一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种试剂盒，具体设及一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果评估 的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌是一种高侵袭性、高转移性的恶性肿瘤，在中国南方和东南亚地区广泛流 行。尽管鼻咽癌早期临床阶段的病人总生存率达到了约90%，但大部分的患者就诊时已是 鼻咽癌晚期，其生存率低于50% ;鼻咽癌治疗后的复发和远处转移进一步导致了更差的预 后。因此，临床上鼻咽癌的早期诊断和及时治疗是提高患者生存率、改善预后的关键突破 口。如何寻找和建立简单可信的生物学标志物用于高发区鼻咽癌的筛查和早期诊断是临床 上亟待解决的问题。
[0003] 已有研究表明，遗传易感性、高发区特有的环境因素和邸病毒感染等因素在鼻咽 癌的发病中扮演着重要的角色。尽管邸V在世界范围内有较高的感染率，EBV感染与鼻咽 癌的发病也是紧密相关的。在高发区，几乎100%的未分化型鼻咽癌（WHO III型）的病变 部位都可W检测到邸V基因组的存在；此外，鼻咽鱗状细胞癌（WK) I型）和非角化型鼻咽 癌的发生也与EBV感染密切相关。在高发区，鼻咽上皮细胞的EBV感染是鼻咽癌的一个重 要特征。
[0004] 鼻咽癌诊断的金标准是鼻咽镜下进行组织活检取材，之后由病理医生进行病理诊 断。由于取材有创、取材组织小、且依赖镜下肉眼观察，因此约有10%的患者在首次取材 时诊断失败，医生和患者需面临再次或多次取材、或随访观察的挟择，易延误病情。在此 情况下，目前临床上缺乏特异性辅助诊断的方法用于参考。邸V相关的血清学指标（包括 VCA-IgA、EA-IgA等）已纳入临床检测。但该些血清学抗体指标最大的缺点是不能实时反 映鼻咽癌发病和进展状况，且存在特异性W及灵敏度不足的问题，在临床上仅能提供有限 参考。血浆游离邸V拷贝数的检测是一个用于鼻咽癌诊断的较好的生物学指标，但其对鼻 咽癌的早期诊断缺乏足够的灵敏度。因此，临床上缺乏一种快捷、无创、可重复的取材手段 W及有效的生物学指标用于鼻咽癌的筛查、早期诊断、疗效监测及预后评估。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于鼻咽癌诊断、 预后判断、治疗效果评估的试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，所采取的技术方案；一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果 评估的试剂盒，所述试剂盒包括总RNA提取试剂、逆转录试剂、EBV-miR-BARTl-5p的逆转录 引物、巧光定量PCR试剂、EBV-miR-BARTl-5p的定量PCR引物。本领域技术人员很容易知晓， 所述逆转录试剂包括逆转录酶、逆转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂和水，所述巧光定量PCR 试剂包括化q DNA聚合酶、聚合反应缓冲液和水。优选地，所述总RNA提取试剂为Trizol 试剂。
[0007] 优选地，所述EBV-miR-BARTl-5p的核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[000引 优选地，所述邸￥-11111?-841?1'1-5口的逆转录引物序列如569 10^:5所示。
[0009] 优选地，所述邸V-miR-BARTl-5p的定量PCR引物包括；
[0010] 正向引物序列如569 10^:9所示，反向引物序列如569 10^:10所示。
[0011] 优选地，所述试剂盒还包括与邸V-miR-BARTl-5p匹配的"Tagman探针，所述"Tagman 探针的核巧酸序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0012] 优选地，所述试剂盒还包括内参基因、内参基因逆转录引物和内参基因的巧光定 量PCR引物。
[0013] 优选地，，所述内参基因为人的RNU她。
[0014] 优选地，所述试剂盒还包括鼻咽刷，所述鼻咽刷包括刷头和柄杆，所述柄杆由第一 柄杆、连接部和第二柄杆组成，所述刷头与所述第一柄杆连接，所述第一柄杆通过所述连接 部与所述第二柄杆相连，所述连接部为可连续弯曲的连接部。
[0015] 优选地，所述刷头由塑料杆和设置于所述塑料杆上的巧龙植绒拭子组成，所述第 二柄杆的末端表面设有防滑点状凸起。
