T1r异源寡聚的味觉受体和表达所述受体的细胞系及其在鉴定味觉化合物中的用途的制作方法

专利名称：T1r异源寡聚的味觉受体和表达所述受体的细胞系及其在鉴定味觉化合物中的用途的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求对以下申请的优先权，即2001年6月26日提出的美国临时申请60/300,434、2001年7月3日提出的美国实用申请09/897,427、2001年7月13日提出的美国临时申请60/304,749、2001年8月8日提出的美国临时申请60/310,493、2001年11月21日提出的美国临时申请60/331,771、2001年12月14日提出的美国临时申请60/339,472、2002年1月3日提出的美国申请10/035,045、2002年4月15日提出的美国临时申请60/372,090、2002年4月22日提出的美国临时申请60/374,143，均全文引入以供参考。
背景技术：
发明领域本发明部分涉及有关T1R受体装配形成功能性味觉受体的发现。具体而言，本发明发现共表达T1R1和T1R3可产生响应鲜味(umamitaste)刺激物(包括谷氨酸一钠)的味觉受体。还发现共表达T1R2和T1R3受体可产生响应甜味刺激物(包括天然存在以及人造甜味剂)的味觉受体。
本发明还涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的异寡聚味觉受体在分析中的用途，用于鉴定分别响应鲜味刺激物和甜味刺激物的化合物。
本发明另外涉及构建在组成型或诱导型条件下稳定或瞬时共表达T1R1和T1R3、或T1R2和T1R3组合的细胞系。
本发明还提供了这些细胞系在基于细胞的分析、特别是利用荧光成像检测受体活性的高通量筛选分析中的用途，用于鉴定鲜味和甜味觉调节化合物。
背景技术：
味觉系统提供了关于外界化学组分的感觉信息。人们相信哺乳动物具有至少5种基本味觉模式甜、苦、酸、咸和鲜(umami)。例如参见Kawamura等人，Introduction to UmamiA Basic Taste(1987)；Kinnamon等人，Ann.Rev.Physiol，54715-31(1992)；Lindemann，Physiol.Rev.，76718-66(1996)；Stewart等人，Am.J.Physiol，2721-26(1997)。人们认为每种味觉模式由舌头表面的味觉受体细胞表达的一种或多种不同的蛋白质受体介导(Lindemann，Physol.Rev.76718-716(1996))。识别苦、甜和鲜味刺激物的味觉受体属于G蛋白质偶联受体(GPCR)超家族(Hoon等人，Cell 96451(1999)；Adler等人，Cell 100693(2000))。(据认为其它味觉模式由离子通道介导。)G蛋白偶联受体介导许多其它的生理功能，例如内分泌功能、外分泌功能、心率、脂解作用以及糖代谢。许多这类受体的生物化学分析和分子克隆已经揭示了关于这些受体功能的许多基本原理。例如，美国专利5,691,188描述了在配体与GPCR结合后，该受体如何经受构象改变，通过促进Gα亚基表面GTP替代结合的GDP，随后Gα亚基与Gβ和Gγ亚基分离，从而导致异源三聚G蛋白活化。游离的Gα亚基和Gβγ复合物可活化多种信号传导途径的下游元件。
本发明涉及味觉特异性GPCR的三元T1R类型。先前假设T1R受体行使甜味受体功能(Hoon等人，Cell 96541-51(1999)；Kitagawa等人，Biochem Biophys Res.Commun.283236-42(2001)；Max等人，Nat.Genet.2858-63(2001)；Montmayeur等人，Nat.Neurosci.4412-8(2001)；Sainz等人，J.Neurochem.77896-903(2001))，最近Nelson等人(2001)证明大鼠T1R2和T1R3在识别甜味刺激物中联合作用。本发明涉及两个发现。首先，与大鼠T1R2/T1R3相同，人T1R2和T1R3在识别甜味刺激物中联合作用。其次，人T1R1和T1R3在识别鲜味刺激物中联合作用。因此，在哺乳动物中，T1R2/T1R3可能发挥甜味受体功能，而T1R1/T1R3可能发挥鲜味受体功能。T1R1和T1R3、T1R2和T1R3的功能相互依赖性的可能解释是，与结构相关的GABAB受体类似(Jones等人，Nature 3965316-22(1998)；Kaupmann等人，Nature 396683-7(1998)；White等人，Nature 396679-82(1998)；Kuner等人，Science 28374-77(1999))，T1Rs以异源二聚复合物行使功能。然而，这种功能的相互依赖性还有可能反映一种必要但短暂的相互作用，最终产生功能无关的单体或同源多聚的味觉受体。
鉴定发挥甜味和鲜味受体功能的味觉受体的特征很有意义，将促进这些受体在识别可调节(增强或阻断)甜味和鲜味觉的化合物的分析中的用途。这些化合物可用于改善人用或动物用食物、饮料、药物的味道和可口性。特别而言，利用功能性甜味受体的分析可以用来鉴定新型甜味剂。
发明概述本发明涉及以下发现，即不同组合的T1R在共表达时可以产生响应味觉刺激物的功能性味觉受体。本发明特别涉及以下发现，即共表达T1R2和T1R3产生响应甜味觉刺激物的异源寡聚的味觉受体。本发明还涉及以下发现，即共表达T1R1和T1R3产生响应鲜味觉刺激物(例如谷氨酸一钠)的异源寡聚味觉受体。
本发明还涉及共表达(优选人)T1R1和T1R3、或(优选人)T1R2和T1R3的细胞系。在优选实施方案中，这些细胞系组成型或诱导型表达数量增多的受体。这些细胞系包括瞬时或稳定表达T1R1和T1R3、或T1R2和T1R3的细胞。
本发明还提供分析方法，优选利用T1R2/T1R3味觉受体或T1R1/T1R3受体的高通量筛选分析，优选基于细胞的高通量分析，以鉴定可调节甜味或鲜味觉的化合物。本发明还提供包括味觉测试的分析方法，以证实这些化合物可调节甜味或鲜味觉。
发明目的为此，本发明的一个目的在于提供介导味觉的哺乳动物G蛋白偶联受体家族，此处称为T1R。
本发明的另一目在于提供保持例如由甜味或鲜味觉刺激物活化或与之结合活性的该T1R的片段和变体。
本发明的另一目的在于提供编码该T1R、其片段或变体的核酸序列或分子。
本发明的另一目的在于提供表达载体，其中包含编码该T1R或其片段或变体的核酸序列，该序列有效连接至少一种调节序列，例如启动子、增强子或参与正向或负向基因转录和/或翻译、和/或蛋白质输出的其它序列。
本发明的另一目的在于提供功能性表达至少一种该T1R、或其片段或变体、优选T1R或其片段或变体的组合的人类或非人类细胞，例如哺乳动物、酵母、蠕虫或昆虫细胞。
本发明的另一目在于提供T1R融合蛋白质或多肽，其至少包含至少一种该T1R的片段。
本发明的另一目的在于提供编码T1R多肽的分离的核酸分子，其包含的核酸序列与具有下述hT1R核酸序列及其保守性修饰变体之一的核酸序列具有至少50％、优选75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明的又一目的在于提供分离的核酸分子，其包含编码多肽的核酸序列，该多肽的氨基酸序列与选自下述T1R氨基酸序列及其保守性修饰变体之一的氨基酸序列具有至少35％-50％、优选60％、75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，其中该片段长度至少为20、优选40、60、80、100、150、200或250个氨基酸。任选该片段是可结合抗-T1R抗体的抗原性片段。
本发明的另一目的在于提供包含所述片段变体的分离的多肽，其中至多在10、优选5、4、3、2、或1个氨基酸残基处存在变异。
本发明另一目的在于提供T1R1/T1R3组合，其中T1R1和/或T1R3是变体或片段，以及T1R2/T1R3组合，其中T1R2和/或T1R3是变体或片段。
本发明的另一个目的在于提供该T1R或其片段或变体的激动剂或拮抗剂。
本发明的另一目的在于提供PDZ结构域相互作用肽(此处称为PDZIP)，其可促进表面表达质膜整合蛋白质、特别是GPCR，例如T1R。本发明的另一目的在于提供包括PDZIP的载体、表达该载体的宿主细胞、以及利用PDZIP促进表面表达的方法。
本发明的优选目的在于提供分析方法、特别是高通量分析，用于鉴定可调节味觉的化合物，特别是可调节甜味觉和鲜味觉的化合物。该分析方法优选利用此处公开的T1R或其片段或变体、或编码该T1R或其片段或变体的基因的组合。该组合最优选包含hT1R1/hT1R3以及hT1R2/hT1R3。
本发明特别优选的实施方案是鉴定可调节T1R1/T1R3或T1R2/T1R3味觉受体(例如增强该受体响应味觉刺激物的能力)的化合物。例如下文所述，已经发现5’-IMP或5’-GMP可增强对L-谷氨酸鲜味(T1R1/T1R3)的响应。这些调节剂化合物可增强不同甜味或鲜味觉刺激物的活性，并提供降低浓度的产生特定甜味或鲜味觉的化合物(可由使用本分析鉴定的味觉调节剂增强其活性)产生增强和/或相同的味觉。
本发明的另一目的在于提供评价一种或多种化合物的味觉的优选分析方法，包括将所述一种或多种化合物与至少一种公开的T1R、其片段或变体、优选人类T1R的组合相接触的步骤。
本发明更特别的目的在于提供筛选在哺乳动物、优选人类中具有增强、模拟、阻断和/或调节甜味觉能力的一种或多种化合物的方法，其包含将一种或多种化合物与hT1R2和hT1R3的组合或包含hT1R2和/或hT1R3的片段、嵌合体或变体的复合物相接触的步骤。
本发明的另一特定目的在于提供筛选在哺乳动物、优选人类中具有增强、模拟、阻断和/或调节味觉、特别是鲜味觉能力的一种或多种化合物的方法，其包含将一种或多种化合物与hT1R1和hT1R3的组合或包含hT1R1和/或hT1R3的片段、嵌合体或变体的复合物相接触的步骤。
本发明的另一特定目的在于产生共表达hT1R1和hT1R3、或其片段、变体或嵌合体的细胞，用于鉴定可增强、模拟、阻断和/或调节味觉、特别是甜味觉的化合物。
本发明的另一特定目的在于产生共表达hT1R1和hT1R3、或其片段、变体或嵌合体的细胞，用于鉴定可增强、模拟、阻断和/或调节味觉、特别是鲜味觉的化合物的分析中。
本发明的另一目的在于产生经基因修饰表达或不表达一种或多种T1R的非人动物。
本发明的另一目的在于将利用T1R、或其组合的分析鉴定的化合物用作食物和饮料组合物中的调味成分(flavor ingredient)。特别而言，本发明的一个目的在于，在食物和饮料组合物中将与hT1R2和/或hT1R3相互作用的化合物用作甜味阻断剂、增强剂、调节剂或模拟剂，将与hT1R1和/或hT1R3相互作用的化合物用作鲜味阻断剂、增强剂、调节剂或模拟剂。
本发明的另一目的在于使用T1R、特别是非人类T1R，鉴定可调节动物饲料制剂味道的化合物，例如用于鱼类水产养殖。
本发明的优选目的在于提供稳定共表达hT1R1/hT1R3或hT1R2/hT1R3的真核、优选哺乳动物或昆虫细胞系，优选HEK-293细胞系，其同样表达G蛋白例如Gα15蛋白、或与T1R2/T1R3或T1R1/T1R3联合表达时可产生功能性味觉受体的其它G蛋白。
本发明的另一优选目的在于提供稳定表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3、优选hT1R1/hT1R3或hT1R2/hT1R3的真核细胞系，优选哺乳动物或昆虫细胞。在优选的实施方案中，该细胞包含稳定表达Gα15、或与T1R1/T1R3或T1R2/T1R3结合可产生功能性鲜味或甜味觉受体的其它G蛋白的HEK-293细胞。
本发明的一个目的还在于提供在组成型或诱导型条件下使用稳定或瞬时表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的HEK-293或其它细胞系的分析方法、优选高通量分析，以鉴定可调节鲜味或甜味觉的化合物。
本发明的另一目的在于根据影响拉克替醇(lactisole)(一种甜味觉抑制剂)或结构相关化合物与T1R1/T1R3(鲜味)味觉受体结合的能力，鉴定可增强、模拟、阻断和/或调节T1R1/T1R3鲜味受体的化合物。
附图简述

图1包含人和大鼠T1R、人钙敏感受体和大鼠代谢型(metabotropic)谷氨酸受体的序列比对。
图2包含RT-PCR扩增实验结果，显示味觉组织中表达hT1R2和hT1R3。
图3a-3b包含各种浓度的不同甜味觉刺激物在瞬时转染人T1R2、T1R3和T1R2/T1R3的稳定表达Gα15的HEK细胞中产生的功能性数据(细胞内钙反应)(图3a)；人T1R2/T1R3对几种甜味觉刺激物有响应(图3b)；人T1R2/T1R3在gurmarin存在下对蔗糖有响应，内源性β2-肾上腺素能受体在gurmarin存在下对异丙基肾上腺素有响应。图3c包含对不同甜味剂的标准化响应。
图4包含瞬时转染hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3和rT1R2/hT1R3的稳定表达Gα15的HEK细胞针对350mM蔗糖、25mM色氨酸、15mM天冬甜精(aspartame)以及0.05％应乐果甜蛋白(monellin)的细胞内钙响应。
图5包含基于荧光平板反应器分析的结果，其中将稳定表达Gα15的HEK细胞瞬时转染hT1R2和hT1R3、或单独hT1R3，并接触钙染料Fluo-4和甜味觉刺激物(12.5mM环己氨基磺酸盐(cyclamate))。
图6包含标准化的剂量-反应曲线，根据其与各种甜味刺激物(色氨酸、环己氨基磺酸盐、蔗糖、纽甜(neotame)、天冬甜精(Aspartame)、糖精(saccharin)和Acek)的剂量特异性相互作用显示hT1R2和hT1R3组合发挥人甜味受体的功能。
图7包含有关mGluR1和T1R1的结构性信息，显示在这些分子中观察到关键的配体结合残基。
图8a-8c包含功能性数据，显示瞬时转染T1R1/T1R3的稳定表达Gα15的HEK细胞在细胞内钙分析中响应谷氨酸。图8a显示细胞内钙响应谷氨酸浓度的提高而提高；图8b显示细胞内钙对IMP(2mM)、谷氨酸(0.5mM)和0.2mM IMP的响应；图8c显示人T1R1/T1R3在有无0.2mM IMP存在下对谷氨酸的响应。
图9a-9b分别包含使用Myc-标记的hT1R2的免疫荧光染色分析以及FACS实验的结果，显示引入PDZIP肽(SEQID No1)可增强T1R(hT1R2)在质膜上的表达。
图10a-10b包含钙成像数据，表明h1TR2/hT1R3响应不同的甜味刺激物。
图11利用自动荧光成像，显示稳定表达hT1R1/hT1R3的细胞系对鲜味觉刺激物的响应。
图12利用自动荧光成像，显示稳定表达hT1R2/hT1R3的细胞系对甜味觉刺激物的响应。
图13显示使用自动荧光成像测定的诱导型表达人T1R1/T1R3味觉受体的细胞系在有无0.2mM IMP存在下对L-谷氨酸的剂量-反应曲线。
图14和15显示诱导型表达人T1R1/T1R3味觉受体的细胞系(克隆1-17)对一组L-氨基酸的响应。图14在有无1mM IMP存在下检测10mM的不同C-氨基酸。图15在有无0.2mM IMP存在下测定活性氨基酸的剂量-反应。
图16显示拉克替醇抑制人T1R2/T1R3和人T1R1/T1R3的受体活性。
发明详述本发明通过共表达不同T1R的组合、优选T1R1/T1R3或T1R2/T1R3，因而提供功能性味觉受体、优选人味觉受体，以及相应的分离的核酸序列或其片段、嵌合体或变体，其共表达后可产生功能性味觉受体，即甜味觉受体(T1R2/T1R3)或鲜味觉受体(T1R1/T1R3)。
如文献报道，味觉细胞特异性GPCR的T1R家族成员已知并由Hoon等人，Cell，96541-551(1999)、WO 00/06592、WO 00/06593和U.S.Serial No.09/799,629鉴定，在此均全文引用以供参考。
更具体而言，本发明涉及共表达不同的味觉细胞特异性GPCR。这些核酸及其编码的受体被称为味觉细胞特异性GPCR的“T1R”家族成员。在本发明的特定实施方案中，共表达的T1R家族成员包括rT1R1、rT1R2、rT1R3、mT1R1、mT1R2、mT1R3、hT1R1、hT1R2和hT1R3。不希望局限于理论，人们认为这些味觉细胞特异性GPCR是味觉传导途径的组分，并参与甜味和鲜味刺激物和/或产生其它味觉模式的味觉刺激物的味觉检测。
此处证明，T1R家族成员与其它T1R家族成员联合作用，行使甜味觉和鲜味觉受体功能。正如下文实施例所进一步详细公开的，已经证明共表达hT1R2和hT1R3的异源细胞可由甜味觉刺激物以类似(mirror)人甜味觉的方式选择性活化。例如，共表达hT1R2和hT1R3的HEK-293-Gα15细胞特异性响应环己氨基磺酸盐、蔗糖、天冬甜精和糖精，这些化合物的剂量响应与身心味觉检测阈值相关。因此，共表达hT1R2和hT1R3的细胞可用于筛选、优选高通量筛选方法，以鉴定可模拟、调节、阻断和/或增强甜味觉感受的化合物。
同样在实施例实验数据支持下，已经表明共表达hT1R1和hT1R3的细胞可由谷氨酸(谷氨酸一钠)和5’-核糖核苷酸以类似人鲜味觉的方式选择性活化。例如，共表达hT1R1和hT1R3的HEK-293-Gα15细胞特异性响应谷氨酸，对该鲜味化合物的剂量响应与身心味觉检测阈值相关。此外，5’-核糖核苷酸例如IMP可增强T1R1/T1R3受体的谷氨酸响应，这是鲜味觉的协同作用特征。因此，共表达hT1R1和hT1R3的细胞可用于筛选、优选高通量筛选方法，以鉴定可模拟、调节、阻断和/或增强鲜味觉感受的化合物。
另外，如实施例的实验数据所示，已经表明稳定和诱导型共表达T1R1/T1R3的细胞可选择性响应鲜味觉刺激物L-谷氨酸和L-天冬氨酸，并只对很高浓度的其它L-氨基酸较弱响应，从而提供了进一步的证据，证明T1R1/T1R3受体可用于分析方法，以鉴定可调节(增强或阻断)鲜味觉刺激物的化合物。
同样在实施例的实验数据支持下，已经表明共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的细胞分别响应鲜味或甜味刺激物，其定量的剂量-反应性方式进一步支持以下结论，即T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受体可用于鉴定受体激动剂和拮抗剂，例如MSG取代物、鲜味阻断剂、新型人造及天然甜味剂以及甜味阻断剂。
同样在实施例的实验数据支持下，已经表明甜味觉阻断剂拉克替醇抑制T1R2/T1R3甜味受体和T1R1/T1R3鲜味受体。这提示筛选可影响拉克替醇结合T1R2/T1R3或T1R1/T1R3的化合物的分析方法可用于鉴定可增强、模拟、调节或阻断甜或鲜味觉的化合物。拉克替醇可抑制T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受体，提示这些受体可能共有相同的亚基，该亚基与拉克替醇、并可能与其它调节剂结合。因此，提示可增强、模拟、调节或阻断甜味觉的某些化合物可能对鲜味觉具有类似作用，反之亦然。
在实施例实验数据的进一步支持下，利用自动化荧光成像分析已经证明，稳定共表达T1R、即T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的细胞系非常有效地响应各种甜味和鲜味觉刺激物，也就是说，其程度大大超过瞬时转染的细胞。因此，这些细胞系特别适合用于高通量筛选分析，以鉴定可调节、阻断、模拟或增强甜味或鲜味觉的化合物。然而，本发明同样包括利用瞬时表达一种T1R或其组合的细胞的分析方法。
此外，尽管本申请包含的数据表明，某些T1R联合作用，特别是T1R1/T1R3和T1R2/T1R3，而且这种受体组合可能用于分析方法、优选高通量分析，但应认识到，本发明同样包括单独或与其它蛋白质、例如其它GPCR联合使用T1R1、T1R2和T1R3的分析方法。
在此方面，预测到甜味受体可能只由T1R2组成，和/或鲜味受体可能只由T1R1组成，而T1R3受体可能具有促进T1R2或T1R1表面表达的功能。
或者，也可能甜味受体和鲜味受体可能只由T1R3组成，在T1R1和/或T1R2控制下进行不同加工。该受体表达类型可能类似于降钙素相关受体的RAMP依赖性加工。
利用T1R分析方法鉴定的化合物可用于调节食物和饮料的味道。下文更详细描述的合适分析方法包括例如完整细胞分析和生物化学分析，其中包括使用不同T1R受体、其嵌合体或片段(特别是包含N端配体结合结构域的片段)的组合的直接结合分析。下文详述了适于本发明使用的分析实例，并为GPCR领域已知。
可以设计分析方法，定量不同化合物或化合物的混合物与T1R味觉受体、或T1R味觉受体的组合、或与其它异源(非T1R)蛋白质、例如其它GPCRs联合表达的T1R味觉受体的结合，或定量表达T1R味觉受体的细胞的活化。通过在异源细胞、例如HEK-293、CHO和COS细胞中稳定或瞬时表达味觉受体，可以做到这一点。
该分析方法优选使用同时表达(优选稳定表达)G蛋白(例如Gα15或Gα16)、或其它混栖(promiscuous)G蛋白或G蛋白变体、或内源性G蛋白的细胞。此外，其中还可表达Gβ和Gγ蛋白。
利用各种方法，包括使用钙敏感性染料、电压敏感性染料、cAMP分析、利用荧光标记配体或放射性配体例如3H-谷氨酸的直接结合分析、或转录分析(使用合适的报告分子，例如萤光素酶或β-内酰胺酶)，可使用表达或包含上述鉴定的受体或受体组合的细胞或组合物测定化合物对甜味或鲜味觉的作用。
可使用本发明的一种或多种T1R的分析方法包括，例如利用活细胞基因选择的分析；利用完整细胞或膜片段或纯化的T1R蛋白质的分析；利用第二信使、例如cAMP和IP3的分析；检测抑制蛋白易位到细胞表面的分析；利用待测配体检测细胞表面受体表达丧失(内化)的分析；直接配体结合分析，利用抑制剂的竞争性结合分析，利用体外翻译蛋白质的分析，检测配体结合后构象变化(例如通过蛋白质水解、荧光或NMR证明)的分析，利用表达T1R或T1R组合的转基因非人动物(例如苍蝇、蠕虫或小鼠)的行为分析，利用包含T1R基因的重组病毒感染的细胞的分析。
基于结构的分析同样位于本发明范围之内，其中测定T1R或T1R片段(或T1R组合、或T1R与另一蛋白质的组合)的x射线晶体结构，并用来通过分子模建技术预测可结合和/或增强、模拟、阻断或调节特定T1R受体或受体组合的化合物。更具体而言，本发明包括测定T1R1/T1R3(优选hT1R1/hT1R3)和/或T1R2/T1R3(优选hT1R2/hT1R3)的晶体结构，以及该晶体结构在基于结构的设计方法中的用途，用于鉴定可调节T1R受体活性的分子。
本发明特别包括使用表达一种或多种全长T1R受体或片段、优选T1R1、T1R2和/或T1R3的N端结构域的细胞、例如哺乳动物、酵母、昆虫或其它异源细胞进行的生物化学分析。使用竞争性结合分析，例如使用放射性的谷氨酸或IMP、荧光(例如荧光偏振、FRET)或GTPγ35S结合分析，可以测定化合物在上述分析中的作用。如优选实施方案所述，上述分析使用稳定共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3以及合适的G蛋白、例如Gα15的细胞系。其它合适的G蛋白包括公开于美国申请09/984,292和60/243,770(在此全文引用以供参考)的G蛋白的嵌合体和变体。
此外，可以构建并表达具有改善性质(例如增强的表面表达或G蛋白偶联)的改变的受体。可以在基于细胞的分析以及生物化学分析中引入这些T1R变体。
可以想象，与人T1R有关的这些发现可扩展到其它物种，例如啮齿类、猪、猴、狗和猫，还可能甚至扩展到非哺乳动物，例如鱼类。在此方面，以下实施例1鉴定了几种鱼类T1R片段。因此，本发明可应用于筛选供动物饲料制剂中使用的化合物。
本发明另外包括使用各种T1R的不同等位基因变体及其组合，从而鉴定可在表达这些等位变体的个体、或所有个体中引起特定味觉感受的化合物。可使用这种化合物使食物更普遍可口。
T1R编码核酸在味觉细胞中特异性表达，因而这些核酸还为鉴定味觉细胞提供了有价值的探针。例如，T1R多肽和蛋白质的探针可用于鉴定存在于叶状、轮廓和菌状乳头中的味觉细胞，以及存在于geschmackstreifen、口腔、胃肠道上皮和会厌中的味觉细胞。特别是检测T1R的方法，可用于鉴定对甜味和/或鲜味觉刺激物、或代表其它味觉模式的其它味觉刺激物敏感的味觉细胞。例如，根据此处工作可以预测，稳定或瞬时表达T1R2和/或T1R3的细胞可响应甜味觉刺激物。类似地，可以预测表达T1R1和/或T1R3的细胞可响应鲜味觉刺激物。依据WO 00/035374公开的方法，可以从多种来源分离、基因工程、扩增、合成、和/或重组表达本发明编码T1R蛋白质和多肽的核酸，该专利申请在此全文引用以供参考。实施例提供了本发明可以表达的T1R的清单。但是应当强调，本发明包括其它特定T1R或片段、变体、或以这些T1R序列为基础构建的嵌合体、特别是其它物种的T1R的表达及用途。
本发明公开的一个重要方面在于，筛选这些味觉细胞特异性GPCR的调节剂例如活化剂、抑制剂、刺激剂、增强剂、激动剂和拮抗剂的多种方法。这些味觉传导调节剂对于味觉信号途径的调节十分有用。这些筛选方法可用于鉴定味觉细胞活性的高亲和力激动剂和拮抗剂。这些调节性化合物因而可用于食品工业来定制味道，例如调节食品的甜味和/或鲜味觉。
本发明鉴定了介导甜味和鲜味觉感受的特异性T1R以及T1R受体组合，因而纠正了先前对有关甜味和鲜味觉缺少了解的情况。因此，一般而言，本申请涉及本发明人有关T1R类味觉特异性G蛋白偶联受体及其在味觉中特定功能的发现，以及这些发现之间的关系，以更好理解味觉的分子基础。
