1860ctttgtcccc attgcattaa tgtaggggct tggtataatg gatggaaatt tcgagaattt 1920accccagatt tggtgcgatg tagctgccat gtgggagctt ctaatccctt ttctgtgcta 1980acctgcaaaa aatgtgctta cctgtctgga ttgcaaagct ttgtagatta tgagtaagtc 2040gacatactc 2049<210> 25<211> 671<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B1获得的NS1氨基酸<400> 25Met Glu Leu Phe Arg Gly Val Leu Gln Val Set Ser Asn Val Leu Asp
1 5 10 15Cys Ala Asn Asp Asn Trp Trp Cys Ser Leu Leu Asp Leu Asp Thr Ser20 25 30Asp Trp Glu Pro Leu Thr His Thr Asn Arg Leu Met Ala Ile Tyr Leu35 40 45Ser Ser Val Ala Ser Lys Leu Asp Phe Thr Gly Gly Pro Leu Ala Gly50 55 60Cys Leu Tyr Phe Phe Gln Val Glu Cys Asn Lys Phe Glu Glu Gly Tyr65 70 75 80His Ile His Val Val Ile Gly Gly Pro Gly Leu Asn Pro Arg Asn Leu85 90 95Thr Val Cys Val Glu Gly Leu Phe Asn Asn Val Leu Tyr His Leu Val100 105 110Thr Glu Asn Leu Lys Leu Lys Phe Leu Pro Gly Met Thr Thr Lys Gly115 120 125Lys Tyr Phe Arg Asp Gly Glu Gln Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Met Lys130 135 140Lys Ile Pro Leu Asn Val Val Trp Cys Val Thr Asn Ile Asp Gly His145 150 155 160Ile Asp Thr Cys Ile Ser Ala Thr Phe Arg Lys Gly Ala Cys His Ala165 170 175Lys Lys Pro Arg Ile Thr Thr Ala Ile Asn Asp Thr Ser Thr Asp Ala180 185 190Gly Glu Ser Ser Gly Thr Gly Ala Glu Val Val Pro Phe Asn Gly Lys195 200 205Gly Thr Lys Ala Ser Ile Lys Phe Gln Thr Met Val Asn Trp Leu Cys210 215 220Glu Asn Arg Val Phe Thr Glu Asp Lys Trp Lys Leu Val Asp Phe Asn225 230 235 240Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Ser Ser His Ser Gly Ser Phe Gln Ile Gln245 250 255Ser Ala Leu Lys Leu Ala Ile Tyr Lys Ala Thr Asn Leu Val Pro Thr260 265 270Ser Thr Phe Leu Leu His Thr Asp Phe Glu Gln Val Met Cys Ile Lys275 280 285Asn Asn Lys Ile Val Lys Leu Leu Leu Cys Gln Asn Tyr Asp Pro Leu290 295 300Leu Val Gly Gln His Val Leu Lys Trp Ile Asp Lys Lys Cys Gly Lys305 310 315 320Lys Asn Thr Leu Trp Phe Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Gly Lys Thr Asn325 330 335Leu Ala Met Ala Ile Ala Lys Ser Val Pro Val Tyr Gly Met Val Asn340 345 350
Trp Asn Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Val Ala Gly Lys Ser Leu355 360 365Val Val Trp Asp Glu Gly Ile Ile Lys Ser Thr Ile Val Glu Ala Ala370 375 380Lys Ala Ile Leu Gly Gly Gln Pro Thr Arg Val Asp Gln Lys Met Arg385 390 395 400Gly Ser Val Ala Val Pro Gly Val Pro Val Val Ile Thr Ser Asn Gly405 410 415Asp Ile Thr Phe Val Val Ser Gly Asn Thr Thr Thr Thr Val His Ala420 425 430Lys Ala Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Leu Asn Phe Thr Val Arg Cys435 440 445Ser Pro Asp Met Gly Leu Leu Thr Glu Ala Asp Val Gln Gln Trp Leu450 455 460Thr Trp Cys Asn Ala Gln Ser Trp Asp His Tyr Glu Asn Trp Ala Ile465 470 475 480Asn Tyr Thr Phe Asp Phe Pro Gly Ile Asn Ala Asp Ala Leu His Pro485 490 495Asp Leu Gln Thr Thr Pro lle Val Thr Asp Thr Ser Ile Ser Ser Ser500 505 510Gly Gly Glu Ser Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ser Ser Phe Phe Asn Leu515 520 525Ile Thr Pro Gly Ala Trp Asn Thr Glu Thr Pro Arg Ser Ser Thr Pro530 535 540Ile Pro Gly Thr Ser Ser Gly Glu Ser Ser Val Gly Ser Pro Val Ser545 550 555 560Ser Glu Val Val Ala Ala Ser Trp Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Pro Leu565 570 575Ala Asp Gln Phe Arg Glu Leu Leu Val Gly Val Asp Tyr Val Trp Asp580 585 590Gly Val Arg Gly Leu Pro Val Cys Cys Val Gln His Ile Asn Asn Ser595 600 605Gly Gly Gly Leu Gly Leu Cys Pro His Cys Ile Asn Val Gly Ala Trp610 615 620Tyr Asn Gly Trp Lys Phe Arg Glu Phe Thr Pro Asp Leu Val Arg Cys625 630 635 640Ser Cys His Val Gly Ala Ser Asn Pro Phe Ser Val Leu Thr Cys Lys645 650 655Lys Cys Ala Tyr Leu Ser Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Tyr Glu660 665 670<210> 26<211> 2380<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP1<400> 26atactcaagc ttacaaaaca aaatgagtaa agaaagtggc aaatggtggg aaagtgatga 60taaatttgct aaagctgtgt atcagcaatt tgtggaattt tatgaaaagg ttactggaac 120agacttagag cttattcaaa tattaaaaga tcattataat atttctttag ataatcccct 180agaaaaccca tcctctttgt ttgacttagt tgctcgtatt aaaaataacc ttaaaaactc 240tccagactta tatagtcatc attttcaaag tcatggacag ttatctgacc acccccatgc 300cttatcatcc agtagcagtc atgcagaacc tagaggagaa gatgcagtat tatctagtga 360agacttacac aagcctgggc aagttagcgt acaactaccc ggtactaact atgttgggcc 420tggcaatgag ctacaagctg ggcccccgca aagtgctgtt gacagtgctg caaggattca 480tgactttagg tatagccaac tggctaagtt gggaataaat ccatatactc attggactgt 540agcagatgaa gagcttttaa aaaatataaa aaatgaaact gggtttcaag cacaagtagt 600aaaagactac tttactttaa aaggtgcagc tgcccctgtg gcccattttc aaggaagttt 660gccggaagtt cccgcttaca acgcctcaga aaaataccca agcatgactt cagttaattc 720tgcagaagcc agcactggtg caggaggggg gggcagtaat cctgtgaaaa gcatgtggag 780tgagggggcc acttttagtg ccaactctgt aacttgtaca ttttccagac aatttttaat 840tccatatgac ccagagcacc attataaggt gttttctccc gcagcaagta gctgccacaa 900tgccagtgga aaggaggcaa aggtttgcac cattagtccc ataatgggat actcaacccc 960atggagatat ttagatttta atgctttaaa tttatttttt tcacctttag agtttcagca 1020cttaattgaa aattatggaa gtatagctcc tgatgcttta actgtaacca tatcagaaat 1080tgctgttaag gatgttacgg acaaaactgg agggggggtg caggttactg acagcactac 1140agggcgccta tgcatgttag tagaccatga atataagtac ccatatgtgt tagggcaagg 1200tcaagatact ttagccccag aacttcctat ttgggtatac tttccccctc aatacgctta 1260cttaacagta ggagatgtta acacacaagg aatttctgga gacagcaaaa aattggcaag 1320tgaagaatca gcattttatg ttttggaaca cagttctttt cagcttttag gtacaggagg 1380tacagcaact atgtcttata agtttcctcc agtgccccca gaaaatttag agggctgcag 1440tcaacacttt tatgaaatgt acaacccctt atacggatcc cgcttagggg ttcctgacac 1500attaggaggt gacccaaaat ttagatcttt aacacatgaa gaccatgcaa ttcagcccca 1560aaacttcatg ccagggccac tagtaaactc agtgtctaca aaggagggag acagctctag 1620tactggagct ggaaaagcct taacaggcct tagcacaggt acctctcaaa acactagaat 1680atccttacgc cctgggccag tgtctcagcc gtaccaccac tgggacacag ataaatatgt 1740cacaggaata aatgccattt ctcatggtca gaccacttat ggtaacgctg aagacaaaga 1800gtatcagcaa ggagtgggta gatttccaaa tgaaaaagaa cagctaaaac agttacaggg 1860tttaaacatg cacacctact ttcccaataa aggaacccag caatatacag atcaaattga 1920gcgcccccta atggtgggtt ctgtatggaa cagaagagcc cttcactatg aaagccagct 1980gtggagtaaa attccaaatt tagatgacag ttttaaaact cagtttgcag ccttaggagg 2040atggggtttg catcagccac ctcctcaaat atttttaaaa atattaccac aaagtgggcc 2100aattggaggt attaaatcaa tgggaattac taccttagtt cagtatgccg tgggaattat 2160gacagtaacc atgacattta aattggggcc ccgtaaagct acgggacggt ggaatcctca 2220acctggagtg tatcccccgc acgcagcagg tcatttacca tatgtactat atgaccccac 2280agctacagat gcaaaacaac accacagaca tggatatgaa aagcctgaag aattgtggac 2340agccaaaagc cgtgtgcacc cattgtaagt cgacatactc 2380<210> 27<211> 781<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP1氨基酸<400> 27Met Ser Lys Glu Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala1 5 10 15Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val Thr Gly20 25 30Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser35 40 45Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala
