光谱分析系统和方法

专利名称：光谱分析系统和方法
技术领域：
本发明的实施方案涉及利用拉曼光谱术对样品进行分析。特别地，实施方案涉及利用受激或相干反斯托克斯拉曼光谱来分析含有感兴趣的单个核酸衍生物的样品，所述样品被包含在光谱分析腔(spectroscopic analysis chamber)内。
背景技术：
脱氧核糖核酸(DNA)测序在医学诊断、药物发现和疾病治疗领域具有很多在商业上重要的应用。现有的DNA测序方法是基于对已根据尺寸分离的荧光标记DNA分子所进行的检测，其在能被测序的DNA的长度方面是有限制性的。通常，一次只能测定DNA序列的500至1,000个碱基。这与称作基因的DNA功能单元的长度相比太短，DNA功能单元的长度可以达数万或数十万个碱基。利用现有的方法，确定一个完整的基因序列需要制备该基因的很多个拷贝，将其切成重叠片段并进行测序，然后可将重叠的DNA序列装配成完整基因。这个过程工作量大，费用高昂，效率低下并且耗费时间。它通常还需要使用荧光性或放射性标记，这会形成潜在的安全和废料处理问题。
最近，已经开发出的DNA测序方法涉及与附着到DNA芯片上特定位置的具有确定序列的短寡核苷酸进行杂交。这类方法可用于推断短的DNA序列或在样品中检测特定的DNA分子是否存在，但并不适于鉴定长的DNA序列。


下列描述和附图用于阐明本发明的实施方式，通过参照这些描述和附图，人们可以更好地理解本发明。附图包括图1示出了依据本发明实施方式的基于谐振增强光谱分析的样品鉴定方法。
图2示出了依据本发明实施方式的光谱分析系统的剖视图，该光谱分析系统包含处于流体通道中的腔室。
图3示出了瑞利、斯托克斯和反斯托克斯辐射。
图4示出了依据本发明实施方式的四种DNA核苷酸的稀释水溶液的斯托克斯曼光谱。
图5示出了依据本发明实施方式的光谱分析系统的剖视图，该光谱分析系统包含与流体通道相连的球状腔。
图6示出了依据本发明实施方式的与流体通道相连的球状腔的另一个剖视图。
图7A示出了依据本发明实施方式的图6所示的腔室顶部沿剖切线7A-7A的视图。
图7B示出了依据本发明实施方式的图6所示的腔室底部沿剖切线7B-7B的视图。
图8示出了依据本发明实施方式的被设置成可接收激发辐射的光谱分析腔的俯视图，其中所述激发辐射的形式为调准的频率匹配的源辐射(seed radiation)和横向的频率不匹配的辐射，该调准的频率匹配的源辐射的频率与散射辐射相同，而该横向的频率不匹配的辐射的频率不同于散射辐射。
图9示出了依据本发明实施方式的用于分析样品的相干反斯托克斯拉曼光谱术过程的能级图。
图10示出了依据本发明实施方式的用于实施相干反斯托克斯拉曼光谱术的交叉光束构型(cross-beam configuration)。
图11示出了依据本发明实施方式的与图10所示类似的交叉光束构型的动量守恒。
图12示出了依据本发明实施方式的用于实施相干反斯托克斯拉曼光谱术的前向散射构型。
图13示出了依据本发明实施方式的用于实施相干反斯托克斯拉曼光谱的后向散射构型。
图14示出了可以实施本发明实施方式的核酸测序系统。
图15示出了用于核酸测序的示意性装置和方法，其通过表面增强拉曼光谱术(SERS)、表面增强谐振拉曼光谱术(SERRS)、谐振增强拉曼光谱术(例如，受激拉曼光谱术)，和/或相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)检测来进行。
图16示出了浓度为100mM的四种脱氧核苷单磷酸(dNTPs)的拉曼光谱，所用的数据采集时间为100毫秒。
图17示出了1nM鸟嘌呤的SERS检测，该鸟嘌呤是通过酸处理从dGMP中获得的，可参考Nucleic Acid Chemistry，Part 1，LBTownsendand RSTipson(Eds)，Wiley-Interscience，New York，1978。
图18示出了100nM胞嘧啶的SERS检测。
图19示出了100nM胸腺嘧啶的SERS检测。
图20示出了100pM腺嘌呤的SERS检测，该腺嘌呤是通过酸处理从dAMP中获得的。
图21示出了用荧光素共价标记的500nM三磷酸脱氧腺苷溶液(上方曲线)和未标记的dATP(下方曲线)的对比SERS光谱。
图22示出了依据本发明的一个实施方式，对产生于单个分子的拉曼散射光的能量进行比较的曲线图，所述单个分子装在光谐振腔中(曲线A和B)或位于没有谐振增强的自由空间中(曲线C)。
发明详述在此描述了利用拉曼光谱术来分析样品的光谱分析系统和方法。在下面的描述中，给出了大量的具体细节。然而应理解的是，本发明的实施方式在不遵照这些具体细节的情况下仍可实施。例如，技术人员可以使用某种光谱分析腔，而非本文所公开的特定的腔室。作为另一个例子，技术人员可以使用另一种光谱技术，而非本文所公开的特定的受激和相干反斯托克斯拉曼光谱。在其他的例子中，为了避免对理解本说明书造成妨碍，对于公知的结构和技术本文并不详细说明。应该认为，技术人员在光谱学领域和在制造在此所公开的腔室方面，具有普遍的高水平。
