检验和治疗鼻咽癌的物质和方法

专利名称：检验和治疗鼻咽癌的物质和方法
技术领域：
本发明涉及基于癌细胞中的差异基因表达治疗癌症的物质和方法。尤其是，但不仅仅是，本发明提供了诊断和治疗鼻咽癌的物质和方法。
人鼻咽癌(NPC)出现于后鼻咽部的表面上皮，并且并发高频率的颈部和远处转移。NPC在中国东南部、亚洲东南部、台湾、非洲东部和阿拉斯加州的某些区域发生率高(Marks等，1998)。NPC的高峰发生率发生在生命的第四十至五十年。在新加坡，NPC是中国血统的男性中第五个最流行的癌症，具有每100,000中14.3的年发生率(Chia等，2000)。在临床上，最常用离子放射治疗NPC(Lee等，1992；Marks等，1998)。
世界卫生组织(WHO)已根据分化程度将NPC分为三类(Marks等，1998)。I型是指鳞状细胞癌，它们高度分化，具有特征性的上皮生长方式和细胞内和细胞外角蛋白丝。无角质化WHO II型癌保留上皮细胞性状和生长方式。另一方面，WHO III型未分化癌不产生角蛋白并且不产生独特的生长方式。WHO-I角质化鳞状细胞癌包括75％美国鼻咽癌病例并且在美国出生的、非西班牙白种人中发现最多。WHO-II无角质化和WHO-III未分化鼻咽癌包括剩余25％的NPC并且更常见于亚洲人。在临床上，报道了亚洲人具有最高比例的放射反应性WHO-II无角质化和WHO-III未分化鼻咽癌并且与具有更大数量低放射反应性的角质化鳞状细胞鼻咽癌的非洲人-美洲人和西班牙人和非西班牙白种人相比能更好地存活。报道了无角质化和未分化鼻咽癌的5年相对存活率是65％，和角质化变种是37％(Marks等，1998)。
已经证明EB病毒(EBV)与NPC密切相关(Mutirangura等，1998；Chen等，1998)。已报到WHOII和III型NPC与EBV感染相关。WHO-II和III型NPC患者中，他们针对EBV病毒壳体抗原(VCA)以及早期抗原传播成分的IgG和IgA水平升高(Zong等，1992；Sigel等，1994)。相比之下，WHO I型分化很好的癌症患者具有与对照人群类似的EBV血清学特征且看来与EBV感染没有特殊相关。此外，分子研究表明在所有三个WHO型NPC的恶性上皮肿瘤细胞中都可清楚证明EBV基因组。Northern印迹分析也证明了从NPC患者获得的活检组织中潜伏期和溶解周期中包括的EBV基因产物的表达(Busson等，1992)。然而，表明EBV是NPC病因物质的直接证据很困难且尚未建立。
NPC的另一个重要特征是NPC肿瘤的病理组织学特征是非恶性淋巴细胞重度浸润。已经表明显著比例的这些肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)是T细胞(Huang等，1999)。这些TIL产生的某些细胞因子可能有助于NPC发展过程中肿瘤的生长(Huang等，1999 Tang等，2001)。
NPC癌发生可能反映了多种遗传、饮食和病毒相关事件的累积，它改变了癌基因和肿瘤抑制基因的正常功能(Gray and Collins，2000；Williams，2000)。广泛的分子分析包括核型和比较基因组杂交(CGH)研究(Chien等，2001；Fang等，2001)提示NPC因多步骤过程出现。等位基因分型和CGH的基因组宽泛研究检测到NPC中染色体3p、9p、11q、12q、13q和14q上高频率的基因异常。这个数据提示在RASSF1A基因定位的3p21.3的区域存在潜在NPC相关肿瘤抑制基因(Lo等，2001)。近来报道了NPC细胞中启动子过度甲基化与RASSF1A基因表达丧失的相关性(Lo等，2001)。发现饮食接触在发生NPC特殊组织学亚组的整体改变风险中起作用。在含高水平N-亚硝基化合物的防腐肉的频繁消费者中无角质化和未分化鼻咽癌肿瘤的风险增加(Farrow等，1998)。在摄入维生素C的个体中分化鳞状细胞癌的风险降低，不是其它组织学类型(Farrow等，1998)。这个关系在不吸烟者和以前吸烟者比当前吸烟者明显增强(Farrow等，1998)。此外，发现无角质化和未分化鼻咽癌的患者中针对早期抗原和病毒壳体抗原的EBV抗体的效价升高，而这些抗体的效价在对照和角质化变种患者之间相当(Neel，1985和1986)。然而，角质化鳞状细胞鼻咽癌和放射反应性相对更高的无角质化和未分化鼻咽癌之间的分子基础尚未系统地研究。
为了试图理解角质化鳞状细胞鼻咽癌与无角质化和未分化鼻咽癌之间的分子差异，本发明人采用cDNA微阵列来鉴定人NPC癌形成中可能潜在包括的基因。发明人确定了在未分化和分化人NPC中差异表达的少量基因。特别是，发明人发现了在未分化CNE-2 NPC细胞中十五个基因差异性上调，而在分化很好的HK1细胞中六个基因特异性上调。
鉴定的未分化人NPC细胞系CNE-2中特异性上调的基因之一是人印记基因H19。有趣的是，H19不在分化很好的人HK1 NPC细胞中表达。Northern印迹和原位杂交分析也证实了H19在未分化CNE-2人NPC细胞系中强烈表达，但不在分化很好的HK1人NPC细胞系中表达。而且，发明人证明了H19启动子区域CpG位点的甲基化不足可诱导H19基因表达在分化很好的人HK1 NPC细胞中去调节。发明人相信启动子区域基因的甲基化过度因此可能是在人NPC细胞分化和印记基因转录沉默中起作用的重要后生事件。
因此，最基本，本发明提供了诊断和治疗鼻咽癌(NPC)的物质和方法。本发明进一步提供了筛选可以用于鼻咽癌治疗或诊断的试剂或治疗目标的方法。
在不同类型NPC中某些基因的差异表达知识首次提供了诊断NPC或NPC风险的工具。这种诊断可以不依赖组织学研究或可以用于补充组织学研究。
更加和非常重要的是，差异基因表达知识能够诊断NPC类型，因此确保得到适当治疗。
在本发明的第一个方面，提供了确定患者NPC的存在或风险的方法，包括步骤(a)获得从怀疑具有NPC或具有NPC风险的患者得到的鼻咽细胞的表达产物；