甜味觉和鲜味觉-谷氨酸一钠的味道-的分子基础是个谜团。最近鉴定了三个成员类型的味觉特异性G蛋白偶联受体，称为T1R。重叠的T1R表达模式以及证明结构相关的GABAB受体为异源二聚体，提示T1R具有异源二聚味觉受体的功能。在以下实施例中，本发明人描述了在异源细胞中功能性共表达人T1R1、T1R2和T1R3；共表达T1R1和T1R3的细胞可由鲜味觉刺激物活化；共表达T1R2和T1R3的细胞可由甜味觉刺激物活化。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的活性与身心检测阈值相关。此外，发现5’-核糖核苷酸IMP可增强T1R1/T1R3受体对谷氨酸响应，这是鲜味觉的协同作用特征。这些发现证明，特定T1R、特别是T1R的不同组合具有甜味和鲜味觉受体的功能。
据认为人类的苦、甜和鲜味觉由G蛋白偶联受体介导(Lindemann，B.，Physiol.Res.76718-66(1996))。最近，测定人类基因组揭示了T2R类苦味受体(Adler等人，Cell 100613-702(2000)；Chandrasgekar等人，Cell 100703-11(2000)；Matsunami等人，Nature 404601-604(2000))，但尚未鉴定甜味和鲜味受体。最近鉴定了另一类候选的味觉受体，T1R。T1R的鉴定首先是通过来源于大鼠味觉组织的消减cDNA文库的大规模测序鉴定了T1R1，随后通过基于T1R1的简并PCR鉴定了T1R2(Noon等人，Cell 96541-551(1999))。本发明人和他人最近在人基因组数据库中鉴定了T1R家族的第3个、可能是最后一个成员，T1R3(Kitagawa等人，BiochemBiophys.Res Commun.283(1)236-42(2001)；Max等人，Nat.Genet.28(1)58-63(2001)；Sainz等人，J.Neurochem.77(3)896-903(2001)；Montmayeur等人，Nat.Neurosci.4，492-8.(2001))。最说明问题的是，小鼠T1R3定位于包含影响小鼠甜味觉的基因座Sac的基因组间隔(Fuller等人，J.Hered.6533-6(1974)；Li等人，Mamm.Genome 1213-16(2001))。因此，预测T1R3具有甜味觉受体功能。最近的高分辨率遗传图谱研究加强了小鼠T1R3和Sac之间的关联(Fuller等人，J.Hered. 65(1)33-36(1974)；Li等人，Mammal.Genome 12(1)13-16(2001))。
有趣的是，已经表明迄今功能性表达的所有C家族受体-代谢型谷氨酸受体、GABAB受体、钙敏感受体(Conigrave，A.D.，Quinn，S.J.&Brown，E.M.，Proc Natl Acad Sci USA97，4814-9.(2000))、鱼嗅觉受体(Speca，D.J.等人，Neuron 23，487-98.(1999))-均可由氨基酸活化。这个共同特征表明，有可能T1R可识别氨基酸，除甜味觉氨基酸以外，T1R可能还涉及谷氨酸的检测。另外，有人提议mGluR4代谢型谷氨酸受体的转录变体是鲜味觉受体，因为它选择性表达于大鼠味觉组织，而且其受体活化阈值类似于谷氨酸的身心检测阈值(Chaudhari等人，Nat.Neurosci.3113-119(2000))。该假设与mGIuR4变体在味觉组织中表达水平极低以及mGluR4敲除小鼠的谷氨酸味觉没有多少改变不相符(Chaudhari和Roper，Ann.N.Y.AcadSci.855398-406(1998))。另外，该味觉变体在结构上不可信，不仅缺少形成野生型受体的谷氨酸结合口袋的大部分残基，也缺少大约半数的N端球状谷氨酸结合结构域(Kunishima等人，Nature407971-7(2000))。
啮齿类T1R表达模式的比较性分析证明，T1R2、还可能T1R1分别与T1R3共表达(Hoon等人，Cell 96541-51(1999)；Kitagawa等人，Biochem Biophy.Res.Commun.283236-242(2001)；Max等人，Nat.Genet.2858-63(2001)；Montmayeur等人，Nat.Neurosci 4492-8(2001)；Sainz等人，J.Neurochem 77896-903(2001))。另外，二聚体化显现为C-家族受体的共同特征代谢型谷氨酸和钙敏感受体是同源二聚体(Romomano等人，J.Biol.Chem.27128612-6(1996)；Okamoto等人，J.Biol.Chem.27313089-96(1998)；Han等人，J.Biol.Chem.274100008-13(1999)；Bai等人，J.Biol.Chem.27323605-10(1998))，结构上相关的GABAB受体是异源二聚的(Jones等人，Nature 396674-9(1998)；Kaupmann等人，Nature396683-687(1998)；White等人，Nature 396679-682(1998)；Kuner等人，Science 28374-77(1999))。本发明人通过在异源细胞中功能性共表达T1R证明，人T1R2与人T1R3联合行使甜味觉受体功能，人T1R1与人T1R3联合行使鲜味觉受体功能。
以前因缺少甜味觉分析方法而妨碍了改善的人造甜味剂的开发，此处讨论的这些发现因而特别有意义。实际上，5种常用的商品化人造甜味剂(均活化hT1R2/hT1R3)都是偶然发现的。类似地，除了感觉测试这一艰辛方法以外，尚无鉴定可调节鲜味觉的化合物的分析方法。如今这些困难减小了，如下文讨论的实验结果所示，已经鉴定了人的甜味和鲜味受体，并开发了这些受体的分析方法，特别是使用稳定表达功能性T1R味觉受体、即甜味觉或鲜味觉受体的细胞的分析方法。
基于此，本发明提供了检测和鉴定味道调节化合物的分析方法，其中T1R家族成员如同在味蕾中那样，作为报告分子作用于味道调节化合物的甜味和鲜味觉。特别提供了鉴定可分别调节、模拟、增强和/或阻断甜味和鲜味觉的化合物，并属于本发明范围之内。众所周知分析GPCR活性、特别是影响GPCR活性的化合物活性的方法，适用于本发明T1R家族成员及其功能性组合。上文已经指明了合适的分析方法。
特别而言，所述GPCR可用于分析中，例如在体内和体外测量配体结合、离子浓度、膜电位、电流、离子通量、转录、受体配体相互作用、第二信使浓度的变化。在另一实施方案中，可以在细胞中重组表达T1 R家族成员，通过测定Ca++水平和其它细胞内信使如cAMP、cGMP或IP3的变化，分析通过GPCR活性对味觉传导的调节。
在某些分析中，T1R多肽的结构域，例如细胞外、跨膜或细胞内结构域，与异源多肽融合，从而形成嵌合多肽，例如具有GPCR活性的嵌合蛋白质。本发明特别包括包含N端配体结合结构域的T1R1、T1R2或T1R3片段的用途。该蛋白质十分有用，例如可用于鉴定T1R受体的配体、激动剂、拮抗剂或其它调节剂的分析中。例如，T1R多肽可在真核细胞内表达，与促进质膜运输或成熟以及通过分泌途径定向的异源、伴侣序列一起表达为嵌合受体。可选的异源序列可以是PDZ结构域相互作用肽，例如C端PDZIP片段(SEQ ID NO 1)。PDZIP是ER输出信号，本发明已经表明，它可以促进异源蛋白质、例如此处所述T1R受体的表面表达。更特别而言，在本发明的一个方面中，PDZIP可用于促进可疑膜蛋白质例如嗅觉受体、T2R味觉受体以及此处所述T1R味觉受体的合适定向。
这种嵌合T1R受体可以在任何真核细胞如HEK-293细胞中表达。优选地，这些细胞包含G蛋白，优选例如Gα15或Gα16或另一类型的混栖G蛋白，这些蛋白质能够将广泛的GPCR与细胞内信号途径、或信号蛋白质如磷脂酶C相联系。可以使用任何标准方法检测细胞内这种嵌合受体的活化，例如通过检测细胞内FURA-2依赖性荧光来检测细胞内钙的变化。如果优选的宿主细胞不表达合适的G蛋白，可以利用编码混栖G蛋白的基因转染，例如美国申请60/243,770、2001年10月29日提交的美国申请09/984,297以及2001年11月21日提交的美国申请09/989,497所述，在此全文引用以供参考。
分析味觉传导调节剂的其它方法包括体外配体结合试验，其中使用T1R多肽、其部分即细胞外结构域、跨膜区或其组合、或包含T1R家族成员一种或多种结构域的嵌合蛋白质；表达T1R多肽、片段或融合蛋白质的卵母细胞或组织培养细胞；T1R家族成员的磷酸化和去磷酸化；结合GPCR的G蛋白；配体结合分析；电压、膜电位和电导变化；离子通量分析；细胞内第二信使如cGMP、cAMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化；以及细胞内钙水平的变化。
此外，本发明提供检测T1R核酸和蛋白质表达的方法，以进行味觉传导调节研究以及味觉受体细胞的特异性鉴定。T1R家族成员也提供用于亲子和法医鉴定的核酸探针。T1R基因也用作鉴定味觉受体细胞，如叶状、菌状、轮廓状、geschmackstreifen以及会厌味觉受体细胞的核酸探针。也可使用T1R受体产生用于鉴定味觉受体细胞的单克隆和多克隆抗体。
功能上，T1R多肽包含一个相关的7跨膜G蛋白偶联受体的家族，其被认为参与味觉传导，可能与G蛋白相互作用以介导味觉信号传导(例如参见，Fong，Cell Signal，8217(1996)；Baldwin，Curr.Opin.Cell Biol.，6180(1994))。结构上，T1R家族成员的核苷酸序列编码包含一个细胞外结构域、7个跨膜结构域和一个胞质结构域的相关多肽。来自其它物种的相关T1R家族基因与此处实施例公开的T1R核酸序列、或其保守性修饰的变体中至少约50个核苷酸长度、可选地100、200、500或更多核苷酸长度的区域，具有至少约50％、可选地60％、70％、80％或90％核苷酸序列同一性，或编码的多肽与下文实施例公开的T1R多肽序列、或其保守性修饰的变体中至少约25个氨基酸长度、任选地50-100个氨基酸长度的区域，具有至少约35-50％、可选地60％、70％、80％或90％氨基酸序列同一性。
已经鉴定了T1R家族成员特征性的若干共有氨基酸序列或结构域。例如，T1R家族成员通常包含与T1R共有序列1和2(分别为SEQ ID NO2和3)具有至少约50％、可选地55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95-99％或更高的同一性的序列。这些保守的结构域因而可用于通过一致性、特异杂交或扩增、或与针对结构域产生的抗体的特异结合鉴定T1R家族的成员。T1R共有序列包括例如以下序列T1R家族共有序列1(SEQ ID NO2)(TR)C(FL)(RQP)R(RT)(SPV)(VERKT)FL(AE)(WL)(RHG)ET1R家族共有序列2(SEQ ID NO3)(LQ)P(EGT)(NRC)YN(RE)A(RK)(CGF)(VLI)T(FL)(AS)(ML)这些共有序列包含在此处所述的T1R多肽中发现的序列，但是可预期其它生物体的T1R家族成员包含与此处特别描述的共有序列具有约75％或更高同一性的共有序列。
T1R核苷酸和氨基酸序列的特异性区域可能用于鉴定T1R家族成员的多态性变体、种间同源体和等位基因。该鉴定可以体外进行，例如在严谨杂交条件下或通过PCR(例如，使用编码上述T1R共有序列的引物)，或在计算机系统中利用序列信息与其它核苷酸序列进行比较。单一物种群内T1R基因的不同等位基因也可用于确定等位基因序列差异是否控制种群不同成员之间的味觉感知差异。经典PCR类型的扩增和克隆技术对于分离新的T1R很有用处，例如简并引物足以检测物种间的相关基因。
通常，通过比较大约25个氨基酸或更多、例如50-100个氨基酸的氨基酸序列，可以进行T1R家族成员多态性变体和等位基因的鉴定。大约至少35-50％、可选地60％、70％、75％、80％、85％、90％、95-99％或更高的氨基酸同一性通常表明蛋白质是T1R家族成员的多态性变体、种间同源体或等位基因。可以使用下述任何一种序列比较算法进行序列比较。特异性结合T1R多肽或其保守区的抗体也可用于鉴定等位基因、种间同源体和多态性变体。
可以通过检验推定的T1R多肽或蛋白质的味觉细胞特异性表达来确认T1R基因的多态性变体、种间同源体和等位基因。通常，具有此处公开的氨基酸序列的T1R多肽可用作阳性对照，与推定的T1R多肽相比较，以证明T1R家族成员的多态性变体或等位基因的身份。预期多态性变体、等位基因和种间同源体保留有G蛋白偶联受体的7个跨膜结构。更详细内容参见WO 00/06592，其中公开了相关的T1R家族成员GPCR-B3，其内容以符合本公开的方式在此引用以供参考。GPCR-B3受体在此处称为rT1R1和mT1R1。另外参见WO 00/06593，其中也公开了相关的T1R家族成员GPCR-B4，其内容以符合本公开的方式在此引用以供参考。GPCR-B4受体在此处称为rT1R2和mT1R2。如前所述，本发明也包括利用T1R或T1R组合、例如hT1R2/hT1R3或hT1R1/hT1R3的X射线晶体结构的基于结构的分析方法，鉴定可调节T1R受体活性、从而调节甜味和/或鲜味觉的分子。
本发明同样提供分析方法、优选高通量分析方法，以鉴定可增强、模拟、阻断和/或调节T1R受体的分子。在某些分析方法中，将一个T1R家族成员的特定结构域与另一T1R家族成员的特定结构域联合使用，例如细胞外、跨膜、或细胞内结构域或区。在另一实施方案中，细胞外结构域、跨膜区或其组合可以结合固相基质，用来例如分离配体、激动剂、拮抗剂、或能够结合T1R多肽和/或调节其活性的任何其它分子。
各种保守性突变和替换均被认为处于本发明范围之内。例如，利用已知的重组基因技术方法，包括PCR、基因克隆、cDNA定点突变、宿主细胞转染和体外转录，进行氨基酸替换，处于本领域技术人员的水平之内。从而可以筛选到具有活性的变体。
定义除非另外指明，此处使用的下列术语具有其所述含义。
“味觉细胞”包括神经上皮细胞，其成组后形成舌的味蕾，例如叶状、菌状和轮廓状细胞(例如参见，Roper等人，Ann.Rev.Neurosci.12329-353(1989))。味觉细胞也见于颚和其它组织，如食管和胃。
“T1R”指G蛋白偶联受体家族中的一个或多个成员，这些受体在味觉细胞如叶状、菌状和轮廓状细胞以及颚和食管的细胞中表达(例如参见，Hoon等人，Cell，96541-551(1999)，在此全文引用以供参考)。该家族成员在WO 00/06592中也称为GPCR-B3和TR1，在WO00/06593中也称为GPCR-B4和TR2。此处GPCR-B3也称为rT1R1，GPCR-B4也称为rT1R2。味觉受体细胞也可以根据形态学(例如参见，Roper，同上)、或通过味觉细胞特异性表达蛋白质的表达来鉴定。T1R家族成员可能具有作为甜味觉传导受体、或辨别其它各种不同味觉模式的能力。下文实施例鉴定了代表性的T1R序列，包括hT1R1、hT1R2和hT1R3。
“T1R”核酸编码拥有7个跨膜区的GPCR家族，其具有“G蛋白偶联受体活性”，例如它们可以响应外界刺激物而与G蛋白结合并在一些酶如磷脂酶C和腺苷酸环化酶(关于GPCR结构和功能的描述，参见例如，Fong，同上，和Baldwin，同上)的刺激下，促进产生第二信使如IP3、cAMP、cGMP和钙离子。单个味觉细胞可能包含很多不同的T1R多肽。
因此，术语“T1R”家族是指多态性变体、等位基因、突变体和种间同源体，其(1)与T1R多肽、优选实施例1鉴定的T1R多肽在大约25个氨基酸、可选地50-100个氨基酸的窗口上相比，具有至少约35-50％氨基酸序列同一性、可选地约60、75、80、85、90、95、96、97、98、或99％氨基酸序列同一性；(2)特异性结合针对免疫原产生的抗体，该免疫原包含优选选自实施例1公开的T1R多肽序列及其保守性修饰变体的氨基酸序列；(3)由一种核酸分子编码，该分子可在严谨杂交条件下与选自实施例1所包含的T1R核酸序列及其保守性修饰变体的序列特异性杂交(大小至少约100、可选地至少约500-1000个核苷酸)；或(4)包含一种序列，该序列与选自实施例1鉴定的T1R氨基酸序列的氨基酸序列具有至少约35-50％一致性。
拓扑结构上，某些化学感受GPCR具有“N末端结构域”、“细胞外结构域”、包含7个跨膜区以及相应胞质和细胞外环的“跨膜结构域”；“胞质结构域”和”C末端结构域”(参见例如，Hoon等人，Cell，96541-551(1999)；Buck&Axel，Cell，65175-187(1991))。使用本领域技术人员已知的方法可以在结构上鉴定这些结构域，例如鉴定疏水和亲水结构域的序列分析程序(参见例如，Stryer，Biochemistry，(3rd ed.1988)；另见任何基于因特网的序列分析程序，例如可以在dot.imgen.bcm.tmc.edu上找到的程序)。这些结构域对于制备嵌合蛋白质以及本发明的体外分析、例如配体结合分析十分有用。
因而“细胞外结构域”指从细胞膜向外突出并暴露于细胞外侧的T1R多肽的结构域。这些结构域一般包括暴露到细胞的细胞外侧的“N端结构域”、可选地可以包括暴露到细胞的细胞外侧的跨膜结构域的细胞外环部分，即跨膜区2和3之间、跨膜区4和5之间、跨膜区6和7之间的环。
“N末端结构域”区开始于N末端并延伸至靠近第一个跨膜结构域开始部位的区域。更具体而言，在本发明的一个实施方案中，该结构域开始于N末端，并大约在位于563±约20个氨基酸位置的保守性谷氨酸处结束。这些细胞外结构域对于溶液和固相中的体外配体结合试验十分有用。另外，下述跨膜区与细胞外结构域联用也能够结合配体，因而对于体外配体结合试验也十分有用。
包含7个“跨膜区”的“跨膜结构域”，是指位于质膜内的T1R多肽的结构域，也可能包括相应的胞质(细胞内)和细胞外环。在一个实施方案中，该区对应于T1R家族成员大致开始于约563±20个氨基酸位置处的保守性谷氨酸残基、终止于约812±10个氨基酸位置处的保守性酪氨酸残基的结构域。使用如Kyte&Doolittle，J.Mol.Biol.，157105-32(1982)，或Stryer(同上)所描述的标准方法，可以对7个跨膜区和细胞外和胞质环进行鉴定。
“胞质结构域”是指朝向细胞内部的T1R多肽的结构域，例如“C末端结构域”和跨膜结构域的细胞内环，如跨膜区1和2之间、跨膜区3和4之间以及跨膜区5和6之间的细胞内环。“C末端结构域”是指跨越最后一个跨膜结构域末端和蛋白质C末端的区域，通常位于胞质内。在一个实施方案中，该区开始于约812±10个氨基酸位置处的保守性酪氨酸残基，并延续至多肽的C末端。
术语“配体结合区”或“配体结合结构域”是指来源于味觉受体、特别是基本上至少包含受体细胞外结构域的味觉受体的序列。在一个实施方案中，配体结合区的细胞外结构域可能包括N末端结构域，以及可选地，跨膜结构域的一部分，例如跨膜结构域的细胞外环。配体结合区可能结合配体，特别是可增强、模拟、阻断和/或调节味觉、例如甜味或鲜味觉的化合物。
关于本发明T1R受体或多肽的术语”异源多聚体”或”异源多聚复合物”是指至少一种T1R受体和另一种受体，一般是另一种T1R受体多肽(或者另一种非T1R受体多肽)的功能性联合。明白而言，本申请描述T1R的功能性相互依赖反映了其可能具有异源二聚的味觉受体复合物的功能。然而，如前所述，功能性相互依赖还可能反映间接的相互作用。例如，T1R3可能只是具有促进T1R1和T1R2表面表达的功能，T1R1和T1R2可能独立作为味觉受体。或者，功能性味觉受体可能只由T1R3组成，T1R3在T1R1或T1R2控制下进行不同的加工，类似于钙相关受体的RAMP依赖性加工。
在测试可调节T1R家族成员介导的味觉传导的化合物的分析中，短语“功能性效应”包括确定任何一个间接或直接受受体影响的参数，例如功能性、物理和化学效应。它包括体内、体外和离体(ex vivo)的配体结合，离子通量、膜电位、电流、转录、G蛋白结合、GPCR磷酸化或去磷酸化、基于构象变化的分析、信号传导、受体配体相互作用、第二信使浓度(如cAMP、cGMP、IP3，或细胞内钙++)的变化，还包括其它生理学效应，例如神经递质或激素释放的增加或减少。
在分析中的“确定功能性效应”是指分析可使直接或间接受T1R家族成员影响的参数(例如功能性、物理和化学效应)增加或减少的化合物。这些功能性效应可利用本领域技术人员已知的任何方法进行测量，例如光谱特征(例如荧光、吸收、折射率)、流体动力学(如形状)、色谱或溶解特性、膜片钳试验(patch clamping)、电压敏感性染料、全细胞电流、放射性同位素流出、可诱导标志、卵母细胞T1R基因表达的变化；组织培养细胞T1R表达；T1R基因的转录活化；配体结合分析；电压、膜电位和电导变化；离子通量分析、细胞内第二信使如cAMP、cGMP和三磷酸肌醇(IP3)的变化；细胞内钙水平的变化；神经递质释放、构象分析等。
T1R基因或蛋白质的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”用来指利用体内和体外味觉传导分析鉴定的抑制性、活化性或调节性的分子，例如配体、激动剂、拮抗剂及其同源物和模拟物。
抑制剂是指例如结合、部分或完全阻断刺激、降低、防止、延迟活化、失活、脱敏或下调味觉传导的化合物，例如拮抗剂。活化剂是指例如可结合，刺激、增加、打开、活化、促进、增强活化、增敏或上调味觉传导的化合物，例如激动剂。调节剂包括例如可改变受体与以下物质相互作用的化合物可结合活化剂或抑制剂的细胞外蛋白质(例如ebnerin和其它疏水载体家族成员)；G蛋白；激酶(例如参与受体失活和脱敏的视紫红质激酶和β肾上腺素能受体激酶的类似物)；以及同样可使受体失活和脱敏的抑制蛋白(arrestin)。调节剂包括基因修饰的T1R家族成员，例如活性改变的、天然存在的以及合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。这些抑制剂和活化剂的分析包括，例如在细胞或细胞膜内表达T1R家族成员，在有或无促味剂例如甜味促味剂的情况下，应用推测的调节剂化合物，然后如上所述确定对味觉传导的功能性效应。包含T1R家族成员的样品或分析经过可能的激活剂、抑制剂或调节剂处理后与不用激活剂、抑制剂或调节剂的对照样品比较，检测调节的程度。阳性对照样品(例如不加调节剂的甜味促味剂)的相对T1R活性值定为100％。
阴性对照样品(例如不加味觉刺激物的缓冲液)的相对T1R活性值定为0％。当阳性对照样品和调节剂的混合物使相对于阳性对照的T1R活性值约为80％、可选地50％或25-0％时，就获得了对T1R的抑制。当相对于阳性对照样品的T1R活性值为10％、25％、50％、75％、可选地150％、可选地150％、可选地200-500％或1000-3000％或更高时，就获得了单独调节剂对T1R的活化。
此处所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”是指不含其它不同化合物的状态(这些不同化合物在自然状态下通常与本发明化合物结合在一起)，从而按给定样品的重量计，“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”物质至少包含样品质量的0.5％、1％、5％、10％或20％、最优选至少50％或70％。在一个优选的实施方案中，这些术语是指包含(以重量计)指定样品至少95％质量的本发明化合物。涉及核酸或多肽时，此处所用术语“纯化的”、“基本纯化的”和“分离的”是指不同于哺乳动物、特别是人体内天然存在的一种纯度或浓度。高于哺乳动物特别是人体内天然存在的任何程度的纯度或浓度，包括(1)从其它相关结构或化合物中纯化或(2)与通常在哺乳动物特别是人体内不相关的结构和化合物结合，均属于“分离的”含义之内。此处所述核酸或蛋白质、或核酸或蛋白质种类可根据本领域技术人员已知的多种方法和过程分离，或与自然状态下无关联的结构和化合物相连。
术语“核酸”或“核酸序列”指或者是单链或是双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸寡核苷酸。该术语包括核酸，即含有天然核苷酸已知类似物的寡核苷酸。该术语还包括具有合成主链的核酸样结构(参见例如，Oligonucleotides and Analogues，a PracticalApproach，ed.F.Eckstein，Oxford Univ.Press(1991)；AntisenseStrategies，Annals ofthe N.Y.Academy of Sciences，Vol.600，Eds.Baserga等人.(NYAS 1992)；Milligan，J.Med.chem.361923-1937(1993)；Antisense Researchand Applications(1993，CRC Press)，WO 97/03211；WO 96/39154；Mata，Toxicol.Appl.Pharmacol.144189-197(1997)；Strauss-Soukup，Biochemistry368692-8698(1997)；Samstag，Antisense Nucleic Acid Drug Dev，6153-156(1996))。
除非另外指定，特定的核酸序列也暗指包括其保守性修饰变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及清楚指明的序列。特别是，简并密码子替换可以通过产生例如其中一种或多种选定密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替代的序列来实现(Batzer等人，NucleicAcidRes.，195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.，2602605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes，891-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸交替使用。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”此处可交替使用，是指氨基酸残基多聚物。该术语适用于其中一种或多种氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸多聚物，以及天然存在的氨基酸多聚物和非天然存在的氨基酸多聚物。