本发明的实施方式可结合DNA测序一起使用。用于DNA测序的一种示范性方法可以是涉及将DNA分子有序解构为较小的核苷酸成分(例如通过应用酶)，然后对核苷酸进行分析鉴定以确定原始DNA分子中核苷酸的有序序列。已经尝试将自发拉曼光谱术用于鉴定核苷酸。在应用自发拉曼光谱术的过程中，将含有核苷酸的样品暴露于辐射，由于自发拉曼散射效应，与核苷酸相互作用的辐射的一小部分将根据该核苷酸的振动特性而被散射。
不幸的是，在自发拉曼光谱术中，从稀释溶液中的核苷酸所散射出的光信号通常都是很微弱，因而导致检测到所述光信号的概率一般较低，这造成该方法灵敏度低，精确度低，而且不可靠。尽管可以通过进行多次测量并取数据平均值来努力改善这种方法的精确度，但是这将花费更长的时间，在快速DNA测序环境中并不符合要求。也通过将化学组成部分(moieties)(例如荧光生色团)连接到核苷酸以增强它们的光性质或荧光性质来努力提高光信号的强度。要可靠且一致地连接上这些组成部分却是存在问题的。所述组成部分或它们的缓冲溶液可能是不稳定的。在一些情况下，所述组成部分并不能连接在一起。在其他情况下，进行连接的组成部分具有不同的特性，从而导致它们的核苷酸具有不同的光谱响应。这样的问题使核苷酸难于被精确可靠地鉴定。此外，连接所述化学组成部分的过程增加了额外的时间和分析的复杂性。本文所公开的方法和系统可克服这些问题。
图1示出了根据本发明实施方式的基于谐振增强受激拉曼光谱分析来鉴定样品的方法。所述方法允许基于光谱数据来鉴定样品，所述光谱数据充当了样品的指纹和信号。简而言之，该方法包括，在步骤(block)110处，将样品例如溶液中感兴趣的单个分子加入到谐振光谱分析腔中；在步骤120-160处，利用谐振增强受激拉曼光谱术来分析该样品，在步骤170处，在该分析的基础上来鉴定样品。分析单个分子是某些应用的一个方面，并非限制性的。其他应用可包括分析多个分子。在本发明的某些实施方式中，谐振增强受激拉曼光谱术可包括在步骤120处，照射盛放于谐振腔中的样品；在步骤130处，从该样品散射辐射；在步骤140处，在该腔室中谐振该被散射的辐射；在步骤150处，发射或传送来自该腔室的被散射的辐射；在步骤160处，检测所发射出的散射辐射。一方面，该方法可与核酸测序结合使用，并可包括鉴定样品中的单个核酸衍生物这一步骤，其中该样品是从一个致力于对DNA或RNA分子进行测序的核酸测序系统中接收的。
图2示出了依据本发明实施方式的光谱分析系统200的剖视图，该光谱分析系统适于对样品进行谐振增强受激拉曼光谱分析以鉴定该样品。该系统包括电磁辐射源210、流体通道270、光谱分析腔250(如虚线所示)，以及电磁辐射检测器290。样品230装在该腔室中。在对样品进行谐振增强光谱分析期间，电磁辐射源提供输入或激发辐射215以照射腔室中的样品，以产生拉曼非弹性散射辐射285的输出，其中包含了可用来表征和鉴定该样品的信息。在受激拉曼光谱术的情况中，该输入辐射可以是来自电磁辐射源例如激光器的可见光、紫外线或近红外线光谱辐射，而该输出辐射可以是相应的受激拉曼非弹性散射辐射。该输出辐射可由检测器检测，并用于鉴定该样品或其中的一个或多个成分。
首先，参照方法100的步骤110，将样品230加入光谱分析腔250中，该样品可包括液体、气体或混合流体。在图2所描述的系统中，样品流过流体通道而被加入腔室中。通道是固体材料内未填满的或挖空的空间，例如可以是传送流体的任何管道、导管、输送管或管线。该通道的横截面可为圆形、椭圆形、正方形、矩形或其他形状。该流体通道具有样品入口275和样品出口280，样品入口275与样品源相连以接收用于分析的样品，样品出口280与样品目的地相连以排出分析后的样品。样品可在入口处被接收，然后流过通道，流入该腔室，在被分析后流出该腔室，并通过出口流到合适的目的地。可以提供合适的驱动力来完成流动，例如在入口和出口之间不同的压力或在该通道中提供一个泵。作为一个实施例，通过压力注入(pressure injection)可从加压的核酸测序系统中接收核酸衍生物的稀释水溶液，并通过流过通道而加入到该腔室中，以鉴定特定的核酸衍生物。或者，可利用流体泵如注射器而不是通过流过一个流体通道，将样品经由一个开口加入腔室中，并且随后利用该注射器来排出样品。在其他的实现方式中，如果该样品是带电的，则可在电场所提供的力的作用下将该样品加入该腔室中，或者如果该样品是磁性的(例如，具有一个附加的磁部分)，则可通过磁场所提供的力将该样品加入腔室中。
该通道可以是微尺寸的(micro-sized)，尽管这并不是必需的。术语微尺寸通道、微流体通道以及类似的术语将被用来表示一个横截面长度——例如在管状导管的情况下指直径——小于约1毫米(mm，千分之一米)的通道。通常，该微尺寸通道的横截面长度可以是约10-500微米(μm，百万分之一米)。为有助于恰当地理解这些长度，人头发的横截面直径为大约100微米。这些微型化的通道通常用于处理某些小尺寸的样品，并使得可在一个小衬底中构造许多通道，尽管这不是必需的。