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Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val405 410 415Gly Asp Val Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala420 425 430Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu435 440 445Leu Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val450 455 460Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr465 470 475 480Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly485 490 495Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro500 505 510Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu515 520 525Gly Asp Ser Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser530 535 540Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val545 550 555 560Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile565 570 575Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala GLu Asp Lys580 585 590Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu595 600 605Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly610 615 620Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser625 630 635 640Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys645 650 655Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly660 665 670Gly Trp Gly Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu675 680 685Pro Gln Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr690 695 700Leu Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys705 710 715 720Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val725 730 735Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro740 745 750
Thr Ala Thr Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro755 760 765Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu770 775 780<210> 28<211> 1699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP2<400> 28atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcactggtgc 60aggagggggg ggcagtaatc ctgtgaaaag catgtggagt gagggggcca cttttagtgc 120caactctgta acttgtacat tttccagaca atttttaatt ccatatgacc cagagcacca 180ttataaggtg ttttctcccg cagcaagtag ctgccacaat gccagtggaa aggaggcaaa 240ggtttgcacc attagtccca taatgggata ctcaacccca tggagatatt tagattttaa 300tgctttaaat ttattttttt cacctttaga gtttcagcac ttaattgaaa attatggaag 360tatagctcct gatgctttaa ctgtaaccat atcagaaatt gctgttaagg atgttacgga 420caaaactgga gggggggtgc aggttactga cagcactaca gggcgcctat gcatgttagt 480agaccatgaa tataagtacc catatgtgtt agggcaaggt caagatactt tagccccaga 540acttcctatt tgggtatact ttccccctca atacgcttac ttaacagtag gagatgttaa 600cacacaagga atttctggag acagcaaaaa attggcaagt gaagaatcag cattttatgt 660tttggaacac agttcttttc agcttttagg tacaggaggt acagcaacta tgtcttataa 720gtttcctcca gtgcccccag aaaatttaga gggctgcagt caacactttt atgaaatgta 780caacccctta tacggatccc gcttaggggt tcctgacaca ttaggaggtg acccaaaatt 840tagatcttta acacatgaag accatgcaat tcagccccaa aacttcatgc cagggccact 900agtaaactca gtgtctacaa aggagggaga cagctctagt actggagctg gaaaagcctt 960aacaggcctt agcacaggta cctctcaaaa cactagaata tccttacgcc ctgggccagt 1020gtctcagccg taccaccact gggacacaga taaatatgtc acaggaataa atgccatttc 1080tcatggtcag accacttatg gtaacgctga agacaaagag tatcagcaag gagtgggtag 1140atttccaaat gaaaaagaac agctaaaaca gttacagggt ttaaacatgc acacctactt 1200tcccaataaa ggaacccagc aatatacaga tcaaattgag cgccccctaa tggtgggttc 1260tgtatggaac agaagagccc ttcactatga aagccagctg tggagtaaaa ttccaaattt 1320agatgacagt tttaaaactc agtttgcagc cttaggagga tggggtttgc atcagccacc 1380tcctcaaata tttttaaaaa tattaccaca aagtgggcca attggaggta ttaaatcaat 1440gggaattact accttagttc agtatgccgt gggaattatg acagtaacca tgacatttaa 1500attggggccc cgtaaagcta cgggacggtg gaatcctcaa cctggagtgt atcccccgca 1560cgcagcaggt catttaccat atgtactata tgaccccaca gctacagatg caaaacaaca 1620ccacagacat ggatatgaaa agcctgaaga attgtggaca gccaaaagcc gtgtgcaccc 1680attgtaagtc gacatactc 1699<210> 29<211> 554<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B1获得的VP2氨基酸<400> 29Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Gly Gly1 5 10 15Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thr Phe Ser20 25 30Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu Ile Pro Tyr35 40 45
Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala Ser Ser Cys50 55 60His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile Ser Pro Ile65 70 75 80Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn Ala Leu Asn85 90 95Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly100 105 110Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu Ile Ala Val115 120 125Lys Asp Val Thr Asp Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser130 135 140Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro145 150 155 160Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile165 170 175Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val180 185 190Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu195 200 205Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly Thr210 215 220Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu225 230 235 240Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu245 250 255Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly Asp Pro Lys260 265 270Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro Gln Asn Phe275 280 285Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu Gly Asp Ser290 295 300Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Thr Gly Thr305 310 315 320Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val Ser Gln Pro325 330 335Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile340 345 350Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln355 360 365Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu370 375 380Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln385 390 395 400
Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn405 410 415Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn420 425 430Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly435 440 445Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln Ser450 455 460Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu Val Gln465 470 475 480Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys Leu Gly Pro485 490 495Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val Tyr Pro Pro500 505 510His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro Thr Ala Thr515 520 525Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu530 535 540Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu545 550<210> 30<211> 2049<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B6获得的NS1<400> 30atactcttcg aacaaaacaa aatggagcta tttagagggg tgcttcaagt ttcttctaat 60gttctggact gtgctaacga taactggtgg tgctctttac tggatttaga cacttctgac 120tgggaaccac taactcatac taacagacta atggcaatat acttaagcag tgtggcttct 180aagcttgact ttactggggg gccactagca gggtgcttgt acttttttca agtagaatgt 240aacaaatttg aagaaggcta tcatattcat gtggttattg gggggccagg gttaaacccc 300agaaacctca cagtgtgtgt agaggggtta tttaataatg tactttatca ccttgtaact 360gaaaatctga agctaaaatt tttgccagga atgactacaa aaggcaaata ctttagagat 420ggagagcagt ttatagaaaa ctatttaatg aaaaaaatac ctttaaatgt tgtatggtgt 480gttactaata ttgatggaca tatagatacc tgtatttctg ctacttttag aaagggagct 540tgccatgcca agaaaccccg catcaccaca gccataaatg atactagtac tgatgctggg 600gagtctagcg gcacaggggc agaggttgtg ccatttaatg ggaagggaac taaggctagc 660ataaagtttc aaactatggt aaactggttg tgtgaaaaca gagtgtttac agaggataag 720tggaaactag ttgactttaa ccagtacact ttactaagca gtagtcacag tggaagtttt 780caaattcaaa gtgcactaaa actagcaatt tataaagcaa ctaatttagt gcctactagc 840acatttttat tgcatacaga ctttgagcaa gttatgtgta ttaaagacaa taaaattgtt 900aaattgttac tttgtcaaaa ctatgacccc ctattagtgg ggcagcatgt gttaaagtgg 960attgataaaa aatgtggcaa gaaaaacaca ctgtggtttt atggaccgcc aagtacaggg 1020aaaacaaact tggcaatggc cattgctaaa agtgttccag tatatggcat ggttaactgg 1080aataatgaaa actttccatt taatgatgta gcaggaaaaa gcttggtggt ctgggatgaa 1140ggtattatta agtctacaat tgtagaagct gcaaaagcca ttttaggcgg gcaacccacc 1200agggtagatc aaaaaatgcg tggaagtgta gctgtgcctg gagtacccgt ggttataacc 1260agcaatggtg acattacttt tgttgtaagc gggaacacta caacaactgt acatgctaaa 1320gccttaaaag agcgcatggt aaagttaaac tttactgtaa gatgcagccc tgacatgggg 1380
ttactaacag aggctgatgt acaacagtgg cttacatggt gtaatgcaca aagctgggac 1440cactatgaaa actgggcaat aaactacact tttgatttcc ctggaattaa tgcagatgcc 1500ctccacccag acctccaaac caccccaatt gtcacagaca ccagtatcag cagcagtggt 1560ggtgaaagct ctgaagaact cagtgaaagc agctttttta acctcatcac cccaggcgcc 1620tggaacactg aaaccccgcg ctctagtacg cccatccccg ggaccagttc aggagaatca 1680tctgtcggaa gcccagtttc ctccgaagtt gtagctgcat cgtgggaaga agccttctac 1740acacctttgg cagaccagtt tcgtgaactg ttagttgggg ttgattatgt gtgggacggt 1800gtaaggggtt tacctgtctg ttgtgtgcaa catattaaca atagtggggg aggcttggga 1860ctttgtcccc attgcattaa tgtaggggct tggtataatg gatggaaatt tcgagaattt 1920accccagatt tggtgcgatg tagctgccat gtgggagctt ctaatccctt ttctgtgcta 1980acctgcaaaa aatgtgctta cctgtctgga ttgcaaagct ttgtagatta tgagtaagtc 2040gacatactc 2049<210> 31<211> 671<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B6获得的NS1氨基酸<400> 31Met Glu Leu Phe Arg Gly Val Leu Gln Val Ser Ser Asn Val Leu Asp1 5 10 15Cys Ala Asn Asp Asn Trp Trp Cys Ser Leu Leu Asp Leu Asp Thr Ser20 25 30Asp Trp Glu Pro Leu Thr His Thr Asn Arg Leu Met Ala Ile Tyr Leu35 40 45Ser Ser Val Ala Ser Lys Leu Asp Phe Thr Gly Gly Pro Leu Ala Gly50 55 60Cys Leu Tyr Phe Phe Gln Val Glu Cys Asn Lys Phe Glu Glu Gly Tyr65 70 75 80His Ile His Val Val Ile Gly Gly Pro Gly Leu Asn Pro Arg Asn Leu85 90 95Thr Val Cys Val Glu Gly Leu Phe Asn Asn Val Leu Tyr His Leu Val100 105 110Thr Glu Asn Leu Lys Leu Lys Phe Leu Pro Gly Met Thr Thr Lys Gly115 120 125Lys Tyr Phe Arg Asp Gly Glu Gln Phe Ile Glu Asn Tyr Leu Met Lys130 135 140Lys Ile Pro Leu Asn Val Val Trp Cys Val Thr Asn Ile Asp Gly His145 150 155 160Ile Asp Thr Cys Ile Ser Ala Thr Phe Arg Lys Gly Ala Cys His Ala165 170 175Lys Lys Pro Arg Ile Thr Thr Ala Ile Asn Asp Thr Ser Thr Asp Ala180 185 190Gly Glu Ser Ser Gly Thr Gly Ala Glu Val Val Pro Phe Asn Gly Lys195 200 205Gly Thr Lys Ala Ser Ile Lys Phe Gln Thr Met Val Asn Trp Leu Cys210 215 220Glu Asn Arg Val Phe Thr Glu Asp Lys Trp Lys Leu Val Asp Phe Asn
225 230 235 240Gln Tyr Thr Leu Leu Ser Ser Ser His Ser Gly Ser Phe Gln Ile Gln245 250 255Ser Ala Leu Lys Leu Ala Ile Tyr Lys Ala Thr Asn Leu Val Pro Thr260 265 270Ser Thr Phe Leu Leu His Thr Asp Phe Glu Gln Val Met Cys Ile Lys275 280 285Asp Asn Lys Ile Val Lys Leu Leu Leu Cys Gln Asn Tyr Asp Pro Leu290 295 300Leu Val Gly Gln His Val Leu Lys Trp Ile Asp Lys Lys Cys Gly Lys305 310 315 320Lys Asn Thr Leu Trp Phe Tyr Gly Pro Pro Ser Thr Gly Lys Thr Asn325 330 335Leu Ala Met Ala Ile Ala Lys Ser Val Pro Val Tyr Gly Met Val Asn340 345 350Trp Asn Asn Glu Asn Phe Pro Phe Asn Asp Val Ala Gly Lys Ser Leu355 360 365Val Val Trp Asp Glu Gly Ile Ile Lys Ser Thr Ile Val Glu Ala Ala370 375 380Lys Ala Ile Leu Gly Gly Gln Pro Thr Arg Val Asp Gln Lys Met Arg385 390 395 400Gly Ser Val Ala Val Pro Gly Val Pro Val Val Ile Thr Ser Asn Gly405 410 415Asp Ile Thr Phe Val yal Ser Gly Asn Thr Thr Thr Thr Val His Ala420 425 430Lys Ala Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Leu Asn Phe Thr Val Arg Cys435 440 445Ser Pro Asp Met Gly Leu Leu Thr Glu Ala Asp Val Gln Gln Trp Leu450 455 460Thr Trp Cys Asn Ala Gln Ser Trp Asp His Tyr Glu Asn Trp Ala Ile465 470 475 480Asn Tyr Thr Phe Asp Phe Pro Gly Ile Asn Ala Asp Ala Leu His Pro485 490 495Asp Leu Gln Thr Thr Pro Ile Val Thr Asp Thr Ser Ile Ser Ser Ser500 505 510Gly Gly Glu Ser Ser Glu Glu Leu Ser Glu Ser Ser Phe Phe Asn Leu515 520 525Ile Thr Pro Gly Ala Trp Asn Thr Glu Thr Pro Arg Ser Ser Thr Pro530 535 540Ile Pro Gly Thr Ser Ser Gly Glu Ser Ser Val Gly Ser Pro Val Ser545 550 555 560Ser Glu Val Val Ala Ala Ser Trp Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Pro Leu565 570 575