术语“质膜转位结构(plasma membrane translocation domain)域”或简称“转位结构域”是指当其掺入多肽编码序列时，与没有该结构域相比，能够有效地把杂合(“融合”)蛋白“伴随(chaperone)”或“转位”至细胞质膜的多肽结构域。例如，“转位结构域”可来源于牛视紫红质受体多肽(一个7跨膜受体)的氨基末端。但是，可以使用任何哺乳动物的视紫红质，以及其它的转位促进序列。因此，转位结构域在转位7跨膜融合蛋白至质膜时特别有效，并且包含氨基末端转位结构域的蛋白质(例如味觉受体多肽)比没有该结构域的蛋白质更容易有效地被运输至质膜上。但是，如果多肽N末端结构域在结合中具有活性，例如本发明的T1R受体，则可优选使用其它的转位结构域。例如，可使用此处所述PDZ结构域相互作用肽。
此处所述“转位结构域”、“配体结合结构域”和嵌合受体组分也包括具有与示例序列基本一致的结构和活性的“类似物”、或“保守性变体”和“模拟物”(“肽模拟物”(peptidomimetic))。因此，术语“保守性变体”或“类似物”或“模拟物”指具有修饰的氨基酸序列的多肽，这类变化基本上不改变此处定义的多肽的(保守性变体的)结构和/或活性。这包括氨基酸序列的保守性修饰变异，即对于蛋白质活性无关紧要的残基的氨基酸替换、添加或缺失，或性质类似的残基的氨基酸替换(例如酸性、碱性、正电或负电、极性或非极性等)，使得甚至替换关键的氨基酸也基本上不改变结构和/或活性。
更具体而言，”保守性修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守性修饰变体是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者如果该核酸不编码氨基酸序列，则指基本相同的序列。由于遗传密码子的简并性，大量功能性相同的核酸可编码任一特定的蛋白质。
例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在由密码子决定的丙氨酸每一个位置，可以将该密码子改变为任一所述对应密码子，而不改变编码的多肽。
该核酸变异为“沉默变异”，是一种保守性修饰的变异。此处每一个编码多肽的核酸序列也描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。技术人员应当认识到，核酸中的每个密码子(除了通常情况下甲硫氨酸的唯一密码子AUG，以及通常情况下色氨酸的唯一密码子TGG)都可以经修饰产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一个沉默变异均隐含在每个描述的序列中。
能够提供功能相似的氨基酸的保守性替换表在本领域众所周知。例如，一个选择保守性替换的示例性指南包括(原始残基，其后是示例替换)ala/gly或ser；arg/lys；asn/gln或his；asp/glu；cys/ser；gln/asn；gly/asp；gly/ala或pro；his/asn或gln；ile/leu或val；leu/ile或val；lys/arg或gln或glu；met/leu或tyr或ile；phe/met或leu或tyr；ser/thr；thr/ser；trp/tyr；tyr/trp或phe；val/ile或leu。另一示例指南使用下列六组，每组包含相互保守性替换的氨基酸1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(I)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；(参见例如，Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company(1984)；Schultz和Schimer，Principles of Protein Structure，Springer-Vrlag(1979))。本领域技术人员应当理解上述替换并非唯一可能的保守性替换。例如，出于某些目的，人们可能将所有带电氨基酸互为保守性替换体，而不管是正电还是负电。另外，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小部分氨基酸的各个替换、缺失或添加也被认为是“保守性修饰变异”。
术语“模拟物”和“肽模拟物”是指合成的化学化合物，它具有与本发明多肽基本相同的结构和/或功能性特征，例如转位结构域、配体结合结构域或嵌合受体。模拟物可以完全由合成的非天然氨基酸类似物组成，或者是部分天然肽氨基酸和部分非天然氨基酸类似物的嵌合分子。模拟物也可以具有任意数量的天然氨基酸保守性替换，只要该替换也基本上不改变模拟物的结构和/或活性即可。
对于本发明保守性变体的多肽，常规实验将确定模拟物是否属于本发明的范围，即其结构和/或活性基本没有改变。多肽模拟物组分可包含任何非天然结构性组分的组合，其通常来自三个结构基团a)除天然酰胺键(“肽键”)连接之外的残基连接基团；b)非天然残基替代天然存在的氨基酸残基；或c)可诱导二级结构模拟物的残基，即诱导或稳定二级结构例如β转角、γ转角、β折叠片和α螺旋构象等的残基。当多肽的全部或某些残基是通过化学手段而非天然肽键连接时，该多肽就可以被鉴定为模拟物。各个肽模似物残基可以通过肽键、其它化学键或偶联手段连接，诸如戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能马来酰亚胺、N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N’-二异丙基碳二亚胺(DIC)。可以作为传统酰胺键(“肽键”)的替代物的连接基团包括，例如酮亚甲基(例如-C(＝O)-CH2-替换-C(＝O)-NH-)、氨亚甲基(CH2-NH)、乙烯、烯烃(CH＝CH)、醚(CH2-O)、硫醚(CH2-S)、四唑、噻唑、retroamide、硫代酰胺或酯(参见例如，Spatola，Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，Vol.7，pp267-357，“Peptide Backbone Modifications，”Marcell Dekker，NY(1983))。包含全部或某些非天然残基替代天然存在的氨基酸残基的多肽也可以被鉴定为模拟物；在科学和专利文献中对非天然残基有详尽描述。
“标记”或”可检测的部分”是可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测到的组分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如通常用于ELISA的)、生物素、地高辛、或半抗原以及可被检测(例如通过在肽中掺入放射性标记)或可用于检测可特异性与肽反应的抗体的蛋白质。
“标记的核酸探针或寡核苷酸”是指或通过接头或化学键的共价结合，或通过离子、范德华力、静电、或氢键的非共价结合而与标记物结合的核酸或寡核苷酸，这样通过检测探针上结合的标记就可以检测探针的存在。
此处所用“核酸探针或寡核苷酸”定义为能够通过一种或多种类型的化学键，一般是通过氢键形成的互补碱基配对，而与互补序列的靶核酸结合的核酸。此处所用探针可包括天然(即A、G、C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷酸、肌苷等)。另外，探针中的碱基可以由磷酸二酯键之外的连接相连，只要不影响杂交即可。因此，例如探针可以是其组成碱基由肽键而非磷酸二酯键相连的肽核酸。本领域的技术人员应当理解，根据杂交条件的严谨性，探针可以结合与探针序列不完全互补的靶序列。探针任选直接标记同位素、发色团、发光团、色原，或间接标记如可随后结合链霉亲和素复合物的生物素。通过分析探针的有无，人们可以检测是否存在选择序列或亚序列。
当针对核酸部分使用术语“异源”时，表示该核酸包含在天然状态下没有同样相互关系的两个或多个亚序列。例如，所述核酸一般重组产生，组织两个或多个非相关基因序列形成新的功能性核酸分子，例如，一个来源的启动子以及另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白质包含在天然状态下没有同样相互关系的两个或多个亚序列(例如，融合蛋白质)。
“启动子”定义为指导核酸转录的核酸序列。此处所用启动子包括在转录起始位点附近的必要核酸序列，例如在聚合酶II型启动子情况下的TATA元件。启动子还任选包括远端增强子或阻遏子元件，可位于离转录起始位点多达几千碱基对处。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下都具有活性的启动子。
“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。术语“有效连接”是指核酸表达控制序列(例如启动子、或转录因子结合位点阵列)和第二个核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导第二个序列所对应核酸的转录。
此处所用“重组”是指合成或其它体外操作的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)，以及使用重组多核苷酸在细胞或其它生物系统中产生基因产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。“重组方法”也包括将具有不同来源的各种编码区或结构域或启动子序列的核酸连接到表达盒或载体中表达，例如诱导型或组成型表达包含本发明易位结构域以及使用本发明引物扩增的核酸序列的融合蛋白。
此处所用”稳定细胞系”是指稳定、即长期表达异源核酸序列、即T1R或G蛋白的细胞系。在优选实施方案中，利用包含T1R表达构建体、即T1R1、T1R2和/或T1R3的线性化载体转染合适的细胞，通常是哺乳动物细胞，例如HEK-293细胞，产生这种稳定细胞系。最优选地，通过共转染表达hT1R1和hT1R3、或hT1R2和hT1R3的两种线性化质粒，并通过合适筛选方法产生其中稳定整合这些基因的细胞系，从而产生这种稳定细胞系。最优选地，该细胞系还稳定表达G蛋白，例如Gα15。
短语“选择性(或特异性)杂交”指在严谨性杂交条件下，一种分子仅与存在于复杂混合物中(例如，总细胞或文库DNA或RNA)的特定核苷酸序列结合、形成双链或杂交。
短语“严谨性杂交条件”是指在这样的条件下，探针仅与通常存在于核酸复杂混合物中的靶序列杂交，而不与其它序列杂交。严谨性条件是序列依赖性的，并且在不同情况下会有所不同。长序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详尽指南参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of Principles ofHybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays”(1993)。一般而言，选择的严谨性条件比特定序列在指定离子强度pH下的热解链温度(Tm)低约5-10℃。Tm是指(在指定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡后与靶序列互补的探针中有50％与靶序列杂交时的温度(靶序列过量时，在Tm下，平衡后利用了50％的探针)。严谨性条件为盐浓度小于约1.0M钠离子、一般为约0.01-1.0M钠离子(或其它盐)浓度、pH7.0-8.3、短探针(例如10-50个核苷酸)时温度至少约30℃、长探针(例如大于50个核苷酸)时温度至少约60℃。加入去稳定的试剂如甲酰胺也可以形成严谨性条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景的两倍，可选10倍于杂交背景。典型严谨性杂交条件如下50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS，42℃温育，或者5xSSC、1％SDS，65℃温育，在0.2xSSC和0.1％SDS、65℃下洗涤。该杂交和洗涤步骤可以进行例如1、2、5、10、15、30、60分钟或更长时间。
如果核酸编码的多肽基本上相关，则在严谨性条件下互不杂交的核酸仍然基本上相关。例如，利用遗传密码允许下的最大密码子简并性产生核酸拷贝时就会发生这种情况。在这些情况下，核酸通常在中等严谨性杂交条件下杂交。典型的”中等严谨性杂交条件”包括在40％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲液中、于37℃杂交，并于1xSSC、45℃洗涤。该杂交和洗涤步骤可以进行例如1、2、5、10、15、30、60分钟或更长时间。阳性杂交至少是背景值的两倍。普通技术人员很容易认识到，可以利用其它的杂交和洗涤条件提供类似严谨性的条件。
“抗体”是指包含免疫球蛋白基因或其片段的构架区域的多肽，其可特异性地结合并识别抗原。公认的免疫球蛋白基因包括к、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及许多免疫球蛋白可变区基因。轻链可分类为к或λ。重链可分类为γ、μ、α、δ或ε，它们依次分别确定了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
典型的免疫球蛋白(抗体)结构单位包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链N末端确定了一个约100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语”可变轻链”(VL)和”可变重链”(VH)分别指这些轻链和重链。
“嵌合抗体”是指一种抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替换或交换，以至于抗原结合位点(可变区)与类别、效应物功能和/或物种不同或被改变的恒定区相连，或与可赋予嵌合抗体以新的特性的完全不同的分子(例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等)相连接；或(b)可变区或其部分被改变、替换或交换成具有不同或改变的抗原特异性的可变区。
“抗T1R”抗体是可特异性结合T1R基因、cDNA或其亚序列编码的多肽的抗体或抗体片段。
术语“免疫分析”是使用抗体特异性结合抗原的分析。免疫分析的特征在于使用特定抗体的特异性结合特性来分离、定向和/或定量抗原。
在涉及蛋白质或肽时，短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“特异性(或选择性)进行免疫反应”是指可在异源蛋白质和其它生物产品的群体中确定蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫分析条件下，指定抗体与特定蛋白质的结合至少是背景值的两倍，并且基本上不与样品中存在的其它蛋白质明显结合。这些条件下与抗体的特异性结合可能需要针对特定蛋白质的特异性进行选择的抗体。例如，可选择针对特定物种如大鼠、小鼠、或人T1R家族成员产生的多克隆抗体，以获得那些仅与T1R多肽或其免疫原部分而非其它蛋白质(T1R多肽直向进化同源物(ortholog)或多态性变体和等位基因除外)发生特异性免疫反应的多克隆抗体。这种选择过程可以通过去除与其它物种T1R分子、或其它T1R分子交叉反应的抗体来完成。也可以选择只识别T1R GPCR家族成员而非其它家族GPCR的抗体。
多种免疫分析形式可以用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，一般使用固相ELISA免疫分析选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(例如参见，Harlow&Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，(1988)，其中有关可用于确定特异性免疫反应性的免疫分析形式和条件的描述)。典型特异性或选择性反应至少是背景信号或噪声的两倍，更典型地大于背景10-100倍。
短语“选择性结合”是指核酸与另一核酸如上所述“选择性杂交”的能力，或抗体与蛋白质如上所述“选择性(特异性)结合”的能力。
术语“表达载体”是指意在于任何细胞包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中，体内或体外、组成型或诱导型表达本发明的核酸序列的任何重组表达系统。该术语包括线性或环状表达系统。该术语包括保持附加体或整合至宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统可具有自我复制能力，或者没有，即在细胞内只驱动瞬时表达。该术语包括重组表达“盒”，其中只包含重组核酸转录所需的最少元件。
“宿主细胞”是指包含表达载体并支持该表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物、蠕虫或哺乳动物细胞如CHO、Hela和HEK-293等，例如培养的细胞、外植体(explants)和体内细胞。
T1R多肽的分离和表达可如下所述完成本发明T1R或其片段或变体的分离和表达。可以使用PCR引物扩增编码味觉受体配体结合区的核酸，可选地建立这些核酸的文库。可以使用各个表达载体或表达载体文库感染或转染宿主细胞，用来功能性表达这些核酸或文库。这些基因和载体可在体外或体内制备并表达。技术人员应认识到，通过调节本发明载体中基因和核酸(例如启动子、增强子等)的表达或活性，可以得到改变和控制核酸表达的理想表型。可以使用所述用于提高或降低表达或活性的任何已知方法。可以结合本领域任何已知的方法或方案实施本发明，这些方法或方案在科学和专利文献中有详尽描述。
本发明的核酸序列以及用于实施本发明的其它核酸分子，不论RNA、cDNA、基因组DNA、载体、病毒或其杂合体，可以从多种来源分离、基因工程、扩增、和/或重组表达。可以使用任何重组表达系统，除哺乳动物细胞外包括例如细菌、酵母、昆虫或植物系统。
另外，可利用下述公知的化学合成技术体外合成这些核酸分子，例如Carruthers，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)；Adams，Am.Chem.Soc.105661(1983)；Belousov，Nucleic Acids Res.253440-3444(1997)；Frenkel，Free Radic.Biol.Med.19373-380(1995)；Blomers，Biochemistry 337886-7896(1994)；Narang，Metb.Enzymol.6890(1979)；Brown，Meth.Enzymol.68109(1979)；Beaucage，Tetra.Lett.221859(1981)；美国专利4,458,066所述。然后或者通过合成互补链并在适当条件下一起退火，或通过利用合适的引物序列及DNA聚合酶加入互补链，可以获得双链DNA片段。
核酸操作技术，例如产生序列突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交等，在科学和专利文献中有详尽描述。参见例如，Sambrook，ed.，Molecular Cloninga Laboratory Manual(2nd ed)，Vols.1-3，ColdSpring Harbor laboratory (1989)；Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel，ed.John Wiley&Sons，Inc.，NewYork(1997)；Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Theory and Nucleic Acid Preparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。
核酸、载体、衣壳(capsids)、多肽等可以通过本领域技术人员公知的众多通用方法中任何一个来分析和定量。其中包括，例如分析生物化学方法如NMR、分光光度法、放射显影、电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)和超扩散层析等，各种免疫学方法如流体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫荧光分析，Southern分析、Northern分析、点印迹分析、凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR、其它核酸或靶物质或信号扩增方法、放射性标记、闪烁计数以及亲和层析。
寡核苷酸引物可以用来扩增编码味觉受体配体结合区的核酸片段。此处所述核酸还可以利用扩增技术进行克隆或定量测量。扩增方法也为本领域公知，包括例如聚合酶链反应、PCR(PCRProtocols，aGuide to Methods and Applications，ed.Innis.Academic Press，N.Y.(1990)以及PCR Strategies，ed.Innis，Academic Press，Inc.，N.Y.(1995)、连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR，例如参见，Wu，Genomics 4560(1989)；Landegren，Science 2411077，(1988)；Barringer，Gene 89117(1990))；转录扩增(例如参见，Kwoh，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))；自动维持序列复制(例如参见，Guatelli，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871874(1990))；Q-β复制酶扩增(例如参见，Smith，J.Clin.Microbiol.351477-1491(1997))；自动Q-β复制酶扩增分析(例如参见，Burg，Mol.Cell.Probes 10257-271(1996))以及其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；还参见Berger，Methods Enzymol.152307-316(1987)；Sambrook；Ausubel；美国专利4,683,195和4,683,202；Sooknanan，Biotechnology13563-564(1995)。引物可以设计成保留“供体”7膜受体的原始序列。或者，引物可以编码保守性替换(例如疏水性残基换成疏水性残基，参见上述)或功能上有利的替换(例如，不干扰质膜插入、导致肽酶裂解、导致受体非正常折叠等)的氨基酸残基。扩增以后，如有需要，使用常规分子生物学方法，按照本领域已知的方法，将核酸逐一或以文库形式克隆到任一载体；扩增核酸的体外克隆方法如美国专利5,426,039所述。
引物对可以设计成选择性扩增T1R家族成员的配体结合区。对于不同的配体或促味剂，这些区域可能有所变化。因此，可能是一种促味剂的最小结合区域，对于第二种促味剂则可能太局限。因此，可能扩增包含不同细胞外结构域结构的不同大小的配体结合区。
设计简并引物对的范例为本领域众所周知。例如，COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CODEHOP)策略计算机程序可以从http//blocks.fhcrc.org/codehop.html获得，并从Blockmaker多序列比对地址直接连接，由一套相关的蛋白质序列如已知的味觉受体配体结合区开始，进行杂合引物预测(例如参见，Rose，Nucleic Acids Res.261628-1635(1998)；Singh，Biotechniques 24318-319(1998))。
合成寡核苷酸引物对的手段为本领域公知。可以使用“天然”碱基对或合成碱基对。例如，使用人工核苷酸碱基能够提供操作引物序列、产生更加复杂的扩增产物混合物的通用方法。人工核苷酸碱基的多个家族能够通过内部键旋转而采取多种氢键方向，从而提供简并分子识别的方法。这些类似物掺入PCR引物的单个位点可产生扩增产物的复杂文库。例如参见，Hoops，Nucleic Acids Res.254866-4871(1997)。也可以使用非极性分子模仿天然DNA碱基的形状。腺嘌呤的非氢键形状模拟物可以有效和选择性地针对胸腺嘧啶非极性形状的模拟物进行复制(例如参见，Morales，Nat.Struct.Biol.5950-954(1998))。例如，两个简并碱基可以是嘧啶碱基6H，8H-3，4-二羟基嘧啶并[4，5-c][1，2]嗪-7-酮、或嘌呤碱基N6-甲氧基-2，6-二氨基嘌呤(例如参见，Hill，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 954258-4263(1998))。本发明示例性简并引物掺入有核碱基(nucleobase)类似物5’-二甲氧三苯甲基-N-苯甲酰基-2’-脱氧胞苷、3’-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(参见上文序列中的术语“P”)。这种嘧啶类似物与嘌呤，包括A和G残基形成氢键。