通常，通道和腔室可被布置在一个固体衬底(substrate)中。用于固体衬底的合适材料包括但不限于，陶瓷(例如，氧化铝)、半导体(例如，硅或砷化镓)、玻璃、石英、金属(例如，不锈钢或铝)、聚合物(例如，聚碳酸脂、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基硅氧烷(polymethylsiloxine)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚四氟乙烯(特氟纶))以及这些材料的组合。当然，应该意识到的是，也可采用其他许多材料。这些特定材料中，已知某些玻璃、石英和聚合物(例如，PMMA和聚碳酸脂)至少在可见光谱区是基本透明的。这些和其他材料在近红外线或紫外线中的透明度可通过文献获得，或无需进行过度的试验即可容易地确定。这些透明材料可用作衬底。或者，不透明材料也可用作衬底，而透明材料可用作窗口以使相关辐射能够充分透射。适于用作窗口的材料包括前面所提到的透明材料以及其他材料，例如蓝宝石、氟化镁和氟化钙晶体。一个示范性的衬底包括在不锈钢衬底中形成的通道和空腔，该通道和该空腔表面以惰性材料(例如特氟纶)饰面(为了改善化学相容性)，而且由这些或其他透明材料制成的一个或多个透明窗口形成于该腔室中以允许辐射透射进入到该腔室中。或者，该不锈钢衬底可以由合适的玻璃、石英或陶瓷代替，其与样品间应该具有足够的相容性，这可以省去特氟纶涂层。再如另一个实施例，希望使用聚合物来帮助降低制造成本，并利用模塑、热压纹以及其他制造技术。一个示范性的衬底可包括聚二甲基硅氧烷，其包括被模塑或热压在其中的通道和腔室壳体，该腔室壳体中可插入和固定一个或多个窗口和反射镜。
可采用各种微机械加工方法，例如微磨、激光烧蚀和聚焦离子束研磨在陶瓷、玻璃石英、半导体、金属和聚合衬底中形成通道。用于制造微流体通道的方法在下列专利文献中有所描述，例如美国专利5,904,824，6,197,503，6,379,974，6,409,900以及6,425,972。此外，也可采用普遍用于半导体加工领域的光刻蚀刻技术在半导体、石英、玻璃以及某些陶瓷和金属衬底中形成通道。例如，活性等离子体可用于在硅衬底中蚀刻出深度为几百微米、具有光滑竖直侧壁的通道。基于不同化学技术的光刻蚀刻可被类似地用来在聚合材料中形成通道。此外，模塑、注模、冲压、热模压印以及其他方法可被用来在聚合材料和某些金属中形成通道。适于形成通道的其他技术以及关于微制造的进一步背景信息可在“The MEMS Handbook”(ISBN/ISSN0849300770)中得到，其由Mohamed Gad-el-Hak在2001年9月27日出版，包括1-1368页，并且可从University of Notre Dame处得到。
根据本发明实施方式的腔室包含盛装分析样品的谐振空腔、该空腔的至少一个窗口，以及多个反射器(例如，多层介质镜)，其中所述窗口将具有第一频率的第一辐射(例如，来自一个激光器的输入激发辐射)传入该空腔，并将具有第二频率的第二电磁辐射(例如，受激拉曼辐射的输出光束)传出该空腔，所述反射器被固定到腔室壳体上以反射预定频率的辐射(例如，受激辐射)。
参照图2和特定的分析腔250，谐振空腔是在流体通道内的、在反射器(reflector)235与部分反射器(partial reflector)245之间的一个区域。腔室在反射器235，245的最左侧边缘(如图所示)具有入口开口以允许加入样品，在反射器235，245的最右侧边缘(如图所示)具有出口开口以允许移除已分析的样品。样品可连续流过该腔室或在该腔室中停留。或者，该腔室可以位于该通道的尽头并且可以利用共用的入口-出口开口以加入或移除样品。
参考方法100的步骤120(图1)，一旦样品被装在腔室中，该样品就被照射。在图2所示的系统中，源210向该腔室提供输入辐射215，并照射位于其中的样品。合适的源包括相干光源、激光器、发光二极管(LED)、灯以及连接到这样一个辐射源的纤维光缆。提供强单色或准单色辐射的辐射源通常要优于那些提供较弱辐射或广谱辐射的辐射源，因为这种单色辐射有利于相关偏移光谱信号的检测。源210可包括滤光器或单色仪以减少某些频率。该源还可包括透镜、反射镜或其他装置，以使辐射改变方向和聚焦在该腔室上。这些装置可从很多渠道买到，包括列于“The Photonics DirectoryTMThe Photonics Buyers′Guide To Products and Manufacturers”中的厂商。这个目录包括了辐射源、辐射检测器、光谱仪、光谱分析软件以及很多其他附件(例如，透镜、波长选择装置等)的厂商目录。Photonics DirectoryTM可从LaurinPublishing处获得，并且现在可从如下万维网站在线购得www.photonicscom/directory/index.asp。