(b)所述表达产物接触能够结合对应于表1中鉴定的一种或多种基因的表达产物的结合成员；和(c)基于来自所述鼻咽细胞的表达产物与一种或多种结合成员的结合来确定所述患者NPC的存在或风险。
表达产物的存在或上调可以通过将从测试下细胞得到的表达产物的存在或水平与适当对照细胞得到的进行比较来确定。理想地，对照细胞将是“正常的”，即来自鼻咽的非癌上皮细胞。这些细胞也可以从检测下的患者得到。也可以使用来自其它身体部分的正常上皮细胞。分析对照细胞的可供选择方法是可以用作对照的表达产物标准与测试下细胞的表达水平或模式进行比较。这种标准可以通过分析样品收集物确定正常细胞中一种或多种产物“标准”表达水平或模式来产生。这在下面更详细讨论。
如上提及，根据本发明第一个方面的方法不仅特别适合于将鼻咽样品分类为正常或恶性，而且适合于对特定类型NPC进行分类。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了通过检测表1中鉴定的至少一种基因的差异上调表达来确定NPC类型的方法，如分化或未分化。
该表达产物可以是转录核酸序列或表达的多肽。该转录核酸序列可以是RNA、mRNA或mRNA产生的cDNA。
结合成员可以是在适合杂交条件下能够特异性结合转录核酸的互补核酸序列。
当表达产物是表达蛋白的情况下，优选结合成员是所述表达多肽特异性的抗体或包含抗体结合结构域的分子。
为了检测目的，可以使用本领域已知的标准步骤标记结合成员。
优选，该结合成员固定在固相支持体上。接着表达产物可以通过该固相支持体，由此使它们接触结合成员。固相支持体可以是玻璃表面，如显微镜玻片；小珠(Lynx)；或光纤维。在小珠的情况下，每个结合成员可以固定到各个小珠并在溶液中接触表达产物。
本发明人已经成功使用了包含固定到固相支持体上的多种核酸序列的核酸微阵列。代表表达基因的核酸序列通过微阵列，它们能够产生NPC和更进一步NPC类型的特征性表达形式。
本领域现存确定特定基因组的表达形式的各种方法并且它们可以应用于本发明。例如，基于小珠(Lynx)的方法或分子条码(Surromed)是已知技术。在这些情况下，每个结合成员与各自可读和自由浮动容易接触表达产物的小珠或“条码”连接。结合成员与表达产物(目标)的结合在溶液中完成，其后标记的小珠或条码通过装置(如流式细胞仪)并阅读。
确定表达形式的更多已知方法是Illumina开发的器械，即光纤维。在这种情况下，每个结合成员与光纤维电缆一端的特殊“地址”连接。表达产物与结合成员的结合可以诱导荧光改变，它可以通过光纤维电缆另一端的装置阅读。
本发明进一步提供了确定个体NPC的存在或风险的核酸微阵列，包括带有多种核酸序列的固相支持体，所述核酸序列能够特异性结合表1中鉴定的一种或多种基因的表达产物。样品的分类将得到个体NPC的诊断和/或NPC的分类。
典型地，高密度核酸序列，通常是cDNA或寡核苷酸，固定到固相支持体的很小的分散区域或点上。该固相支持体通常是显微镜玻片或滤膜，被基质(或芯片)包被。该核酸序列通常通过自动机系统传递(或印记)到包被的固相支持体上并接着制动或固定到支持体上。
在优选实施方案中，典型地使用荧光标记来标记样品得到的表达产物，接着接触固定的核酸序列。杂交后，使用检测器检测荧光标记，如高分辨率激光扫描仪。
用数字图像软件分析每个分散点发射的信号获得表示基因表达模式(表达形式)的结合形式。接着实验样品的基因表达模式可以与对照的(即来自正常组织样品的表达形式)比较进行差异分析。
如上提及，对照或标准可以是以前判断是正常或恶性细胞特征性的一种或多种表达形式。这些一种或多种表达形式可以可提取地保存于数据载体上作为部分数据库。然而，也可以将对照导入试验步骤。换句话说，测试样品可以“掺加”一种或多种“合成肿瘤”或“合成正常”表达产物，它可以用作待与测试样品中基因鉴定者的表达水平相比的对照。
多数微阵列利用两种荧光团，典型地，最常使用的荧光团是Cy3(绿波激发)和Cy5(红波激发)。微阵列图像分析的目的是从每个表达产物提取杂交信号。以给定目标的绝对强度(主要对于与单一样品杂交的阵列)或具有不同荧光标记，代表待与作为内对照的一个探针进行比较的两种分开处理的两个表达产物的比率，(如样品和对照)来测定信号。
优选根据本发明的微阵列包含多种分散点，每个点含有一种或多种寡核苷酸并且每个点代表选自表1中的一个基因的表达产物的一个不同结合成员。
本发明的第二个方面，提供了产生NPC或特定类型NPC特征性的表达形式的方法，所述方法包括(a)获得从患者得到的NPC细胞的表达产物(b)所述表达产物接触能特异性结合表1中鉴定的一种或多种基因的表达产物的多种结合成员；(c)确定所述表达产物与结合成员的结合，使得产生NPC细胞特征性的表达形式。
本发明进一步提供了包括NPC或NPC类型特征性的表达数据的核酸(RNA或cDNA)表达形式数据库，所述数据得自显示NPC或NPC类型特征性核酸分布的多种寡核苷酸微阵列的分析，用于诊断。
本发明进一步提供了诊断NPC或NPC类型的诊断工具，包括寡核苷酸微阵列，所述微阵列具有带有多种寡核苷酸序列的固相支持体，所述寡核苷酸各自包括能够特异性结合表1中鉴定的多种基因的表达核酸的核酸序列。
在本发明的第三个方面，提供了确定生物学样品中NPC的存在或类型的试剂盒，所述试剂盒包括个能够特异性结合表1中鉴定的一种或多种基因的表达产物的一种或多种结合成员，和检测工具。优选该生物学样品是细胞提取物。
优选，试剂盒中一种或多种结合成员(抗体结合结构域或核酸序列)固定到固相支持体上。优选检测工具是当结合成员已经与表达产物结合时进行检测的标记(放射性或染料，如荧光染料)。
优选，一种或多种结合成员包括能够特异性结合H19或CNKNIC表达产物的结合成员。这些基因都被用作未分化人NPC的方便标记。当H19不产生蛋白产物时，表达产物将是mRNA。在CNKNIC的情况下，表达产物可以是mRNA或产生的蛋白产物。
如上提及，II型和III型未分化NPC对放疗反应更大，因此罹患这些类型NPC的患者有更好的存活率。本发明人确定了与分化的I型NPC相反，在未分化NPC中上调的很多基因(见表1)。这些基因包括H19和CNKN1C。