与此处公开的味觉受体基本相同的多态性变体、等位基因和种间同源体，可以使用上述核酸探针进行分离。或者，通过利用针对T1R多肽制备的抗血清或纯化抗体对表达同源体进行免疫学检测(其同样识别并选择性结合T1R同源体)，可以使用表达文库克隆T1R多肽及其多态性变体、等位基因和种间同源体。
可以使用简并引物对扩增(如PCR)合适的核酸序列，得到编码味觉受体的配体结合区的核酸。被扩增的核酸可以来自任何细胞或组织的基因组DNA、或来源于味觉受体表达细胞的mRNA或cDNA。
在一个实施方案中，可以构建包含与转位序列融合的编码T1R的核酸的杂合蛋白质编码序列。同样提供了包含转位基序以及化学感受受体、特别是味觉受体其它家族的促味剂结合结构域的杂合T1Rs。这些核酸序列可以有效连接转录或翻译控制元件，例如转录和翻译起始序列、启动子和增强子、转录和翻译终止子、聚腺苷酸化序列、以及对DNA转录成RNA有用的其它序列。在重组表达盒、载体和转基因动物的构成中，可以利用启动子片段指导目的核酸在所有目的细胞或组织中表达。
在另一实施方案中，融合蛋白质可能包括C末端或N末端转位序列。此外，融合蛋白质可以包含另外的元件，例如用于蛋白质检测、纯化或其它应用。促进检测和纯化的结构域包括，例如金属鳌合肽如聚组氨酸序列段、组氨酸色氨酸组件或其它可以在固定化的金属上进行纯化的结构域；麦芽糖结合蛋白；可以在固定化的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域；或FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的结构域(Immunex Corp，Seattle WA)。
在转位结构域(供有效的质膜表达)以及新翻译多肽的其余部分之间，包含可断裂的连接物序列，例如Xa因子(例如参见，Ottavi，Biochimie 80289-293(1998))、枯草杆菌蛋白酶识别基序(例如参见，Polyak，Protein Eng.10615-619(1997))、肠激酶(Invitrogen，San Diego，CA)等，可能有利于促进纯化。例如，一个构建体可以包括一条与6个组氨酸残基相连的多肽编码核酸序列，后接硫氧还蛋白、肠激酶裂解位点(例如参见，Williams，Biochemistry 341787-1797(1995)))以及一个C末端转位结构域。该组氨酸残基可促进检测和纯化，而肠激酶裂解位点提供了从其余融合蛋白中纯化目的蛋白质的手段。有关编码融合蛋白质的载体以及融合蛋白质应用的技术在科学和专利文献中已有详细描述，例如参见，Kroll，DNA Cell.Biol.12441-53(1993)。
包含配体结合结构域编码序列的表达载体(不管是单个的表达载体还是表达载体文库)可以引入细胞的基因组或胞质或细胞核中，并利用各种常规技术进行表达，这在科学和专利文献中有详尽描述。例如参见，Roberts，Nature 328731(1987)；Berger同上；Schneider，Protein Expr.Purif.643510(1995)；Sambrook；Tijssen；Ausubel。生物试剂和实验设备厂家的产品信息也提供有关已知生物学方法的信息。载体可以从天然来源分离、从ATCC或GenBank文库诸如此类的来源获得、或通过合成或重组方法制备。
核酸可以使用在细胞内稳定或瞬时表达(例如附加体表达系统)的表达盒、载体或病毒进行表达。可以将选择标志引入表达盒和载体中，从而赋予转化细胞和序列以可选择的表型。例如，选择标志可以编码供附加体维持和复制，以至于不需要整合至宿主基因组中。例如，标志可能编码抗生素抗性(例如氯霉素、卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素)或除草剂抗性(例如chlorosulfuron或Basta)，以选择转化了目的DNA序列的细胞(例如参见，Blondelet-Rouault，Gene 190315-317(1997)；Aubrecht，J.Pharmacol.Exp.Ther.281992-997(1997))。由于赋予新霉素或潮霉素这类底物抗性的选择标志基因只能用于组织培养，也可以使用化学抗性基因作为体外和体内的选择性标志。
嵌合核酸序列可编码位于任何7跨膜多肽内部的T1R配体结合结构域。由于7跨膜受体多肽具有相似的一级序列以及二级和三级结构，通过序列分析可以很容易地鉴定结构域(例如细胞外结构域、TM结构域、胞质结构域等)。例如，同源性模建、傅立叶分析和螺旋周期检测可以鉴定并表征7跨膜受体序列的7个结构域。快速傅立叶转换(FFT)算法可用于评价表征被分析序列疏水性和可变性概况的显性周期。周期检测增强和α螺旋周期指数可以通过例如Donnelly，Protein Sci.255-70(1993)的方法完成。其它比对和模建算法为本领域所公知，例如参见Peitsch，Receptors Channels 4161-164(1996)；kyte&Doolittle，J.Md.Bio.，157105-132(1982)；Cronet，Protein Eng.659-64(1993)。
本发明还包括具有指定核苷酸和氨基酸序列的DNA和蛋白质，而且包括DNA片段，特别是例如40、60、80、100、150、200或250、或更多核苷酸的片段，以及例如10、20、30、50、70、100或150、或更多氨基酸的蛋白质片段。可选地，核酸片段可编码能够与针对T1R家族成员产生的抗体相结合的抗原性多肽。此外，本发明的蛋白质片段可选地是能够与针对T1R家族成员产生的抗体相结合的抗原性片段。
本发明还包括嵌合蛋白质，其包含至少一种此处所述T1R多肽的至少10、20、30、50、70、100或150、或更多的氨基酸，与代表另一GPCR、优选7跨膜超家族成员的全部或部分的另外的氨基酸序列相偶联。这些嵌合子可以由此处受体和另一个GPCR制备，或组合两种或多种所述T1R受体而制备。在一个实施方案中，该嵌合子的一部分对应或来源于本发明T1R多肽的细胞外结构域。在另一实施方案中，该嵌合子的一部分对应或来源于此处描述的T1R多肽的细胞外结构域以及一个或多个跨膜结构域，其余部分来自另一个GPCR。嵌合受体为本领域所公知，其制备技术以及引入其中的G蛋白偶联受体结构域或片段的选择及界定也为本领域所公知。因此，本领域技术人员这方面的知识很容易用于制备这种嵌合受体。使用这种嵌合受体可以提供例如此处特别公开的一种受体的味觉选择性特征，并与另一个受体的信号传导特征相偶联，例如现有技术分析系统中使用的公知的受体。
如上所述，这种嵌合体、天然T1R受体的类似物、或天然T1R受体组合或联合可以结合到通常影响甜味觉或鲜味觉的分子、或由其活化。功能性嵌合的T1R受体或受体组合是这样的分子，其单独或与其它T1R或其它GPCR组合(其自身可能就是嵌合体)表达时可以结合到味觉刺激物、特别是甜(T1R2/3)或鲜(T1R1/3)味觉刺激物，或者由其活化。引起甜味觉的分子包括天然和人工甜味剂，例如蔗糖、天冬甜精(aspartame)、木糖醇、环己氨基磺酸盐等，引起鲜味觉的分子包括谷氨酸及其类似物、以及可结合天然T1R1和/或T1R3的其它化合物，例如5’-核苷酸。
例如，诸如配体结合结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、跨膜结构域、胞质结构域、N末端结构域、C末端结构域或其任意组合的结构域，可以共价连接到异源蛋白质。例如，T1R细胞外结构域可连接至异源GPCR跨膜结构域，或异源GPCR细胞外结构域可连接至T1R跨膜结构域。可以使用其它可选的异源蛋白质，例如绿色荧光蛋白质。
表达本发明的T1R、片段、嵌合体或变体的宿主细胞也处在本发明范围之内。为了获得克隆的基因或核酸(例如编码本发明的T1R、片段或变体的cDNA)的高水平表达，技术人员通常将目的核酸序列亚克隆至包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子的表达载体中，对于编码蛋白质的核酸，其中还包含供翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子为本领域所公知，例如Sambrook等人所述。然而可以使用细菌或真核表达系统。
可以使用任何公知的将外源核苷酸序列引入宿主细胞的方法。其中包括使用磷酸钙转染、polybrene、原生质体融合、电穿孔、脂质体、微注射、胞质载体(plasma vector)、病毒载体以及将克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞的其它任何公知方法(例如参见，Sambrook等人)。只要求所用特定基因工程方法能够成功地将至少一个核酸分子引入能够表达目的T1R、片段或变体的宿主细胞中。
将表达载体引入细胞以后，转染细胞在适合目的受体、片段或变体表达的条件下培养，然后使用标准技术将其从培养物中回收。这种技术的实例为本领域公知。例如参见WO 00/06593，按符合本公开内容的方式引用，以供参考。
T1R多肽的检测除了使用核酸杂交技术检测T1R基因及基因表达以外，还可以使用免疫分析检测T1R，例如鉴定味觉受体细胞以及T1R家族成员的变体。可以使用免疫分析定性或定量分析T1R。适用技术的综述参见Harlow&Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(1988)。
1.T1R家族成员的抗体制备与T1R家族成员特异性反应的单克隆抗体和多克隆抗体的方法为本领域技术人员已知(例如参见Coligan，Current Protocols inImmunology(1991)；Harlow&Lane，supra；Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice(2d ed.1986)；以及Kohler&Milstein，Nature，256495-497(1975))。此类技术包括通过从噬菌体或类似载体的重组抗体文库中选择抗体来制备抗体，以及通过免疫兔或小鼠来制备单克隆抗体和多克隆抗体(例如参见Huse等人，Science，2461275-1281(1989)；Ward等人，Nature，341544-546(1989))。
许多包含T1R的免疫原可用于制备与T1R家族成员特异性反应的抗体。例如，可如此处所述分离重组T1R多肽、或其抗原性片段。合适的抗原性区包括，例如用于鉴定T1R家族成员的共有序列。重组蛋白质可以如上所述在真核或原核细胞中表达，并如上文一般所述进行纯化。重组蛋白质是制备单克隆或多克隆抗体的优选免疫原。另外，来源于此处公开序列并缀合载体蛋白质的合成肽可以用作免疫原。也可以使用纯净或非纯净形式的天然存在蛋白质。然后将产物注射到能够产生抗体的动物中。可产生单克隆或多克隆抗体，其后用于免疫分析以测量蛋白质。
制备多克隆抗体的方法为本领域技术人员已知。例如，使用标准佐剂例如弗氏佐剂和标准免疫程序，用蛋白质免疫近交系小鼠(例如BALB/C小鼠)或兔。通过采血并测定与T1R的反应滴度来监测动物对免疫原制剂的免疫应答。当获得合适的针对免疫原的高滴度抗体后，收集动物血液并制备抗血清。如果需要，可以进一步分级分离抗血清来富集与蛋白质反应的抗体(参见Harlow&Lane，同上)。
可利用本领域技术人员熟悉的多种技术获得单克隆抗体。简而言之，通常经过与骨髓瘤细胞融合，可使目的抗原免疫动物的脾细胞永生化(参见kohler&Milstein，Eur.J.Immunol.，6511-519(1976))。永生化的另外方法包括利用E-B病毒(Epstein Barr Virus)、癌基因、或反转录病毒转化、或本领域公知的其它方法。筛选由单个永生化细胞形成的克隆，以产生针对抗原具有所需特异性和亲和性的抗体，利用多种技术可以提高这些细胞产生的单克隆抗体的产量，包括注射到脊椎动物宿主的腹腔内。或者，按照Huse等人，Science，2461275-1281(1989)概述的一般方法，通过筛选人B细胞DNA文库，可以分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。
收集单克隆抗体和多克隆血清并在免疫分析中利用免疫原蛋白质滴定，例如利用固定于固相支持物的免疫原进行的固相免疫分析。通常，选择具有104或更高滴度的多克隆抗血清，并使用竞争结合免疫分析，测试其对非T1R多肽、或甚至其它T1R家族成员、或其它生物体的其它相关蛋白质的交叉反应。特异性多克隆抗血清和单克隆抗体通常结合Kd为至少约0.1mM，更通常至少约1pM，可选地至少约0.1pM或更好，并且可选地0.01pM或更好。
一旦获得T1R家族成员特异性抗体，则可以利用多种免疫分析方法检测各个T1R蛋白质和蛋白质片段。有关免疫学和免疫分析方法的综述，参见Basic and Clinical Immunology(Stites&Terr eds.，7th ed.1991)。此外，本发明的免疫分析可以由几种形式来完成，详述于Enzyme Immuncassay(Maggio，ed.，1980)；以及Harlow&Lane，同上。
2.免疫学结合分析可利用任一公知的免疫学结合分析检测和/或定量T1R蛋白、片段和变体(例如参见美国专利4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168)。一般免疫分析的综述还参见Methods in Cell BiologyAutibodies in Cell Biology，volume 37(Asai，ed.1993)；Basicand Clinical Immunology(Stiters&Terr，eds.，7th ed.1991)。免疫学结合分析(或免疫分析)通常使用能够特异性结合所选蛋白质或抗原(此处为T1R家族成员或其抗原性亚序列)的抗体。可以使用本领域技术人员公知的以及如上所述的多种方法中任一种制备抗体(例如抗-T1R)。
免疫分析也经常使用标记物，特异性结合并标记抗体和抗原形成的复合物。标记物本身可能是包含抗体/抗原复合物的一个部分。因此，标记物可以是标记的T1R多肽或标记的抗T1R抗体。或者，标记物可以是第三个部分，例如特异性结合抗体/T1R复合物的第二抗体(第二抗体通常对第一抗体所来源的物种的抗体是特异的)。能够特异结合免疫球蛋白恒定区的其它蛋白质，如蛋白A或蛋白G也可用作标记物。这些蛋白质与许多物种的免疫球蛋白恒定区显示强烈的非免疫原性反应性(例如参见，Kronval等人，J.Immunol.，1111401-1406(1973)；Akerstrom等人，J.Immunol.，1352589-2542(1985))。可利用可检测部分修饰标记物，例如生物素，其可与另一分子特异性结合，如链霉亲和素。多种可检测部分为本领域技术人员所熟知。
贯穿整个分析，每次结合试剂都需要温育和/或漂洗步骤。温育步骤从约5秒钟到几小时不等，可选地约5分钟-24小时。但是，温育时间取决于分析形式、抗原、溶液体积、浓度等。分析通常在室温下进行，尽管可以在例如10℃-40℃的温度范围内进行。
A.非竞争性分析形式检测样品中T1R多肽的免疫分析既可以是竞争性或非竞争性的。非竞争性免疫分析是直接测定抗原量的分析。例如在一个优选的“夹心”(sandwich)分析中，抗T1R抗体可直接被结合到其所固定的固相基质上。然后这些固定化抗体捕获试样中的T1R多肽。T1R多肽因而被固定化，然后结合标记物，例如带有标记的第二T1R抗体。或者，第二抗体可能没有标记，但是它可以被标记了的第三抗体结合，该第三抗体特异性针对第二抗体所来源的物种的抗体。通常利用可检测部分修饰第二抗体或第三抗体，例如生物素，其可与另一分子如链霉亲和素特异性结合，以提供可检测部分。
B.竞争性分析形式在竞争性分析中，通过测量由样品中未知的T1R多肽从抗T1R抗体中取代(竞争去除)已知的外加(外源)T1R多肽的量，从而间接测量样品中T1R多肽的量。在一个竞争性分析中，将已知量的T1R多肽加入样品中，然后将样品与可特异性结合T1R的抗体接触。与抗体结合的外源T1R多肽的量与样品中T1R多肽浓度成反比。在一个特别优选的实施方案中，抗体被固定化在固相基质上。通过刻量T1R/抗体复合物中T1R多肽的量，或测量未形成复合物的剩余蛋白质的量，可以确定与抗体结合的T1R多肽的量。通过提供标记的T1R分子，可以检测T1R多肽的量。
另一优选的竞争性分析是半抗原抑制分析。在此分析中，已知的T1R多肽被固定化在固相基质上。将已知量的抗T1R抗体加入样品中，然后将样品与固定化的T1R接触。与已知的固定化T1R多肽结合的抗T1R抗体的量与样品中T1R多肽的量成反比。同样，通过检测抗体的固定化部分、或溶液中剩余的抗体部分，可以检测固定化抗体的量。抗体被标记时可以直接检测，或随后加入上述可特异性结合抗体的标记部分进行间接检测。
C.交叉反应性测定竞争结合形式的免疫分析也可用来测定交叉反应性。例如，可以将一种至少部分由此处公开的核酸序列编码的蛋白质固定化在固相基质上。将蛋白质(例如T1R多肽和同源物)加入分析体系中，与固定化抗原竞争性结合抗血清。加入的蛋白质同固定化蛋白质竞争性结合抗血清的能力，与由此处公开的核酸序列编码的T1R多肽同自身竞争的能力相比较。使用标准算法计算上述蛋白质的交叉反应性百分比。选择并合并与加入的上述每种蛋白质的交叉反应性小于10％的抗血清。通过加入特定蛋白质、例如远源(distantly related)同源物进行免疫吸收，任选从合并的抗血清中去除交叉反应的抗体。另外，用于鉴定T1R家族成员的包含代表保守性基序的氨基酸序列的肽，可用于测定交叉反应性。
经免疫吸收并合并的抗血清然后可用于上述竞争结合免疫分析，将被认为可能是T1R家族成员的等位基因或多态性变体的第二蛋白质与免疫原蛋白质(即由此处公开的核酸序列编码的T1R多肽)相比较。为进行比较，在一个宽的浓度范围内对两种蛋白质分别进行分析，确定抑制抗血清与固定化蛋白质50％结合所需的每一种蛋白质的量。如果抑制50％结合所需第二蛋白质的量比由此处公开的核酸序列编码的蛋白质抑制50％结合所需的量低10倍，那么就认为该第二蛋白质可特异性结合针对T1R免疫原产生的多克隆抗体。
针对T1R保守性基序产生的抗体也可用于制备只与T1R家族GPCR特异性结合、而不与其它家族的GPCR结合的抗体。
通过使用其它T1R家族成员消减去除交叉反应性抗体，可以制备特异性结合特定T1R家族成员的多克隆抗体。按类似方式可以制备种特异性多克隆抗体。例如，通过消减去除与直向进化同源物序列例如大鼠T1R1或小鼠T1R1交叉反应的抗体，可以制备人T1R1特异性抗体。
D.其它分析形式Westem印迹(免疫印迹)分析可用于检测和定量样品中存在的T1R多肽。该技术一般包含利用凝胶电泳根据分子量分离样品蛋白质、将分离的蛋白质转移到合适的固相支持物(例如硝酸纤维素膜、尼龙膜或衍生尼龙膜)、将样品与可特异性结合T1R多肽的抗体温育。抗T1R多肽抗体可特异性结合固相支持物上的T1R多肽。这些抗体可能被直接标记，或随后使用可特异性结合抗T1R抗体的标记抗体(例如标记的绵羊抗小鼠抗体)进行检测。
其它分析形式包括脂质体免疫分析(LIA)，其利用设计成可结合特定分子(例如抗体)并释放所包被的试剂或标志的脂质体。然后按照标准技术检测释放出的试剂(参见Monroe等人，Amer.Clin.Prod.Rev.，534-41(1986))。
E.非特异结合的降低本领域技术人员应当理解，免疫分析中经常希望将非特异性结合降至最低。特别是当该分析涉及固定在固相基质上的抗原或抗体时，希望将非特异性结合到基质上的量降至最低。降低该非特异结合的方法为本领域技术人员所公知。一般而言，该技术涉及使用蛋白质性质的组分来包被基质。特别而言，广泛使用蛋白质组分，例如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、明胶，最优选奶粉。
F.标记物分析中使用的特定标记物或可检测基团不是本发明的关键因素，只要它不显著影响分析中抗体的特异性结合即可。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学性质的任何物质。这类可检测标记在免疫分析领域发展完善，一般情况下，用于这些方法中的大多数标记物都可以应用于本发明。因此，标记物是可用光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组分。本发明有用的标记物包括磁珠(如DYNABEADSTM)、荧光染料(例如异硫氰酸荧光素、德克萨斯红(Texas red)、罗丹明等)、放射性标记物(如3H、125I、14C、35S)、酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其它通常用于ELISA的酶)、以及显色标记物，例如胶体金、或彩色玻璃或塑料珠(如聚苯乙烯、聚丙乙烯、乳胶等)。
按照本领域已知的方法，标记物可与分析的目的组分直接或间接偶联。如上所述，根据所需灵敏度、与化合物缀合的难易度、稳定性要求、现有仪器及处置规定，可以选择使用各种标记物。
通常利用间接方法连上非放射性标记物。一般而言，配体分子(如生物素)共价结合到分子上。然后该配体结合另一分子(如链霉亲和素)，该分子本身可被检测或共价连接至信号系统，例如可检测的酶、荧光化合物、或化学发光化合物。配基及其靶物质可以与识别T1R多肽的抗体、或识别抗T1R的第二抗体以任意适当的组合使用。
分子也可以直接缀合产生信号的化合物，例如与酶或荧光团缀合。作为标记物的目的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、脂酶和糖苷酶、或氧化酶，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰化合物、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素(luciferin)和2，3-二氢吩嗪二酮类(2，3-dihydrophthalazinediones)，例如鲁米诺(luminol)。可能使用的各种标记或信号产生系统参见美国专利4,391,904的综述。
检测标记物的方法为本领域技术人员所熟知。因此，例如当标记物是放射标记物时，检测方法包括闪烁计数器或感光膜放射自显影。当标记物是荧光标记物时，可能通过合适波长的光激发荧光色素并检测产生的荧光进行检测。荧光可以通过感光膜、利用电子检测器如电荷耦联装置(CCD)或光电倍增器等进行目视检测。类似地，酶标记物可以通过提供酶的合适底物并检测反应产物来进行检测。最后，简单的显色标记物可以通过观察与标记物相关的颜色进行简单检测。因此，在各种试纸条(dipstick)分析中，缀合的金通常显粉红色，而各种缀合的小珠显示该小珠的颜色。
某些分析形式不需要使用标记组分。例如，凝集试验可用于检测靶抗体的存在。在此情况下，抗原包被颗粒可被包含靶抗体的样品凝集。在该形式中，各组分均无需标记，通过肉眼简单观测就能检测靶抗体的存在。
调节剂的检测确定待测化合物是否可在体外和体内特异性结合本发明的T1R受体的组合物和方法如下所述。可以监测细胞生理学的许多方面，以评价配体结合本发明T1R多肽的效应。可以对表达化学感受受体的完整细胞、通透化的细胞、或利用标准方法产生的膜成分或体外从头合成的蛋白质进行这些分析。
在体内，味觉受体结合促味剂并引发化学刺激物转导为电信号。活化或抑制的G蛋白依次改变目标酶、通道、或其它效应蛋白质的性质。一些例子有，例如通过视觉系统的转导素(transducin)而活化cGMP磷酸二酯酶、通过刺激物性G蛋白活化腺苷酸环化酶、通过Gq和其它同类G蛋白活化磷脂酶C、以及通过Gi和其它G蛋白调节不同的通道调节。也可检测下游结果，例如由磷脂酶C产生的二酰基甘油和IP3，继而由IP3引发钙的动员。
该分析中的T1R蛋白质或多肽优选具有选自实施例1公开的T1R多肽序列的多肽、或其片段或保守性修饰变体。可选地，该片段和变体可以是能够结合抗T1R抗体的抗原性片段和变体。可选地，该片段和变体可以结合甜味剂或鲜味促味剂、或由其活化。
或者，该分析中的T1R蛋白质或多肽可以来源于真核宿主细胞，可以包括与实施例1公开的T1R多肽、或其片段或保守性修饰变体具有氨基酸序列同一性的氨基酸亚序列。一般而言，该氨基酸序列同一性为至少35-50％，或可选75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。可选地，该分析中的T1R蛋白或多肽可以包含T1R蛋白的结构域，例如细胞外结构域、跨膜区、跨膜结构域、胞质结构域、配体结合结构域等。此外如上所述，T1R蛋白质或其结构域可以共价连接异源蛋白质，以产生可用于此处所述分析的嵌合蛋白质。
使用上述T1R蛋白质或多肽，不论是重组的还是天然产生的，来测试T1R受体活性的调节剂。可以分离、在细胞中共表达、在来源于细胞的膜上共表达、在组织或动物中共表达重组或天然产生的T1R蛋白或多肽。例如，舌切片、从舌上分离的细胞、转化细胞或膜都可以使用。可以使用此处所述体外或体内分析之一来测试调节作用。
例如，如下文实施例实验所公开，已经发现某些5’核苷酸、例如5，IMP或5’GMP，可增强L-谷氨酸活化鲜味觉受体的活性、或阻断鲜味觉刺激物、例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸对鲜味觉受体的活化。
1.体外结合分析使用本发明的T1R多肽，利用可溶性或固相反应，可以体外检测味觉传导。在特定实施方案中，可以使用T1 R配体结合结构域，以体外可溶性或固相反应分析配体结合。
例如，预测T1R的N末端结构域参与配体结合。具体而言，T1R属于GPCR亚家族，其特征在于具有大的、约600个氨基酸的细胞外N末端片段。这些N末端片段据认为形成配体结合结构域，因而可用于鉴定T1R激动剂和拮抗剂的生物化学分析。配体结合域可能由细胞外结构域的另外部分形成，例如跨膜结构域的细胞外环。