激光器(由辐射的受激发射造成光放大)可用于提供高强度相干单色光光束，其具有适用于谐振增强拉曼光谱术的波长。有许多合适的不同类型激光器，包括可调谐激光器、气体激光器、固态激光器、半导体激光器、激光二极管、VCSEL(垂直空腔表面发射激光器)以及量子空腔激光器。激光器可用于以适于拉曼光谱术的频率或波长提供辐射，包括在可见光中的——通常在绿光、红光中的，或近红外和紫外的辐射。许多可能感兴趣的分子——包括许多核酸衍生物——的谐振波长发生在紫外光谱中或在紫外光谱附近。例如，腺嘌呤，一种DNA碱基，在大约267纳米(nm，一米的十亿分之一)处具有几乎最大的谐振波长。这样，紫外光谱作为一种激发波长可以提供相当强的信号。将紫外线用作激发辐射的一个潜在缺点是，根据强度的不同它可能会破坏感兴趣的分子，而且在紫外线中可能也具有谐振波长的其他系统成分和化合物可能引起背景噪音。而且，用于紫外线范围的激光器和相关光学装置一般更为昂贵。另一种选择就是使用近红外线的或可见光的激发辐射。与紫外线相比，尽管信号强度可能会稍弱一些，但是背景噪音却相当小，因为大多数材料的谐振波长在这些光谱频率之外。虽然并不要求该激光器为某种特定的激光器，但本发明人使用了一种氩离子激光器来提供波长为大约514纳米的辐射，并发现这种激光器适于分辨DNA核苷酸的拉曼光谱。这种特定的激光器可从SantaClara，California的Coherent Inc和Mountain View，California的Spectra-Physics，Inc处购买到。激光器可以足够的强度工作，从而允许检测该分子并避免对分子造成破坏。作为一个实施例，该激光器可在大约100W至100kW的能量范围内工作，这取决于分子的稳定性。其他合适的激光器包括一种10mW氦氖激光器，其提供波长为633纳米的辐射，一种线性偏振50mW二极管激光器，其提供波长为785纳米的近红外线辐射，以及其他的激光器。
参照图2，该腔室接收从辐射源经由至少一个窗口进入空腔中的输入辐射，这样置于其中的样品便可被照射。所示的特定腔室通过入口窗220来接收所传输的辐射225，该辐射被传输穿过流体通道壁，该入口窗在反射器235，245的左侧边缘处开口到该空腔。该入口窗可以是对于特定激发辐射至少部分透明的空腔壳体的一部分，邻近于反射器的位置，位于反射器之间的空间或缝隙，一部分辐射可以穿过的不完整的或有限的反射器，透镜，光电装置或将辐射限定引导入或引导出该空腔的导波器(例如，光纤材料或耳语廊模式(wispering gallerymode))。合适的光电装置包括激光调节器和普克尔盒(多个普克尔盒)。普克尔盒是一种固态电光学装置，其常被用作Q开关。将电场或其他信号施加到该装置上，以改变或切换该盒的双折射。这允许改变通过该盒的辐射的透过率，并将其切换为开或关。因此，光电装置可以充当窗口，通过应用合适的电流可将其打开或关闭，以使光线通过该装置透射入和/或透射出腔室。光电装置和普克尔盒可从Conoptics，Inc ofDanbury Connecticut以及其他厂商处购得。也应想到的是，可打开和关闭一个实际可活动的遮光器来使光线射入和/或射出腔室。普遍用于MEMS(微机电)装置的铰链元件可被用于该遮光器。
如前文所讨论的，所传输的输入辐射225被引入空腔，一部分的输入辐射或一部分被反射的输入辐射或两者都照射该样品。参见图1的方法100中的步骤130，该辐射中的一部分被样品散射。此处所使用的术语“散射辐射”及类似的术语用于表示和样品物质例如一个分子发生碰撞并被样品物质吸收，并且已被释放或发射的光或其他辐射的光子。大多数的散射光子将被弹性地释放，其中该散射辐射的能量或频率不改变。这种辐射被称为瑞利散射辐射。一些散射光子，通常仅是一小部分，将会被非弹性地释放，其中存在能量交换和频率变化。这些均是公知的现象。斯托克斯散射辐射是指分子损失能量、频率下降的散射，而反斯托克斯散射辐射是指分子获得能量、频率增加的散射。物质对光的这种散射被称为拉曼光谱。图3在概念上示出了瑞利、斯托克斯和反斯托克斯辐射。斯托克斯和反斯托克斯辐射通常具有比瑞利辐射低的强度，并且分别存在于比瑞利辐射低和高的频率中。此处所使用的斯托克斯和反斯托克斯辐射将被共同表示为非弹性散射辐射。
非弹性散射辐射的频率或波长基于样品或其中所含的感兴趣分子的特定特性而发生变化。也就是说，输入辐射和非弹性散射辐射之间频率的差别可以表征该样品。例如，与分子的非弹性碰撞中，散射的光子的频率可以取决于分子的极化、振动、旋转和取向特性。原因可由量子力学解释。简而言之，光子可以将分子从其基础振动状态激发到一个高能或虚振动状态，它可从该高能或虚振动状态通过非弹性散射辐射的发射衰减到低能振动状态，最后衰减到基态。关于这个过程的进一步的背景信息以及其他的振动光谱话题的进一步的背景信息可从″The Handbook of Vibrational Spectroscopy″中获得，John Chalmers和Peter R Griffiths著，由John Wiley & Sons，Ltd出版。在任何情况下，由感兴趣的分子非弹性散射的光的频移所具有的信息包括了分子极化、振动、旋转和取向特性的指纹或信号。