本发明人进一步确定了与未分化(II型或III型)细胞相反，在I型分化细胞中上调的很多基因(见表1)。
不仅该差异表达知识产生了极其有效的诊断方法，而且也提供了治疗NPC，尤其是过去治疗成功有限的I型的新方法。
本发明人惊奇地发现分化细胞的H19基因的启动子区域被高度甲基化，而未分化细胞中相同区域没有见到甲基化。发明人进一步表明这个区域的去甲基化导致分化细胞中H19基因的表达。
这个令人兴奋的发现提供了改变不同类型NPC特征性的基因差异表达的方法并提供了对治疗，如放疗更易感的细胞。
因此，在本发明的第四个方面，提供了治疗NPC或NPC风险的患者的方法，包括给予去甲基化剂，如5′氮杂-2′-脱氧胞苷，联合癌症治疗，如化疗或放疗。
本发明也提供了去甲基化剂用于制备联合化疗或放疗治疗鼻咽癌药物的用途。
优选该去甲基化剂用于治疗I型NPC。
本发明人的发现-分化和未分化形式NPC具有不同的基因表达，发展了筛选能够治疗NPC的物质，和尤其是能够选择性治疗不同类型NPC的物质的方法。
因此，在第五个方面，提供了筛选能够治疗患者的NPC的物质的方法，所述方法包括(a)在细胞中过度表达表1中鉴定的一种或多种基因，(b)所述细胞与测试物质接触；(c)确定与所述测试物质对缺乏所述一种或多种基因过度表达的可比较细胞的作用相比，所述测试物质对所述细胞的作用；和(d)鉴定所述测试物质为能够治疗NPC的物质。
该方法可以进一步包括制备包含步骤(d)鉴定的物质的药物组合物的步骤。
通过将能够表达所述基因特征性的表达产物的核酸插入所述细胞可以过度表达该一种或多种基因。
根据该筛选方法，可以优选选择已知在分化NPC或未分化NPC中上调的基因。此外，根据测试下的物质，可以优选选择已知产生蛋白产物如CNKNIC的那些基因。
在优选实施方案中，被表达的一种或多种基因包括CNKN1C。
该方法也可以包括用去甲基化剂联合该测试物质来处理过度表达表1中鉴定的一种或多种基因的细胞。
作为重组产生过度表达不同类型NPC特征性的一种或多种基因的细胞可供选择的方法，可以直接使用NPC细胞(I、II或III型)。尽管这将提供关于测试物质作用的有价值信息，但是可能需要进一步测试来鉴定该特殊基因目标。
现在将通过实施例，参照附图来说明本发明的方面和实施方案。更多方面和实施方案对本领域技术人员将很明显。本文中提及的所有文件并入这里作为参考。
在图中

图1未分化NPC(CNE-2)和很好分化的NPC(HK1)细胞之间的基因表达的对比微阵列分析，来自双份实施的三个实验(1至3)。用Cy5(扫描时假红色(pseudo-colored red))标记得自CNE-2细胞或HK1细胞的cDNA，用Cy3(假绿色)标记对照cDNA(混合来自10个细胞系)。使用Cluster程序计算Log2转换的中值(median-centered)Cy5∶Cy3比率。这些比率是每个实验样品中相对基因表达的测定结果，并且根据底部显示的颜色棒(使用TreeView程序)以从红经过黑至绿的梯度色谱显示。不幸的是，这不能呈现于本说明书所附的黑白图中。实际上，线图已经用于试图呈现梯度色谱。红 代表高于实验样品特定基因的中值的Cy5∶Cy3比率。绿 或黑 分别代表低于或等于实验样品基因的中值的Cy5∶Cy3比率。呈现了四个基因簇(A至D)，显示(A)HK1比CNE-2细胞中表达水平高的基因，(B和C)CNE-2细胞比HK1中表达水平高的基因，和(D)内部“看家”对照基因。
图2从18个不同人肿瘤细胞系(Detroit 562，Fadu，CNE-2，DAKIKI，Raji，WT-18，FHS-738Lu，MRC-5，A549，HeLa，HT-3，SW480，PA-1，HeCat，Bt-20，Hep-G2，A498和Hs67)纯化的polyA+RNA的Northern印迹分析。5μg polyA+RNA在1％含甲醛的琼脂糖凝胶中进行电泳，转移到尼龙膜上并如“材料和方法”中所述探测H19和β-肌动蛋白。
图3由未分化NPC(CNE-2)、分化很好的NPC(HK1)和宫颈癌(HT-3)得到的细胞系的原位杂交，使用如“材料和方法”中所述的β-肌动蛋白探针和H19有义和反义探针。以×400的放大率进行照相。
图4来自正常鼻咽(NP)和未分化鼻咽癌(NPC)的初级人组织的原位杂交。如“材料和方法”所述使用H19或β-肌动蛋白特异性的DIG标记探针。以×400的放大率进行照相。
图5来自(A)十六种成人组织(心、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和白细胞)和(B)五种胎儿组织(心、脑、肺、肝、肾)的polyA+RNA在尼龙膜(MTN Blots，Clontech)上的Northern印迹分析。如“材料和方法”所述探测印迹的H19和β-肌动蛋白。
图6分别得自未分化和分化很好的鼻咽癌的人细胞系CNE-2和HK1的RNA的Northern印迹分析，使用H19、胰岛素样生长因子2(IGF-2)和β-肌动蛋白的探针。
图7使用亚硫酸氢盐测序检测H19启动子内304bp区域的CpG甲基化的程度。分析未分化NPC细胞(CNE-2)、分化很好的NPC细胞(HK1)和用甲基化抑制剂-5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(AzC)处理的HK1细胞的这个区域的十二个CpG位点的甲基化特征。每个CpG位点甲基化的发生率以测序的克隆数量百分比来表示。CNE-2、HK1和AzC处理的HK1细胞得到的测序的克隆数量分别是19、63和27。
图8Northern印迹分析检测在存在或不存在5′-氮杂-2′-脱氧胞苷(AzC)下培养7天的分化很好的NPC(HK1)和未分化NPC(CNE-2)细胞中H19基因表达。如“材料和方法”所述探测印迹的H19和β-肌动蛋白。
