专利名称：对基于衍射的诊断的结果进行观察和分析的方法
技术领域：
概括而言，本发明属于在介质中检测分析物的领域，具体而言，本发明涉及对能够指示介质中分析物存在的基于衍射的诊断装置进行观察和/或分析的方法。
背景技术：
有许多系统和装置能用于在各种介质中检测多种分析物。大多数这类系统和装置相对昂贵，并需要经过专门训练的技术人员执行检测。在许多情形中如果能迅速、廉价地确定分析物是否存在则非常有利。因此需要一种能简单、廉价制造且能可靠、灵敏地检测分析物的系统。
Sandstrom等人(24 Applied Optics 472，1985)描述了一种以一层一氧化硅和一层硅作为介电膜的硅光学基质的应用。他们指出薄膜厚度的改变会改变光学基质的性质，产生与薄膜厚度有关的不同颜色。薄膜厚度与观察到的颜色有关，且设置在光学基质顶部上的薄膜可以产生可观察到的颜色改变。作者提出可使用数学模型对颜色变化进行定量，并且“使用计算机执行的计算表明，使用多层结构得到的光学效能非常微小...，不过，表面上的生物层对这种结构反射率的改变非常小，因为光学性质主要由多层结构内部的界面决定。用于检测生物层的最灵敏系统是单层涂层，而在大多数其他应用中，可通过加入介电层来改善性质。”Sandstrom等人继续指出，由金属上的金属氧化物形成的载片具有某些缺点，并且金属离子的存在在许多生物化学应用中还可能是有害的。他们指出，理想的顶部介电膜为2-3nm厚的二氧化硅，该薄膜是当一氧化硅在周围环境大气中沉积时自然形成的，并且在玻璃或塑料基质上可使用在40-60nm一氧化硅层上的70-95nm的二氧化硅层。他们还描述了通过选择性蚀刻一氧化硅，用二氯二甲基硅烷处理二氧化硅表面，然后涂覆抗原和抗体生物层，从而形成楔形一氧化硅。根据这种楔形结构，能用偏振光椭圆计测定膜厚度，并指出在最大反差见于约65nm的区域，在此干涉衍射由紫变蓝。
授予Kumar等人的美国专利5,512,131批露了一种包括聚合物基质的装置，其中聚合物基质具有金属涂层。在经过涂覆的基质上压模一个具有分析物特异性的受体层。该装置用于冲模过程，或者作为开关。当分析物与该装置结合时，产生衍射图像。然后使用显象装置如光谱仪确定衍射图像的存在。
不过，Kumar等人描述的装置具有多个缺点。一个缺点是需要复杂的显象装置来观察任何衍射图像。
授予Bogart等人的美国专利No.5,482,830描述了一种包括一种基质的装置，该基质具有光学活性表面，其在光入射到其上时呈现出第一种颜色。所述第一种颜色定义为射气光的光谱分布。该基质还呈现出与第一种颜色不同的第二种颜色(通过具有与第一种颜色中存在的组合不同的光波长组合，或者具有不同光谱分布)。当表面上存在分析物时，响应于相同光呈现出第二种颜色。可通过使用仪器或者通过眼睛检测从一种颜色到另一种颜色的改变。这种灵敏的检测优于上面Sandstrom和Nygren所述的装置，且该装置的使用可商业化并具有竞争力。
不过，Bograt等人专利中披露的方法和装置具有若干缺陷。一个缺陷是装置的成本高。该装置的另一问题是难以控制处于晶片上的各层以便获得可靠读出。
Bogdanski等人的专利WO94/13835中描述了用于检测大分子的方法和系统。该系统包括预定尺寸样板的探针，其以已知图案衍射光。通过结合大分子(例如分析物)，衍射峰的位置由于这种结合而改变。
因此，该系统必须包括更加复杂的检测器和分析仪来检测衍射图样的改变。与之相比，当前所披露的基于衍射的系统检测衍射图样或图像的信息，从而必须检测的仅为衍射光的外观。从而，Bogdanski等人披露的方法和系统的一个缺点是，需要更加复杂的装置来检测衍射图样的变化。另一缺点是需要更加复杂的方法来制备探针，包含在易碎的二氧化硅表面上进行光刻和/或蚀刻步骤；这些方法由于费用高而不适于全规模制造过程。
授予Backman等人的美国专利No.5,196,350描述了一种光学检测方法，其使用免疫测定装置和产生衍射图案的掩模。免疫测定装置处于掩模和光源之间，从而与分析物结合会引起掩模产生的衍射或干涉图案改变。因此，该专利具有与Bogdanski专利相同的缺点，因为其使用了基于对衍射图案的改变进行检测的方法，而不是一种由结合产生的信息。这使得分析更加复杂，因为与存在被检测物时简单的是/否形成衍射图像相比，这些改变更细微。
授予Godfrey等人的美国专利No.4,992,385描述了一种用薄聚合物膜制备衍射光栅的方法，该衍射光栅随后用作传感装置。该传感装置在检测由于结合分析物导致其光学性质改变期间需要使用分光光度技术。因此，正如前面两个专利，该专利也涉及更加复杂的检测方法，因为其必须检测衍射图案的改变，而非简单地检测由分析物形成的图案信息。
还使用了某些采用乳胶珠技术的商业侧向流技术。目前在许多市售家用诊断试剂盒中采用这些技术(例如妊娠和排卵试剂盒)。这些试剂盒使用带颜色的珠子，它们积聚在所限定的“捕获区域”，直至珠子的数量可以用肉眼看到为止。不过，对于许多分析物而言这些系统缺乏必须的检测灵敏度，因为为了使肉眼可见，结合在捕获区域内的乳胶珠数量必须要远远大于在同样大小区域引起衍射所需的数量。理论上，所需的珠子数量比本发明传感器所需的珠子数量高2到3个量级。
已经存在多种涉及使用生物传感装置来检测分析物的新装置。某些这类生物传感器具有自组装单层，并且已经用于检测分析物。在美国专利No.5,922,550和6,060,256中提到了这类装置。还使用具有自组装单层并使用微粒子技术的其他装置检测较小分析物，并且在美国专利No.6,221,579B1中披露。最后，还提出了某些使用非自组装材料，并且仍就提供可被肉眼看到的衍射图像的传感装置。在美国专利申请No.09/213,713中提到了这类装置。不过，本发明通过提供这些装置结果的更快、更精确的解释，增强了这些生物传感装置的易用性和/或精度。