Ala Asp Gln Phe Arg Glu Leu Leu Val Gly Val Asp Tyr Val Trp Asp580 585 590Gly Val Arg Gly Leu Pro Val Cys Cys Val Gln His Ile Asn Asn Ser595 600 605Gly Gly Gly Leu Gly Leu Cys Pro His Cys Ile Asn Val Gly Ala Trp610 615 620Tyr Asn Gly Trp Lys Phe Arg Glu Phe Thr Pro Asp Leu Val Arg Cys625 630 635 640Ser Cys His Val Gly Ala Ser Asn Pro Phe Ser Val Leu Thr Cys Lys645 650 655Lys Cys Ala Tyr Leu Ser Gly Leu Gln Ser Phe Val Asp Tyr Glu660 665 670<210> 32<211> 2380<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP1<400> 32atactcaagc ttacaaaaca aaatgagtaa agaaagtggc aaatggtggg aaagtgatga 60taaatttgct aaagctgtgt atcagcaatt tgtggaattt tatgaaaagg ttactggaac 120agacttagag cttattcaaa tattaaaaga tcattataat atttctttag ataatcccct 180agaagaccca tcctctttgt ttgacttagt tgctcgtatt aaaaataacc ttaaaaactc 240tccagactta tatagtcatc attttcaaag tcatggacag ttatctgacc acccccatgc 300cttatcatcc agtagcagtc atgcagaacc tagaggagaa gatgcagtat tatctagtga 360agacttacac aagcctgggc aagttagcgt acaactaccc ggtactaact atgttgggcc 420tggcaatgag ctacaagctg ggcccccgca aagtgctgtt gacagtgctg caaggattca 480tgactttagg tatagccaac tggctaagtt gggaataaat ccatatactc attggactgt 540agcagatgaa gagcttttaa aaaatataaa aaatgaaact gggtttcaag cacaagtagt 600aaaagactac tttactttaa aaggtgcagc tgcccctgtg gcccattttc aaggaagttt 660gccggaagtt cccgcttaca acgcctcaga aaaataccca agcatgactt cagttaattc 720tgcagaagcc agcactggtg caggaggggg gggcagtaat cctgtgaaaa gcatgtggag 780tgagggggcc acttttagtg ccaactctgt aacttgtaca ttttccagac aatttttaat 840tccatatgac ccagagcacc attataaggt gttttctccc gcagcaagta gctgccacaa 900tgccagtgga aaggaggcaa aggtttgcac cattagtccc ataatgggat actcaacccc 960atggagatat ttagatttta atgctttaaa tttatttttt tcacctttag agtttcagca 1020cttaattgaa aattatggaa gtatagctcc tgatgcttta actgtaacca tatcagaaat 1080tgctgttaag gatgttacaa acaaaactgg agggggggtg caggttactg acagcactac 1140agggcgccta tgcatgttag tagaccatga atataagtac ccatatgtgt tagggcaagg 1200tcaagatact ttagccccag aacttcctat ttgggtatac tttccccctc aatacgctta 1260cttaacagta ggagatgtta acacacaagg aatttctgga gacagcaaaa aattggcaag 1320tgaagaatca gcattttatg ttttggaaca cagttctttt cagcttttag gtacaggagg 1380tacagcaact atgtcttata agtttcctcc agtgccccca gaaaatttag agggctgcag 1440tcaacacttt tatgaaatgt acaacccctt atacggatcc cgcttagggg ttcctgacac 1500attaggaggt gacccaaaat ttagatcttt aacacatgaa gaccatgcaa ttcagcccca 1560aaacttcatg ccagggccac tagtaaactc agtgtctaca aaggagggag acagctctag 1620tactggagct ggaaaagcct taacaggcct tagcacaggt acctctcaaa acactagaat 1680atccttacgc cctgggccag tgtctcagcc gtaccaccac tgggacacag ataaatatgt 1740cacaggaata aatgccattt ctcatggtca gaccacttat ggtaacgctg aagacaaaga 1800gtatcagcaa ggagtgggta gatttccaaa tgaaaaagaa cagctaaaac agttacaggg 1860tttaaacatg cacacctact ttcccaataa aggaacccag caatatacag atcaaattga 1920gcgcccccta atggtgggtt ctgtatggaa cagaagagcc cttcactatg aaagccagct 1980gtggagtaaa attccaaatt tagatgacag ttttaaaact cagtttgcag ccttaggagg 2040atggggtttg catcagccac ctcctcaaat attcttaaaa atattaccac aaagtgggcc 2100aattggaggt attaaatcaa tgggaattac taccttagtt cagtatgccg tgggaattat 2160
gacagtaacc atgacattta aattggggcc ccgtaaagct acgggacggt ggaatcctca 2220acctggagtg tatcccccgc acgcagcagg tcatttacca tatgtactat atgaccccac 2280agctacagat gcaaaacaac gccacggaca tggatatgaa aagcctgaag aattgtggac 2340agccaaaagc cgtgtgcacc cattgtaagt cgacatactc 2380<210> 33<211> 781<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP1氨基酸<400> 33Met Ser Lys Glu Ser Gly Lys Trp Trp Glu Ser Asp Asp Lys Phe Ala1 5 10 15Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Val Glu Phe Tyr Glu Lys Val Thr Gly20 25 30Thr Asp Leu Glu Leu Ile Gln Ile Leu Lys Asp His Tyr Asn Ile Ser35 40 45Leu Asp Asn Pro Leu Glu Asn Pro Ser Ser Leu Phe Asp Leu Val Ala50 55 60Arg Ile Lys Asn Asn Leu Lys Asn Ser Pro Asp Leu Tyr Ser His His65 70 75 80Phe Gln Ser His Gly Gln Leu Ser Asp His Pro His Ala Leu Ser Ser85 90 95Ser Ser Ser His Ala Glu Pro Arg Gly Glu Asp Ala Val Leu Ser Ser100 105 110Glu Asp Leu His Lys Pro Gly Gln Val Ser Val Gln Leu Pro Gly Thr115 120 125Asn Tyr Val Gly Pro Gly Asn Glu Leu Gln Ala Gly Pro Pro Gln Ser130 135 140Ala Val Asp Ser Ala Ala Arg Ile His Asp Phe Arg Tyr Ser Gln Leu145 150 155 160Ala Lys Leu Gly Ile Asn Pro Tyr Thr His Trp Thr Val Ala Asp Glu165 170 175Glu Leu Leu Lys Asn Ile Lys Asn Glu Thr Gly Phe Gln Ala Gln Val180 185 190Val Lys Asp Tyr Phe Thr Leu Lys Gly Ala Ala Ala Pro Val Ala His195 200 205Phe Gln Gly Ser Leu Pro Glu Val Pro Ala Tyr Asn Ala Ser Glu Lys210 215 220Tyr Pro Ser Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala225 230 235 240Gly Gly Gly Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala245 250 255Thr Phe Ser Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu260 265 270
Ile Pro Tyr Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala275 280 285Ser Ser Cys His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile290 295 300Ser Pro Ile Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn305 310 315 320Ala Leu Asn Leu Phe Glu Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu325 330 335Asn Tyr Gly Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu340 345 350Ile Ala Val Lys Asp Val Thr Asn Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val355 360 365Thr Asp Ser Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr370 375 380Lys Tyr Pro Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu385 390 395 400Leu Pro Ile Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val405 410 415Gly Asp Val Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala420 425 430Ser Glu Glu Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu435 440 445Leu Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val450 455 460Pro Pro Glu Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr465 470 475 480Asn Pro Leu Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly485 490 495Asp Pro Lys Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro500 505 510Gln Asn Phe Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu515 520 525Gly Asp Ser Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser530 535 540Thr Gly Thr Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val545 550 555 560Ser Gln Pro Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile565 570 575Asn Ala Ile Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys580 585 590Glu Tyr Gln Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu595 600 605Lys Gln Leu Gln Gly Leu Asn Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly610 615 620