已经使用了利用与T1R相关的其它GPCR、例如代谢型谷氨酸受体的体外结合分析(例如参见，Han和Hampson，J.Biol.Chem.27410008-10013(1999))。这些分析可能涉及替换放射性或荧光标记的配体，测量内在荧光的变化或蛋白水解敏感性的变化等。
可以在溶液、双层膜(可选附着于固相)、脂单层、或囊泡中检测与本发明T1R多肽异源多聚复合物结合的配体。可以使用例如光谱特征变化(例如荧光、吸收、折射率)、流体力学(例如形状)、层析或溶解性测试调节剂的结合。
在本发明另一实施方案中，可以使用GTPγ35S分析。如上所述，在GPCR活化的情况下，刺激G蛋白复合物的Gα亚基，将结合的GDP交换为GTP。在生物化学分析中，测定所加入的放射性标记GTPγ35S在假定的配体存在下与G蛋白的结合，可以测定配体介导的对G蛋白交换活性的刺激。一般而言，包含目的化学感受受体的膜与G蛋白复合物相混合。在分析中加入潜在抑制剂和/或活化剂以及GTPγ35S，测量与G蛋白结合的GTPγ35S。通过液体闪烁计数或本领域已知的其它方法、包括闪烁亲近测定法(SPA)，可以测量结合作用。在其它分析形式中，可以使用荧光标记的GTPγS。
2.荧光偏振分析在另一实施方案中，可以使用基于荧光偏振(“FP”)的分析检测并监测配体结合。荧光偏振是测量平衡结合、核酸杂交和酶活性的实验室通用技术。荧光偏振分析是均一性的，因为它不需要分离步骤，例如离心、过滤、层析、沉淀或电泳。这些分析直接在溶液中实时进行，不需要固定化相。偏振值可重复测量，在加入试剂后测量偏振非常快速，所以不会破坏样品。一般而言，本技术可用于测量荧光团(fluorophore)低至皮摩尔(picomolar)到微摩尔(micromolar)水平的偏振值。本节描述了怎样简单定量地使用荧光偏振测量配体与本发明T1R多肽的结合。
荧光标记分子被平面偏振光激发时，发出具有一定偏振程度的光，其偏振程度与分子旋转成反比。大的荧光标记分子在激发态(对于荧光素而言为4纳秒)保持相对静止，在激发和发射之间光的偏振保持相对恒定。小的荧光标记分子在激发态快速旋转，在激发和发射之间光的偏振显著变化。因此，小分子偏振值低，大分子偏振值高。例如，单链荧光素标记的寡核苷酸的偏振值相对较低，但当它与互补链杂交时，就具有较高的偏振值。当使用FP来检测和监测可能活化或抑制本发明化学感受受体的促味剂结合时，可以使用荧光标记的促味剂或自发荧光促味剂。
荧光偏振(P)定义为 其中H是与激发光平面平行的发射光强度，Int⊥是与激发光平面垂直的发射光强度。P为光强度比值，是一个无量纲的数字。例如，Beacon和Beacon 2000TM系统可以与这些分析联合使用。这类系统一般用毫偏振单位表示偏振值(1偏振单位＝1000mP单位)。
Perrin方程式描述了分子旋转和大小之间的关系，读者可以参考Jolley，M.E.(1991)在Journal of Analytical Toxicology，236-240页，其中给出了该方程式的详细解释。概要地，Perrin方程式认定偏振与旋转弛豫(rotational relaxation)时间、即分子旋转约68.5°角所需时间直接成比例。旋转弛豫时间按下列方程式与粘度(η)、绝对温度(T)、分子体积(V)、和气体常数(R)相关 旋转弛豫时间对于小分子(如荧光素)很小(≈1纳秒)，对于大分子(如免疫球蛋白)很大(≈100纳秒)。如果粘度和温度保持恒定，旋转弛豫时间，也即偏振，与分子大小直接相关。分子体积的变化可能是由于荧光标记分子与其它分子的相互作用、解离、聚合、降解、杂交或构象变化所致。例如，荧光偏振已经用于测量蛋白酶、DNA酶和RNA酶酶促裂解大的荧光素标记的聚合物。还用于测量蛋白质/蛋白质相互作用、抗体/抗原结合以及DNA/蛋白质结合的结合平衡。
A.固相和可溶性高通量分析在另一实施方案中，本发明提供了使用异源寡聚T1R多肽复合物、或共表达T1R多肽的细胞或组织进行的可溶性分析。优选地，该细胞包含稳定共表达功能性T1R1/T1R3(鲜)味觉受体或T1R2/T1R3(甜)味觉受体的细胞系。在另一实施方案中，本发明提供了高通量形式的基于固相的体外分析，其中将T1R多肽、或表达T1R多肽的细胞或组织附着于固相基质、或味觉刺激化合物，并与T1R受体相接触，使用合适的标签、或针对该T1R受体产生的抗体检测结合作用。
在本发明的高通量分析中，一天之内可能筛选多达数千种不同的调节剂或配体。特别而言，可以用微孔板的每个孔来进行针对所选的潜在调节剂的单独分析，或者如果要观察浓度或温育时间效应，每5-10个孔可以测试一种调节剂。因此，一块标准微孔板可以分析约100种(例如96种)调节剂。如果使用1536孔板，那么一块板可以轻松分析约1000-1500种不同的化合物。也可能在每个平板孔中分析多种化合物。每天可能分析数块不同的平板；使用本发明集成的系统可能分析筛选多达约6,000-20,000种不同的化合物。最近发展了试剂操作的微流方法(microfluidic approaches)。
目的分子可以通过共价或非共价键(例如通过标签)直接或间接与固态组分结合。标签可以是多种组分任意一种。一般而言，将可结合标签的分子(标签结合物)固定在固相支持物上，通过标签与标签结合物的相互作用，将加标记的目的分子(例如味觉传导目的分子)附着于固相支持物。
根据文献详述的已知的分子相互作用，可以使用多种标签和标签结合物。例如，如果标签具有天然结合物，例如生物素、蛋白A、或蛋白G，它就可以与合适的标签结合物(亲和素、链霉亲和素、中性亲和素、免疫球蛋白Fc区等)结合使用。也可广泛获得针对具有天然结合物的分子(例如生物素)的抗体，这也是合适的标签结合物(参见，SIGMA Immunochemicals 1998 Catalogue Sigma，St.Louis MO)。
类似地，任何半抗原或抗原性化合物都可与适当的抗体组合，以形成标签/标签结合物对。可以商品化获得数千种抗体，文献描述了许多另外的抗体。例如，在一种常见的形式中，标签是第一抗体，标而签结合物是识别第一抗体的第二抗体。除了抗体-抗原相互作用外，受体-配体相互作用也适合作为标签和标签结合物对。例如，细胞膜受体的激动剂和拮抗剂(例如细胞受体-配体相互作用，如转铁蛋白、c-kit、病毒受体配体、细胞因子受体、趋化因子受体、白介素受体、免疫球蛋白受体和抗体、钙粘着蛋白家族、整联蛋白家族、选择蛋白(selectin)家族等，例如参见Pogott&Power，The AdhesionMolecule Facts Book I(1993))。类似地，毒素和毒液(venoms)、病毒表位、激素(例如阿片制剂、类固醇等)、细胞内受体(例如，其介导各种小配体的效应，包括类固醇、甲状腺激素、类维生素A(retinoids)和维生素D；肽)、药物、凝集素、糖、核酸(线性和环状聚合物构型)、寡糖、蛋白质、磷脂和抗体，都可以与各种细胞受体作用。
合成聚合物，例如聚氨基甲酸酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳撑硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯(polyacetates)，也可以形成合适的标签或标签结合物。本领域技术人员在浏览本公开内容时显而易见，许多其它的标签/标签结合物对也可用于此处所述分析系统。
常用接头，例如肽、聚醚等，也可以用作标签，包括多肽序列，例如约5-200个氨基酸的聚甘氨酸序列。这类柔性接头为本领域技术人员已知。例如，聚(乙二醇)接头可以得自Shearwater Polymers，Inc.Huntsville，Alabama。这些接头可选地具有酰胺键、巯键或异源功能键。
可以使用现有的各种方法将标签结合物固定于固相基质。固相基质通常全部或部分暴露于化学试剂，将可与标签结合物的一部分发生反应的化学基团固定于表面，从而进行衍生化或功能化。例如，适合连接于长链部分上的基团包括胺、羟基、硫醇和羧基基团。氨基烷基硅烷(aminoalkylsilanes)和羟烷基硅烷(hydroxyalkylsilanes)可用于多种表面的功能化，例如玻璃表面。文献详述了构建此类固相生物聚合物阵列的方法。例如参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)(描述了例如肽的固相合成)；Geysen等人，J.Immun.Meth.，102259-274(1987)(描述了在针上的固相组分合成)；Frank&Doring，Tetrahedron，446031-6040(1988)(描述了在纤维素盘上合成各种肽序列)；Fodor等人，Science，251767-777(1991)；Sheldon等人，Clinical Chemistry，39(4)718-719(1993)；以及Kozal等人，Nature Medicine，2(7)753-759(1996)(均描述了固定于固相基质上的生物聚合物阵列)。将标签结合物固定于基质上的非化学方法包括其它常用方法，例如加热、UV辐射交联等。
3.基于细胞的分析在优选的处理实施方案中，将T1R蛋白质或多肽组名在真核细胞中瞬时或稳定共表达为未修饰形式、或嵌合体、变体或截短的受体，其带有、或优选没有可促进其成熟并定向通过分泌途径的异源伴侣序列。这类T1R多肽可在任何真核细胞中表达，例如HEK-293细胞。优选地，该细胞包含功能性G蛋白如Gα15、或前述嵌合G蛋白、或能够偶联嵌合受体至细胞内信号途径或信号蛋白如磷脂酶C的另外蛋白质。还优选产生可稳定共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的细胞，已经发现(如实验实施例所示)该细胞显示增强的对味觉刺激物的响应(相比瞬时表达相同T1R组合的细胞)。可以使用任何标准方法检测这些细胞中T1R受体的活化，例如通过检测细胞中Fluo-4依赖性荧光来检测细胞内钙的变化。这类分析是本申请所示实验发现的基础。
活化的GPCR受体通常是使受体C末端尾部(也可能其它位点)磷酸化的激酶的底物。因此，活化剂能促进32P从放射性标记的ATP转移到受体，可利用闪烁计数器分析。C末端尾部的磷酸化能促进抑制蛋白(arrestin)样蛋白质的结合，并干扰G蛋白的结合。GPCR信号传导及信号传导分析方法的综述参见，例如Methods in Enzymology，卷237和238(1994)以及卷96(1983)；Bourne等人，Nature，10349117-27(1991)；Bourne等人，Nature，348125-32(1990)；Pitcher等人，Annu.Rev.Biochem.，67653-92(1998)。
通过将经推定的T1R调节剂处理的T1R多肽的响应与未处理的对照样品、或包含已知的”阳性”对照样品的响应作比较，从而分析T1R调节作用。这类推定的T1R调节剂可包括抑制或活化T1R多肽活性的分子。在一个实施方案中，将对照样品(未经活化剂或抑制剂处理)的相对T1R活性值定为100。如果相对于对照的T1R活性值为约90％、可选地50％、可选地25-0％，则获得T1R多肽的抑制。如果相对于对照的T1R活性值为110％、可选地150％、200-500％或1000-2000％，则获得T1R多肽的活化。
通过测定表达T1R多肽的细胞或膜的离子极化(即电势)变化，可以评价离子通量变化。测定细胞极化变化的一个方法是利用电压-钳(voltage-clamp)和补丁-钳(patch-clamp)技术测量电流变化(从而检测极化的变化)(例如参见，“细胞附着”模式、“内-外”模式、和“全细胞”模式，如Ackerman等人，New Engl. J Med.，3361575-1595(1997))。利用标准方法可以很方便地测量全细胞电流。其它已知的分析包括放射性标记离子通量分析以及使用电压敏感性染料的荧光分析(例如参见，Vestergarrd-Bogind等人，J.Membrane Biol.，8867-75(1988)；Gonzales&Tsien，Chem.Biol.，4269-277(1997)；Daniel等人，J.Pharmacol.Meth.，25185-193(1991)；Holevinsky等人，J.Membrane Biol.，13759-70(1994))。
通过检测上述任何一个参数，可以测定待测化合物对多肽功能的效应。可以使用影响GPCR活性的任何适当的生理学变化来评价待测化合物对本发明多肽的影响。当使用完整细胞或动物确定功能结果时，还可以测定各种效应，例如递质释放、激素释放、已知或未鉴定遗传标志的转录变化(例如Northern印迹)、细胞代谢变化(例如细胞生长或pH变化)以及细胞内第二信使如Ca2+、IP3、cGMP或cAMP的变化。
优选的GPCR分析包括带有离子或电压敏感性染料以报告受体活性的细胞。测定这类受体活性的分析也可使用其它G蛋白偶联受体的已知激动剂和拮抗剂作为对照，来评价待测化合物的活性。在鉴定调节性化合物(例如激动剂、拮抗剂)的分析中，分别使用离子敏感性或膜电位荧光指示剂来监测胞质中离子水平或膜电位的变化。可能使用的离子敏感性指示剂和电压探针公开见于Molecular Probes 1997Catalog。混栖(promiscuous)G蛋白如Gα15和Gα16可用于选择分析G蛋白偶联受体(Wilkie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，8810049-10053(1991))。
受体活化启动随后的细胞内事件，例如第二信使增加。某些G蛋白偶联受体的活化通过磷脂酶C介导的磷脂酰肌醇水解作用刺激形成三磷酸肌醇(IP3)(Berridge&Irvine，Nature，312315-21(1984))。IP3继而刺激细胞内钙离子库存的释放。因此，胞质钙离子水平的变化、或第二信使如IP3水平的变化可用于评价G蛋白偶联受体的功能。由于细胞内库存钙的释放以及细胞外钙通过质膜离子通道进入的作用，表达该类G蛋白偶联受体的细胞可能显示胞质中钙离子水平提高。
在优选实施方案中，通过在异源细胞中稳定或瞬时、优选稳定共表达T1R基因以及可以将受体连接到磷脂酶C信号传导途径的混栖G蛋白，可以测定T1R多肽的活性(参见Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995))。在优选实施方案中，该细胞系是HEK-293(其通常不表达T1R基因)，该混栖G蛋白是Gα15(Offermanns&Simon，同上)。细胞内Ca2+水平可响应由给予可结合T1R多肽的分子而调节的T1R信号传导途径而变化，通过测量细胞内Ca2+水平的变化可分析味觉传导的调节。可选地使用荧光Ca2+指示剂染料和荧光成像术测定Ca2+水平。
在另一实施方案中，可以根据美国专利5,436,128分析磷脂酰肌醇(PI)水解作用，在此引用以供参考。简而言之，该分析包括用3H-肌醇标记细胞48小时或更长时间。标记的细胞利用待测化合物处理1小时。将处理的细胞裂解并用氯仿-甲醇-水抽提，其后通过离子交换层析分离磷酸肌醇，通过闪烁计数定量。计算存在激动剂时的cpm和存在缓冲液对照时的cpm的比率，确定刺激倍数。同样，计算存在拮抗剂时的cpm和存在缓冲液对照(可能含有或不含有激动剂)时的cpm的比率，确定抑制倍数。
其它受体分析可包括测定细胞内环核苷酸、例如cAMP或cGMP的水平。在受体活化导致环核苷酸水平降低的情况下，可能优选在分析中将受体活化化合物加入细胞之前，将细胞暴露于可增加细胞内环核苷酸水平的试剂如福斯高林(Forskolin)中。在一个实施方案中，可以使用免疫分析测定细胞内cAMP或cGMP的变化。Offermanns&Simon，J.Biol.Chem.，27015175-15180(1995)所述方法可以用于测定cAMP水平。同样，Felley-Bosco等人，Am.J.Resp.Cell and Mol.Biol.，11159-164(1994)所述方法可以用于测定cGMP水平。此外，美国专利4,115,538描述了测定cAMP和/或cGMP的分析试剂盒，在此引用以供参考。
在另一实施方案中，可以测量转录水平，以评价待测化合物对信号传导的效应。将包含目的T1R多肽的宿主细胞与待测化合物接触足够长的时间，以实现任何相互作用，然后测量基因表达水平。可以凭经验确定实现这些相互作用的时间量，例如执行一个时间进程并测量转录水平作为时间的函数。可以使用本领域技术人员已知的适当方法测量转录量。例如，可以使用Northern印迹检测目的蛋白的mRNA表达，或使用免疫分析鉴定其多肽产物。或者，可以使用利用报告基因的基于转录的分析，如美国专利5,436,128所述，在此引用以供参考。报告基因可以是，例如氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶和碱性磷酸酶。此外，通过附着于第二报告分子如绿色荧光蛋白，可以将目的蛋白用作间接报告分子(例如参见，Mistili&Spector，Nature Biotechnology，15961-964(1997))。
然后将转录量与相同细胞在缺少待测化合物时的转录量相比较，或者与基本相同细胞在缺少目的T1R多肽时的转录量相比较。基本相同的细胞可以来源于制备重组细胞的相同细胞，但未引入异源DNA进行修饰。转录量的任何差异意味着待测化合物在某种意义上改变了目的T1R多肽的活性。
4.表达化学感受受体的非人类转基因动物表达本发明T1R味觉受体序列组合的非人类动物也可用于受体分析。通过将稳定或瞬时转染编码化学感受受体或其配体结合区核酸的非人类动物与待测化合物接触，并确定该动物是否通过特异性结合受体多肽复合物而与待测化合物反应，从而可以使用这类表达确定待测化合物是否在体内特异性结合哺乳动物味觉跨膜受体复合物，利用本发明载体转染或感染的动物可用于鉴定和表征可结合特定或成组受体的味觉刺激物的分析中。这类经载体感染、可表达人类味觉受体序列的动物，可用于体内筛选味觉刺激物及其对例如细胞生理学(例如对味觉神经元)、CNS或行为的作用。另外，表达T1R或其组合的稳定细胞系可用作核酸供体，以产生稳定表达特定T1R或其组合的转基因克隆动物。使用核酸转移技术产生表达目的外源DNA的克隆动物的方法，是授予University of Massachusetts(授权给AdvancedCell Technology，Inc.)以及Roslin Institute(授权给Geron Corp.)的几个授权的美国专利的主题。
以单独或文库形式感染/表达核酸和载体的方法为本领域所公知。可以利用多种方法测量各种单个细胞、器官、或整体动物的参数。通过利用感染剂、例如腺病毒表达载体运送，可在例如动物味觉组织中共表达本发明的T1R序列。
内源性味觉受体基因可保持功能性，并仍然表现野生型(天然)活性。在其它情况下，如果希望所有的味觉受体活性均通过引入外源杂合受体产生，优选使用敲除系。构建非人类转基因动物、特别是转基因小鼠，并选择和制备产生转化细胞的重组构建体的方法为本领域所公知。
构建“敲除”细胞和动物根据的前提是，通过将用于干扰待抑制基因某部分DNA序列的新DNA序列引入基因组中，可以降低或完全消除哺乳动物细胞中特定基因的表达水平。同样，“基因诱捕插入”(gene trap insertion)可用于破坏宿主基因，小鼠胚胎干(ES)细胞可用于产生敲除的转基因动物(例如参见，Holzschu，TransgenicRes.697-106(1997))。通常利用互补核酸序列间的同源重组进行外源序列的插入。外源序列是待修饰靶基因的某一部分，例如外显子、内含子或转录调节序列，或可影响靶基因表达水平的任何基因组序列；或其组合。多能胚胎干细胞通过同源重组进行基因导向，可以精确修饰目的基因组序列。任何技术都可用于产生、筛选、繁殖敲除动物，例如参见Bijvoet，Hum.Mol.Genet.753-62(1998)；Moreadith，J.Mol.Med.75208-216(1997)；Tojo，Cytotechnology19161-165(1995)；Mudgett，Methods Mol.Biol.48167-184(1995)；Longo，Transgenic Res.6321-328(1997)；美国专利5,616,491；5,464,764；5,631,153；5,487,992；5,627,059；5,272,071；WO 91/09955；WO 93/09222；WO 96/29411；WO 95/31560；WO 91/12650。
本发明的核酸也可用作产生“敲除”人细胞及其后代的试剂。类似地，本发明的核酸也可用作产生小鼠“敲入(knock-ins)”的试剂。人或大鼠T1R基因序列可以替换小鼠基因组中的直向进化同源T1R。利用这种方式可以产生表达人或大鼠T1R的小鼠。该小鼠然后可用于分析人或大鼠T1R的功能，并鉴定这类T1R的配体。
a.调节子作为T1R家族成员调节剂进行测试的化合物可以是任何小的化学化合物、或生物学实体，例如蛋白质、核酸或脂类。其实例包括5’IMP和5’GMP。基本上任何化学化合物都可以用作本发明分析中的潜在调节剂或配体，尽管最常测试可溶于含水溶液中的化合物。这些分析可以设计成通过自动化分析步骤以及提供来自任何方便来源的化合物，进行大的化学文库的筛选；这些分析通常平行进行(例如，在机器人分析中，于微量滴定板上以微量滴定方式进行)。应当理解，可以利用多种化学反应之一(例如Senomyx proprietary chemistries)合成化学文库。另外还有很多化学化合物供应商，包括Sigma(St.Louis，MO)、Aldrich(St.Louis，MO)、Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Buchs，Switzerland)等。
在一个优选实施方案中，高通量筛选方法包括提供包含大量潜在味觉影响性化合物(潜在调节剂或配体化合物)的组合化学品或肽文库。然后在上述一种或多种分析中筛选这类“组合化学品文库”或“配体文库”，以鉴定显示所需特征性活性的文库成员(特别是化学种类或亚类)。这样鉴定的化合物可作为常规的“前导化合物(leadcompounds)”，或其本身可用作可能的或实际的味觉调节剂。
优选针对稳定表达T1R或T1R组合、即T1R1/T1R3或T1R2/T1R3并优选合适的G蛋白、例如Gα15的细胞或细胞系，筛选这类文库。如下文实施例所示，这类稳定的细胞系对味觉刺激物、例如鲜味觉或甜味觉刺激物显示非常显著的响应。然而，瞬时表达一种或多种T1R的细胞和细胞系也可用于这类分析中。
组合化学品文库是由化学合成或生物合成产生的不同化学化合物的集合，经大量化学“构造部件(building blocks)”例如试剂组合而成。例如，线性组合化学品文库、例如多肽文库是由一系列化学构造部件(氨基酸)按各种可能方式以指定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸的数目)组合而成。通过这种化学构造部件的组合混合，可以合成出成千上百万种化学化合物。
组合化学品文库的制备和筛选为本领域技术人员所公知。这类组合化学品文库包括、但并不局限于肽文库(例如参见，美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493(1991)以及Houghton等人，Nature，35484-88(1991))。也可以使用产生化学多样性文库的其它化学物质。这些化学物质包括、但并不局限于类肽(peptoid)(例如PCT公开WO 91/19735)、编码的肽(例如PCT公开WO 93/20242)、随机生物寡聚物(PCT公开WO 92/00091)、苯并二氮杂(例如美国专利5,288,514)、异聚物(diversomers)例如乙内酰脲和苯并二氮杂和二肽(Hubbs等人，Proc.Nat.Acad.Sci.，906906-6913(1993))、联乙烯(vinylogous)多肽(Hagihara等人，J.Amer.Chem.Soc.，1146568(1992))、具有葡萄糖支架的非肽性肽模拟物(nonpeptidal petidomimetics)(Hirschmann等人，J.Amer.Chem.Soc.，1149217-9218(1992))、类似的有机合成小分子化合物文库(Chen等人，J.Amer.Chem.Soc.，1162661(1994))、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho等人，Science，2611303(1993))、肽基膦酸酯(Campbell等人，J.Org.Chem.，59658(1994))、核酸文库(Ausubel，Berger和Sambrook，均同上)、肽核酸文库(美国专利5,539,083)、抗体文库(Vaughn等人，NatureBiotechnology，14(3)309-314(1996)和PCT/US96/10287)、糖类文库(Liang等人，Science，2741520-1522(1996)和美国专利5,593,853)，有机小分子文库(苯并二氮杂，Baum，C&EN，Jan 18，33页(1993)；噻唑烷酮(thiazolidinones)和间噻嗪烷酮(metathiazanones)，美国专利5,549,974；pynrolidines，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮杂，5,288,514等)。
制备组合文库的装置已可商品化获得(例如参见，357 MPS，390MPS(Advanced Chem Tech，Louisville KY)，Symphony(Rainin，Woburn，MA)，433A(Applied Biosystems，Foster City，CA)，9050Plus(Millipore，Bedford，MA))。另外，众多组合文库本身也可商品化获得(例如参见，ComGenex，Princeton，NJ；Tripos，Inc.，St.Louis，MO；3D Pharmaceuticals，Exton，PA；Martek Biosciences；Columbia，MD等)。