材料和方法细胞系和组织培养以前已经描述了人NPC细胞系CNE-2和HK1(Sizhong等人，1983；Huang等，1983)。CNE-2细胞是由H.M.Wang博士(CancerInstitute，Sun Yat-sen University of Medical Sciences，广州，中国)得到的，而细胞系HK1是由D.P.Huang博士(中国香港大学)得到的。CNE-2细胞得自未分化鼻咽癌(Sizhong等，1983)，而HK1得自分化很好的鳞状鼻咽癌(Huang等，1983)。
除非另有指出，本研究中采用的多数肿瘤细胞系是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的。这些人细胞系包括A498(肾癌)、A549(肺癌)、DAKIKI(EBV转化的淋巴母细胞)、Fadu(咽癌)、HeLa(子宫颈腺癌)、HepG2(heptocellular癌)、MCF-7(乳腺癌)、HT-3(子宫颈癌)、K562(骨髓白血病)、Detroit-562(咽癌)，Raji(Burkitt淋巴瘤)，WT-18(EBV转化的B-淋巴细胞)，FHS-738Lu(正常肺)，MRC-5(二倍体肺)。采用的另外细胞系包括SW480(结肠腺癌)、PA-1(卵巢畸胎瘤)、HeCat(上皮)、BT-20(乳癌)和Hs67(正常胸腺)。所有这些细胞系在补充了10％FCS(Hyclone，Logan，UT)，0.1mM非必需氨基酸、4mM L-谷氨酸和1mM丙酮酸钠的RPMI培养基(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)中增殖。
组织样品治疗前从新加坡国立医院(Singapore General Hospital)ENT科的知情同意患者得到人NPC肿瘤活检组织。使用棉签敷料器施用的4％可卡因溶液从局部麻醉下的患者获得活检组织。使用Hilyard钳，在用光纤维鼻内窥镜直接观察下钳取共三钳咬肿瘤组织。前两个钳咬送去组织学检查，取获得的第三个活检组织进行本研究。来自患者的肿瘤活检组织立即速冻并保存在液氮中直到研究。在石蜡切片中证实组织病理学诊断。
cDNA微阵列本发明人选择了1000个以上IMAGE人cDNA克隆(IncyteGenomics Inc.，Palo Alto，CA)，代表大约941个不同的单基因簇(即独特基因)，进行它们的点微阵列研究。这1000个克隆形成建立作为新加坡国立癌症中心的cDNA微阵列分析核心设备的18000个克隆库的一部分。这些克隆的全部列表将可以申请获得。划线培养这1000个克隆，各个克隆生长过夜。这些当中，使用基因特异性引物对，PCR扩增鉴定并证实了713个克隆。用100μl PCR反应中1∶1000的终稀释度，从过夜细菌培养物中扩增到每个插入物。浓缩PCR产物，重悬于20μl3×SSC中，接着利用它印记到聚L-赖氨酸(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)处理的玻璃显微镜玻片(Fisher)上，使用配备四个印记环针(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)的自动机GMS 417微阵列仪(Genetic Microsystems Inc，Woburn，MA)。看家基因包括GAPDH，β-肌动蛋白，β-2-微球蛋白，亲环蛋白和泛素类似地点印作为数据分析过程中杂交信号标准化的内对照。印记后，倒置玻片于沸水浴(试剂级水)中2-3秒使阵列再水合，快速干燥5秒在100℃热block上4秒并使用Stratalinker(Strategene，La Jolla，CA)用550mJ紫外线照射交联。接着玻片置于0.2％SDS中(10分钟，磁力搅拌)，随后在清洁水(2L)中洗涤5次之后转移到沸腾热水(10分钟)中，印迹除去过量液体，在95％乙醇中干燥5分钟并在80℃烘箱中空气干燥5分钟。
cDNA微阵列杂交使用附于3DNA表达阵列检测试剂盒(Genisphere Inc.，Montvale，NJ)的合成杂交探针的方案，有修改。使用10μg从人NPC细胞提取的总RNA或从10μg对照RNA(10个细胞系混合的)通过反转录合成cDNA，寡(dT)引物分别加入3DNA Cy5“标记”试剂(5′-CCTGTTGCTCTATTTCCCGTGCCGCTCCGGT-(dT)n-3′)或3DNA Cy3“标记”试剂(5′GGCCGACTCACTGCGCGTCTTCTGTCCCGCC-(dT)n-3′)的捕获序列。产生混合对照RNA的10个细胞系是A498、A549、DAKIKI、CNE-2、Fadu、HeLa、HepG2、MCF-7、HT-3和K562。使用20μl杂交体积在玻璃盖片下和潮湿暗室(TeleChem International Inc，Sunnyvale，CA)中，每个测试RNA样品(CNE-2或HK1)以及对照RNA产生的cDNA与微阵列42℃竞争性杂交过夜。
杂交后玻片洗涤包括一系列洗涤，从2×SSC/0.1％SDS(2次洗涤，每次5分钟)开始，随后是0.2×SSC/0.1％SDS(2次洗涤，每次5分钟)，最后用0.1×SSC(2次洗涂，每次5分钟)。在cDNA已经与微阵列杂交后，仅用Cy5或Cy3标记的掺入荧光染料捕获序列的cDNA并洗去过量未结合的cDNA。
阵列定量和聚类(cluster)分析用GMS 418激光扫描仪(Genetic Microsystems Inc，Woburn，MA)扫描杂交阵列。使用不同的波道分开获得Cy5和Cy3的图像，叠加并用Imagene软件3.0版(BioDiscovery Inc，Los Angeles，CA)定量。一格环对准整个阵列图像上的每个点限定阵列上的点。从点内平均强度减去背景信号得到每个点的净信号。应用调节因子使得整个阵列上点的平均Cy5∶Cy3比率为1.0，使从Cy5和Cy3波道获得的信号强度标准化。接着计算Cy5∶Cy3比率的Log2转换和中值集中。使用完全链接聚类(linkage clustering)(Gene Cluster progrand，http://rana.lbl.gov/；Eisen等，1998)实施分级聚类算法。TreeView程序(Eisen等，1998)用于使聚类数据可视化，通过使用从亮红、经过黑色、至亮绿的梯度色谱显示基因表达强度。不幸的是，这不能在本说明书所附的黑白图中显示。然而，通过不同标记的盒子已经表示了强度。见例如图1。