Thr Gln Gln Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser625 630 635 640Val Trp Asn Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys645 650 655Ile Pro Asn Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly660 665 670Gly Trp Gly Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu675 680 685Pro Gln Ser Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr690 695 700Leu Val Gln Tyr Ala Val Gly Ile Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys705 710 715 720Leu Gly Pro Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val725 730 735Tyr Pro Pro His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro740 745 750Thr Ala Thr Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro755 760 765Glu Glu Leu Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu770 775 780<210> 34<211> 1699<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP2<400> 34atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcactggtgc 60aggagggggg ggcagtaatc ctgtgaaaag catgtggagt gagggggcca cttttagtgc 120caactctgta acttgtacat tttccagaca atttttaatt ccatatgacc cagagcacca 180ttataaggtg ttttctcccg cagcaagtag ctgccacaat gccagtggaa aggaggcaaa 240ggtttgcacc attagtccca taatgggata ctcaacccca tggagatatt tagattttaa 300tgctttaaat ttattttttt cacctttaga gtttcagcac ttaattgaaa attatggaag 360tatagctcct gatgctttaa ctgtaaccat atcagaaatt gctgttaagg atgttacaaa 420caaaactgga gggggggtgc aggttactga cagcactaca gggcgcctat gcatgttagt 480agaccatgaa tataagtacc catatgtgtt agggcaaggt caagatactt tagccccaga 540acttcctatt tgggtatact ttccccctca atacgcttac ttaacagtag gagatgttaa 600cacacaagga atttctggag acagcaaaaa attggcaagt gaagaatcag cattttatgt 660tttggaacac agttcttttc agcttttagg tacaggaggt acagcaacta tgtcttataa 720gtttcctcca gtgcccccag aaaatttaga gggctgcagt caacactttt atgaaatgta 780caacccctta tacggatccc gcttaggggt tcctgacaca ttaggaggtg acccaaaatt 840tagatcttta acacatgaag accatgcaat tcagccccaa aacttcatgc cagggccact 900agtaaactca gtgtctacaa aggagggaga cagctctagt actggagctg gaaaagcctt 960aacaggcctt agcacaggta cctctcaaaa cactagaata tccttacgcc ctgggccagt 1020gtctcagccg taccaccact gggacacaga taaatatgtc acaggaataa atgccatttc 1080tcatggtcag accacttatg gtaacgctga agacaaagag tatcagcaag gagtgggtag 1140atttccaaat gaaaaagaac agctaaaaca gttacagggt ttaaacatgc acacctactt 1200tcccaataaa ggaacccagc aatatacaga tcaaattgag cgccccctaa tggtgggttc 1260tgtatggaac agaagagccc ttcactatga aagccagctg tggagtaaaa ttccaaattt 1320agatgacagt tttaaaactc agtttgcagc cttaggagga tggggtttgc atcagccacc 1380tcctcaaata tttttaaaaa tattaccaca aagtgggcca attggaggta ttaaatcaat 1440
gggaattact accttagttc agtatgccgt gggaattatg acagtaacca tgacatttaa 1500attggggccc cgtaaagcta cgggacggtg gaatcctcaa cctggagtgt atcccccgca 1560cgcagcaggt catttaccat atgtactata tgaccccaca gctacagatg caaaacaaca 1620ccacagacat ggatatgaaa agcctgaaga attgtggaca gccaaaagcc gtgtgcaccc 1680attgtaagtc gacatactc 1699<210> 35<211> 554<212> PRT<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述从细小病毒B19克隆2-B6获得的VP2氨基酸<400> 35Met Thr Ser Val Asn Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Ala Gly Gly Glyl 5 10 15Gly Ser Asn Pro Val Lys Ser Met Trp Ser Glu Gly Ala Thr Phe Ser20 25 30Ala Asn Ser Val Thr Cys Thr Phe Ser Arg Gln Phe Leu Ile Pro Tyr35 40 45Asp Pro Glu His His Tyr Lys Val Phe Ser Pro Ala Ala Ser Ser Cys50 55 60His Asn Ala Ser Gly Lys Glu Ala Lys Val Cys Thr Ile Ser Pro Ile65 70 75 80Met Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Arg Tyr Leu Asp Phe Asn Ala Leu Asn85 90 95Leu Phe Phe Ser Pro Leu Glu Phe Gln His Leu Ile Glu Asn Tyr Gly100 105 110Ser Ile Ala Pro Asp Ala Leu Thr Val Thr Ile Ser Glu lle Ala Val115 120 125Lys Asp Val Thr Asn Lys Thr Gly Gly Gly Val Gln Val Thr Asp Ser130 135 140Thr Thr Gly Arg Leu Cys Met Leu Val Asp His Glu Tyr Lys Tyr Pro145 150 155 160Tyr Val Leu Gly Gln Gly Gln Asp Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Ile165 170 175Trp Val Tyr Phe Pro Pro Gln Tyr Ala Tyr Leu Thr Val Gly Asp Val180 185 190Asn Thr Gln Gly Ile Ser Gly Asp Ser Lys Lys Leu Ala Ser Glu Glu195 200 205Ser Ala Phe Tyr Val Leu Glu His Ser Ser Phe Gln Leu Leu Gly Thr210 215 220Gly Gly Thr Ala Thr Met Ser Tyr Lys Phe Pro Pro Val Pro Pro Glu225 230 235 240Asn Leu Glu Gly Cys Ser Gln His Phe Tyr Glu Met Tyr Asn Pro Leu245 250 255Tyr Gly Ser Arg Leu Gly Val Pro Asp Thr Leu Gly Gly Asp Pro Lys260 265 270
Phe Arg Ser Leu Thr His Glu Asp His Ala Ile Gln Pro Gln Asn Phe275 280 285Met Pro Gly Pro Leu Val Asn Ser Val Ser Thr Lys Glu Gly Asp Ser290 295 300Ser Ser Thr Gly Ala Gly Lys Ala Leu Thr Gly Leu Ser Thr Gly Thr305 310 315 320Ser Gln Asn Thr Arg Ile Ser Leu Arg Pro Gly Pro Val Ser Gln Pro325 330 335Tyr His His Trp Asp Thr Asp Lys Tyr Val Thr Gly Ile Asn Ala Ile340 345 350Ser His Gly Gln Thr Thr Tyr Gly Asn Ala Glu Asp Lys Glu Tyr Gln355 360 365Gln Gly Val Gly Arg Phe Pro Asn Glu Lys Glu Gln Leu Lys Gln Leu370 375 380Gln Gly Leu ASh Met His Thr Tyr Phe Pro Asn Lys Gly Thr Gln Gln385 390 395 400Tyr Thr Asp Gln Ile Glu Arg Pro Leu Met Val Gly Ser Val Trp Asn405 410 415Arg Arg Ala Leu His Tyr Glu Ser Gln Leu Trp Ser Lys Ile Pro Asn420 425 430Leu Asp Asp Ser Phe Lys Thr Gln Phe Ala Ala Leu Gly Gly Trp Gly435 440 445Leu His Gln Pro Pro Pro Gln Ile Phe Leu Lys Ile Leu Pro Gln Ser450 455 460Gly Pro Ile Gly Gly Ile Lys Ser Met Gly Ile Thr Thr Leu Val Gln465 470 475 480Tyr Ala Val Gly lle Met Thr Val Thr Met Thr Phe Lys Leu Gly Pro485 490 495Arg Lys Ala Thr Gly Arg Trp Asn Pro Gln Pro Gly Val Tyr Pro Pro500 505 510His Ala Ala Gly His Leu Pro Tyr Val Leu Tyr Asp Pro Thr Ala Thr515 520 525Asp Ala Lys Gln His His Arg His Gly Tyr Glu Lys Pro Glu Glu Leu530 535 540Trp Thr Ala Lys Ser Arg Val His Pro Leu545 550<210> 36<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP-5<400> 36