因此，需要一种可以与多种基于衍射的诊断系统一起使用的分析仪，用于以迅速而精确的方式确定分析物的存在。并且还需要一种使用这种分析仪快速、精确地确定给定样品中分析物存在的方法。
发明内容
本发明提供一种用于对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的系统和方法，与要求复杂观察装置的方法和系统相比，其可更加迅速、更加精确和/或更加简单地使用。本发明可以与多种不同诊断系统和方法一起使用来增强这些装置在诊断仅使用诊断系统时不能检测出的更小分析物时的效率和/或用途。
因此，本发明的一个目的在于提供一种对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的方法。
本发明还提供一种用于对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的系统。
理想情况下本发明还提供一种使用能产生与观察者视力无关的结果的装置，对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的方法。
另外，本发明提供一种对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的方法，其及时提供精确的结果，并减少误差。
本发明还提供一种对可以自动控制的基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的方法。
理想情况下本发明还提供一种使用分析仪对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的系统，该分析仪在存储器中保存以往的结果，从而允许用户调用最近样品的结果。
另外，本发明提供一种对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的系统，其允许远程数据访问。
本发明通过提供一种可结合基于衍射的诊断系统、确定给定样品中分析物存在的新型观测仪和/或分析仪而实现这些目的中的至少一个。可使用观测仪和/或分析仪，通过观察和/或分析当采用诊断系统时分析物是否产生衍射图像，确定样品中分析物的存在。
另外，可使用观测仪和/或分析仪进行定量或半定量分析。上述参考文献中描述的装置可通过把会与有关的分析物结合、反应或者通过其他方式缔合的物质此处称作“粘合剂”，印制在表面上而制得。与有关的分析物结合、反应或者通过其他方式缔合的物质，称作粘合剂，并可以包括可与有关的分析物结合、反应或者通过其他方式缔合的化学物质、化合物、组合物、部分、粒子等。
优选粘合剂对于有关的分析物或者有关的分析物种类是特异性的，并且一点也不会与感兴趣样品中存在的其他物质结合、反应或者通过其他方式缔合。
通常，粘合剂印制在基质例如塑料膜上成规定图案，从而当电磁辐射反射或者透过印有粘合剂的薄膜时，印有粘合剂的薄膜不会衍射电磁辐射，不过当印有粘合剂的薄膜暴露于分析物并且分析物已经与粘合剂结合、反应或者通过其他方式缔合之后，就衍射电磁辐射。或者，印有粘合剂的薄膜或表面在暴露于分析物之后可能呈现出可测量的衍射增大或减小。例如，薄膜上可以印制粘合剂，使印有粘合剂的薄膜最初衍射光，不过当分析物与印有粘合剂的表面结合、缔合或者反应时不衍射光或者衍射更少。在另一例中，薄膜上可以印制粘合剂，从而使印有粘合剂的薄膜最初衍射光，不过当分析物与印有粘合剂的表面结合、缔合或者反应时，衍射程度更大。通过测得透过或者反射离开基质表面的衍射光的改变，确定分析物的存在。
通常，分析物可以为任何激励物，包括但不限于将与粘合剂结合、反应或者通过他方式缔合，或者粘合剂对其有响应的任何化学或生物物质，化合物，组合物，部分，粒子等。考虑检测的分析物包括但不限于以下物质细菌；酵母；真菌；病毒；原生动物；或这些微生物的特异性抗原；类风湿因子；抗体，包括但不限于IgG、IgM、IgA和IgE抗体；癌胚抗原；链球菌A族抗原；病毒抗原；与自身免疫性疾病有关的抗原；变应原；肿瘤抗原；链球菌B族抗原；HIVI或HIVII抗原；或者对这些或其他病毒的宿主响应(抗体)；对RSV具有特异性的抗原或者病毒的宿主响应(抗体)；单个抗原；酶；激素；多糖；蛋白质；类脂；碳水化合物；药品或核酸；沙门氏菌类；假丝酵母类，包括但不限于白色念珠菌和念珠菌属(Candida tropicalis)；沙门氏菌类；脑脊膜炎奈瑟氏菌型A，B，C，Y和W亚型135，肺炎链球菌，大肠杆菌K1，B型流感嗜血菌；从微生物衍生出的抗原；半抗原，滥用药物；治疗药物；环境因素；肝炎特异性抗原等。
图1为根据本发明一个实施例的观测仪的透视图。
图2为根据本发明另一实施例的观测仪的透视图。
图3为根据本发明一个实施例的分析仪的示意图。
图4为用于测量衍射图像中x，y阵列的第0级和第1级光强度的掩模的示意图。
图5为用于测量衍射图像中x，y阵列的第2级光强度的掩模的示意图。
图6为用于测量衍射图像中x，y阵列的第3级光强度的掩模的示意图。
图7为用于测量衍射图像中x，y阵列的第4级光强度的掩模的示意图。
具体实施例方式
本发明提供一种用于对基于衍射的诊断系统的结果进行观察和/或分析的分析仪、系统和方法。本发明可以与多种不同诊断装置和系统一起使用，通过快速精确地检测分析物而提高这些装置的效率和/或用途，由此提供给用户易使用性。
本发明首先提供一种观测仪，其使用光源通过与观测仪相连的样品透射或反射光。如果分析物已经与基于衍射的传感装置结合，则透射或反射光将产生衍射图像或图案。可以用肉眼直接观看该图像。或者图像可以投影到屏幕上，允许用户判断是否发生了衍射。