Northern印迹分析使用TRIzol试剂(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)分离总细胞RNA。使用来自Invitrogen的Fast-Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)选择Poly(A)+RNA。对于Northern印迹分析，Poly(A)+RNA(5μg)加样于含0.7％甲醛和5mM碘化乙酰胺的1％琼脂糖凝胶的每一道，进行电泳。通过毛细管转移将RNA转移到Hybond-N+尼龙膜(Amersham，Piscataway，NJ)并用32P标记的H19 DNA(得自Shirley Tilghman教授的全长cDNA克隆，普雷斯顿大学，NJ)探测。使用高引发DNA标记试剂盒(BoehringerMannheim GmbH，Mannheim，Germany)根据制造商方案，通过随机六核苷酸引发来标记探针。人和人胎儿多种组织Northern印迹采用的滤膜购自Clontech实验室(Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)。使用BioRadFX PhosphorImager(BioRad，Richmond，CA)定量杂交信号。
原位杂交在恒冷切片机中将冰冻活检组织NPC组织切成10μm。细胞系(CNE-2，HK1和HT-3)在玻片(Falcon CultureSlide，Becton Dickinsonand Co.，NJ)上安装的室中生长至一半融合。用非放射活性有义和反义H19探针实施杂交，该探针根据制造商的规程，掺入地高辛配基(DIG)标记的dUTP(DIG RNA标记试剂盒，Hoffmann-La Roche，Basel，瑞士)被标记。用过氧化物酶缀合的抗DIG抗体检测杂交的地高辛配基标记的探针，随后与5-溴基-4-氯-3-吲哚磷酸盐和硝基蓝四唑盐(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，德国)进行酶催化的颜色反应。用苏木精(BDH Laboratory Supplies，Dorset，英国)计数器染色切片。用Olympus BX51显微镜(Olympus Optical Co.Ltd.，Tokyo，日本)观察玻片。
用5’-氮杂-2’-脱氧胞苷处理七个细胞系(CNE-2，HK1，HeLa，Hep-G2，HT-3，NIHOVCAR-3和SW480)在RPMI(含10％胎牛血清)中12.5μM 5’-氮杂-2’-脱氧胞苷(Sigma Diagnostics，St.Louis，MO)存在或缺乏下分别培养7天。使用TRIzol试剂(Gibco BRL，Life Technologies，Grand Island，NY)，根据制造商的规程，提取这些细胞系的总RNA。20μg总RNA用于Northern印迹分析。
H19启动子区域的亚硫酸氢盐测序用RsaI在37℃消化基因组DNA(2μg)16小时并添加新鲜制备的NaOH至终浓度0.3M，在42℃变性30分钟。通过添加尿素/亚硫酸氢盐溶液和氢醌分别至终浓度5.36M，3.44M和0.5mM，对变性DNA实施亚硫酸氢盐反应。反应包括20个循环的55℃(15分钟)，随后95℃变性(30秒)。PCR扩增亚硫酸氢盐处理的DNA(5μl)，以20μl反应，含0.5单位AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，CT)和使用引物(10μM)，将扩增H19启动子中306bp区域5′-AGATAGTGGTTTGGGAGGGAGAGGTTTTGGAT-3′和5′-ATCCCACCCCCTCCCTCACCCTACT CCTCA-3′。反应经历94℃(3分钟)，接着35个循环(94℃30秒，58℃1分钟，72℃30秒)，以72℃(6分钟)结束。接着如(Tremblay等人，1997)所述克隆并测序亚硫酸氢盐处理的DNA。使用CEQ 2000毛细管测序仪(Beckman Coulter Inc.，Fullerton，CA)实施DNA测序。
结果未分化人NPC细胞系CNE-2和分化很好的人HK1 NPC肿瘤细胞显示独特的基因表达形式为了鉴定人NPC特异性基因，发明人启动新加坡国立癌症中心程序，采用包含18000个cDNA克隆的文库筛选人鼻咽癌临床活检组织将临床信息内容与这些表达形式联系起来。基于他们的初步数据，他们选择了大约1000个基因进行他们的本研究。
使用从未分化人NPC细胞系CNE-2和分化很好的NPC细胞系HK1提取的RNA建立基因表达形式并杂交到点印微阵列。CNE-2和HK1细胞显示了不同的基因表达形式(图1，表1)。发现与CNE-2细胞相比，研究的大约1000个基因中有六个基因在HK1细胞中一致上调(表1)。这些包括编码金属硫蛋白-I、人黑素瘤相关抗原蛋白B3和单核细胞趋化蛋白3(MCP-3)的基因(图1A，表1)。相比之下，发现十五个基因在未分化CNE-2细胞RNA中比在分化很好的HK1细胞RNA中一致更高度表达(表1)。这些基因中有些包括H19印记基因、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1C(CDKN1C或p57KTP2)基因，编码蛋白-酪氨酸激酶Flt4、Tat相互作用蛋白和细胞周期蛋白D3的基因(图1B和C，表1)。