aggaagtttg ccggaagttc 20<210> 37<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP-3<400> 37gtgctgaaac tctaaaggtg 20<210> 38<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP2-5<400> 38gacatggata tgaaaagcct gaag24<210> 39<211> 24<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP2-3<400> 39gttgttcata tctggttaag tact24<210> 40<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物K-1sp<400> 40ataaatccat atactcatt 19<210> 41<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物K-2sp<400> 41ctaaagtatc ctgaccttg 19<210> 42<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Hicks-5
<400> 42cccgccttat gcaaatgggc ag 22<210> 43<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Hicks-3<400> 43ttgtgttagg ctgtcttata gg 22<210> 44<211> 54<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物NS1-5<400> 44atactctcta gacaaaacaa aatggagcta tttagagggg tgcttcaagt ttct 54<210> 45<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物NS1-3<400> 45gagtatgtcg acttactcat aatctacaaa gctttgcaat ccagacag 48<210> 46<211> 55<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP1-5SN<400> 46atactcaagc ttacaaaaca aaatgagtaa agaaagtggc aaatggtggg aaagt 55<210> 47<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VPALL-3<400> 47gagtatgtcg acttacaatg ggtgcacacg gcttttggct gtccacaatt c 51<210> 48<211> 55<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VP2-5SN<400> 48atactcaagc ttacaaaaca aaatgacttc agttaattct gcagaagcca gcact 55<210> 49<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC1<400> 49aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atccttaaca gcaatttctg ata 43<210> 50<211> 39<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC2<400> 50aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa cgccctgtag tgctgtcag39<210> 51<211> 42<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC3<400> 51aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tatacccaaa taggaagttc tg42<210> 52<211> 43<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC4<400> 52aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taaaatgctg attcttcact tgc 43<210> 53<211> 40<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC5<400> 53aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tgctgtacct cctgtaccta 40<210> 54<211> 40<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述VSPC6<400> 54aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agccctctaa attttctggg 40<210> 55<211> 40<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述VSPC7<400> 55aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctcctaatgt gtcaggaacc 40<210> 56<211> 51<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSA1<400> 56aattctaata cgactcacta tagggagaag gccatatact cattggactg t 51<210> 57<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSA2<400> 57aattctaata cgactcacta tagggagaag gccagagcac cattataa 48<210> 58<211> 48<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSA3<400> 58aattctaata cgactcacta tagggagaag gcacaatgcc agtggaaa 48<210> 59<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSP2<400> 59gtgctgaaac tctaaaggt 19<210> 60<211> 17<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物VSP1<400> 60ggaggcaaag gtttgca17<210> 61<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> misc_feature<222> (1)<223> 其中“c”在5’被荧光素亚磷酰胺修饰<220>
<221> misc_feature<222> (20)<223> 其中“t”在3’被DABCYL修饰<220>
<223> 人工序列的描述引物VSPPR1<400> 61cccatggaga tatttagatt 20<210> 62<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH80-1<400> 62ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaatttg 480tttttttcac ctttagagtt tcagcattta attgaaaact atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggagtacaag ttactgacag cactaccggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 63<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物CH81-3<400> 63ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240
agtaatcctg ttaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tcgcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatacttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 64<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL1-4<400> 64ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 65<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL2-1<400> 65ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 66<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL3-1<400> 66ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180
tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 67<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL4-3<400> 67ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 68<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL5-2<400> 68ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 69<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL6-2<400> 69ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120
cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 70<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL7-3<400> 70ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 71<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL8-2<400> 71ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag gttttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 72<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL9-1<400> 72
ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcaat taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag ccagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 73<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL9-9<400> 73ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 74<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL10-2<400> 74ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 75<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL11-1