本发明还提供一种分析仪，其使用一种算法或一系列算法和/或计算机软件分析基于衍射的传感装置，判断在传感装置上是否存在一种或多种分析物，从而检测出样品中分析物的存在。虽然也可以使用不带分析仪的基于衍射的传感装置，不过与不使用分析仪的情形相比，分析仪可更加迅速、更加容易和/或更加精确地产生结果。
基于分析仪将要使用的系统参数得出所用算法。或者，如果使用软件元件，则可以按照需要进行调整，使分析仪在判断样品中是否存在分析物时更加简单和/或更加精确。
理想情况下分析仪必须将样品的衍射图像转变成是/否结果给用户。因此，用户不必观察衍射图像，而看到给出以下解释的显示例如，“分析物存在”，“分析物不存在”或者“错误”。分析仪的选项包括声音发生器，照明灯，用于显示结果的LED或LCD显示器；用于提供结果的打印输出的打印机；用于保存早先结果的存储器；或者可以采用其他功能如加热或混合来增强试验结果、可靠性和/或方便性。
除了观测仪和/或分析仪以外，本发明还包括使用观测仪和/或分析仪检测分析物的方法。正如讨论的，分析仪可以使用一个或多个算法和/或软件元件来确定给定样品中分析物的存在。
并且，本发明包括一种使用基于衍射的传感装置和观测仪或分析仪来检测分析物的系统。正如所讨论的，分析仪可以使用一个或多个算法和/或软件元件来确定给定样品中分析物的存在。
本发明还包括替代某些基于衍射的系统中所使用的复杂的现有技术观察装置，如光谱仪的装置。不需要用户使用复杂的观察装置如光谱仪，本发明使用简单的观测仪使用户能观察衍射图像，或使用根据分析物是否存在而显示易于解释的信号，提供易于理解的结果的分析仪。分析仪使用装置采集来自衍射样品的光；如果足够多的光被衍射，则触发该装置指明分析物存在。小装置还可以增大精度，因为其能校准结果，从而可减小假阳性。这可通过将装置设计成遮蔽某些弱衍射信号，如用一些对照品可看到的信号而实现。因此，衍射越强，则越能检测到真阳性。
本发明是基于基于衍射的传感装置的使用。在本发明的系统和方法中，分析仪与这些基于衍射的传感装置一起使用，以扩展这些装置的用途。有大量种类的基于衍射的传感装置，本发明的分析仪可考虑与这些基于衍射的传感装置中的任何一个一起使用。
如此处使用的，“基于衍射的传感装置”意在包括任何通过将分析物与装置结合而衍射透射或反射光、形成衍射图像的传感装置。基于衍射的传感装置优选在不存在分析物时不衍射光，不过当存在分析物时衍射光。本领域技术人员可知，在本发明中还可以使用两个或多个衍射图像之间的差异检测分析物的存在。本领域技术人员还可知，基于衍射的传感装置可以包括第一衍射图像，并且在分析物与装置结合之后，包括第二非衍射图像。
本发明中使用的基于衍射的传感装置通常提供一个基板，在基板上放置与所选择的分析物结合的材料。可以提供其他特征来增强基于衍射的传感装置的效率，如附加涂层，阻挡层，衍射增强元件等。
因此，本发明的一个方面包括一种观测器，通过允许用户观察是否存在衍射图像而使用户很容易地了解系统中是否存在分析物。该观测器通常包括用于支持基于衍射的传感装置的装置，用于使光透过传感装置或从传感装置反射的装置，并且可能还包括用于容纳支持装置和光传输装置的外壳。观测仪还可以包括用于激励光的装置，和用于更简单地判断是否存在衍射图像的装置，如投影屏。
图1和2说明根据本发明的观测器的两种可能实施方案。在图1中，观测器100包括包含有光源(未示出)的外壳110。光源可以为激光，LED，电灯泡，或者任何其他能发光的装置。外壳包括孔120，使用者可通过该孔进行观察。外壳110包括狭缝130或放入被观察样品的其他装置。样品也可以使用夹具，托盘或者其他适当装置保持在适当位置。当样品放入狭缝130中时，光源可被自动激励，或者可以使用按钮140或其他装置来激励光源。然后光透过样品或者通过样品反射。从而装置使用者只需通过孔120观察。如果存在分析物，则使用者将观察到衍射图像，如果不存在分析物，则使用者将仅能看到光源。
图2表示根据本发明的观测仪的备选实施方案。观测仪200包括外壳210，光源(未示出)和用于容纳样品的狭缝230或其他装置，以及用于激励光源的按钮240或其他装置。不过，取代图1中所用的孔120，观测仪200包括透射光或反射光投影的屏幕250。在使用时，激励光源，然后光透过样品或从样品反射。如果存在分析物，则使用者将看到投射到屏幕250上的衍射图像，如果不存在分析物，则使用者将仅看到投影到屏幕250上的光源。
上述观测仪可选择设置的一个部件是使用不透明物体(例如掩模)以阻挡零级或非衍射光束。由此，如果存在分析物则使用者将仅看到衍射级，如果不存在分析物，则根本不能看到光。
用肉眼取代允许使用者进行观察的观测仪，无论是否产生衍射图像，本发明还提供一种分析仪，使基于衍射的传感装置的用户能迅速、有效地确定给定样品中是否存在分析物。尽管基于衍射的传感装置的使用者可以用肉眼和观测仪确定分析物的存在，不过分析仪可以证实由使用者进行的判断，或者可用于进行初始判断，而使用者可用肉眼证实，这取决于使用者的能力和/或所产生的衍射图像类型。
如果分析仪单独使用或者用于作出样品中分析物存在的初始判断，则通常使用衍射算法设定用于判断表明分析物存在的阳性结果或表明分析物不存在的阴性结果的标准。所使用的算法的类型可以考虑众多因素，可以单独或者结合，并且包括但不限于被检测的分析物，所使用的基于衍射的传感装置的类型，被检测的样品，所产生的衍射图像，衍射图像中特征的尺寸，图案中的衍射图像和/或特征尺寸和/或形状，所使用的分析仪类型，所需灵敏度大小，和使用该装置的整个系统。因此，此处提供的算法仅为本发明中可以使用的算法的代表例。可以预见可以使用其他算法，只要这些算法能精确、可靠地使用基于衍射的传感装置确定分析物的存在。另外，希望算法能快速地确定分析物的存在，不过最好具有足够大的精度。