如前文所讨论的，检测或可靠地检测来自溶液中稀释分子的自发散射辐射，通常是困难的或者是不可能的。因此，参见图1方法100中的步骤140，本发明人已经发现了在空腔中谐振辐射的系统和方法，从而进行样品的谐振增强光谱分析。与自发信号相比，谐振信号要强且更易于检测。有优势的是，这可改善精确可靠地检测和鉴定溶液中感兴趣的稀释分子的概率和可靠性。
图2的特定腔室250是一个谐振腔，其含有反射器和部分反射器以将辐射封闭在空腔内并发生谐振，从而提高或放大其强度。非弹性散射辐射可以被谐振，以提高其强度，这有助于检测和鉴定位于该腔室中的样品。反射器可被并入或固定到通道的壳体上，以在该空腔内部反射辐射。被样品非弹性散射的辐射或被反射器235反射的输入辐射225的一部分可以被部分反射器245反射，并在该空腔中发生谐振。平行于反射器法向光轴的未充分反射的辐射的部分可快速离开该腔室。反射器的长度可小于反射器之间的间隔距离，以便快速去除未对准的辐射。这样，除了使某个特定频率或频率范围发生谐振外，该腔室还可有效地选择一个使辐射积聚在该腔中的方向，从而可获得强的相干辐射光束。
空腔可以具有有利于谐振的形状和尺寸。除非特别说明，否则本文所用的术语“谐振”是指腔室中的辐射由于反射而增强，而不要与分子中电子的受激状态相混淆。如图所示，腔室250具有彼此相向地平行放置的反射器，其中心在共同的光轴上，并且相隔特定的预定距离，该距离成比例于或至少基于该腔室中待谐振的辐射的波长，并且其提供入射和反射辐射的相位之间的非相消关系。当反射器之间的距离是辐射场的波长的大约一半的倍数时，分波可以基本上相长地叠加，否则它们很少相长地或相消地叠加。特定反射器的间隔距离可为共振频率的模值(mode)乘以光速，除以填充空腔的介质的折射率，再除以腔室中待谐振的特定辐射的频率所得到的结果的一半。由于相干拉曼光谱可以利用在可见、近红外和紫外区域的激发辐射，并且由于非弹性散射辐射仅仅是激发辐射的偏移，因此空腔可被设计成可使实际上具有可见、紫外和近红外区域中的任何波长的非弹性散射辐射发生谐振，这取决于所期望的特定的激发辐射。激发辐射的具体选择可取决于激光器和检测器的费用、检测器检测特定辐射的能力、感兴趣的分子的谐振和稳定性、不感兴趣的其他吸收分子或物质所导致的错误信号或干扰，等等。
腔室可被设计为使一个感兴趣的分子(例如，一个特定的核苷酸)或一组感兴趣的分子(例如，一组核苷酸)发生非弹性散射辐射。作为一个实施例，考虑图4所示的斯托克斯光谱，它是由514纳米氩离子激光器的激发产生的(其将在下文更加详细地讨论)。最下方的脱氧胸苷单磷酸分子的光谱在大约1350cm-1的斯托克斯拉曼位移处具有一个主峰。这个位移是从514纳米激发辐射的激发波数19455cm-1(即107/514＝19455)偏移，并转换为大约18105cm-1(即，19455-1350)的实际斯托克斯拉曼波数。这对应于552纳米(即，107/18105)的波长。这个斯托克斯散射辐射可以在该腔室中发生谐振，以放大光信号并改善检测。图2所示的特定的反射器可以按照一个距离分隔开，对于这个552纳米的散射辐射，该距离是谐振频率的模值乘以光速除以填充在该空腔中的介质的折射率，再除以在该腔室中要被谐振的特定辐射的频率所得结果的大约一半。作为另一个实施例，该腔室可被设计为使这个辐射波长以及来自其他感兴趣分子的非弹性散射辐射的波长发生谐振。在本发明的一个实施方式中，反射器间的预定距离是与多个感兴趣分子的拉曼光谱中的主峰(参见，例如图4中的峰)相对应的波长的函数。该函数可以是平均、加权平均或其他的组合函数。
反射器235和部分反射器245可以是普遍用于光谱术、激光、光学或纤维光学领域中的多层介质镜、金属镜或其他反射器。多层介质镜的一个实施例是分布布拉格反射镜(DBR)，它是基于干涉的镜结构，其包括一堆或一叠交替的折射率不同的材料构成的层。这些层的厚度可以与要被反射的辐射波长成比例，以致从这些层所反射的波彼此同相并叠加。该反射器可含有交替的由折射率低的材料和折射率高的材料制成的层。介电或绝缘材料常用于这些交替层中的至少一个，而其他层可以是不同的介质材料、非介质材料、半导体或其他材料。介质镜的一个非限制性实施例包括多个交替的硅(Si)层和硅氧化物(例如，二氧化硅，SiO2)层，例如SiO2/Si/SiO2，每个的厚度为被反射的辐射(例如，非弹性散射辐射)的大约四分之一波长(即，1/4波长)。可以添加更多对的交替层以改善反射。为了让反射器235所传输的入射辐射比反射镜245所传输的多，反射镜235的总层数可小于反射镜245的总层数。介质镜的另一个非限制性实施例包括厚度为四分之一波长的砷化镓(GaAs)、应力匹配(stress matched)的SiO2/Si3N4/SiO2三层(交替的介质层)，以及大约1500埃的金。即，该镜包含基于介质干涉的镜以及一个金属镜。文献中有许多其他的多层介质镜的实施例。多层介质镜可获得高的反射效果，其范围通常为大约99-99.9％或更高。这些镜可被用来快速实现好的增益和提高的强度。