<400> 75ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttat 700<210> 76<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL12-1<400> 76ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tcaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtgact 300tgtacatttt ccagacagtt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtccgataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacagacaa aactggaggg 600ggggtgcaag ttactgacag cagtacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatac 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 77<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL13-3<400> 77ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtgcatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 78<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL14-1<400> 78ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 79<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL15-3<400> 79ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 80<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL16-2<400> 80ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttat 700<210> 81<211> 700<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL17-1<400> 81ataaatccat atacttattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 82<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL18-1<400> 82ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 83<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL19-1<400> 83ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 84<211> 700<212> DNA<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL20-3<400> 84ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 85<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL21-3<400> 85ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 86<211> 700<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL22-11<400> 86ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcggg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatttag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 87<211> 700<212> DNA
<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述分离物B19SCL2-14<400> 87ataaatccat atactcattg gactgtagca gatgaagagc ttttaaaaaa tataaaaaat 60gaaactgggt ttcaagcaca agtagtaaaa gactacttta ctttaaaagg tgcagctgcc 120cctgtggccc attttcaagg aagtttgccg gaagttcccg cttacaacgc ctcagaaaaa 180tacccaagca tgacttcagt taattctgca gaagccagca ctggtgcagg aggggggggc 240agtaatcctg tgaaaagcat gtggagtgag ggggccactt ttagtgccaa ctctgtaact 300tgtacatttt ccagacaatt tttaattcca tatgacccag agcaccatta taaggtgttt 360tctcccgcag caagtagctg ccacaatgcc agtggaaagg aggcaaaggt ttgcaccatt 420agtcccataa tgggatactc aaccccatgg agatatctag attttaatgc tttaaattta 480tttttttcac ctttagagtt tcagcactta attgaaaatt atggaagtat agctcctgat 540gctttaactg taaccatatc agaaattgct gttaaggatg ttacggacaa aactggaggg 600ggggtgcagg ttactgacag cactacaggg cgcctatgca tgttagtaga ccatgaatat 660aagtacccat atgtgttagg gcaaggtcag gatactttag 700<210> 88<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Vpara8<400> 88tccatatgac ccagagcacc a 21<210> 89<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述引物Vpara9<400> 89tttccactgg cattgtggc 19<210> 90<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<220>
<221> misc_feature<222> (1)<223> 其中“a”在5’被Fam修饰<220>
<221> misc_feature<222> (21)<223> 其中“g”在3’被Tamra修饰<220>
<223> 人工序列的描述引物Vpara10<400> 90agctagacct gcatgtcact g 21<210> 91<211> 26
<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述靶序列<400> 91ctacttgctg cgggagaaaa acacct 26<210> 92<211> 681<212> DNA<213> 人工序列<220>
<223> 人工序列的描述内部对照物序列<400> 92gaattcactt gtacattttc cagacaattt ttaattccat atgacccaga gcaccattat 60acagtgacat gcaggtctag ctctgccaca atgccagtgg aaaggaggca aaggtttgca 120ccattagtcc cataatggga tactcaaccc catggagata tttagatttt aatgctttaa 180atttattttt ttcaccttta gagtttcagc acttaattga aaattatgga agtatagctc 240ctgatgcttt aactgtaacc atatcagaaa ttgctgttaa ggatgttacg gacaaaactg 300gagggggggt gcaggttact gacagcacta cagggcgcct atgcatgtta gtagaccatg 360aatataagta cccatatgtg ttagggcaag gtcaagatac tttagcccca gaacttccta 420tttgggtata ctttccccct caatacgctt acttaacagt aggagatgtt aacacacaag 480gaatttctgg agacagcaaa aaattggcaa gtgaagaatc agcattttat gttttggaac 540acagttcttt tcagctttta ggtacaggag gtacagcaac tatgtcttat aagtttcctc 600cagtgccccc agaaaattta gagggctgca gtcaacactt ttatgaaatg tacaacccct 660tatacggatc ccgctgtcga c 68权利要求
1.一种检测生物学样品中人细小病毒B19感染的方法，其特征在于，该方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分离得到的细小病毒B19核酸与第一寡核苷酸反应，该第一寡核苷酸含有第一引物，该第一引物含有与所述RNA靶序列的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，其中，所述第一引物还含有DNA依赖性RNA聚合酶5′的启动子，该启动子操作性连接于所述复合序列，所述反应在能形成寡核苷酸/靶序列复合物和启动DNA合成的条件下进行；(c)以所述RNA靶序列为模板，在延伸反应中使所述第一引物延伸，产生与所述RNA靶序列互补的第一DNA引物延伸产物；(d)用能选择性降解所述RNA靶序列的酶将所述第一DNA引物延伸产物从所述RNA靶序列中分离；(e)在形成寡核苷酸/靶序列复合物和启动DNA合成的条件下，用第二寡核苷酸处理所述DNA引物延伸产物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，该第二引物含有与所述DNA引物延伸产物的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列；(f)在DNA延伸反应中延伸所述第二引物的3′末端，产生第二DNA引物延伸产物，从而产生DNA依赖性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和能识别所述启动子序列的DNA依赖性RNA聚合酶产生所述靶序列的多个RNA拷贝；和(h)使用步骤(g)的RNA拷贝，自身催化性地重复步骤(b)到步骤(g)，以扩增所述靶序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(i)在使探针与靶序列杂交形成探针靶标复合物的条件下，将一标记的寡核苷酸探针加到步骤(h)的产物中，其中，所述寡核苷酸探针与该靶序列的一部分互补；(j)检测标记物是否存在，作为靶序列存在与否的指示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述标记物是吖啶酯。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物以及所述探针衍生自人细小病毒B19基因组的VP1区域。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物以及所述探针衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(b)中提供内部对照物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述内部对照物衍生自图12的SEQ ID NO92的序列。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述内部对照物含有SEQ IDNO90。
9.一种检测生物学样品中人细小病毒B19感染的方法，其特征在于，该方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，所述核酸含有RNA靶序列；(b)使分离得到的细小病毒B19核酸与第一寡核苷酸反应，该第一寡核苷酸含有第一引物，该第一引物含有与所述RNA靶序列的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，其中，所述第一引物还含有DNA依赖性RNA聚合酶5′的启动子，该启动子操作性连接于所述复合序列，所述第一引物含有衍生自图2A-2U或图11A-11Z任一所示的多核苷酸序列的序列，所述反应在能形成寡核苷酸/靶序列复合物和启动DNA合成的条件下进行；(c)以所述RNA靶序列为模板，在延伸反应中使所述第一引物延伸，产生与所述RNA靶序列互补的第一DNA引物延伸产物；(d)用能选择性降解所述RNA靶序列的酶将所述第一DNA引物延伸产物从所述RNA靶序列中分离；(e)在形成寡核苷酸/靶序列复合物和启动DNA合成的条件下，用第二寡核苷酸处理所述DNA引物延伸产物，所述第二寡核苷酸含有第二引物，该第二引物含有与所述DNA引物延伸产物的3′末端部分充分互补而能与其复合的复合序列，其中，所述第二引物衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(f)在DNA延伸反应中延伸所述第二引物的3′末端，产生第二DNA引物延伸产物，从而产生DNA依赖性RNA聚合酶的模板；(g)利用所述模板和识别所述启动子序列的DNA依赖性RNA聚合酶产生所述靶序列的多个RNA拷贝；和(h)使用步骤(g)的RNA拷贝，自身催化性地重复步骤(b)到步骤(g)，以扩增所述靶序列；(i)在使探针与靶序列杂交形成探针靶标复合物的条件下，将吖啶酯标记的寡核苷酸探针加到步骤(h)的产物中，其中，所述寡核苷酸探针与该靶序列的一部分互补，所述探针衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(j)检测标记物是否存在，作为靶序列存在与否的指示。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法还包括在步骤(b)提供内部对照物。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述内部对照物衍生自图12的SEQ ID NO92序列。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述内部对照物含有SEQ IDNO90。