H19基因在未分化人NPC细胞中高度表达最有趣的是印记H19基因在未分化CNE-2 NPC细胞中特异性上调。为了检测H19表达是否对人NPC细胞是独特的，发明人实施Northern印迹分析比较十八种不同来源的不同人肿瘤细胞系的H19表达。这些包括来自人Burkitt淋巴瘤、咽癌、子宫颈癌、肺癌、结肠直肠癌、卵巢畸胎瘤、肝细胞癌、肾癌、乳腺癌、EBV转化的正常B淋巴细胞、成纤维细胞、上皮和胸腺的肿瘤细胞系(图2)。仅可在CNE-2细胞检测到与H19探针的阳性杂交(图2)。这些情况下检测的其它十七个细胞系没有可检测的H19基因表达。
H19在人中的特异性表达原位杂交研究也证实了未分化CNE-2 NPC细胞系(图3)。尽管在检测的CNE-2、HK1和HT-3(子宫颈癌)细胞中可以检测到β-肌动蛋白的表达，仅可在CNE-2细胞中特异性检测到H19表达(图3)。随后结合非放射活性的地高辛配基标记的反义H19 RNA探针后的灰-棕色染色鉴定表达H19 mRNA的细胞(图3)。
为了寻找未分化CNE-2细胞中H19表达的相关性，实施原位杂交研究未分化人初级NPC组织中H19的表达。原位杂交研究揭示H19也在未分化人NPC活检组织中强烈表达(图4)，并且不在非恶性但取自与鼻咽区域类似条件的慢性炎症组织活检组织的上皮中表达(图4)。原位杂交研究了共七种未分化人初级NPC活检组织和三个非NPC活检组织并且图4显示了代表性结果。
此外，通过Northern印迹分析也确定了H19在人胎盘组织中表达(图5A)。在来自检测的多数成年组织中RNA中不能检测到H19。这些包括心、脑、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和白血病的组织(图5A)。在胎儿肝脏的RNA，而不是胎儿心脏、胎儿脑、胎儿肺或胎儿肾组织中也可以检测到H19表达(图5B)。
H19是父本印记基因并且位于染色体11p15.5上母本印记IGF-2基因非常接近的位置(Feinberg，1999)。为了确定这两个基因在未分化CNE-2细胞和分化很好的HK1细胞中的表达之间的关系，实施Northern印迹分析。与仅在CNE-2细胞中表达的H19相比，IGF-2在CNE-2和HK1细胞中均表达(图6)。
分化很好的HK1 NPC细胞的启动子区域中CpG二核苷酸甲基化过度当检测H19的DNA序列时，一个值得注意的特征是H19基因启动子区域很多CpG二核苷酸的存在(图7)。已经证明CpG二核苷酸甲基化不足和过度在基因转录调节中是重要的后生事件。为了研究甲基化是否在未分化和分化很好的NPC细胞中H19基因的调节中起作用，发明人比较了CNE-2和HK1细胞中H19基因的启动子甲基化状况。从CNE-2细胞和HK1细胞中纯化基因组DNA，PCR扩增H19启动子区域和亚硫酸氢盐测序后估计H19启动子的甲基化状况。亚硫酸氢钠特异性诱导胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶残基的水解脱氨基作用。因此，预期当亚硫酸氢盐处理后测序PCR扩增的DNA时，最终测序反应中检测的胞嘧啶将代表在天然DNA样品中甲基化的那些胞嘧啶残基。相比之下，在最初DNA样品中没有甲基化的所有胞嘧啶残基在亚硫酸氢盐处理后随后将转变为胸腺嘧啶。研究了跨越H19启动子区域304bp的共十二个CpG二核苷酸(图7)。在从H19强烈表达的CNE-2细胞纯化的DNA中，这些CpG二核苷酸中多数没有甲基化(图7)。相比之下，在从H19不表达的HK1细胞纯化的基因组DNA中，这些CpG二核苷酸中多数被甲基化(图7)。在位置-209，-189，-180，-117和-102的CpG二核苷酸看来是甲基化“热点”并且计数大于70％测序的克隆(图7)。
H19启动子区域内的CpG二核苷酸甲基化不足与分化很好的HK1 NPC细胞中H19基因表达的恢复有关为了确定甲基化不足是否可以诱导H19表达，发明人用去甲基化剂5′-氮杂-2′-脱氧胞苷处理HK1细胞。当用H19探针的Northern印迹杂交分析从去甲基化剂5′-氮杂-2′-脱氧胞苷处理后的HK1细胞中提取的RNA时，在处理的HK1细胞的RNA中可检测到多种的H19转录物(图8)。
为了进一步寻找HK1细胞中启动子甲基化不足与H19基因表达的相关性，从去甲基化剂5′-氮杂-2′-脱氧胞苷处理的HK1细胞纯化基因组DNA并如上所述利用它进行亚硫酸氢盐测序。与从野生型HK1细胞纯化的DNA中多数甲基化的CpG二核苷酸相比，从5′-氮杂-2′-脱氧胞苷处理的HK1细胞纯化的DNA的H19启动子区域内的CpG二核苷酸甲基化大大减少(图7)。这些发现提示H19启动子区域甲基化不足与人NPC细胞中H19基因表达相关。
讨论根据其分化和角化程度，人NPC分为I、II和III型(Marks等，1998)。I型是高度分化和对放射反应相对较小的鳞状细胞NPC癌。另一方面，III型未分化NPC癌对放射反应较大(Neel 1985；Marks等，1998)。最多部分理解了人NPC的肿瘤增进和进展的分子机制并且没有研究NPC细胞的分化状态和癌形成之间的关系。基因改变已经暗含作为有助于向NPC发展的很多机制之一。各自基因产物的随后变化将反映这些基因改变中的多数。在新加坡，已经提出90％以上的临床检测的NPC病例分化很差。在本研究中，发明人因此采用cDNA微阵列来鉴定在分化很好和未分化NPC癌细胞中表达有差异的基因。这些基因无疑将对阐明人NPC癌形成很重要。从它们的cDNA微阵列分析来看，证明十五个基因在未分化CNE-2 NPC细胞中被差异上调，而在分化很好的HK1细胞中六个基因被特异性上调(图1和表1)。
在分化很好的HK1细胞中一致上调的基因之一是金属硫蛋白I(图1和表1)。金属硫蛋白I编码在细胞生长、修复和分化中起作用并且已经暗示作为肿瘤分化或细胞增殖的潜在标志的金属结合蛋白(Hengstler等，2001)。此外，金属硫蛋白I也起着抵抗由氧化性或外部应力诱导的DNA损害和调亡的保护性作用，并且假定有助于肿瘤细胞抵抗放射(Jayasurya等，2000)。在HK1细胞中也差异上调的其它基因包括编码单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)、CPR2、CDK抑制剂2A和IGFBP-3(图1和表1)的基因。