多层介质镜可包括厚度与一个感兴趣分子(例如，某个特定的核苷酸)或一组感兴趣分子(例如，一组核苷酸)的非弹性散射辐射的波长成比例的层。例如，这些层的厚度可以是DNA的一组单碱价(monobasic)核酸衍生物的平均反斯托克斯或斯托克斯散射辐射的大约四分之一波长。例如在DNA测序的环境中，这可允许使用单个谐振腔来进行整组衍生物的谐振增强光谱分析，并允许基于从空腔中传输出的谐振增强光束来鉴定该组中某种特定的衍生物，该谐振增强光束含有衍生物的特定频移信息。作为另一个实施例，对于暴露在来自氩离子激光器的5 14纳米辐射中的单磷酸脱氧胸苷分子，这些层的厚度是552纳米斯托克斯散射辐射的大约四分之一波长。其他厚度可用于其他的分子和激发辐射。
多层介质镜可从许多渠道购得或者也可制造得到。SuperMirrorsTM是合适的多层介质镜的示例，其可从Irvine，Califomia的NewportCorporation处购得。可获得SuperMirrorsTM并将其固定到腔室的壳体上。或者，多层介质镜可以通过半导体加工领域中普遍使用的技术制得(参见，例如美国专利6,320,991或6,208,680)。作为另一个实施例，含有Si和SiO2交替层的介质镜可通过半导体加工领域中普遍使用的传统化学气相沉积或物理气相沉积技术来沉积。例如，可采用一种低压化学气相沉积(LPCVD)技术来提供高质量的可控厚度的层。或者，可采用物理气相沉积技术例如蒸发、溅射或分子束外延术来沉积这些层。另一种变化是，可通过化学气相沉积来沉积一个较厚的硅层，可从该硅层进行热生长而获得类似厚度的一个二氧化硅层。当然，也可采用化学和物理沉积技术来沉积其他材料。
或者，反射器和部分反射器可以是金属镜。合适的金属包括，尤其是，铝、金、银、铬以及合金，混合物或其组合。此后，术语“金属”将包括纯金属以及合金，混合物或其组合。合适的金属镜可从Newport Corporation处获得。金属镜也可以通过传统的化学气相沉积和物理气相沉积技术来制得。例如，一个金层可通过分子束外延蒸发沉积被沉积在一个空腔壁上。金属镜可提供的反射率的范围是90-95％或稍高一些，但通常不会高于约99％。
被反射的辐射可在该空腔内谐振，并可激发或引发其他非弹性散射事件。受激事件与自发散射事件相比可以更快地或更高概率地产生，并且非弹性散射辐射的强度可在该腔室中增强，直到达到饱和或平衡，其中因谐振匹配而出现的往返增益(round trip gain)出现损失。可预见的是，可获得高到一百毫瓦数量级的强度。这种谐振增强受激拉曼光谱术可提供一个放大的强的相干频移光束，其允许对甚至是稀释溶液中的一个感兴趣的单个分子进行可能的、精确的和可靠的检测和鉴定。并不要求必须检测单个感兴趣的分子，在其他实施方式中可分析含有任何期望数量的感兴趣分子的样品。
至此，应该意识到的是可对不同类型的样品进行分析。此处所使用的术语“样品”是指单独的或与蒸气、气体、溶液、固体或吸附剂(例如金属粒子或胶质聚合物)一起被分析的一个或多个分子、原子或离子。该样品可包括含有一个或多个感兴趣分子的稀释溶液。实际上任何分子都可是感兴趣的，这取决于具体的实施，例如生物分子、与核酸测序有关的分子、药物、杀虫剂、除草剂、聚合物、污染物或其他。例如在分析与核酸测序有关的感兴趣生物分子的情况下，可分析含有蛋白质、蛋白片段或核酸衍生物的水溶液或其他溶液。术语核酸衍生物指核酸、核酸片段、核苷酸、核苷(例如腺苷、胞苷、鸟苷、胸苷、尿苷)、碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、嘌呤、嘧啶或这些分子中的一个的衍生物。一个示意性样品包括单个核酸衍生物的溶液，该单个核酸衍生物具有从腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中选择的单个碱基。
蛋白质为细胞提供了大量关键的反应、结构和控制。核酸为细胞提供了要合成哪些蛋白质的信息。核酸是由磷酸二酯键连接的核苷酸的线形聚合物。核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。核苷酸由三个部分构成，即一个磷酸根基团、一个戊糖(一种5碳糖分子)以及一个碱基。核苷是不带磷酸根基团的碱基和糖。核苷酸和核苷的碱基是腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。碱基腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤存在于DNA和RNA中，胸腺嘧啶通常只存在于DNA中，而尿嘧啶通常只存在于RNA中。因此，DNA核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷，而RNA核苷包括腺苷、鸟苷、胞啶和尿苷。