考虑到一种或多种因素包括但不限于被检测的分析物，所使用的基于衍射的传感装置的类型，被检测的样品，所产生的衍射图像，所需灵敏度大小，和使用该装置的整个系统等，分析仪的结构可以不同。通常，分析仪包括容纳内部元件的外壳，用于照射基于衍射的传感装置以便产生衍射图像的装置，用于测量衍射和/或非衍射光量的装置，用于将用于测量衍射光量的装置的测量结果转换成表示分析物存在或缺乏的结果的装置，和/或用于通知使用者样品中是否存在分析物的装置。
用于照射基于衍射的传感装置以便产生衍射图像的装置，可以包括光源或某些相关照明装置。希望使用光源。光源可以处于外壳内部(例如LED，激光二极管或卤灯)或者外部(例如环境光)。另外，光源可以处于人眼可见或不可见光谱范围内。选择光源使分析仪能检测是否由于在基于衍射的传感装置上存在分析物而发生光源的衍射。预计在本发明中，LED，激光器或者任何聚焦光源将是最有效的光源，不过可以使用其他光源。此外，光源发出的光可以直接透过基于衍射的传感装置，或者光源发出的光通常可以以一定角度入射在装置表面上，从而衍射图像从表面反射。
分析仪可以采用一个或多个光电探测器作为测量衍射和/或非衍射光量的装置。可用的光电探测器包括光电压或光电导半导体结(光电二极管)，热辐射计或热电探测器。探测器可以单独设置或者设置成多元阵列(如电荷耦合装置或CMOS接口探测器阵列)。
在优选实施方案中，分析仪采用微处理器或类似装置，作为将用于测量衍射光量的装置的测量结果转变成表示分析物存在或缺乏的结果的装置。
一旦确定出结果，无论阳性还是阴性，该结果都通过用于通知使用者样品中是否存在分析物的装置显示给使用者。该装置最好包括能通知使用者信息的显示器或类似装置。显示器可以为任何标准显示器，如液晶显示器(LCD)。显示器可能显示出衍射图像，从而使使用者可以观察是否已经发生衍射。或者，显示器可简单地提供信息，如“是”或“否”或“分析物存在”或‘分析物不存在“或者类似信息，使使用者无需了解是否已经发生衍射即可获悉样品中是否存在分析物，从而减少人为误差。在另一实施方案中，在发生误差或者如果分析仪不能确定分析物存在时，那么可以显示这种效果的信息。
或者，可使用至少一个灯发出是否存在分析物的信号。例如，可以使用一个灯，根据所需设置该灯仅在存在或不存在分析物时发光。或者，可以使用两个或多个灯，其中一个灯标示为“是”。另一灯标示为“否”，分析仪将点亮适当的灯。或者可以将灯进行彩色编码，从而可使用一种颜色如绿色表示分析物存在，可使用第二种颜色如红色表示分析物不存在。
分析仪还可以包括一个或多个有助于使用者更加精确和/或快速确定分析物是否存在的附加特征。例如，分析仪可以包括用于将样品保持在适当位置的装置，从而可获得更佳精确的结果，或者可更加快速地确定分析物是否存在。该装置可以包括托盘，夹具，狭缝或着任何其他能将样品保持在适当位置的类似装置。
分析仪还可以包括用于引导、聚焦和/或加强光源的装置。如前面所述，该装置可以反射光，或者可以加强光，从而增强衍射水平，因此增大装置的灵敏度和/或精度。该用于引导和/或强化光的装置可以包括反射镜和/或透镜或者任何类似装置。通过使用这类装置，可无需使用微处理器等，因为增强光衍射允许使用者用肉眼判断分析物是否存在。
另外，本发明可以使用掩模帮助消除光透过传感装置或从传感装置反射时光电二极管检测漫射或散射光而非衍射光导致的假阳性的概率。掩模包括不透明物体，不透明物体具有与衍射图像对准的孔，或者与有关的衍射图像的某些部分对准的孔。可以使用掩模来阻挡除衍射光以外的所有被用于测量衍射光量的装置如光电二极管检测的光。掩模支架或组件也可以包括根据所使用的基于衍射的传感装置，或者为了任何其他期望的原因，而用于旋转掩模的装置。
在使用时，掩模设置在基于衍射的传感装置与光电二极管或其他用于测量光的装置之间。掩模包括固体部分和允许光透过的孔。选择孔的图案，使其与如果分析物与基于衍射的传感装置结合时传感装置所产生的衍射图像相应。由此，掩模阻挡非衍射光，同时使衍射光通过；通过这种方式，可仅测量衍射光的强度。
然后，旋转掩模从而阻挡衍射光，并且再次测量光强大小。某些漫射或散射光，如果有的话，将穿过掩模中的孔，同时衍射光被阻挡。由此，当第二次读出光强时，比较掩模处于适当位置时检测出的光量与掩模旋转时检测出的光量，判断样品中是否存在分析物。分析仪将根据所使用的算法比较读出，产生结果。如果在分析仪中使用掩模，则掩模可以与用于旋转掩模所需量的装置一起包含在分析仪中，用于测量衍射或非衍射光。
如果使用微处理器作为用于将光电二极管或类似装置的测量结果转换成表示分析物存在或缺乏的结果的装置，则微处理器可以包括存储能力，允许使用者调用分析仪的最近几次结果。可以依照需要改变所调用的结果数量。不过通常，存储器能调用至少大约5次结果。本领域技术人员可知，适当的计算机可读存储装置包括RAM，ROM，EPROM，EEPROM，闪存卡，数字视频盘，柏努利(Bernoulli)磁带等。包含存储器的任何类型的计算机芯片，可以安装或者可以通过其他方式与分析仪相关联。
图3表示本发明分析仪的另一实施方案，该实施方案具有若干任选的特征。该实施方案提供一种引导光的方法，使其可以用于小型阅读机装置中。如图3中所示，样品310放置在用于将样品310保持在适当位置的支架312上。光源314透过样品310。如果样品含有分析物，则光被衍射并以一系列包括衍射光和非衍射光的光316的形式发射出光。衍射光316反射离开反射镜318，并使用掩模320阻挡所有主要由非衍射光组成的非衍射光322。其余的光324，即主要由衍射光组成的光，再次反射离开另一反射镜326，并被光电二极管328收集，微处理器(未示出)翻译该结果，并在显示器330上提供适当的结果，在本实施方案中显示器为一系列灯。