在本发明的一个方面，T1R调节剂可用于任何食品、糖果、药物组合物或其成分，从而按所需方式调节产品、组合物或成分的味道。例如，可以加入可增强甜味觉感受的T1R调节剂，使产品或组合物变甜，而在食品中加入可增强鲜味觉感受的T1R调节剂，可增加鲜美味道。另外，可以使用T1R拮抗剂阻断甜味和/或鲜味觉。
b.试剂盒T1R基因及其同源体是鉴定化学感受受体细胞、法医学和亲子鉴定、以及检验味觉传导的有用工具。可与T1R核酸特异性杂交的T1R家族成员特异性试剂，例如T1R探针和引物，以及可特异性结合T1R多肽的T1R特异性试剂，例如T1R抗体，可以用于检验味觉细胞表达和味觉传导调节。
确定样品中存在T1R家族成员DNA和RNA的核酸分析包括本领域技术人员已知的众多技术，例如Southern分析、Northern分析、点印迹、RNA酶保护、S1分析、扩增技术例如PCR、以及原位杂交。例如在原位杂交中，将靶核酸从其细胞内环境中释放出来，以便能够在细胞内进行杂交，同时保持细胞形态，供随后的解释和分析。下列文章提供了原位杂交技术的概况Singer等人，Biotechniques，4230-250(1986)；Haase等人，Methods in Virology，卷VII189-226页(1984)；以及Nucleic Acid HybridizationA PracticalApproach(Names等人，eds.1987)。另外，可以利用上述多种免疫分析技术检测T1R多肽。测试样品通常同时与阳性对照(例如，表达重组T1R多肽的样品)和阴性对照作比较。
本发明还提供了用于筛选T1R家族成员调节剂的试剂盒。该试剂盒可以从易于获得的材料和试剂中制备。例如，该试剂盒可以包含下列材料中的任何一种或多种T1R核酸或蛋白质、反应管以及测试T1R活性的说明书。可选地，该试剂盒包含生物学活性的T1R受体、或可以稳定或瞬时表达含生物学活性T1R的味觉受体的细胞系。按照本发明可以制备多种试剂盒及组分，这取决于该试剂盒的特定用户以及用户的特定需要。
实施例在上文详述本发明的同时，提供以下实施例阐述其优选实施方案。这些实施例意在说明、而非限制本发明的范围。
在此处所示蛋白质序列中，单字母编码X或Xaa是指二十种常见氨基酸残基中的任何一种。在此处所示DNA序列中，单字母编码N或n是指四种常见核苷酸碱基A、T、C或G中的任何一种。
实施例1制备无内含子的hT1R表达构建体联用基于cDNA和基因组DNA的方法，克隆无内含子的hT1R表达构建体。为了产生全长hT1R1表达构建体，将在克隆的hT1R1间隔中(登录号#AL159177)鉴定的两个5’编码的外显子通过PCR-重叠进行组合，然后连接到5’-截短的睾丸cDNA克隆中。从部分测序的hT1R2基因组间隔中产生hT1R2表达构建体。使用来源于大鼠对应编码序列的探针筛选所克隆的基因组间隔的鸟枪文库(shotgun libraries)，鉴定缺少的两个hT1R2 5’外显子。然后通过PCR-重叠组合编码外显子，产生全长的表达构建体。通过PCR-重叠从测序的hT1R3基因组间隔中(登录号#AL139287)产生hT1R3表达构建体。使用通过基于hT1R3的简并PCR产生的rT1R3外显子片段，从大鼠味觉组织来源的cDNA文库中分离大鼠T1R3。从Dr.Charles Zuker(University ofCalifornia，San Diego)获得部分hT1R1 cDNA、rT1R2 cDNA以及部分hT1R2序列。
上述鉴定的T1R克隆序列及其它全长和部分T1R序列的核酸和氨基酸序列如下所示SEQ ID NO4氨基酸序列rT1R3MPGLAILGLSLAAFLELGMGSSLCLSQQFKAQGDYILGGLFPLGTTEEATLNQRTQPNGILCTRFSPLGLFLAMAMKMAVEEINNGSALLPGLRLGYDLFDTCSEPVVTMKPSLMFMAKVGSQSIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELALITGKFFSFFLMPQVSYSASMDRLSDRETFPSFFRTVPSDRVQLQAVVTLLQNFSWNWVAALGSDDDYGREGLSIFSGLANSRGICIAHEGLVPQHDTSGQQLGKVVDVLRQVNQSKVQVVVLFASARAVYSLFSYSILHDLSPKVWVASESWLTSDLVMTLPNIARVGTVLGFLQRGALLPEFSHYVETRLALAADPTFCASLKAELDLEERVMGPRCSQCDYIMLQNLSSGLMQNLSAGQLHHQIFATYAAVYSVAQALHNTLQCNVSHCHTSEPVQPWQLLENMYNMSFRARDLTLQFDAKGSVDMEYDLKMWVWQSPTPVLHTVGTFNGTLQLQHSKMYWPGNQVPVSQCSRQCKDGQVRRVKGFHSCCYDCVDCKAGSYRKHPDDFTCTPCGKDQWSPEKSTTCLPRRPKFLAWGEPAVLSLLLLLCLVLGLTLAALGLFVHYWDSPLVQASGGSLFCFGLICLGLFCLSVLLFPGRPRSASCLAQQPMAHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWANWLCSYLRGPWAWLVVLLATLVEAALCAWYLMAFPPEVVTDWQVLPTEVLEHCRMRSWVSLGLVHITNAVLAFLCFLGTFLVQSQPGRYNRARGLTFAMLAYFIIWVSFVPLLANVQVAYQPAVQMGAILFCALGILATFHLPKCYVLLWLPELNTQEFFLGRSPKEASDGNSGSSEATRGHSESEQ ID NO5氨基酸序列hT1R1MLLCTARLVGLQLLISCCWAFACHSTESSPDFTLPGDYLLAGLFPLHSGCLQVRHRPEVTLCDRSCSFNEHGYHLFQAMRLGVEEINNSTALLPNITLGYQLYDVCSDSANVYATLRVLSLPGQHHIELQGDLLHYSPTVLAVIGPDSTNRAATTAALLSPFLVPMISYAASSETLSVKRQYPSFLRTIPNDKYQVETMVLLLQKFGWTWISLVGSSDDYGQLGVQALENQATGQGICIAFKDIMPFSAQVGDERMQCLMRHLAQAGATVVVVFSSRQLARVFFESVVLTNLTGKVWVASEAWALSRHITGVPGIQRIGMVLGVAIQKRAVPGLKAFEEAYARADKKAPRPCHKGSWCSSNQLCRECQAFMAHTMPKLKAFSMSSAYNAYRAVYAVAHGLHQLLGCASGACSRGRVYPWQLLEQIHKVHFLLHKDTVAFNDNRDPLSSYNIIAWDWNGPKWTFTVLGSSTWSPVQLNINETKIQWHGKDNQVPKSVCSSDCLEGHQRVVTGFHHCCFECVPCGAGTFLNKSDLYRCQPCGKEEWAPEGSQTCFPRTVVFLALREHTSWVLLAANTLLLLLLLGTAGLFAWHLDTPVVRSA
GGRLCFLMLGSLAAGSGSLYGFFGEPTRPACLLRQALFALGFTIFLSCLTVRSFQLIIIFKFSTKVPTFYHAWVQNHGAGLFVMISSAAQLLICLTWLVVWTPLPAREYQRFPHLVMLECTETNSLGFILAFLYNGLLSISAFACSYLGKDLPENYNEAKCVTFSLLFNFVSWIAFFTTASVYDGKYLPAANMMAGLSSLSSGFGGYFLPKCYVILCRPDLNSTEHFQASIQDYTRRCGSTSEQ ID NO6氨基酸序列hT1R2MGPRAKTICSLFFLLWVLAEPAENSDFYLPGDYLLGGLFSLHANMKGIVHLNFLQVPMCKEYEVKVIGYNLMQAMRFAVEEINNDSSLLPGVLLGYEIVDVCYISMNVQPVLYFLAHEDNLLPIQEDYSNYISRVVAVIGPDNSESVMTVANFLSLFLLPQITYSAISDELRDKVRFPALLRTTPSADHHVEAMVQLMLHFRWNWIIVLVSSDTYGRDNGQLLGERVARRDICIAFQETLPTLQPNQNMTSEERQRLVTIVDKLQQSTARVVVVFSPDLTLYHFFNEVLRQNFTGAVWIASESWAIDPVLHNLTELGHLGTFLGITIQSVPIPGFSEFREWGPQAGPPPLSRTSQSYTCNQECDNCLNATLSFNTILRLSGERVVYSVYSAVYAVAHALHSLLGCDKSTCTKRVVYPWQLLEEIWKVNFTLLDHQIFFDPQGDVALHLEIVQWQWDRSQNPFQSVASYYPLQRQLKNIQDISWHTVNNTIPMSMCSKRCQSGQKKKPVGIHVCCFECIDCLPGTFLNHTEDEYECQACPNNEWSYQSETSCFKRQLVFLEWHEAPTIAVALLAALGFLSTLAILVIFWRHFQTPIVRSAGGPMCFLMLTLLLVAYMVVPVYVGPPKVSTCLCRQALFPLCFTICISCIAVRSFQIVCAFKMASRFPRAYSYWVRYQGPYVSMAFITVLKMVIVVIGMLATGLSPTTRTDPDDPKITIVSCNPNYRNSLLFNTSLDLLLSVVGFSFAYMGKELPTNYNEAKFITLSMTFYFTSSVSLCTFMSAYSGVLVTIVDLLVTVLNLLAISLGYFGPKCYMILFYPERNTPAYFNSMIQGYTMRRDSEQ ID NO7氨基酸序列hT1R3MLGPAVLGLSLWALLHPGTGAPLCLSQQLRMKGDYVLGGLFPLGEAEEAGLRSRTRPSSPVCTRFSSNGLLWALAMKMAVEEINNKSDLLPGLRLGYDLFDTCSEPVVAMKPSLMFLAKAGSRDIAAYCNYTQYQPRVLAVIGPHSSELAMVTGKFFSFFLMPQVSYGASMELLSARETFPSFFRTVPSDRVQLTAAAELLQEFGWNWVAALGSDDEYGRQGLSIFSALAAARGICIAHEGLVPLPRADDSRLGKVQDVLHQVNQSSVQVVLLFASVHAAHALFNYSISSRLSPKVWVASEAWLTSDLVMGLPGMAQMGTVLGFLQRGAQLHEFPQYVKTHLALATDPAFCSALGEREQGLEEDVVGQRCPQCDCITLQNVSAGLNHHQTFSVYAAVYSVAQALHNTLQCNASGCPAQDPVKPWQLLENMYNLTFHVGGLPLRFDSSGNVDMEYDLKLWVWQGSVPRLHDVGRFNGSLRT
ERLKIRWHTSDNQKPVSRCSRQCQEGQVRRVKGFHSCCYDCVDCEAGSYRQNPDDIACTFCGQDEWSPERSTRCFRRRSRFLAWGEPAVLLLLLLLSLALGLVLAALGLFVHHRDSPLVQASGGPLACFGLVCLGLVCLSVLLFPGQPSPARCLAQQPLSHLPLTGCLSTLFLQAAEIFVESELPLSWADRLSGCLRGPWAWLVVLLAMLVEVALCTWYLVAFPPEVVTDWHMLPTEALVHCRTRSWVSFGLAHATNATLAFLCFLGTFLVRSQPGRYNRARGLTFAMLAYFITWVSFVPLLANVQVVLRPAVQMGALLLCVLGILAAFHLPRCYLLMRQPGLNTPEFFLGGGPGDAQGQNDGNTGNQGKHESEQ ID NO8核酸序列hT1R1ATGCTGCTCTGCACGGCTCGCCTGGTCGGCCTGCAGCTTCTCATTTCCTGCTGCTGGGCCTTTGCCTGCCATAGCACGGAGTCTTCTCCTGACTTCACCCTCCCCGGAGATTACCTCCTGGCAGGCCTGTTCCCTCTCCATTCTGGCTGTCTGCAGGTGAGGCACAGACCCGAGGTGACCCTGTGTGACAGGTCTTGTAGCTTCAATGAGCATGGCTACCACCTCTTCCAGGCTATGCGGCTTGGGGTTGAGGAGATAAACAACTCCACGGCCCTGCTGCCCAACATCACCCTGGGGTACCAGCTGTATGATGTGTGTTCTGACTCTGCCAATGTGTATGCCACGCTGAGAGTGCTCTCCCTGCCAGGGCAACACCACATAGAGCTCCAAGGAGACCTTCTCCACTATTCCCCTACGGTGCTGGCAGTGATTGGGCCTGACAGCACCAACCGTGCTGCCACCACAGCCGCCCTGCTGAGCCCTTTCCTGGTGCCCATGATTAGCTATGCGGCCAGCAGCGAGACGCTCAGCGTGAAGCGGCAGTATCCCTCTTTCCTGCGCACCATCCCCAATGACAAGTACCAGGTGGAGACCATGGTGCTGCTGCTGCAGAAGTTCGGGTGGACCTGGATCTCTCTGGTTGGCAGCAGTGACGACTATGGGCAGCTAGGGGTGCAGGCACTGGAGAACCAGGCCACTGGTCAGGGGATCTGCATTGCTTTCAAGGACATCATGCCCTTCTCTGCCCAGGTGGGCGATGAGAGGATGCAGTGCCTCATGCGCCACCTGGCCCAGGCCGGGGCCACCGTCGTGGTTGTTTTTTCCAGCCGGCAGTTGGCCAGGGTGTTTTTCGAGTCCGTGGTGCTGACCAACCTGACTGGCAAGGTGTGGGTCGCCTCAGAAGCCTGGGCCCTCTCCAGGCACATCACTGGGGTGCCCGGGATCCAGCGCATTGGGATGGTGCTGGGCGTGGCCATCCAGAAGAGGGCTGTCCCTGGCCTGAAGGCGTTTGAAGAAGCCTATGCCCGGGCAGACAAGAAGGCCCCTAGGCCTTGCCACAAGGGCTCCTGGTGCAGCAGCAATCAGCTCTGCAGAGAATGCCAAGCTTTCATGGCACACACGATGCCCAAGCTCAAAGCCTTCTCCATGAGTTCTGCCTACAACGCATACCGGGCTGTGTATGCGGTGGCCCATGGCCTC
CACCAGCTCCTGGGCTGTGCCTCTGGAGCTTGTTCCAGGGGCCGAGTCTACCCCTGGCAGCTTTTGGAGCAGATCCACAAGGTGCATTTCCTTCTACACAAGGACACTGTGGCGTTTAATGACAACAGAGATCCCCTCAGTAGCTATAACATAATTGCCTGGGACTGGAATGGACCCAAGTGGACCTTCACGGTCCTCGGTTCCTCCACATGGTCTCCAGTTCAGCTAAACATAAATGAGACCAAAATCCAGTGGCACGGAAAGGACAACCAGGTGCCTAAGTCTGTGTGTTCCAGCGACTGTCTTGAAGGGCACCAGCGAGTGGTTACGGGTTTCCATCACTGCTGCTTTGAGTGTGTGCCCTGTGGGGCTGGGACCTTCCTCAACAAGAGTGACCTCTACAGATGCCAGCCTTGTGGGAAAGAAGAGTGGGCACCTGAGGGAAGCCAGACCTGCTTCCCGCGCACTGTGGTGTTTTTGGCTTTGCGTGAGCACACCTCTTGGGTGCTGCTGGCAGCTAACACGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTTGGGACTGCTGGCCTGTTTGCCTGGCACCTAGACACCCCTGTGGTGAGGTCAGCAGGGGGCCGCCTGTGCTTTCTTATGCTGGGCTCCCTGGCAGCAGGTAGTGGCAGCCTCTATGGCTTCTTTGGGGAACCCACAAGGCCTGCGTGCTTGCTACGCCAGGCCCTCTTTGCCCTTGGTTTCACCATCTTCCTGTCCTGCCTGACAGTTCGCTCATTCCAACTAATCATCATCTTCAAGTTTTCCACCAAGGTACCTACATTCTACCACGCCTGGGTCCAAAACCACGGTGCTGGCCTGTTTGTGATGATCAGCTCAGCGGCCCAGCTGCTTATCTGTCTAACTTGGCTGGTGGTGTGGACCCCACTGCCTGCTAGGGAATACCAGCGCTTCCCCCATCTGGTGATGCTTGAGTGCACAGAGACCAACTCCCTGGGCTTCATACTGGCCTTCCTCTACAATGGCCTCCTCTCCATCAGTGCCTTTGCCTGCAGCTACCTGGGTAAGGACTTGCCAGAGAACTACAACGAGGCCAAATGTGTCACCTTCAGCCTGCTCTTCAACTTCGTGTCCTGGATCGCCTTCTTCACCACGGCCAGCGTCTACGACGGCAAGTACCTGCCTGCGGCCAACATGATGGCTGGGCTGAGCAGCCTGAGCAGCGGCTTCGGTGGGTATTTTCTGCCTAAGTGCTACGTGATCCTCTGCCGCCCAGACCTCAACAGCACAGAGCACTTCCAGGCCTCCATTCAGGACTACACGAGGCGCTGCGGCTCCACCTGASEQ ID NO 9核酸序列hT1R3ATGCTGGGCCCTGCTGTCCTGGGCCTCAGCCTCTGGGCTCTCCTGCACCCTGGGACGGGGGCCCCATTGTGCCTGTCACAGCAACTTAGGATGAAGGGGGACTACGTGCTGGGGGGGCTGTTCCCCCTGGGCGAGGCCGAGGAGGCTGGCCTCCGCAGCCGGACACGGCCCAGCAGCCCTGTGTGCACCAGGTTCTCCTCAAACGGCCTGCTCTGGGCACTGGCCATGAAAATGGCCGTGGAGGAGATCAACAACAAGTCGGATCTGCTGCCCGGGCTGCGCCTGGGCTACGACCTCTTTGATACGTGCTCGGAGCCTGTGGTGGCCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCCTGGCCAAGGCAGGCAGCCGCGACATCGCCGCCTACTGCAACTACACGCAGTACCAGCCCCGTGTGCTGGCTGTCATCGGGCCCCACTCGTCAGAGCTCGCCATGGTCACCGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCCCAggtcagCTACGGTGCTAGCATGGAGCTGCTGAGCGCCCGGGAGACCTTC
CCCTCCTTCTTCCGCACCGTGCCCAGCGACCGTGTGCAGCTGACGGCCGCCGCGGAGCTGCTGCAGGAGTTCGGCTGGAACTGGGTGGCCGCCCTGGGCAGCGACGACGAGTACGGCCGGCAGGGCCTGAGCATCTTCTCGGCCCTGGCCGCGGCACGCGGCATCTGCATCGCGCACGAGGGCCTGGTGCCGCTGCCCCGTGCCGATGACTCGCGGCTGGGGAAGGTGCAGGACGTCCTGCACCAGGTGAACCAGAGCAGCGTGCAGGTGGTGCTGCTGTTCGCCTCCGTGCACGCCGCCCACGCCCTCTTCAACTACAGCATCAGCAGCAGGCTCTCGCCCAAGGTGTGGGTGGCCAGCGAGGCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGGGGCTGCCCGGCATGGCCCAGATGGGCACGGTGCTTGGCTTCCTCCAGAGGGGTGCCCAGCTGCACGAGTTCCCCCAGTACGTGAAGACGCACCTGGCCCTGGCCACCGACCCGGCCTTCTGCTCTGCCCTGGGCGAGAGGGAGCAGGGTCTGGAGGAGGACGTGGTGGGCCAGCGCTGCCCGCAGTGTGACTGCATCACGCTGCAGAACGTGAGCGCAGGGCTAAATCACCACCAGACGTTCTCTGTCTACGCAGCTGTGTATAGCGTGGCCCAGGCCCTGCACAACACTCTTCAGTGCAACGCCTCAGGCTGCCCCGCGCAGGACCCCGTGAAGCCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAACCTGACCTTCCACGTGGGCGGGCTGCCGCTGCGGTTCGACAGCAGCGGAAACGTGGACATGGAGTACGACCTGAAGCTGTGGGTGTGGCAGGGCTCAGTGCCCAGGCTCCACGACGTGGGCAGGTTCAACGGCAGCCTCAGGACAGAGCGCCTGAAGATCCGCTGGCACACGTCTGACAACCAGAAGCCCGTGTCCCGGTGCTCGCGGCAGTGCCAGGAGGGCCAGGTGCGCCGGGTCAAGGGGTTCCACTCCTGCTGCTACGACTGTGTGGACTGCGAGGCGGGCAGCTACCGGCAAAACCCAGACGACATCGCCTGCACCTTTTGTGGCCAGGATGAGTGGTCCCCGGAGCGAAGCACACGCTGCTTCCGCCGCAGGTCTCGGTTCCTGGCATGGGGCGAGCCGGCTGTGCTGCTGCTGCTCCTGCTGCTGAGCCTGGCGCTGGGCCTTGTGCTGGCTGCTTTGGGGCTGTTCGTTCACCATCGGGACAGCCCACTGGTTCAGGCCTCGGGGGGGCCCCTGGCCTGCTTTGGCCTGGTGTGCCTGGGCCTGGTCTGCCTCAGCGTCCTCCTGTTCCCTGGCCAGCCCAGCCCTGCCCGATGCCTGGCCCAGCAGCCCTTGTCCCACCTCCCGCTCACGGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAGGCGGCCGAGATCTTCGTGGAGTCAGAACTGCCTCTGAGCTGGGCAGACCGGCTGAGTGGCTGCCTGCGGGGGCCCTGGGCCTGGCTGGTGGTGCTGCTGGCCATGCTGGTGGAGGTCGCACTGTGCACCTGGTACCTGGTGGCCTTCCCGCCGGAGGTGGTGACGGACTGGCACATGCTGCCCACGGAGGCGCTGGTGCACTGCCGCACACGCTCCTGGGTCAGCTTCGGCCTAGCGCACGCCACCAATGCCACGCTGGCCTTTCTCTGCTTCCTGGGCACTTTCCTGGTGCGGAGCCAGCCGGGCTGCTACAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTTGCCATGCTGGCCTACTTCATCACCTGGGTCTCCTTTGTGCCC