同样地，DNA核苷酸包括单磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧胞苷、单磷酸脱氧胸苷(或为盐的形式，脱氧腺苷酸盐、脱氧鸟苷酸盐、脱氧胞苷酸盐和脱氧胸苷酸盐)，而RNA核苷酸包括单磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、单磷酸胞苷、单磷酸尿苷(或为盐的形式，腺苷酸盐、鸟苷酸盐、胞苷酸盐和尿苷酸盐)。在RNA中戊糖是核糖，而在DNA戊糖是脱氧核糖。碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶是嘧啶碱，其包含单个含有碳和其他原子-在这种情况下为氮-的杂环。碱基腺嘌呤和鸟嘌呤是嘌呤碱，其包含一对稠合杂环，也含有氮。确定核酸和/或蛋白质序列的能力在医学诊断、疾病治疗和药品发现领域中可具有极大的商业价值。当然，这些只是本发明所开发的系统和方法可分析的几类样品和分子的例子。
继续参见图1的方法100和步骤150，散射辐射在谐振后可以从该腔室中被发射或透射。参照图2，该腔室可包括至少一个窗口以允许辐射射出该腔室并被检测。特定的腔室250含有一个出口窗260，在该特定实例中其包括部分反射器245。该部分反射器是一个不完全的或有限的反射器，其具有足以实现谐振的反射率和足以使入射辐射以可检测水平被透射到检测器290的透光率。反射器235的总反射率可高于部分反射器245，以便在该空腔中提供良好的强度放大，尽管这并不是必需的。在一个实例中，反射器235对于入射激发辐射和非弹性散射辐射可具有高反射率，例如大于约99％(例如，约99.9％)，然而部分反射器245对于非弹性散射辐射可具有足够的透光率，例如透光率不小于约1％(即反射率不大于约99％)。当然也可使用其它替换类型的出口窗，例如并入到空腔壳体的透明材料、普克尔盒、空间、间隙、缝隙、小孔或在反射器235中的其他开口，或遮光器。此外，另一种替换方式是，采用将辐射射入和射出该腔室的单个入口-出口窗。
入射到部分反射器245上的谐振辐射240的至少一部分作为输出辐射285离开该空腔和腔室。该输出辐射包括含有该腔室中样品频移信息的非弹性散射辐射。该输出辐射的强度可取决于该部分反射器的反射率、该腔室的谐振特性，还取决于因吸收、散射和衍射而造成的损失。通常，该腔室将被设计成可以实现高强度的输出辐射，从而能精确地检测和鉴定样品。
再次参见图1中的方法100，在步骤160处检测输出辐射285中的至少一些非弹性散射辐射。电磁辐射检测器290以简化的形式示出，但应得到宽泛的解释。通常，该输出辐射可穿过透镜和波长选择装置。该透镜可收集、引导和聚焦从该腔室中发出的辐射。来自透镜或腔室的光可穿过波长选择装置，该波长选择装置强调、选择、分离或隔离特定的频率或特定的频率范围。该波长选择器可用于使感兴趣的辐射(例如，非弹性散射辐射)与其他辐射(例如，弹性散射辐射和激发辐射)相区别。合适的波长选择装置包括楞镜、单色仪、滤光器(例如，吸收、带通、干涉或傅立叶)、分色滤光器、分色镜以及多路信号分离器。
在来自腔室的辐射穿过任何透镜、波长选择装置以及类似装置之后，可将得到的辐射传送至光谱仪、光学多道分析器(OMA)或其他辐射检测装置。这些辐射检测装置通常会利用光学传感器使接收到的辐射转换成相应的电信号，该电信号俘获并表示了至少一部分的相同信息。示范性的光传感器包括电荷耦合器件(CCD)、光电晶体管、光电倍增管、光电二极管或一个或多个这些装置构成的阵列。
辐射检测装置可包括拉曼光谱仪。光谱仪是公知的用于测定光的波长和强度的辐射检测装置。光谱仪可从多种商业来源购得。一种合适的拉曼光谱仪是购自位于Acton Massachusetts的Acton ResearchCorporation的SpectraPro 300i光谱仪。其它合适的光谱仪是购自位于Ann Arbor，Michigan的Kaiser Optical Systems，Inc(网址www.kosi.com/)的RAMANRXN1分析仪。这一光谱仪采用热电冷却式电荷耦合器件(CCD)阵列来提供对辐射的高灵敏度检测。可选地，该光谱仪还可与作为辐射源的Invictus NIR激光器、SuperNotch滤光器、全息激光器带通滤光器和HoloSpec全息成像光谱摄制仪一起获得。包括它的操作说明在内的该光谱仪进一步的背景信息可从商家获得。当然也可采用其它光谱仪。
经常，光谱仪可产生示出频率或波长对强度的光谱。图4示出了本发明实施方式中，四个DNA核苷酸中每一个的高度稀释水溶液样品的斯托克斯拉曼光谱。为了清楚起见，这四个光谱已沿着垂直的轴排列。光谱从上至下分别是脱氧腺苷单磷酸盐、脱氧胞苷单磷酸盐、脱氧鸟苷单磷酸盐和脱氧胸苷单磷酸盐。对样品进行自发拉曼光谱分析，包括用来自激光器的5 14纳米辐射照射样品，并用拉曼光谱仪检测输出的非弹性散射辐射，从而产生光谱。除了信号在强度上相对较弱之外，该自发光谱应该与谐振增强拉曼光谱基本相似。该图的纵轴示出了任意单位的强度，横轴示出了以厘米倒数为单位的拉曼波长偏移(由激发辐射产生的斯托克斯偏移)。如图所示，每一个光谱具有可鉴定相应核苷酸的独特光谱特征，即主峰或指纹带。最上方光谱的示意性主峰包括1630cm-1，向下紧邻的光谱的示意性主峰包括1440cm-1，从下向上数的第二个光谱的主峰包括800cm-1，而最下方光谱的主峰包括1350cm-1。