MCP-3，与趋化因子受体CCR1、CCR2和CCR3相互作用的C-C趋化因子，是单核细胞、T细胞、NK细胞、嗜酸性细胞和树突细胞的化学趋化因子(Fioretti等，1998)。已经提示NPC肿瘤损害中见到的特征性白细胞浸润可能是由浸润细胞分泌的C-C趋化因子诱导的(Tang等，2001)。然而，HK1 NPC细胞中MCP-3表达上调提示NPC肿瘤细胞自己也可能对白细胞募集到肿瘤部位有活跃贡献。
发现与分化很好的HK1 NPC细胞相比，在未分化CNE-2细胞中十五个基因一致以较高水平差异表达(图1和表1)。这些基因之一编码与血管生成性血管内皮生长因子-C(VEGF-C)相互作用的蛋白-酪氨酸激酶Flt4-一种受体型酪氨酸激酶(Lee等，1996)。有趣的是，未分化NPC细胞中Flt4的增强表达很好地与Flt4在未分化畸胎瘤细胞但不在分化畸胎瘤细胞中表达的观察结果一致(Pajusola等，1992)。在CNE-2细胞中上调的另一个基因是编码30kDa Tat相互作用蛋白(TIP30)的基因。TIP30等同于作为转移抑制剂的CC3并通过促进肿瘤细胞经历调亡而抑制人小细胞肺癌转移(Shtivelman 1997)。这是通过诱导多种调亡相关基因，如Bad和Siva，和转移抑制剂，TIP30/CC3对NM23-H2介导的(Xiao等，2000)。
有趣的是，证明了H19基因和编码CDKN1C的基因在未分化CNE-2NPC细胞中差异上调(图1和表1)。H19和CDKN1C基因都位于染色体11p15(Feinberg，1999)并且报道了都是印记基因。基因组印记是引起母本和亲本基因差异表达的亲本来源特异性染色体修饰(Tilghman 1999)。尽管已经报道的印记基因量相对较少，但是它们在发育和癌形成中起重要作用(Joyce and Schofield，1998)。已经假定CDKN1C和H19基因是肿瘤抑制基因(Hatada and Mukai，1995)。也证明了CDKN1C是很多G1细胞周期/Cdk复合物的强力抑制剂和细胞增殖的负调节剂(Matsuoka等，1995；Hatada等，1996 & 1995)。
H19是功能未知的父本印记基因。它位于染色体11p15.5上非常接近于母本印记IGF-2基因(Feinberg 1999)。对于正常人组织，在检测的胎盘和胎儿肝组织中检测到H19的表达，但不在其它成人和胎儿组织中表达(图5)。这与小鼠中的研究非常一致，其中H19基因在小鼠胚胎的内胚层和中胚层组织中高度表达，但是出生后戏剧性地下调(Brunkow and Tilghman，1991)。
目前，H19基因在癌形成中的作用不清楚。然而，H19基因在转基因小鼠中的过度表达引起妊娠期后期的出生前致死，强烈提示但不能证明H19在发育和分化过程中的重要作用(Brunkow和Tilghman，1991；Pfeifer等，1996)。与这些观察一致，已经报道了H19基因在损伤后大鼠血管平滑肌细胞中重新表达(Kim等，1994)。也有多种迹象表明基因组印记可能在人疾病中很重要(Paulsen等，2001)。已经报道了一些Beckwith-Wiedemann综合征患者在11p15上显示出单亲二体性(Bliek等，2001)。几个研究进一步证明了在胚胎性肿瘤如Vilms’肿瘤(Moulton et al，1994；Taniguchi et al，1995)和在肿瘤抑制基因位点经历杂合性损失的胚胎性横纹肌肉瘤(Casola等，1997；Zhan等，1994)中父本等位基因的优选保留。这些观察支持两个等位基因的不等同性并提示在肿瘤形成中基因印记的可能作用(Zhang等，1993)。也表明在这个位点保留了杂合性的多数Wilm’s肿瘤中正常印记是松弛的，和基因表达是双等位性(Moulton等，1994；Taniguchi等，1995)。已经证明了人H19基因的肿瘤抑制潜力。H19基因转染两个胚胎性肿瘤细胞系消除了软琼脂中一些转化细胞的致瘤性和在裸鼠中它们的肿瘤性(Hao等，1993)。
当检测并比较分化很好和未分化人NPC细胞中H19的基因表达模式时，证明了H19基因表达可能仅在未分化CNE-2人NPC细胞中特异性出现(图2，4和6)。这也证明了对于人NPC活检组织，H19在未分化NPC细胞中表达和不在正常鼻咽(NP)组织的上皮中表达(图4)。有趣地观察到显示不同程度分化的两种NPC细胞系的H19基因表达不同。更重要的是，我们证明了在5’-氮杂-2’-脱氧胞苷存在下培养分化很好的HK1细胞，H19的表达表达可能倒转(图8)。此外，H19表达与H19基因启动子区域的CpG二核苷酸的甲基化不足有关(图7)。通过亚硫酸氢盐DNA测序清楚证明了这个观察结果并且与DNA甲基化可调节基因表达的概念相一致(Li等，1993；Feil和Khosla，1999；Sleutels等，2000)。
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表1.cDNA微阵列分析总结。
在分化很好和未分化NPC细胞中差异表达的基因的鉴定。
权利要求
1.一种确定个体中鼻咽癌(NPC)的存在或风险的方法，包括步骤(a)获得从怀疑具有NPC或具有NPC风险的人体得到的鼻咽细胞的表达产物；(b)将所述表达产物接触一种或多种能够结合表1中鉴定的一种或多种基因的表达产物的结合成员；和(c)基于来自所述鼻咽细胞的表达产物与一种或多种结合成员的结合来确定所述患者中NPC的存在或风险。