CTCCTGGCCAATGTGCAGGTGGTCCTCAGGCCCGCCGTGCAGATGGGCGCCCTCCTGCTCTGTGTCCTGGGCATCCTGGCTGCCTTCCACCTGCCCAGGTGTTACCTGCTCATGCGGCAGCCAGGGCTCAACACCCCCGAGTTCTTCCTGGGAGGGGGCCCTGGGGATGCCCAAGGCCAGAATGACGGGAACACAGGAAATCAGGGGAAACATGAGTGASEQ ID NO10核酸序列hT1R2ATGGGGCCCAGGGCAAAGACCATCTGCTCCCTGTTCTTCCTCCTATGGGTCCTGGCTGAGCCGGCTGAGAACTCGGACTTCTACCTGCCTGGGGATTACCTCCTGGGTGGCCTCTTCTCCCTCCATGCCAACATGAAGGGCATTGTTCACCTTAACTTCCTGCAGGTGCCCATGTGCAAGGAGTATGAAGTGAAGGTGATAGGCTACAACCTCATGCAGGCCATGCGCTTCGCGGTGGAGGAGATCAACAATGACAGCAGCCTGCTGCCTGGTGTGCTGCTGGGCTATGAGATCGTGGATGTGTGCTACATCTCCAACAATGTCCAGCCGGTGCTCTACTTCCTGGCACACGAGGACAACCTCCTTCCCATCCAAGAGGACTACAGTAACTACATTTCCCGTGTGGTGGCTGTCATTGGCCCTGACAACTCCGAGTCTGTCATGACTGTGGCCAACTTCCTCTCCCTATTTCTCCTTCCACAGATCACCTACAGCGCCATCAGCGATGAGCTGCGAGACAAGGTGCGCTTCCCGGCTTTGCTGCGTACCACACCCAGCGCCGACCACCACGTCGAGGCCATGGTGCAGCTGATGCTGCACTTCCGCTGGAACTGGATCATTGTGCTGGTGAGCAGCGACACCTATGGCCGCGACAATGGCAGCTGCTTGGCGAGCGCGTGGCCCGGCGCGACATCTGCATCGCCTTCCAGGAGACGCTGCCCACACTGCAGCCCAACCAGAACATGACGTCAGAGGAGCGCCAGCGCCTGGTGACCATTGTGGACAAGCTGCAGCAGAGCACAGCGCGCGTCGTGGTCGTGTTCTCGCCCGACCTGACCCTGTACCACTTCTTCAATGAGGTGCTGCGCCAGAACTTCACGGGCGCCGTGTGGATCGCCTCCGAGTCCTGGGCCATCGACCCGGTCCTGCACAACCTCACGGAGCTGGGCCACTTGGGCACCTTCCTGGGCATCACCATCCAGAGCGTGCCCATCCCGGGCTTCAGTGAGTTCCGCGAGTGGGGCCCACAGGCTGGGCCGCCACCCCTCAGCAGGACCAGCCAGAGCTATACCTGCAACCAGGAGTGCGACAACTGCCTGAACGCCACCTTGTCCTTCAACACCATTCTCAGGCTCTCTGGGGAGCGTGTCGTCTACAGCGTGTACTCTGCGGTCTATGCTGTGGCCCATGCCCTGCACAGCCTCCTCGGCTGTGACAAAAGCACCTGCACCAAGAGGGTGGTCTACCCCTGGCAGCTGCTTGAGGAGATCTGGAAGGTCAACTTCACTCTCCTGGACCACCAAATCTTCTTCGACCCGCAAGGGGACGTGGCTCTGCACTTGGAGATTGTCCAGTGGCAATGGGACCGGAGCCAGAATCCCTTCCAGAGCGTCGCCTCCTACTACCCCCTGCAGCGACAGCTGAAGAACATCCAAGACATCTCCTGGCACACCGTCAACAACACGATCCCTATGTCCATGTGTTCCAAGAGGTGCCAGTCAGGGCAAAAGAAGAAGCCTGTGGGCATCCACGTCTGCTGCTTCGAGTGCATCGACTGCC
TTCCCGGCACCTTCCTCAACCACACTGAAGATGAATATGAATGCCAGGCCTGCCCGAATAACGAGTGGTCCTACCAGAGTGAGACCTCCTGCTTCAAGCGGCAGCTGGTCTTCCTGGAATGGCATGAGGCACCCACCATCGCTGTGGCCCTGCTGGCCGCCCTGGGCTTCCTCAGCACCCTGGCCATCCTGGTGATATTCTGGAGGCACTTCCAGACACCCATAGTTCGCTCGGCTGGGGGCCCCATGTGCTTCCTGATGCTGACACTGCTGCTGGTGGCATACATGGTGGTCCCGGTGTACGTGGGGCCGCCCAAGGTCTCCACCTGCCTCTGCCGCCAGGCCCTCTTTCCCCTCTGCTTCACAATTTGCATCTCCTGTATCGCCGTGCGTTCTTTCCAGATCGTCTGCGCCTTCAAGATGGCCAGCCGCTTCCCACGCGCCTACAGCTACTGGGTCCGCTACCAGGGGCCCTACGTCTCTATGGCATTTATCACGGTACTCAAAATGGTCATTGTGGTAATTGGCATGCTGGCCACGGGCCTCAGTCCCACCACCCGTACTGACCCCGATGACCCCAAGATCACAATTGTCTCCTGTAACCCCAACTACCGCAACAGCCTGCTGTTCAACACCAGCCTGGACCTGCTGCTCTCAGTGGTGGGTTTCAGCTTCGCCTACATGGGCAAAGAGCTGCCCACCAACTACAACGAGGCCAAGTTCATCACCCTCAGCATGACCTTCTATTTCACCTCATCCGTCTCCCTCTGCACCTTCATGTCTGCCTACAGCGGGGTGCTGGTCACCATCGTGGACCTCTTGGTCACTGTGCTCAACCTCCTGGCCATCAGCCTGGGCTACTTCGGCCCCAAGTGCTACATGATCCTCTTCTACCCGGAGCGCAACACGCCCGCCTACTTCAACAGCATGATCCAGGGCTACACCATGAGGAGGGACTAGSEQ ID NO 11核酸序列rT1R3ATGCCGGGTTTGGCTATCTTGGGCCTCAGTCTGGCTGCTTTCCTGGAGCTTGGGATGGGGTCCTCTTTGTGTCTGTCACAGCAATTCAAGGCACAAGGGGACTATATATTGGGTGGACTATTTCCCCTGGGCACAACTGAGGAGGCCACTCTCAACCAGAGAACACAGCCCAACGGCATCCTATGTACCAGGTTCTCGCCCCTTGGTTTGTTCCTGGCCATGGCTATGAAGATGGCTGTAGAGGAGATCAACAATGGATCTGCCTTGCTCCCTGGGCTGCGACTGGGCTATGACCTGTTTGACACATGCTCAGAGCCAGTGGTCACCATGAAGCCCAGCCTCATGTTCATGGCCAAGGTGGGAAGTCAAAGCATTGCTGCCTACTGCAACTACACACAGTACCAACCCCGTGTGCTGGCTGTCATTGGTCCCCACTCATCAGAGCTTGCCCTCATTACAGGCAAGTTCTTCAGCTTCTTCCTCATGCCACAGGTCAGCTATAGTGCCAGCATGGATCGGCTAAGTGACCGGGAAACATTTCCATCCTTCTTCCGCACAGTGCCCAGTGACCGGGTGCAGCTGCAGGCCGTTGTGACACTGTTGCAGAATTTCAGCTGGAACTGGGTGGCTGCCTTAGGTAGTGATGATGACTATGGCCGGGAAGGTCTGAGCATCTTTTCTGGTCTGGCCAACTCACGAGGTATCTGCATTGCACACGAGGGCCTGGTGCCACAACATGACACTAGTGGCCAACAATTGGGCAAGGTGGTGGATGTGCTACGCCAAGTGAACCAAAGCAAAGTACAGGTGGTGGTGCTGTTTGCATCTGCCCGTGCTGTCTACTCCCTTTTTAGCTACAGCATCCTTCATGACCTCTCACCCAAGGTATGGGTGGCCAGTGAGTCCTGGCTGACCTCTGACCTGGTCATGACACTTCCCAATATTGCCCGTGTGGGCACT
GTTCTTGGGTTTCTGCAGCGCGGTGCCCTACTGCCTGAATTTTCCCATTATGTGGAGACTCGCCTTGCCCTAGCTGCTGACCCAACATTCTGTGCCTCCCTGAAAGCTGAGTTGGATCTGGAGGAGCGCGTGATGGGGCCACGCTGTTCACAATGTGACTACATCATGCTACAGAACCTGTCATCTGGGCTGATGCAGAACCTATCAGCTGGGCAGTTGCACCACCAAATATTTGCAACCTATGCAGCTGTGTACAGTGTGGCTCAGGCCCTTCACAACACCCTGCAGTGCAATGTCTCACATTGCCACACATCAGAGCCTGTTCAACCCTGGCAGCTCCTGGAGAACATGTACAATATGAGTTTCCGTGCTCGAGACTTGACACTGCAGTTTGATGCCAAAGGGAGTGTAGACATGGAATATGACCTGAAGATGTGGGTGTGGCAGAGCCCTACACCTGTACTACATACTGTAGGCACCTTCAACGGCACCCTTCAGCTGCAGCACTCGAAAATGTATTGGCCAGGCAACCAGGTGCCAGTCTCCCAGTGCTCCCGGCAGTGCAAAGATGGCCAGGTGCGCAGAGTAAAGGGCTTTCATTCCTGCTGCTATGACTGTGTGGACTGCAAGGCAGGGAGCTACCGGAAGCATCCAGATGACTTCACCTGTACTCCATGTGGCAAGGATCAGTGGTCCCCAGAAAAAAGCACAACCTGCTTACCTCGCAGGCCCAAGTTTCTGGCTTGGGGGGAGCCAGCTGTGCTGTCACTTCTCCTGCTGCTTTGCCTGGTGCTGGGCCTGACACTGGCTGCCCTGGGGCTCTTTGTCCACTACTGGGACAGCCCTCTTGTTCAGGCCTCAGGTGGGTCACTGTTCTGCTTTGGCCTGATCTGCCTAGGCCTCTTCTGCCTCAGTGTCCTTCTGTTCCCAGGACGACCACGCTCTGCCAGCTGCCTTGCCCAACAACCAATGGCTCACCTCCCTCTCACAGGCTGCCTGAGCACACTCTTCCTGCAAGCAGCCGAGATCTTTGTGGAGTCTGAGCTGCCACTGAGTTGGGCAAACTGGCTCTGCAGCTACCTTCGGGGCCCCTGGGCTTGGCTGGTGGTACTGCTGGCCACTCTTGTGGAGGCTGCACTATGTGCCTGGTACTTGATGGCTTTCCCTCCAGAGGTGGTGACAGATTGGCAGGTGCTGCCCACGGAGGTACTGGAACACTGCCGCATGCGTTCCTGGGTCAGCCTGGGCTTGGTGCACATCACCAATGCAGTGTTAGCTTTCCTCTGCTTTCTGGGCACTTTCCTGGTACAGAGCCAGCCTGGTCGCTATAACCGTGCCCGTGGCCTCACCTTCGCCATGCTAGCTTATTTCATCATCTGGGTCTCTTTTGTGCCCCTCCTGGCTAATGTGCAGGTGGCCTACCAGCCAGCTGTGCAGATGGGTGCTATCTTATTCTGTGCCCTGGGCATCCTGGCCACCTTCCACCTGCCCAAATGCTATGTACTTCTGTGGCTGCCAGAGCTCAACACCCAGGAGTTCTTCCTGGGAAGGAGCCCCAAGGAAGCATCAGATGGGAATAGTGGTAGTAGTGAGGCAACTCGGGGACACAGTGAATGA同样，下列概念性翻译对应于鱼类T1R的两个直向进化同源基因对的C末端，来源于未发表的基因组序列，提供于此。Fugu T1RA来源于登录号’scaffold164’；Fugu T1RB来源于登录号LPC61711；Tetradon T1RA来源于登录号AL226735；Tetradon T1RB来源于登录号AL222381。概念性翻译中的多义(ambiguity)(’X’)来自于数据库序列的多义。
SEQ ID NO 12T1RA FuguPSPFRDIVSYPDKIILGCFMNLKTSSVSFVLLLLLCLLCFIFSYMGKDLPKNYNEAKAITFCLLLLILTWIIFTTASLLYQGKYIHSLNALAVLSSIYSFLLWYFLPKCYIIIFQPQKNTQKYFQGLIQDYTKTISQSEQ ID NO 13T1RA TetradonFAVNYNTPVVRSAGGPMCFLILGCLSLCSISVFFYFERPTEAFCILRFMPFLLFYAVCLACFAVRSFQIVIIFKIAAKFPRVHSWWMKYHGQWLVISMTFVLQAVVIVIGFSSNPPLPYXXFVSYPDKIILGCDVNLNMASTSFFLLLLLCILCFTFSYMGKDLPKNYNEAKAITFCLLLLILTWIIFATAFMLYHGKYIHTLNALAVLSSAYCFLLWYFLPKCYIIIFQPHKNTQKYFQLSSEQ ID NO 14T1RB FuguKKQGPEVDIFIVSVTILCISVLGVAVGPPEPSQDLDFYMDSIVLECSNTLSPGSFIELCYVCVLSVLCFFFSYMGKDLPANYNEAKCVTFSLMVYMISWISFFTVYLISRGPFTVAAYVCATLVSVLAFFGGYFLPKIYIIVLKPQMNTTAHFQNCIQMYTMSKQSEQ ID NO 15T1RB TetradonAPKSSQRXLRRTRLXLEWDHPMSVALLFFLVCCLLMTSSSAVILLLNINTPVAKSAGGXTCXLKLAALTAAAMSSXCHFGQPSPLASKLKQPQFTFSFTVCLACNRCALATGHLHFXIRVALPPAYNXWAKNHGPXATIFIASAAILCVLCLRVAVGPPQPSQBLBFXTNSIXLXXSNTLSPGSFVELCNVSLLSAVCFVFSXMGKBLPANYNEAKCVTFSLMVNXISWISFFTVY另外，小鼠和大鼠T1R及其公共结构域等位基因变体相关的登录号和参考引用如下所示rT1R1(登录号AAD18069)(Hoon等人，Cell 96(4)541-51(1999))；rT1R2(登录号AAD18070)(Hoon等人，Cell 96(4)541-59(1999))；mT1R1(登录号AAK39437)；mT1R2(登录号AAK 39438)；mT1R3(登录号AAK 55537)(Max等人，Nat.Genet.28(I)58-63(2001))；rT1R1(登录号AAK7092)(Li等人，Mamm.Genome(12(I)13-16(2001))；mT1R1(登录号NP114073)；mT1R1(登录号AAK07091)(Li等人，Mamm.Genome(121)13-16(2001))；rT1R2(登录号AAD18070)(Hoon等人，Cell 9664)541-551(1999))；mT1R2(登录号NP114079)；mT1R3(登录号AAK39436)；mT1R3(登录号BAB47181)；(Kitagawa等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.283(1)236-42(2001))；mT1R3(登录号NP114078)；mT1R3(登录号AAK55536)(Max等人，Nat.Genet.28(1)58-63(2001))；以及mT1R3(登录号AAK01937)。
实施例2人和大鼠T1R的序列比对选自上述所鉴定的T1R克隆序列与大鼠对应T1R进行比对。如图1所示，人T1R1、人T1R2和人T1R3以及大鼠T1R3与前述T1R(登录号为AAD18069的rT1R1以及登录号为AAD18070的rT1R2)、大鼠mGluR1代谢型谷氨酸受体(登录号P23385)；以及人钙感受性受体(登录号P41180)进行比对。为了清晰比较，将mGluR1和钙感受性受体C末端截短。蓝色方框为7个可能的跨膜片段。红色方框为在mGluR1晶体结构中接触谷氨酸侧链carbutylate的残基，绿色方框为接触谷氨酸α-氨基酸部分的残基。紫色圆圈为参与基于亚基间二硫键形成的mGluR1和钙感受性受体半胱氨酸残基。这些半胱氨酸在T1R1和T1R2中并不保守，但位于比对的下降区，其中包含潜在的类似T1R3半胱氨酸残基，也画于圆圈内。
实施例3RT-PCR证明hT1R2和hT1R3在味觉组织中表达如图2所示，hT1R2和hT1R3在味觉组织中表达利用RT-PCR检测人轮廓乳头切片中两个基因的表达。
实施例4
在异源细胞中异源表达T1R的方法稳定表达Gα15的HEK-293衍生细胞(Chandrashekar等人，Cell100(6)703-11(2000))，在添加10％FBS、MEM非必需氨基酸(GibcoBRL)以及3μg/ml灭菌素(blasticidin)的Dulbecco’s ModifiedEagle Medium(DMEM，Gibco BRL)中生长并维持。在钙成像实验中，首先将细胞接种于24孔组织培养板中(约0.1×106/孔)，通过脂质体转染Mirus Transit-293(PanVera)。为最小化谷氨酸诱导以及葡萄糖诱导的脱敏化作用，转染后约24小时利用低葡萄糖DMEM/GlutaMAX(Gibco BRL)替换加入的DMEM。24小时以后，将细胞加入含3μM钙染料Fluo-4(Molecular Probes)的Dulbecco’s PBS缓冲液(DPBS，GibcoBRL)中，室温1.5小时。更换250μl DPBS后，加入含有味觉刺激物的200μl DPBS，室温下进行刺激。利用AxiovertS100 TV显微镜(Zeiss)，通过Imaging Workbench 4.0软件(Axon)监测钙的动员。T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的响应非常短暂-钙增加很少能保持多于15秒-而且是异步的。响应细胞的数量因而随时间相对恒定，因此，通过在固定时间点、一般于加入刺激物后30秒，手工计数响应细胞数目，可以对细胞响应进行定量。
实施例5人T1R2/T1R3具有甜味觉受体功能利用人T1R2、T1R3以及T1R2/T1R3瞬时转染稳定表达Gα15的HEK细胞，分析细胞内钙响应蔗糖浓度的提高而提高(图3(a))。同样，测定几种甜味觉刺激物的T1R2/T1R3剂量响应(图3(b))。不同甜味剂的响应细胞最大百分比不同，为10-30％。为清楚起见，将剂量响应按响应细胞最大百分比进行标准化。图3数值代表4次独立响应的平均值±s.e.。X-轴圆圈标示了通过味觉测试确定的身心检测阈值。Gurmarin(10g/l过滤的匙羹藤(Gymnema Sylvestre)水提取物的50倍稀释液)可抑制T1R2/T1R3对250mM蔗糖的响应，但不抑制内源性β2-肾上腺素能受体对20μM异丙基肾上腺素的响应(图3(b))。图3(c)包含T1R2/T1R3共表达细胞系对不同甜味剂(蔗糖、天冬甜精、D-色氨酸和糖精)的标准化响应。
实施例6大鼠T1R2/T1R3也具有甜味觉受体功能利用hT1R2/hT1R3、rT1R2/rT1R3、hT1R2/rT1R3以及rT1R2/hT1R3瞬时转染稳定表达Gα15的HEK细胞。然后分析这些转染细胞响应350mM蔗糖、25mM色氨酸、15mM天冬甜精、以及0.05％应乐果甜蛋白(monellin)而提高的细胞内钙。图4包含蔗糖和天冬甜精的结果，表明rT1R2/rT1R3也具有甜味剂受体的功能。这些结果还提示T1R2可能控制T1R2/T1R3配体特异性。
实施例7使用基于荧光的自动化分析测定T1R2/T1R3响应利用hT1R2和hT1R3瞬时转染稳定表达Gα15的HEK细胞。这些细胞加入钙染料Fluo-4，使用荧光平板阅读仪测量其对甜味剂的响应。图5包含表达hT1R2/hT1R3的细胞以及只表达hT1R3的细胞(J19-22)对环己氨磺酸盐(cyclamate，12.5mM)的响应。所得荧光结果表明，只有表达hT1R2/hT1R3的细胞对这些味觉刺激物发生响应。图6包含标准化的剂量-响应曲线，结果表明，根据与多种味觉刺激物的剂量特异性相互作用，hT1R2和hT1R3共同发挥人味觉受体的功能。图6特别包含对蔗糖、色氨酸以及可以商品化获得的其它多种甜味剂的剂量-响应。这些结果表明，由于分析中所得排序和阈值密切反映人甜味觉的数值，因此T1R2/T1R3是人甜味剂受体。
实施例8mGluR1的配体结合残基在T1R1中保守如图6所示，mGluR1的关键配体结合残基在T1R1中保守。按照与图1相同的色彩方案加亮的几个关键残基显示谷氨酸与mGluR1的相互作用。
实施例9人T1R1/T1R3具有鲜味觉受体功能利用人T1R1、T1R3以及T1R1/T1R3瞬时转染稳定表达Gα15的HEK细胞，分析细胞内钙响应谷氨酸浓度的提高而提高(图8(a))，0.5mM谷氨酸)，0.2mM IMP，以及0.5mM谷氨酸加上0.2mM IMP(图8(b))。在有无0.2mM IMP存在下测定人T1R1/T1R3对谷氨酸的剂量响应(图8(c))。对谷氨酸响应的细胞最大百分比约为5％，而谷氨酸加上IMP约为10％。为清楚起见，将剂量响应按响应细胞最大百分比进行标准化。数值代表4次独立响应的平均值±s.e.。X-轴圆圈标示了通过味觉测试确定的味觉检测阈值。
实施例10PDZIP作为输出序列将6残基PDZIP序列(SVSTW(SEQ ID NO1))与hT1R2的C末端融合，该嵌合受体(即hT1R2-PDZIP)转染HEK-293宿主细胞。然后使用免疫荧光和FACS扫描数据监测hT1R2的表面表达。如图9A和9B所示，包含PDZIP序列可以相对hT1R2而言提高hT1R2-PDZIP的表面表达。更具体而言，图9A显示myc-标签的hT1R2的免疫荧光染色，表明PDZIP可显著提高hT1R2蛋白质在质膜上的数量。图9B显示FACS分析数据，表明了相同结果-虚线表示表达myc-标签的hT1R2的细胞，实线表示表达myc-标签的hT1R2-PDZIP的细胞。特别而言，图10A显示处于HBS缓冲液中的未转染的Gα15稳定的宿主细胞，图10B显示处于甜味剂混合物no.5(糖精、环己氨基磺酸钠、乙酰舒泛K(Acesulfam K)和天冬甜精-各20mM，处于HBS缓冲液中)中的转染hT1R2-PDZIP的Gα15稳定的宿主细胞，图10C显示处于甜味剂混合物no.5中的转染T1R3-PDZIP的Gα15稳定的宿主细胞，图10D显示处于甜味剂混合物no.5中的共转染hT1R2-PDZIP/hT1R3-PDZIP的Gα15稳定的宿主细胞。另外，图10E-10H显示hT1R2/hT1R3共转染的Gα15稳定的宿主细胞对蔗糖的剂量依赖性响应-E0mM，在HBS缓冲液中；F30mM；G60mM；H250mM。图10I-10L显示hT1R2/hT1R3共转染的Gα15稳定的宿主细胞对各种甜味剂的响应-I天冬甜精(1.5mM)；J乙酰舒泛K(1mM)；K纽甜(Neotame，20mM)；L环己氨基磺酸钠(20mM)。图10的钙成像表明，hT1R2和hT1R3均为甜味刺激物引发的活性所必需。
实施例11产生稳定共表达T1R1/T1R3或T1R2/T1R3的细胞系将分别包含hT1R1或hT1R2表达构建体(T1R1为质粒SAV2485，T1R2为SAV2486)以及hT1R3(T1R3为质粒SXV550)的线性化的PEAK10衍生(Edge Biosystems)载体以及pCDNA 3.1/ZEO衍生(Invitrogen)载体转染到表达Gα15的细胞系中，得到稳定共表达人T1R2/T1R3或人T1R1/T1R3的人细胞系。具体而言，通过将线性化的SAV2486和SXV550共转染到稳定表达Gα15的Aurora Bioscience’s HEK-293细胞系中，产生T1R2/T1R3稳定细胞系。通过将线性化的SAV2485和SXV550共转染到稳定表达Gα15的相同HEK-293细胞系中，产生T1R1/T1R3稳定细胞系。转染S AV2485/SXV550和SAV2486/SXV550以后，选择、扩增嘌呤霉素(puromycin)抗性以及zeocin抗性克隆，并通过钙成像检测其对甜味或鲜味觉刺激物的响应。在添加GlutaMAX、10％透析FBS以及0.003mg/ml灭菌素(blasticidin)的低葡萄糖DMEM中，利用0.0005mg/ml嘌呤霉素(CALBIOCHEM)和0.1mg/ml zeocin(Invitrogen)于37℃选择细胞。扩增抗性克隆，通过荧光显微术评价其对甜味觉刺激物的响应。为了利用VIPR-II仪器(Aurora Biosciences)进行自动化荧光成像分析，首先将稳定表达T1R2/T1R3的细胞接种于96孔板(约100,000细胞/孔)。24小时后，将细胞加入含0.005mM钙染料Fluo-3-AM(Molecular Probes)的PBS缓冲液中，室温1小时。更换70μl PBS后，加入含有味觉刺激物的70μl PBS，室温下进行刺激。在加入化合物之前测量，校正背景荧光，以对0.001mM钙离子载体离子霉素(ionomycin，CALBIOCHEM)的响应进行标准化，加入化合物后荧光(480nm激发，535nm发射)平均响应20-30秒。
这些细胞系接触甜味或鲜味刺激物，然后观察到活性克隆一般80％的细胞可响应味觉刺激。意想不到的是，各细胞的响应强度显著高于瞬时转染的细胞。
在此观察基础上，本发明人如上所述利用Aurora Bioscience’sVIPR仪器通过自动化荧光成像测试了稳定细胞系的T1R活性。两种T1R1/T1R3以及一种T1R2/T1R3细胞系的响应分别如图11和12所示。
值得注意的是，联合提高响应细胞数和响应强度导致相对于瞬时转染的细胞，其活性提高10倍。(通过比较，在优化条件下，T1R2/T1R3瞬时转染的细胞的离子霉素响应百分比约为5％。)此外，稳定表达人T1R2/T1R3和T1R1/T1R3所获得的剂量响应与人味觉检测阈值相关。这些稳定细胞系的强大T1R活性提示，其非常适用于高通量筛选化学文库，以鉴定可调节甜味或鲜味觉受体、从而调节、增强、阻断或模拟甜味或鲜味觉的化合物，例如小分子。
实施例12产生选择性响应鲜味觉刺激物的诱导型共表达T1R1/T1R3的细胞系稳定表达鲜味觉受体的T1R1/T1R3 HEK 293细胞系比瞬时转染的细胞显示更强的活性。但缺点在于，其在细胞增殖过程中快速丧失活性。
这些发现也支持本发明人的假设，即(i)T1R1/T1R3是鲜味觉受体，(ii)高表达T1R1/T1R3的细胞系、优选稳定和/或诱导型表达T1R1/T1R3的细胞系可用于分析中，优选用于高通量筛选化学文库，以鉴定新型鲜味觉调节剂。可能使用增强鲜味觉的调节剂了。