13.一种扩增靶细小病毒B19核苷酸序列的方法，其特征在于，该方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，该核酸含有RNA靶序列；(b)加入一种或多种能与所述RNA靶序列杂交的引物，其中，所述一种或多种引物衍生自图2A-2U和图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列；(c)加入相对于所述一种或多种引物而言能与所述RNA靶序列3′杂交的寡核苷酸探针；(d)用聚合酶延伸所述一种或多种引物。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的RNA靶序列被反转录，以提供cDNA。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用聚合酶链式反应(RT-PCR)或不对称缺口连接酶链式反应(RT-AGLCR)扩增所述cDNA。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是热稳定性聚合酶。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述热稳定性聚合酶是Taq聚合酶或Vent聚合酶。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，或者T4 DNA聚合酶。
19.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤(b)中提供内部对照物。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述内部对照物衍生自图12的SEQ ID NO92序列。
21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述内部对照物含有SEQ IDNO90。
22.一种多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列含有图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的核苷酸序列。
23.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2A所示的核苷酸序列组成。
24.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2B所示的核苷酸序列组成。
25.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2C所示的核苷酸序列组成。
26.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2D所示的核苷酸序列组成。
27.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2E所示的核苷酸序列组成。
28.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2F所示的核苷酸序列组成。
29.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2G所示的核苷酸序列组成。
30.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2H所示的核苷酸序列组成。
31.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2I所示的核苷酸序列组成。
32.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2J所示的核苷酸序列组成。
33.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2K所示的核苷酸序列组成。
34.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2L所示的核苷酸序列组成。
35.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2M所示的核苷酸序列组成。
36.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2N所示的核苷酸序列组成。
37.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2O所示的核苷酸序列组成。
38.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2P所示的核苷酸序列组成。
39.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2Q所示的核苷酸序列组成。
40.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2R所示的核苷酸序列组成。
41.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2S所示的核苷酸序列组成。
42.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2T所示的核苷酸序列组成。
43.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图2U所示的核苷酸序列组成。
44.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11A所示的核苷酸序列组成。
45.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11B所示的核苷酸序列组成。
46.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11C所示的核苷酸序列组成。
47.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11D所示的核苷酸序列组成。
48.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11E所示的核苷酸序列组成。
49.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11F所示的核苷酸序列组成。
50.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11G所示的核苷酸序列组成。
51.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11H所示的核苷酸序列组成。
52.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11I所示的核苷酸序列组成。
53.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11J所示的核苷酸序列组成。
54.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11K所示的核苷酸序列组成。
55.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11L所示的核苷酸序列组成。
56.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11M所示的核苷酸序列组成。
57.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11N所示的核苷酸序列组成。
58.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11O所示的核苷酸序列组成。
59.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11P所示的核苷酸序列组成。
60.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11Q所示的核苷酸序列组成。
61.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11R所示的核苷酸序列组成。
62.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11S所示的核苷酸序列组成。
63.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11T所示的核苷酸序列组成。
64.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11U所示的核苷酸序列组成。
65.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11V所示的核苷酸序列组成。
66.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11W所示的核苷酸序列组成。
67.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11X所示的核苷酸序列组成。
68.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11Y所示的核苷酸序列组成。
69.如权利要求22所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图11Z所示的核苷酸序列组成。
70.一种多核苷酸，其特征在于，它含有一核苷酸序列，该核苷酸序列含有图3A-3C或图4A-4C任一所示的核苷酸序列。
71.如权利要求70所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图3A-3C所示的核苷酸序列组成。
72.如权利要求70所述的多核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列由图4A-4C所示的核苷酸序列组成。
73.一种寡核苷酸引物，其特征在于，它由被DNA依赖性RNA聚合酶识别的、操作性连接于人细小病毒B19特异性复合序列的启动子区域组成，长约10-75个核苷酸。
74.如权利要求73所述的寡核苷酸引物，其特征在于，所述启动子区域是T7启动子，所述核酶是T7 RNA聚合酶。
75.如权利要求73所述的寡核苷酸引物，其特征在于，所述人细小病毒B19特异性序列衍生自人细小病毒B19基因组的VP1区域。
76.如权利要求75所述的寡核苷酸引物，其特征在于，所述人细小病毒B19特异性序列衍生自图2A-2U任一所示的多核苷酸序列。
77.一种寡核苷酸引物，其特征在于，它由操作性连接于人细小病毒B19特异性复合序列的T7启动子组成，长约10-75个核苷酸，其中，所述人细小病毒B19特异性复合序列衍生自图2A-2U或图11A-11Z中任一所示的多核苷酸。
78.一种寡核苷酸探针，其特征在于，它含有连接于吖啶酯标记物的细小病毒B19特异性杂交序列，长约10-50个核苷酸。
79.如权利要求78所述的寡核苷酸探针，其特征在于，所述人细小病毒B19特异性杂交序列衍生自人细小病毒B19基因组的VP1区域。
80.如权利要求79所述的寡核苷酸探针，其特征在于，所述人细小病毒B19特异性杂交序列衍生自图2A-2U或11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列。
81.一种诊断检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求73所述的寡核苷酸引物和进行诊断检测的用法说明书。
82.如权利要求81所述的诊断检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括寡核苷酸探针，该探针含有连接于吖啶酯标记物的细小病毒B19特异性杂交序列，其长度约为10-50个核苷酸。
83.一种检测生物学样品中人细小病毒B19感染的方法，其特征在于，该方法包括(a)分离怀疑含有人细小病毒B19 DNA的生物学样品中的核酸，其中，所述核酸含有靶序列；(b)使分离得到的人细小病毒B19核酸与可检测的标记探针反应，该探针与所述靶序列充分互补并能与其杂交，其中，所述探针衍生自图2A-2U和图11A-11Z中任一所示的多核苷酸序列，且所述反应在能形成探针/靶序列复合物的条件下进行；(c)检测标记物存在与否，作为靶序列存在与否的指示。
全文摘要
本发明公开了衍生自细小病毒B19基因组保守区的人细小病毒B19引物和探针。还公开了采用所述引物和探针的核酸试验。
文档编号G01N33/569GK1636071SQ02812816
公开日2005年7月6日 申请日期2002年6月28日 优先权日2001年6月28日
发明者S·皮谢安特斯, V·夏玛拉 申请人:希龙公司