在一个实施方案中，使用掩模320阻挡非衍射光322。因此，掩模允许大多数衍射光进入光电二极管，而光电二极管测量光强度。在另一实施方案中，测得的光强度发送到采用某种算法的微处理器。然后算法结果输入显示器330，如点亮一组灯，以简单的方式显示给用户样品为阳性还是阴性(例如红光＝阴性；蓝或绿光＝阳性)。如果光没有被衍射，则所有光都将被阻挡，光电二极管328将检测不到光，从而分析仪将显示出样品中不存在分析物。由此，无论系统中是否存在分析物都将显示出光电二极管328所检测出的光量。不过，如果发生误差如灰尘进入系统中而可能产生某些少量衍射光时，尽管样品312中不存在分析物，光电二极管328也可以检测到某些光。因此，当使用分析仪时，在决定光电二极管和微处理器是否指示样品中存在或缺乏分析物时，可以考虑衍射程度。
在可选择的实施方案中，用于分析衍射样品的方法也使用掩模。不过，对光强度测量两次。第一次测量使掩模光亮的衍射光。然后旋转掩模，阻挡衍射光；结果仅漫射光(如果有的话)穿过掩模得到测量。然后使用两次测量结果的比值确定样品是阳性(“是”，分析物存在)还是阴性(“否”，分析物不存在)。通过这种方式，该方法可将漫射光考虑在内，从而 “脏”样品，即定义为漫射或散射光但不衍射光的样品，不会引起阳性读出。
可使用的算法类型有许多种，可根据包括但不限于被检测的分析物、所使用样品、分析仪的部件、所需灵敏度、使用分析仪的系统等的一个或多个因素而改变。在本发明的一个实施方案中，该系统的优选算法允许用户处理数据(各衍射级的衍射光强度数据)，从而仅将高阶衍射级视作衍射样品。这样可以增大系统精度。
算法具有两个基本构成1)测量光强度的方法；和2)用于引起“阳性”或“是”读出和相反的“阴性”或“否”读出的计算。该算法是本发明的一个所需构成部件，因为它提供了一种特别是通过消除假阳性而增大精度的方法。
算法的一个例子为(大于等于2级的衍射光强度)/(入射光强度)在一种情形中，入射光可以在穿过样品之前进行测量。在优选实施方案中，入射光在透过样品之后进行测量，并且收集衍射和零级光束获得这种强度读出。算法可以设定该比值的截止值，从而高于该值的测量样品＝“阳性”，低于该值的测量样品＝“阴性”。截止值的一个例子为大约0.3。而且，截止值可以取决于被检测的分析物，所使用的基于衍射的传感装置的类型，被检测的样品，所产生的衍射图像，衍射图像中特征的尺寸，该图案中的衍射图像和/或特征尺寸和/或形状，所使用的分析仪类型，所需灵敏度大小，和/或使用该装置的整体系统而变。
可以使用其他算法，下面在实施例中给出可使用的算法的一些例子。
本发明还包括用于确定样品中分析物存在的系统和方法。在这些系统和方法中，与分析仪一起使用基于衍射的传感装置。将待检测的样品放置在基于衍射的传感装置上。根据所使用的基于衍射的传感装置的类型，样品可能需要静止几分钟，使分析物如果存在的话有时间与基于衍射的传感装置结合。或者，可以立即观察基于衍射的传感装置和样品。
然后光或者直接通过基于衍射的传感装置或者从基于衍射的传感装置反射。如果样品中存在被检测的分析物，则分析物衍射光。如果不存在分析物，则光不被衍射。不过，基于衍射的传感装置还可以构造和设置成，如果存在分析物则光不衍射，如果不存在分析物则衍射。而且，基于衍射的传感装置可以设计成如果不存在分析物，则光以第一数量衍射，如果存在分析物，则光以第二数量衍射，且分析仪能测量这种差异，判断是否存在分析物。
在光透过或通过样品反射和衍射之后，使用适当的探测器如光电二级管测量衍射光。探测器测量衍射光强。探测器可以任选在样品设置在仪器中之前或者在去除样品之后测量入射光强。或者，可使用第二探测器和分束器装置，在测量衍射光的同时测量入射光强度。然后使用用于确定是否存在分析物的装置如微处理器，确定该样品是阳性还是阴性。如果使用微处理器，则最好使用包含算法的代码或软件程序分析来自光电二极管的输入。为了运行算法，可以安装软件元件，运行必要的计算并确定最终结果。然后使用用于通知用户样品中是否存在分析物的装置，如LCD显示器或一系列灯，将该结果提供给用户。
如果在本发明中使用软件元件，则提供计算机可执行的指令，用于翻译光电二极管测量出的光量，并产生输出表示样品中是否存在分析物。微处理器执行软件元件的计算机可执行指令。
该系统还包括输入界面和输出界面。使用输入界面，微处理器可从光电二极管接收与光量有关的数据。使用输出界面，使通过软件元件控制的微处理器与用于指示用户样品中是否存在分析物的装置通信，将结果提供给用户。
本领域技术人员可以理解，也可以由与分析仪通信并与分析仪一起操作的分离系统，如台式电脑、膝上型电脑或手持式计算机系统执行软件元件。
取决于前面所讨论的因素，基于衍射的传感装置可以包括多种不同特征。
通常，基于衍射的传感装置将使用基质。基质可以包括任何大体上光学透明的材料，包括但不限于玻璃和塑料。不过，优选基质为聚合物薄膜。另外，为了有助于结合到基质上，基质优选具有涂覆在薄膜上的金属或金属氧化物薄膜。不过，如果使用反射光，则可使用非光学透明材料。
其上可以沉积金属涂层的任何薄膜都适合于本发明。这些薄膜包括但不限于聚合物如聚乙烯-对苯二酸酯(MYLAR)，丙烯腈-丁二烯-苯乙烯，丙烯腈-甲基丙烯酸共聚物，玻璃纸，纤维素聚合物如乙基纤维素、醋酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、丙酸纤维素、三乙酸纤维素，聚乙烯，聚乙烯-醋酸乙烯共聚物，离聚物(乙烯聚合物)，聚乙烯-尼龙共聚物，聚丙烯，甲基戊烯聚合物，聚氟乙烯和芳香聚砜。优选塑料薄膜的光学透明度高于80％。在参考文献例如Modern PlasticsEncyclopedia(McGraw-Hill出版公司，纽约1923-1996)中可以找到其他适当的塑料和供应商。