为克服稳定表达T1R1/T1R3的细胞系的不稳定性，已使用GeneSwitch系统(Invitrogen)将HEK-Gα15细胞改造为诱导型表达T1R1/T1R3。pGene衍生的人T1R1和T1R3的zeocin抗性表达载体(T1R1为质粒SXV603，T1R3为质粒SXV611)以及携带GeneSwitch蛋白质的嘌呤霉素抗性的pSwitch衍生载体(质粒SXV628)经线性化，共转染到HEK-Gα15细胞系。Zeocin抗性以及嘌呤霉素抗性的克隆经选择、扩增，利用不同数量的米非司酮(mifepristone)诱导，通过钙成像测试其对鲜味觉刺激物的响应。
诱导型表达T1R1/T1R3产生高活性。例如，约80％的诱导细胞可响应L-谷氨酸，而瞬时转染细胞只有约10％；更具体而言，表达人T1R1和人T1R3的pGene衍生的Zeocin抗性表达载体以及携带GeneSwitch蛋白质的嘌呤霉素抗性pSwitch衍生载体经线性化，共转染到Gα15细胞中。在添加GlutaMAX、10％透析FBS以及3μg/ml灭菌素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium中，利用0.5μg/ml嘌呤霉素(CAL BIOCHEM)和100μg/ml Zeocin(Invitrogen)于37℃选择细胞。抗性克隆经扩增、并用10-10M米非司酮诱导后，按照Li等人，PNAS 99(7)4692-4696(2002).的方法，利用荧光显微术测定其对鲜味觉刺激物的响应。
为了利用FLIPR仪器(Molecular Device)进行自动化荧光成像，将来自一个克隆(称为克隆1-17)的细胞在10-10M米非司酮存在下接种于96孔板中(约80,000细胞/孔)，温育48小时。然后将细胞加入含3μM钙染料Fluo-4-AM(Molecular Probes)的PBS缓冲液中，室温1.5小时。
更换50μl PBS后，加入含有不同刺激物的50μl PBS，室温下进行刺激。与先前需要通过逐一计数响应细胞来定量T1R1/T1R3受体活性的瞬时T1R1/T1R3鲜味受体表达系统(Li等人，PNAS 99(7)4692-4696(2002))(由于其受体活性较低)相比，此诱导型表达系统得到的克隆1-17的活性大大提高，使得可以通过测定成像细胞视野总的最大荧光增强(480nm激发、535nm发射)来定量受体活性。在加入化合物之前测量，校正背景荧光，以对0.002mM离子霉素(CALBIOCHEM)的响应进行标准化，将4次独立测定的最大荧光进行平均。
图13包含了这些结果。图13特别包含在有无0.2mMIMP存在下测定的对L-谷氨酸的剂量响应曲线。在图中，每个数值代表4次独立测定的平均总最大荧光(校正背景荧光)。这些剂量-响应曲线对应于T1R1/T1R3瞬时转染的细胞所测曲线。
还利用不同L-氨基酸进行筛选，来评价鲜味觉T1R1/T1R3受体的选择性。所得结果表明，T1R1/T1R3可被鲜味的L-氨基酸(L-谷氨酸和L-天冬氨酸)选择性活化。
图14和15包含在不同L-氨基酸存在下测试1-17克隆的所获响应的实验结果。图14显示1-17细胞系在有无1mM IMP存在下接触浓度为10mM的不同L-氨基酸的实验结果。
图15包含在0.2mM IMP存在下测定的活性氨基酸的剂量-响应曲线。每个数值代表4次独立测定的平均值。
这些实验所获结果证实，该鲜味觉受体对鲜味觉刺激物具有特异性和选择性。鲜味觉刺激物L-谷氨酸和L-天冬氨酸在不同浓度下显著活化T1R1/T1R3受体(参见图14和15)，而可活化人T1R1/T1R3受体的其它L-氨基酸只在很高浓度下微弱活化该受体。
因此，这些结果证实T1R1/T1R3受体对鲜味觉刺激物的选择性，以及该诱导型稳定表达系统适用于使用自动化荧光成像仪的高通量筛选分析，以鉴定可活化鲜味觉受体的化合物，例如L-谷氨酸或L-天冬氨酸，或可增强L-谷氨酸活化鲜味觉受体的活性的化合物，例如5’-IMP或5’-GMP，或可阻断通过鲜味觉刺激物例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸的鲜味觉受体活化的化合物。
用这些分析方法鉴定的化合物可能用作食品和饮料组合物的香料，以模拟或阻断鲜味觉刺激物。
实施例13拉克替醇抑制人T1R2/T1R3和T1R1/T1R3的受体活性以及甜味和鲜味觉一种芳烷基羧酸，拉克替醇，被认为是选择性的甜味剂抑制剂(参见Lindley(1986)美国专利4,567,053；以及Schiffman等人ChemSenses 24439-447(1999))。测定了瞬时转染T1R2/T1R3的HEK-Gα15细胞在各种浓度拉克替醇存在下对150mM蔗糖的响应。拉克替醇抑制人T1R2/T1R3活性，其IC50为24μM。
T1R1/T1R3鲜味觉和T1R2/T1R3甜味觉受体可能具有共同的亚基。因此推论，可抑制T1R2/T1R3甜味剂受体的拉克替醇，可能对T1R1/T1R3鲜味觉受体具有类似效应。本发明人测试了拉克替醇对人T1R1/T1R3响应10mM L-谷氨酸的作用。与T1R2/T1R3甜味受体类似，拉克替醇抑制T1R1/T1R3的IC50为165μM。拉克替醇抑制可能反映了对T1R受体的拮抗作用，而非例如非特异性抑制Gα15介导的信号发生，因为毒蕈碱型乙酰胆碱受体不受拉克替醇抑制。
本发明人然后评价了拉克替醇对人鲜味觉的作用。按照Schiffman等人(Chem.Senses 24439-447(1989))方法，测定在1和2mM拉克替醇存在下的在有或无0.2mM IMP的鲜味觉刺激物L-谷氨酸、甜味剂刺激物蔗糖和D-色氨酸、以及咸味觉刺激物氯化钠味觉阈值。毫摩尔浓度的拉克替醇可显著提高甜味觉和鲜味觉刺激物的检测阈值，对咸味觉刺激物则不然。图16包含了这些结果。
总之，(i)这些发现进一步支持本发明人的假设，即T1R1/T1R3是唯一的鲜味觉受体，以及(ii)T1R1/T1R3和T1R2/T1R3受体可能共有结构上相关的拉克替醇结合结构域。
尽管以上详尽叙述已经描述了本发明的几个实施方案，应当理解以上描述只是说明、而非限制此公开发明。本发明仅受以下权利要求的限制。
权利要求
1.由至少一种T1R1多肽(或所述T1R1多肽的变体、片段、或嵌合体)和/或至少一种T1R3多肽(或所述T1R3多肽的变体、片段、或嵌合体)组成的受体，其中所述受体可特异性结合鲜味觉刺激物和/或由其活化。
2.权利要求1的受体，其包含天然hT1R1多肽的片段、变体或嵌合体。
3.权利要求1的受体，其包含天然hT1R3多肽的片段、变体或嵌合体。
4.权利要求1的受体，其中所述T1R1和T1R3来源于相同物种。
5.权利要求1的受体，其中所述T1R1和T1R3来源于不同物种。
6.权利要求1的受体，其中所述T1R1和/或T1R3来源于哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物或鸟类。
7.权利要求1的受体，其中所述T1R1和/或T1R3来自hT1R1、hT1R3、rT1R1、rT1R3、mT1R1、mT1R3；或其片段、变体或嵌合体。
8.包含权利要求1的受体的组合物。
9.包含权利要求2的受体的组合物。
10.包含权利要求3的受体的组合物。
11.包含权利要求4的受体的组合物。
12.包含权利要求5的受体的组合物。
13.包含权利要求6的受体的组合物。
14.包含权利要求7的受体的组合物。
15.表达由至少一种T1R1多肽(或所述T1R1多肽的变体、片段、或嵌合体)和/或至少一种T1R3多肽(或所述T1R3多肽的变体、片段、或嵌合体)组成的受体的细胞，其中所述受体可特异性结合鲜味觉刺激物和/或由其活化。
16.权利要求15的细胞，其选自HEK293、COS和CHO细胞以及非洲爪蟾卵母细胞。
17.权利要求15的细胞，其中所述T1R1和T1R3来自于相同物种。
18.权利要求15的细胞，其中所述T1R1和T1R3来源于不同物种。
19.权利要求15的细胞，其中所述T1R1和/或T1R3来源于哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物或鸟类。
20.权利要求15的细胞，其中所述T1R1和T1R3选自hT1R1、hT1R3、mT1R1、mT1R3、rT1R1和rT1R3；或其片段、变体或嵌合体。
21.由至少一种T1R2多肽(或所述T1R2多肽的变体、片段、或嵌合体)和/或至少一种T1R3多肽(或所述T1R3多肽的变体、片段、或嵌合体)组成的受体，其中所述受体可特异性结合甜味觉刺激物和/或由其活化。
22.权利要求21的受体，其包含天然hT1R2多肽的片段、变体或嵌合体。
23.权利要求21的受体，其包含天然hT1R3多肽的片段、变体或嵌合体。
24.权利要求21的受体，其中所述T1R2和T1R3来源于相同物种。
25.权利要求21的受体，其中所述T1R2和T1R3来源于不同物种。
26.权利要求21的受体，其中所述T1R2和/或T1R3来源于哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物或鸟类。
27.权利要求21的受体，其中所述T1R2和/或T1R3来自于hT1R2、hT1R3、rT1R2、rT1R3、mT1R2、mT1R3；或其片段、变体或嵌合体。
28.包含权利要求21的受体的组合物。
29.包含权利要求22的受体的组合物。
30.包含权利要求23的受体的组合物。
31.包含权利要求24的受体的组合物。
32.包含权利要求25的受体的组合物。
33.包含权利要求26的受体的组合物。
34.包含权利要求27的受体的组合物。
35.表达由至少一种T1R2多肽(或所述T1R2多肽的变体、片段、或嵌合体)和/或至少一种T1R3多肽(或所述T1R3多肽的变体、片段、或嵌合体)组成的受体的细胞，其中所述受体可特异性结合甜味觉刺激物和/或由其活化。
36.权利要求35的细胞，其选自HEK293、COS和CHO细胞以及非洲爪蟾卵母细胞。
37.权利要求35的细胞，其中所述T1R2和T1R3来自于相同物种。
38.权利要求35的细胞，其中所述T1R2和T1R3来源于不同物种。
39.权利要求35的细胞，其中所述T1R2和/或T1R3来源于哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物或鸟类。
40.权利要求35的细胞，其中所述T1R2和T1R3选自hT1R2、hT1R3、mT1R2、mT1R3、rT1R2和rT1R3；或其片段、变体或嵌合体。
41.结合于固相的权利要求1-7或21-27的受体。
42.处于溶液中的权利要求1-7或21-27的受体。
43.处于脂双层或囊泡中的权利要求1-7或21-27的受体。
44.鉴定可调节味觉感受的化合物的方法，其通过鉴定可结合、活化、抑制、增强和/或调节权利要求1-7和/或21-27的一种或多种受体的化合物而鉴定。
45.权利要求44的方法，其中所述受体结合于固相物。
46.权利要求44的方法，其中所述受体处于溶液中。
47.权利要求44的方法，其中所述受体处于脂双层或囊泡中。
48.权利要求44的方法，其中使用受体结合分析方法鉴定所述化合物。
49.权利要求44的方法，其中使用基于受体活性的分析方法鉴定所述化合物。
50.权利要求44的方法，其中所述受体表达于细胞中。
51.权利要求50的方法，其中所述细胞是HEK-293、COS或CHO细胞。
52.权利要求50的方法，其中通过其对受体内化的作用而鉴定所述化合物。
53.权利要求50的方法，其中通过其对受体磷酸化的作用而鉴定所述化合物。
54.权利要求50的方法，其中通过其对抑制蛋白易位的作用而鉴定所述化合物。
55.权利要求44的方法，其使用针对第二信使的分析方法。
56.权利要求55的方法，其中所述第二信使是cAMP或IP3。
57.权利要求50的方法，其使用电压敏感性或钙敏感性染料。
58.权利要求50的方法，其中所述细胞表达至一种G蛋白。
59.权利要求58的方法，其中所述G蛋白是混栖G蛋白。
60.权利要求59的方法，其中所述混栖G蛋白是Gα15或Gα16。
61.权利要求44的方法，其中使用病毒性载体表达所述受体。
62.权利要求61的方法，其中所述病毒性载体表达于哺乳动物细胞中。
63.权利要求44的方法，其中所述受体通过体外翻译产生。
64.权利要求44的方法，其中所述受体以膜结合形式分离。
65.权利要求44的方法，其中通过其对所述受体活化G蛋白的作用而鉴定所述化合物。
66.权利要求44的方法，其中通过其对受体构象的作用而鉴定所述化合物。
67.权利要求66的方法，其中通过对蛋白水解的敏感性变化而检测所述构象变化。
68.权利要求66的方法，其中通过NMR光谱学检测所述构象变化。
69.权利要求66的方法，其中通过荧光光谱学检测所述构象变化。
70.权利要求44的方法，其中通过其对所述受体与放射性或荧光标记的配体结合的作用而鉴定所述化合物。
71.权利要求70的方法，其中利用荧光偏振或FRET分析来测定所述标记化合物的移位。
72.权利要求44的方法，其是高通量筛选分析方法。
73.权利要求44的方法，其中受体活性与报告基因相关联。
74.权利要求73的方法，其中所述报告基因是萤光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。
75.权利要求44的方法，其中所述受体是组成型活性变体。
76.权利要求44的方法，其中所述受体的表达位于组成型启动子控制之下。
77.权利要求44的方法，其中所述受体的表达位于调节型启动子控制之下。
78.权利要求44的方法，其中所述受体与可促进表面表达的肽融合。
79.权利要求78的方法，其中所述肽是PDZ结构域相互作用肽。
80.权利要求44的方法，其中根据所述受体的X射线晶体结构预测所述化合物对该受体的作用。
81.权利要求44的方法，其中通过其对表达天然或转基因T1R受体的非人动物的作用而鉴定所述化合物。
82.权利要求81的方法，其中通过其对行为的作用而鉴定所述化合物。
83.权利要求81的方法，其中通过其对味觉受体细胞的作用而鉴定所述化合物。
84.权利要求81的方法，其中所述非人动物是小鼠、大鼠、蠕虫、鱼或昆虫。
85.权利要求44的方法，其中通过其对表达所述受体的酵母细胞的作用而鉴定所述化合物。
86.权利要求44的方法，其中从化合物组合文库中鉴定所述化合物。
87.权利要求44的方法，其中从肽文库中鉴定所述化合物。
88.权利要求44的方法，其中从小分子随机文库中鉴定所述化合物。
89.利用权利要求44鉴定的化合物改变动物味觉的方法。
90.权利要求89的方法，其中所述味觉是鲜味觉。
91.权利要求89的方法，其中所述味觉是甜味觉。
92.权利要求89的方法，其中所述动物是人、狗、猫、鱼、牛、羊或猪。
93.权利要求89的方法，其中所述化合物配制于食物、饮料或口服药物组合物中。
94.定量各个化合物、或食物、或饮料组合物的味道的方法，其使用权利要求1-7和/或21-27的一种或多种受体。
95.稳定表达由至少一种T1R1多肽或所述T1R1多肽的变体、片段、或嵌合体和/或至少一种T1R3多肽或所述T1R3多肽的变体、片段、或嵌合体组成的受体的细胞，其中所述受体可特异性结合鲜味觉刺激物和/或由其活化。
96.权利要求95的细胞，其选自HEK293、COS和CHO细胞以及非洲爪蟾卵母细胞。
97.权利要求95的细胞，其中所述T1R1和T1R3来自于相同物种。
98.权利要求95的细胞，其中所述T1R1和T1R3来源于不同物种。
99.权利要求95的细胞，其中所述T1R1和/或T1R3来源于哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物或鸟类。
100.权利要求95的细胞，其中所述T1R1和T1R3选自hT1R1、hT1R3、mT1R1、mT1R3、rT1R1和rT1R3；或其片段、变体或嵌合体。
101.权利要求95的细胞，是稳定表达Gα15的HEK-293细胞。
102.包含权利要求95的细胞的组合物。
103.包含权利要求96的细胞的组合物。
104.包含权利要求97的细胞的组合物。
105.包含权利要求98的细胞的组合物。
106.包含权利要求99的细胞的组合物。
107.包含权利要求100的细胞的组合物。
108.包含权利要求101的细胞的组合物。
109.稳定表达由至少一种T1R2多肽或所述T1R2多肽的变体、片段、或嵌合体和/或至少一种T1R3多肽或所述T1R3多肽的变体、片段、或嵌合体组成的受体的细胞，其中所述受体可特异性结合甜味觉刺激物和/或由其活化。
110.权利要求109的细胞，其选自HEK293、COS和CHO细胞以及非洲爪蟾卵母细胞。
111.权利要求109的细胞，其中所述T1R2和T1R3来自于相同物种。
112.权利要求109的细胞，其中所述T1R2和T1R3来源于不同物种。
113.权利要求109的细胞，其中所述T1R2和/或T1R3来源于哺乳动物、鱼类、爬行动物、两栖动物或鸟类。
114.权利要求109的细胞，其中所述T1R2和T1R3选自hT1R2、hT1R3、mT1R2、mT1R3、rT1R2和rT1R3；或其片段、变体或嵌合体。
115.权利要求109的细胞，其稳定表达hT1R2、hT1R3和Gα15。
116.鉴定可调节味觉感受的化合物的方法，其通过鉴定可结合、活化、抑制和/或调节受体的化合物而鉴定，其中由稳定表达至少一种T1 R的细胞表达该受体。
117.权利要求116的方法，其中所述细胞结合于固相。
118.权利要求117的方法，其中所述细胞处于溶液中。
119.权利要求117的方法，其中使用受体结合分析方法鉴定所述化合物。
120.权利要求116的方法，其中所述细胞是权利要求95-101或109-115中任一项的细胞。
121.权利要求116的方法，其中使用基于受体活性的分析方法鉴定所述化合物。
122.权利要求116的方法，其中所述T1R受体表达于细胞中。
123.权利要求116的方法，其中所述细胞是HEK-293、COS或CHO细胞。
124.权利要求116的方法，其中通过其对所述细胞内化受体的作用而鉴定所述化合物。
125.权利要求116的方法，其中通过其对受体磷酸化的作用而鉴定所述化合物。
126.权利要求116的方法，其中通过其对抑制蛋白易位的作用而鉴定所述化合物。
127.权利要求116的方法，其使用针对第二信使的分析方法。
128.权利要求127的方法，其中所述第二信使是cAMP或IP3。
129.权利要求116的方法，其使用电压敏感性或钙敏感性染料。
130.权利要求116的方法，其中所述细胞表达至少一种G蛋白。
131.权利要求130的方法，其中所述G蛋白是混栖G蛋白。
132.权利要求131的方法，其中所述混栖G蛋白是Gα15或Gα16。
133.权利要求116的方法，其中使用病毒性启动子稳定表达所述受体。
134.权利要求116的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
135.权利要求116的方法，其中通过其对所述受体活化G蛋白的作用而鉴定所述化合物。
136.权利要求116的方法，其中通过其对受体构象的作用而鉴定所述化合物。
137.权利要求136的方法，其中通过对蛋白水解的敏感性变化而检测所述构象变化。
138.权利要求136的方法，其中通过NMR光谱学检测所述构象变化。
139.权利要求136的方法，其中通过荧光光谱学检测所述构象变化。
140.权利要求136的方法，其中通过其对所述稳定表达的受体与放射性或荧光标记的配体结合的作用而鉴定所述化合物。
141.权利要求140的方法，其中利用荧光偏振或FRET分析来测定所述标记化合物的移位。
142.权利要求116的方法，其是高通量筛选分析方法。
143.权利要求116的方法，其中受体活性与报告基因相关联。
144.权利要求143的方法，其中所述报告基因是萤光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或β-内酰胺酶。
145.权利要求140的方法，其中所述受体是组成型活性变体。
146.权利要求140的方法，其中所述受体的表达位于组成型启动子控制之下。
147.权利要求140的方法，其中所述受体的表达位于调节型启动子控制之下。
148.权利要求140的方法，其中所述受体与可促进表面表达的肽融合。
149.权利要求140的方法，其中所述肽是PDZ结构域相互作用肽。
150.权利要求140的方法，其中根据所述受体的X射线晶体结构预测所述化合物对该受体的作用。
151.权利要求116的方法，其中通过其对表达所述受体的酵母细胞的作用而鉴定所述化合物。
152.权利要求116的方法，其中从化合物组合文库中鉴定所述化合物。
153.权利要求116的方法，其中从肽文库中鉴定所述化合物。
154.权利要求116的方法，其中从小分子随机文库中鉴定所述化合物。
155.利用权利要求116鉴定的化合物改变动物味觉的方法。
156.权利要求155的方法，其中所述味觉是鲜味觉。
157.权利要求155的方法，其中所述味觉是甜味觉。
158.权利要求155的方法，其中所述动物是人、狗、猫、鱼、牛、羊或猪。
159.权利要求155的方法，其中所述化合物配制于食物、饮料或口服药物组合物中。
160.定量各个化合物、或食物、或饮料组合物的味道的方法，其使用稳定表达编码权利要求1-7和/或15-21之一的至少一种T1R的异源核酸序列的细胞。
161.诱导型表达人T1R1/T1R3鲜味觉受体或T1R2/T1R3甜味觉受体的细胞系。
162.权利要求161的细胞系，其中该细胞系是CHO、COS、HEK或BHK细胞系。
163.权利要求162的细胞系，其是HEK-293细胞系。
164.权利要求161的细胞系，其表达G蛋白。
165.权利要求164的细胞系，其中所述G蛋白是Gα15或Gα16。
166.权利要求161的细胞系，其稳定表达所述T1R1/T1R3受体。
167.权利要求161的细胞系，其中由GeneSwitch蛋白质诱导表达。
168.使用权利要求161的细胞系鉴定可激动或拮抗T1R1/T1R3受体或T1R2/T1R3受体的化合物的方法。
169.权利要求168的方法，是结合分析方法。
170.权利要求168的方法，是高通量筛选分析方法。
171.权利要求168的方法，是荧光分析方法。
172.权利要求168的方法，其筛选可与L-谷氨酸或L-天冬氨酸竞争结合T1R1/T1R3鲜味觉受体的化合物。
173.权利要求168的方法，其是使用自动化荧光成像仪的高通量筛选分析方法。
174.权利要求168的方法，用于在化合物文库中筛选可增强或调节L-谷氨酸活化T1R1/T1R3鲜味觉受体活性的化合物。
175.权利要求168的方法，用于在化合物文库中筛选可激动或拮抗T1R2/T1R3甜味觉受体的化合物。
176.权利要求168的方法，其筛选可与IMP、GMP或其类似物竞争结合T1R1/T1R3鲜味觉受体的化合物。
177.权利要求168的方法，用于在化合物文库中筛选可模拟IMP、GMP或其类似物增强T1R1/T1R3激动剂活性的活性的化合物。
178.权利要求168的方法，用于在化合物文库中筛选可增强或调节甜味剂活化T1R2/T1R3甜味觉受体活性的化合物。
179.抑制T1R1/T1R3鲜味觉受体的方法，其包含所述受体与同时抑制T1R1/T1R3甜味觉受体和T1R2/T1R3味觉受体的甜味觉抑制剂相接触。
180.权利要求179的方法，其中所述抑制剂是拉克替醇。
181.鉴定可调节T1R1/T1R3鲜味觉受体的化合物的方法，通过筛选可与拉克替醇竞争结合和/或抑制T1R1/T1R3鲜味觉受体的化合物而鉴定。
182.权利要求179的方法，是基于细胞的分析方法。
183.权利要求182的方法，其中所述分析方法使用共表达T1R1和T1R3的细胞系。
184.权利要求183的方法，其中所述细胞系是HEK-Gα15细胞系。
185.权利要求183的方法，其中所述细胞系稳定表达所述受体。
186.权利要求183的方法，其中所述细胞系瞬时表达所述受体。
187.权利要求186的方法，其中所述G蛋白是Gα15或Gα16。
188.权利要求181的方法，是基于细胞的分析方法。
189.权利要求188的方法，其中所述分析方法使用共表达T1R1和T1R3的细胞系。
190.权利要求189的方法，其中所述细胞系是HEK-Gα15所述细胞系。
191.权利要求189的方法，其中所述细胞系稳定表达所述受体。
192.权利要求191的方法，其中所述细胞系瞬时表达所述受体。
193.权利要求192的方法，其中所述G蛋白是Gα15或Gα16。
全文摘要
本发明涉及T1R受体装配形成功能性味觉受体的发现。具体而言，本发明发现共表达T1R1和T1R3可产生响应鲜味刺激物(包括谷氨酸一钠)的味觉受体。还发现共表达T1R2和T1R3受体可产生响应甜味刺激物(包括天然存在的以及人造的甜味剂)的味觉受体。本发明还涉及包含T1R1/T1R3和T1R2/T1R3的异寡聚味觉受体在分析中的用途，用于鉴定分别响应鲜味刺激物和甜味刺激物的化合物。本发明另外涉及构建在组成型或诱导型条件下稳定或瞬时共表达T1R1和T1R3、或T1R2和T1R3组合的细胞系。本发明还提供了这些细胞系在基于细胞的分析、特别是利用荧光成像检测受体活性的高通量筛选分析中的用途，用于鉴定鲜味和甜味调节剂化合物。最后，本发明涉及以下发现，即某些化合物，例如拉克替醇(lactisole)，抑制人T1R2/T1R3和T1R1/T1R3受体活性，从而抑制甜味和鲜味觉，提示这些受体可能是唯一的甜味和鲜味受体。
文档编号G01N33/50GK1520516SQ02812830
公开日2004年8月11日 申请日期2002年6月26日 优先权日2001年6月26日
发明者M·T·佐勒, 李晓东, L·斯塔谢夫斯基, S·奥康奈尔, S·佐祖利亚, J·E·阿德勒, 徐红, F·埃切韦里, M T 佐勒, 形だ, 环蛩够, 的味, 胬 , 阿德勒 申请人:塞诺米克斯公司