[0016] 优选地，所述刷头中塑料杆的长度为15mm，所述刷头中巧龙植绒拭子的长度为 0. 5mm，所述第一柄杆的材质为塑料，所述第一柄杆的长度为20mm，所述第一柄杆的直径为 1. 75mm，所述第二柄杆的材质为塑料，所述第二柄杆的长度为110mm，所述第二柄杆的直径 为2. 5mm，所述连接部的长度为10mm，所述第一柄杆和第二柄杆之间的夹角呈0°到45°。
[0017] 鼻咽癌是一种高侵袭、高转移的恶性肿瘤，其早期诊断是一个巨大的挑战。研究 认为，EBV编码的microRNAs在鼻咽癌的发生和发展中发挥癌基因的作用，是潜在的鼻咽 癌筛查和早期诊断的生物学标志物。本发明中，我们采用无痛、无侵袭性的鼻咽刷取材的 方式直接从鼻咽部获取组织样本，并进行了 EBV相关microRNA的表达分析。结果表明， EBV-miR-BARTl-5p对鼻咽癌的诊断效率优于首次活组织病理检查、血清邸V VCA-IgA W及 EA-IgA抗体滴度的检测。更为重要的是邸V-miR-BARTl-5p表达水平的检测在区分早期鼻 咽癌（I/II期）、健康对照和更高分期的鼻咽癌方面具有很高的灵敏度。此外，鼻咽癌患者 治疗结束后其鼻咽刷样本中邸V-miR-BARTl-5p的表达水平显著下调。因此，鼻咽刷取材联 合邸V-miR-BARTl-5p表达水平的检测可W有效的反映鼻咽癌病情的进展、辅助鼻咽癌的 诊断和疗效监测，并在鼻咽癌高危人群的筛查中表现出潜在的应用价值。
[0018] 本发明的有益效果在于；本发明提供了一种用于鼻咽癌诊断、预后判断、治疗效果 评估的试剂盒，该试剂盒通过检测邸V-miR-BARTl-5p的表达水平可W有效的反映鼻咽癌 病情的进展，辅助鼻咽癌的诊断和疗效监测，并在鼻咽癌高危人群的筛查中表现出潜在的 应用价值。本发明所述试剂盒还包含鼻咽刷，采用该鼻咽刷直接获取鼻咽部病变部位的样 本，不仅具有无痛、无侵袭性的优点，而且鼻咽刷获取的脱落细胞可W直接反映鼻咽部肿瘤 的特性，因此鼻咽刷取材联合邸V-miR-BARTl-5p表达水平的检测，可W帮助临床医生对鼻 咽癌进行快速诊断，且在鼻咽癌的疗效监测和随访中起到较大的辅助作用。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所述的邸V-miR-BARTl-5p在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织 样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
[0020] 图2为本发明所述的邸V-miR-BART5在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织样本 中的表达水平检测的一种实施例的结果；
[0021] 图3为本发明所述的邸V-miR-BART6-5p在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织 样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
[0022] 图4为本发明所述的邸V-miR-BART17-5p在不同疾病背景病人的鼻咽部活检组织 样本中的表达水平检测的一种实施例的结果；
[0023] 图5为本发明所述的邸V-miR-BARTl-5p在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的 表达水平检测的一种实施例的结果；
[0024] 图6为本发明所述的邸V-miR-BART5在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的表达 水平检测的一种实施例的结果；
[0025] 图7为本发明所述的邸V-miR-BART6-5p在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的 表达水平检测的一种实施例的结果；
[0026] 图8为本发明所述的邸V-miR-BART17-5p在不同疾病背景病人的鼻咽刷样本中的 表达水平检测的一种实施例的结果；
[0027] 图9为本发明所述的邸V-miR-BARTl-5p在健康人、鼻咽癌I/II期样本、III期样 本至IV期样本中的表达水平检测的一种实施例的结果.
[002引图10为鼻咽癌病人治疗前后鼻咽刷样本中邸V-miR-BARTl-5p表达水平检测的一 种实施例的结果；
[0029] 图11为本发明所述的鼻咽刷的一种实施例的结构示意图，图中；1、刷头，2、第一 柄杆，3、连接部，4、第二柄杆，5、防滑点状凸起。
【具体实施方式】
[0030] 为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明 作进一步说明。
[0031] 实施例1 ;研究鼻咽癌诊断及