在本发明一个实施方案中，其上具有金属涂层的薄膜的透光度在大约5％至95％之间。本发明中所使用的其上具有金属涂层的薄膜的更加优选的透光度在大约20％至80％之间。在本发明一个优选实施方案中，薄膜具有至少大约80％的透光度，并且金属涂层的厚度为保持透光度大于大约20％的厚度，从而可由反射或透射光产生衍射图像。不过，在本发明其它实施方案中，金属厚度可以处于大约1nm至2000nm之间。
可用于沉积在薄膜上的金属包括金、银、铝、铬、铜、铁、锆、铂和镍，以及这些金属的氧化物。
除了基质以外，基于衍射的传感装置上还包括对于感兴趣分析物具有特异性的受体材料。受体材料通常在基质上设置成图案，从而当分析物与受体材料结合时，形成特殊衍射图像。
在一个可能的实施方案中，受体材料附着到位于基质上的附着层。在某些情形中，受体材料可以被动地结合到附着层。如果需要，则可以使用通过附着层引入到检测表面上的自由官能团，将受体材料共价附着到检测表面。用于附着受体材料的可用化学物质是本领域技术人员公知的。
在另一实施方案中，使用经过构图的抗体结合蛋白作为附着层。具有被束缚抗体的经过构图的抗体结合蛋白层，使其上的分析物构图设置或结合。
在本发明一个实施方案中，附着层为自组装单层。无机或金属表面上的自组装有机化合物单层是本发明一个实施方案的一个方面。虽然存在多种基于不同有机化合物和载体的自组装单层系统，不过优选的系统为处于金膜上的链烷硫醇盐，HS(CH2)nR。通常，在涂钛底涂层的Si/SiO2晶片或玻璃片上负载1至2000nm厚的金膜。钛作为金与载体之间的结合促进剂。链烷硫醇从金膜浸入的溶液中化学吸附到金表面上，形成损失了氢的吸附链烷硫醇盐。也可从蒸汽产生吸附。单层的表面或内部中可以包括多种官能团(R)。
从而自组装单层被定制来提供多种材料性质诸如可湿性和防止化学蚀刻剂腐蚀。另外，官能团可以反应，允许受体材料与自组装单层共价附着。
在另一实施方案中，受体材料可以直接施加给基质。在该原理的一个特定实施方案中，受体材料为抗体。受体材料的特征在于能特异性结合有关的分析物。可用作受体材料的材料种类仅受与从动部分选择性结合(相对于任何选定样品)的材料种类的限制。全部受体材料种类中所能包含的材料的子类包括毒素，抗体，抗原，激素受体，寄生虫，细胞，半抗原，代谢物，过敏源，核酸，核物质，自体抗体，细胞碎片，酶，组织蛋白，酶作用物，辅酶，神经元传导物，病毒，病毒粒子，微生物，蛋白质，多糖，螯合剂，药物和任何其他特异性结合对元件。该列表仅包含可以用作受体材料产生薄膜化验系统的多种不同材料中的一部分。无论选择哪一种有关的分析物，都将受体材料设计成特异性与该有关的分析物结合。
可根据分析物大小，通过两种方式中的一种使用所产生的具有构图受体的基于衍射的传感装置。对于自身能引起衍射的分析物，如微生物，通过首先将基于衍射的传感装置暴露于含有所选择分析物的介质，然后在适当保温培养周期之后，使光如激光透过薄膜或者从薄膜反射，这样使用该系统。如果介质中存在分析物并与受体层结合，则光被衍射产生可见图像。
或者，对于非常小的分析物如蛋白质，系统可以利用能与目标分析物结合并能产生高度和/或折射率相当大变化的“衍射增强元件”，从而增大生物传感器的衍射效率，从而能检测较小的分析物。在使用中时，目标分析物吸附于衍射增强元件，从而吸附于基于衍射的传感装置，或者直接吸附到印有受体的聚合物膜的选定区域，使衍射增强元件与分析物结合。然后通过物理尺寸和所定义的精确设置分析物和/或衍射增强元件，透射和/或反射光发生衍射。产生易于用眼睛观察或者通过传感装置观察的衍射图像。
该传感器的另一可选用途包括检测抗体分析物。传感装置可以仅包含经过构图的抗体结合蛋白，然后暴露于具有衍射增强粒子的介质，其具有对于被检测抗体具有抗体特异性。优选选择抗体粒子，使其不会非特异性地与经过构图的抗体结合蛋白结合，而是仅当还结合有分析物抗体时进行结合。通过这种方法，如果存在分析物抗体，则衍射增强元件将引起高度和/或折射率发生极大改变，从而形成衍射图像。
本发明中可使用的衍射增强元件粒子包括但不限于，玻璃，纤维素，合成聚合物或塑料，乳胶，聚苯乙烯，聚碳酸酯，金属粒子(例如金微粒子，金纳米粒子，银沉积剂或银微粒子)，细菌或真菌细胞等。粒子优选基本上为球形，不过对于本发明而言粒子的结构和空间形态不重要。例如，粒子可以为长条形，椭圆体，立方体等。粒子直径为大约0.1μm至大约100.0μm，优选处于大约0.3μm至大约1μm之间。元件粒子的组成对于本发明并不重要。优选介质与增强元件之间的折射率差为0.1以上。
基于衍射的传感装置还可以包括使用毛细作用剂(wickingagent)，以从样品中去除未结合的标签微粒子，以及任何残留液体。毛细作用剂使得不再需要任何附加清洗。另外，可以在毛细作用剂的中心打出小孔，从而一旦样品和过量粒子通过毛细作用被带走，则孔允许用户直接检测衍射图像，无需去除毛细作用材料。毛细作用剂的例子包括硝化纤维薄膜，醋酸纤维素薄膜，PVDF薄膜，聚丙烯和玻璃微纤维结构。
此外，可以改变毛细作用薄膜的孔尺寸以控制毛细作用的速度和毛细作用力。这可能会影响诊断装置的精度，并且也可以利用其产生一步式装置。为了实现这一目的，一步式装置包括在基质如金/MYLAR上的接触印制的俘获抗体，然后标签粒子在其表面上预干燥。另外，将切掉孔的慢毛细作用薄膜放置在装置顶部，完成该装置。用户仅仅加入被检测样品，然后一旦发生毛细作用时就观察衍射图像。使用小孔尺寸和/或疏水材料或者涂层，可以延缓毛细作用足够长的时间使之可以充分培养，如发生抗体-抗原相互作用所需的培养时间。或者，在毛细作用剂圆周处可使用易蚀试剂来延迟毛细作用。试剂最终将溶解或衍生，从而在特定时间周期之后允许毛细作用进行。