2.一种确定个体中鼻咽癌(NPC)类型的方法，包括步骤(a)获得从怀疑具有NPC或具有NPC风险的患者得到的鼻咽细胞的表达产物；(b)将所述表达产物接触一种或多种能够结合表1中鉴定的一种或多种基因的表达产物的结合成员；和(c)基于来自所述鼻咽细胞的表达产物与一种或多种结合成员的结合来确定所述患者中NPC的类型。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中表达产物是转录的核酸序列。
4.根据权利要求3的方法，其中转录的核酸序列是RNA、mRNA或mRNA产生的cDNA。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中结合成员是能够特异性结合转录的核酸序列的核酸序列。
6.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中表达产物是表达的多肽。
7.根据权利要求6的方法，其中结合成员是能够特异性结合所述表达多肽的抗体，或包含抗体结合结构域的物质。
8.根据前述权利要求任一项的方法，其中为了检测目的，结合成员被标记。
9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述一种或多种结合成员固定到固相支持体上。
10.根据权利要求1至8任一项的方法，包括将表达产物固定到固相支持体上。
11.一种产生NPC，或特定类型NPC特征性的表达形式的方法，所述方法包括步骤(a)获得从个体得到的NPC细胞的表达产物；(b)将所述表达产物接触能够特异性结合表I中鉴定的一种或多种基因的表达产物的多种结合成员；(c)确定所述表达产物与结合成员的结合，使得产生NPC细胞特征性的表达形式。
12.一种产生NPC，或特定类型NPC特征性的表达形式的方法，所述方法包括步骤(a)获得NPC细胞的表达产物或正常鼻咽细胞的表达产物；(b)将所述NPC细胞或所述正常细胞的所述表达产物分别接触能够特异性结合表I中鉴定的一种或多种基因的表达产物的多种结合成员；(c)比较NPC细胞和正常细胞的表达形式；和(d)确定NPC细胞特征性的表达形式。
13.根据权利要求11或权利要求12的方法，其中表达产物是转录的核酸序列。
14.根据权利要求13的方法，其中转录的核酸序列是RNA、mRNA或mRNA产生的cDNA。
15.根据权利要求11至14任一项的方法，其中结合成员是能够特异性结合转录的核酸序列的核酸序列。
16.根据权利要求11或权利要求12的方法，其中表达产物是表达多肽。
17.根据权利要求16的方法，其中结合成员是能够特异性结合所述表达多肽的抗体，或包含抗体结合结构域的物质。
18.根据权利要求11至17任一项的方法，其中为了检测目的，结合成员被标记。
19.根据权利要求11至18任一项的方法，其中所述一种或多种结合成员固定到固相支持体上。
20.根据权利要求11至18任一项的方法，进一步包括将表达产物固定到固相支持体上。
21.一种诊断试剂，包括固相支持体，其上固定了能够特异性结合表1中鉴定的一种或多种基因的表达产物的一种或多种结合成员。
22.根据权利要求21的诊断试剂，其中一种或多种结合成员包括能够特异性结合H19或CNKNIC的表达产物的结合成员。
23.根据权利要求21或权利要求22的诊断试剂，其中表达产物是mRNA或产生的蛋白产物。
24.一种确定生物学样品中NPC的存在或类型的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求21至23任一项的诊断试剂和检测工具。
25.根据权利要求24的试剂盒，其中生物学样品是细胞提取物。
26.根据权利要求24或权利要求25的试剂盒，其中检测工具是当结合成员已经与表达产物结合时进行检测的标记。
27.去甲基化剂在制备治疗NPC或NPC风险个体的药物中的应用，所述治疗与另一种癌症疗法联合。
28.根据权利要求27的应用，其中另一种癌症疗法是化疗或放疗。
29.根据权利要求27或权利要求28的应用，其中去甲基化剂是5’-氮杂-2’-脱氧胞苷。
30.根据权利要求27至29任一项的应用，其中NPC是I型。
31.一种治疗NPC或NPC风险个体的方法，包括给所述个体施用去甲基化试剂联合另一种癌症疗法。
32.根据权利要求31的方法，其中另一种癌症疗法是化疗或放疗。
33.根据权利要求31或权利要求32的方法，其中去甲基化试剂是5’-氮杂-2’-脱氧胞苷。
34.根据权利要求31或33任一项的方法，其中NPC是I型。
35.一种筛选能够治疗个体的NPC的物质的方法，所述方法包括(a)在细胞中过度表达表I中鉴定的一种或多种基因；(b)将所述细胞接触测试物质；(c)确定与所述测试物质对缺乏所述一种或多种基因过度表达的可比较细胞的作用相比，所述测试物质对所述细胞的作用；和(d)鉴定所述测试物质为能够治疗NPC的物质。
36.根据权利要求35的方法，其中通过将能够表达所述基因特征性的表达产物的核酸插入所述细胞而过度表达所述一种或多种基因。
37.根据权利要求35或权利要求36的方法，其中在分化NPC中，所述一种或多种基因被上调。
38.根据权利要求35或权利要求36的方法，其中在未分化NPC中，所述一种或多种基因被上调。
39.根据权利要求38的方法，其中一种或多种基因包括H19和CDKNIC。
40.根据权利要求35至39任一项的方法，进一步包括用去甲基化剂处理过度表达表I中鉴定的一种或多种基因的细胞。
41.根据权利要求35的方法，其中过度表达表I中鉴定的一种或多种基因的细胞是NPC细胞。
42.根据权利要求35至41任一项的方法，进一步包括制备包含步骤(d)所鉴定的物质的药物组合物的步骤。
全文摘要
本发明有关基于细胞中差异基因表达的鼻咽癌(NPC)的检测和治疗。特别是，本发明提供了NPC中差异表达的基因的细节，用来检测该疾病及其临床类型的存在或风险。本发明也提供了与化疗或放疗联合治疗NPC的方法。
文档编号G01N33/68GK1643377SQ03806030
公开日2005年7月20日 申请日期2003年1月23日 优先权日2002年1月23日
发明者吴俊贤, 唐静萍, 许锦文, 吴福庆 申请人:吴俊贤;许锦文, 唐精萍, 吴福庆