可使用多种技术将受体材料施加到基质上。试验表面可通过将溶液涂覆成分离阵列或图案；溅射；喷墨打印或者其他印制方法，或者通过接触印制而涂覆受体材料。所选择的技术将使涂覆大量试验表面所需的受体材料量最小，并在涂覆期间保持受体材料的稳定性/功能性。该技术必须能将受体材料以非常均匀和可再现的方式涂覆或粘接到基质上。
在一个这种实施方案中，使用微接触印刷印制受体材料。使用弹性图章将受体材料“墨水”通过接触转印到表面；如果图章经过构图，则形成图案化的受体材料层。可通过在具有所需图案的主盘上浇铸聚二甲基硅氧烷(PDMS)而制造图章。使用标准的光刻技术，蚀刻方法制备主盘，或者由具有微观表面特征的现有材料构成。
在另一实施方案中，使用喷墨打印机将受体材料印制在基质如金/MYLAR上成规定的图案。720点每英寸(dpi)的分辨率产生能通过结合目标分析物与标记微观粒子而产生衍射图像的阵列。不过，也可以使用其他分辨率。喷墨打印机还产生足够小的特征尺寸(40-100微米直径)，产生衍射图像。
使用本发明进行检测的分析物包括但不限于细菌；酵母；真菌；病毒；类风湿因子；抗体，包括但不限于IgG，IgM，IgA和IgE抗体；癌胚抗原；链球菌A族抗原；病毒抗原；与自体免疫疾病有关的抗原；过敏原；肿瘤抗原；链球菌B族抗原；HIV I或HIV II抗原；或者这些和其他病毒的宿主响应(抗体)；特异于RSV的抗原或者病毒的宿主响应(抗体)；单个抗原；酶；激素；多糖；蛋白质；类脂；碳水化合物；药物或核酸；沙门氏菌类；假丝酵母类，包括但不限于白色念珠菌和念珠菌属；沙门氏菌类；脑脊膜炎奈瑟氏菌型A，B，C，Y和W亚型135，肺炎链球菌，大肠杆菌K1，B型流感嗜血菌；从微生物衍生出的抗原；半抗原，滥用药品；治疗药物；环境因素；和肝炎特异性抗原。
通过下面的实施例进一步说明本发明，这些实施例并非以任何方式构成对本发明范围的限定。相反，可以清楚理解的是，本领域技术人员在阅读本说明书之后在不超出本发明范围的条件下，可以提出各种其他实施方案，改进及其等同方案。
实施例实施例1-3在实施例1-3中，确定用于通过衍射光强的直接测量结果提出是/否答案的算法和方法。
试验装置包括以下部件作为光源的激光束，基于衍射的传感样品，掩模，光电二极管和多个透镜。当样品符合衍射的必要条件时(例如存在分析物)，各级衍射光束透过处于0°(未旋转)位置的掩模，并使用光电二极管测量强度。然后旋转掩模，用掩模阻挡衍射光束，使其不到达光电二极管；由此，测量漫射和散射光。测量掩模处于两个位置时的光强，通过考虑这些数值而将漫射光和散射光部分排除。
用数百样品评价各算法的精度。测量各衍射级，从最靠近主要的非衍射光束(0级光束)的第1级开始，到第2级，第3级等。由于有些控制样品呈现出第1衍射级，通过将从第2到更高级衍射光的强度赋予更大权重而将其考虑在内。根据从所研究的数百样品收集的数据，选择掩模旋转导致强度的特定损耗，作为精确的是/否判断的截止值。可进行人为校正，给出处于阳性和阴性结果之间的中性区域。通式包括M与R的比值，其中M为衍射光的强度，R为非衍射光的强度；因此，可使用通式X＝(M-R)或X＝(M-R)/M，其中大于某一阈值的’X’表示衍射光的阳性，含有分析物的样品。
更具体的例子用M表示掩模处于0°位置时第2级和更高衍射级的衍射光强度，R为非衍射光强度。可通过旋转用于采集第2级和更高级的相同掩模测量非衍射光，使衍射光被掩模阻挡，仅测量通过掩模的漫射光。同样，公式为X′＝(M-R)或X′＝(M-R)/M。此外，可测量掩模旋转引起的整个光源的强度(X)损失。
在一个实施方案中，其中使用30％的强度损耗，使用下述公式如果X＞30％-(M-R)1.6，则结果为“阳性”，如果X≤30％-(M-R)1.6，则结果为“阴性”在另一实施方案中，使用下述公式如果((M-R)＞0.027-(M-R)1.6)，则结果为“阳性”，如果((M-R)＜0.027-(M-R)1.6)，则结果为“阴性”其他实施方案使用均值细化算法，包括基于强度读数平均值的标准偏差的因子。一个例子为对于X≤0.12，如果((M-R)＞0.014-((-1)(0.12-X)1.7))，则结果为“阳性”，对于X＞0.12，如果((M-R)＞0.014-X3)，则结果为“阳性”如果不满足上述(M-R)的条件，则结果为“阴性”实施例4如图3中所示，用下述部件制备手持式分析仪作为光源的激光二极管；用于保持基于衍射的传感样品使光透过该样品的装置；阻挡除第1，第2，第3和第4衍射级以外所有光的掩模；光电二极管；用于引导光的透镜和/或反射镜；具有存储能力的微处理器；一组显示结果的灯；以及LCD。所有这些部件都包含在小的手持式外壳中。
一旦打开分析仪，则LCD就提示用户必要步骤，如“插入样品”，然后“点击试验按钮”。如果衍射样品插入样品支架中，则光电二极管收集衍射光强度，微处理器将该结果转换成“阳性”。
用下述算法编程微处理器A＝通道1读数/通道2读数其中通道1测量2级和衍射光更高衍射级的强度，通道2测量1级衍射光的强度。
在一个实施方案中，其中截止值设定为2.0，使用下述公式如果X＞2.0，则结果为“阳性”，
如果X小于或等于2.0，则结果为“阴性”在一组样品中，发现2.0的截止值对于样品产生峰值为1μg/mL IgE(读出＝“阳性”)的精确结果，并对于对照品产生0μg/mL IgE的值(读出＝“阴性”)。用打开的红灯表示阳性读出，并在LCD上显示信息“样品阳性”。用打开的绿灯表示阴性读出，并在LCD上显示信息“样品阴性”。可在样品放置于支架后大约5秒内获得读出。
当然，如果设计相反类型的生物传感器，也可以将分析仪的微处理器编程将衍射样品表示为“阴性”。
本发明的分析仪，方法和系统可以用单次试验来检测分析物，或者可以设计成多次试验装置。可以用于检测吸收品如尿布中的污染物，并检测微生物的污染。
在本发明中，基于衍射的传感装置可以附着到背面粘性标签，或者附着到可以放置到硬表面或容器壁的贴花纸上。基于衍射的传感装置可以设置在容器如食品包装或玻璃瓶的内表面上。然后可以分析基于衍射的传感装置，确定分析物的存在。
可以看出，本发明提供一种改进的检测分析物的系统和方法，通过允许用户更容易地使用观测仪观察衍射图像而增大系统精度，或者取决于样品中是否存在分析物，通过分析所产生的衍射图像而产生阳性或阴性读出。
权利要求
1.一种用于在样品中检测分析物的方法，包括步骤将样品插入基于衍射的传感装置；使光源透过或从基于衍射的传感装置反射，产生衍射图像；以及用分析仪观察衍射图像；其中该分析仪用于透过或反射光源；测量衍射图像的光强度；并确定样品中是否存在分析物。
2.如权利要求1所述的方法，其中该基于衍射的传感装置包括聚合物膜；和印制在聚合物膜上面的成图案的受体层，其中该受体层为特异性结合分析物的受体材料。
3.如权利要求2所述的方法，其中受体材料选自抗原，抗体，核苷，螯合剂，酶，细菌，酵母，真菌，病毒，细菌纤毛，细菌鞭毛材料，核酸，多糖，类脂，蛋白质，碳水化合物，金属，激素和所述材料的受体。
4.如权利要求2所述的方法，其中使用对分析物具有特异性的衍射增强元件。
5.如权利要求1所述的方法，其中该分析仪包括光源；光电检测器；微处理器；显示系统；和用于包含该光源，该光电检测器，该微处理器和该显示系统的外壳。
6.如权利要求5所述的方法，其中该光源处于可见光谱内。
7.如权利要求5所述的方法，其中光源选自LED光，激光，激光二极管，通过光纤，通过针孔的自然光，或灯丝灯泡或无灯丝灯泡。
8.如权利要求5所述的方法，其中光源包括反射光。
9.如权利要求5所述的方法，其中该微处理器还包括用于运行算法的软件元件，根据光电二极管的测量结果判断样品中是否存在分析物。
10.如权利要求5所述的方法，其中显示系统选自液晶显示器(LCD)，声音发生器，照明灯，LED，提供结果打印输出的打印机，光敏材料，或者至少一个指示结果的灯。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述至少一个灯包括两个或多个灯。
12.如权利要求5所述的方法，还包括用于将样品保持在适当位置的支架。
13.如权利要求12所述的方法，其中支架选自托盘、夹具、狭缝或其组合。
14.如权利要求5所述的方法，还包括用于引导或增强光的装置，选自反射镜、透镜、波导、光纤或其组合。
15.如权利要求5所述的方法，还包括专用于衍射图像并用于阻挡特定光的掩模。
16.如权利要求15所述的方法，其中该掩模构造和设置成主要仅允许衍射光通过。
17.如权利要求15所述的方法，其中该掩模还包括用于旋转掩模的装置。
18.如权利要求15所述的方法，其中掩模旋转使其主要允许非衍射光通过，并阻挡衍射光。
19.如权利要求15所述的方法，其中该掩模具有至少两个取向，其中在第一取向，主要使衍射光能通过掩模，在第二取向，主要使非衍射光能通过掩模，其中衍射光强度与非衍射光强度之间的比值或差异表示是否存在分析物。
20.如权利要求19所述的方法，其中衍射光量比非衍射光更高表明存在分析物。
21.如权利要求19所述的方法，其中非衍射光量比衍射光量更高表明存在分析物。
22.一种用于在样品中检测分析物的方法，包括步骤将样品放入基于衍射的传感装置；使光源透过或者从基于衍射的传感装置反射，产生衍射图像；以及通过观测仪观察衍射图像；其中观测仪用于透过或反射光源，并确定样品是否衍射光。
23.如权利要求22所述的方法，其中该基于衍射的传感装置包括聚合物膜；和印制在聚合物膜上的成图案的受体层，其中该受体层为与分析物特异性结合的受体材料。
24.如权利要求23所述的方法，其中受体材料选自抗原，抗体，核苷，螯合剂，酶，细菌，酵母，真菌，病毒，细菌纤毛，细菌鞭毛材料，核酸，多糖，类脂，蛋白质，碳水化合物，金属，激素和所述材料的受体。
25.如权利要求23所述的方法，其中使用对分析物具有特异性的衍射增强元件。
26.如权利要求22所述的方法，其中该光源处于可见光谱。
27.如权利要求22所述的方法，其中光源选自LED光，激光，激光二极管，通过光纤，通过针孔的自然光，或有灯丝灯泡或无灯丝灯泡。
28.如权利要求22所述的方法，其中该光源包括反射光。
29.如权利要求22所述的方法，还包括用于将样品保持在适当位置的支架。
30.如权利要求29所述的方法，其中支架选自托盘、夹具、狭缝或其组合。
31.如权利要求22所述的方法，还包括用于引导或增强光的装置，选自反射镜、透镜、波导、光纤或其组合。
32.如权利要求22所述的方法，还包括专用于衍射图像并用于阻挡特定光的掩模。
33.如权利要求32所述的方法，其中该掩模构造和设置成主要仅允许衍射光通过。
全文摘要
一种使用基于衍射的传感装置以及使用该装置的方法和系统，确定分析物存在的分析仪。该分析仪可以与多种不同的基于衍射的诊断方法和系统一起使用。该分析仪增大这些装置在检测分析物时的精度和/或用途，同时为使用者提供更加容易的使用性和方便性。该分析仪可以包括光源，光电二极管，微处理器和用于将结果显示给用户的显示系统。其他特征包括反射镜，透镜，样品支架，和用于阻挡某些光的掩模。该分析仪和相关方法及系统可以用于多种环境下，包括商业、专家和个人应用中。
文档编号G01N21/41GK1697974SQ02827995
公开日2005年11月16日 申请日期2002年8月30日 优先权日2001年12月11日
发明者R·M·凯洛, D·杨, Z·S·阿塔纳索夫, M·E·克诺茨 申请人:金伯利-克拉克环球有限公司