最后，参见图1的方法100，在步骤170处可鉴定样品。样品的鉴定方法可以如下通过将检测到的光谱与包含许多已知样品的预定光谱的光谱库相比较，如果测定的光谱与库中相应的预定光谱足够接近，则鉴定样品为已知样品中的一个。由辐射检测器产生的电信号作为输出辐射的结果，可被提供给计算机系统，该计算机系统通过光谱分析指令和文库(如数据库)进行适当编程，这使得可以将以电信号表示的拉曼指纹或信号与文库中的特定指纹或信号相关联。例如，在采用光谱仪的情况下，可使样品的光谱(或其某些谱带)与其它已鉴定的样品的光谱数据进行比较或对比，从而确定这些指纹是否充分相同(即，样品与数据库中已鉴定的样品具有相同特征)。采用拉曼光谱鉴定核苷酸的各种方法在本领域中是已知的(如参见美国专利5,306,403，6,002,471或6,174,677)。可将样品的鉴定结果存储于内存中，进一步分析或用于其它用途。
再次参见图1中的方法100，实施该方法的另一种方式可包括在步骤110处向腔室中加入样品，在步骤120处采用短的和精确已知的脉冲辐射照射该样品，该脉冲辐射的频率或波长和与样品相关的非弹性散射波长基本相同，然后在步骤130-150处分别进行散射、谐振和送出来自该空腔的辐射，之后在步骤160处检测辐射以及腔室中非弹性散射光的衰减时间的某些指征。可采用衰减时间作为鉴定样品的指纹或信号。当然也可考虑其他方法。
图5示出了根据本发明实施方式的光谱分析系统500的剖视图，该系统适于对样品进行谐振增强光谱分析从而鉴定样品。该系统包括辐射源510、衬底505、流体通道570、光谱分析腔550，以及辐射检测器590。将样品530装入腔室内。在衬底内形成通道和腔室并使它们相连接。特定的腔室包括球状谐振空腔、入口窗520、第一、第二、第三和第四曲面反射器535A-D，以及出口窗560。可在通道的入口575处将样品加入到通道中，然后样品流入腔室的空腔内进行光谱分析，然后样品流出腔室并穿过样品出口580。
球状谐振空腔由凹入的表面形成，这可有利于使辐射向空腔的内部反射。术语球状用来指类似于或接近球体的形状，而并非必须是完美的球体。当然，并不要求形状为球状，在其它空腔中，可以仅有一部分的腔室壳体是凹入的(例如，呈球状或抛物线状凹入)，或者空腔可以是柱形空隙(例如，其直径大于流体通道的直径)、多面体空隙、六面体空隙、立方体空隙或其它具有规则或不规则形状的空隙。
该空腔是流体通道中的宽阔区，其具有便于特定实施过程的体积。通常，该空腔的体积不超过约1毫升(mL，千分之一升)。或者，如果较小的空腔是有利的，则空腔可以为体积不超过约1微升(μL，升的百万分之一)的微尺寸空腔或微腔。例如，体积可为约500纳升(nL，升的十亿分之一)、约100nL、约1nL或更小。
引导来自源510的输入激发辐射515穿过衬底，通过入口窗520进入空腔。特定的入口窗520包括位于第二和第三反射器535B-C之间的空腔壳体区域，其对输入辐射515至少是部分透明的。该入口窗可为第二和第三反射器之间的空间，例如为足够透明的衬底的一部分，或第二和第三反射镜之间的部分反射器，或透明材料。至少部分的输入辐射照射到样品，并发生非弹性散射。反射器535A-D通过内部反射将非弹性散射辐射-在这种特定方式中将输入辐射的大部分-限制在腔室内部。通过重新照射样品和再次发生非弹性散射，一些被反射的辐射可进一步激发非弹性散射辐射。在本发明如图8所讨论的另一种方式中，可采用出口窗从空腔中移除输入激发辐射。
输出辐射585穿过出口窗560而离开空腔，其包括至少部分的谐振增强激发的非弹性散射辐射。该出口窗设置在避开输入辐射和其主要反射路径处，从而减少输入辐射透射穿过该出口窗。当然，这并不是必须的，可采用波长选择装置来除去发射的这类辐射。
图6示出了本发明实施方式中球状腔室650的另一种剖视图。该腔室示出了腔室550以及入口窗620或出口窗660的可替换位置676，677，678和679的特征。作为示例，可将出口窗重新设置在676-679之一的位置上，或可将入口窗重新设置在676-679之一的位置上。将样品630放置入腔室内。图6也示出了显示图7A和图7B各自的视图的剖切线7A-7A和7B-7B。
图7A-7B示出了根据本发明的实施方式制造图6中的腔室。图7A示出了沿图6中的剖切线7A-7A的腔室650的顶部俯视图。可在衬底705A内形成腔室650顶部的半球状空隙750A和半柱形空隙770A(柱形通道空隙的一半)。在一个实施例中，采用光刻或蚀刻在石英或玻璃衬底上形成这些空隙750A，770A。可采用带有搅拌的各向异性蚀刻沿着晶体表面进行蚀刻来形成腔室750A的近似球状的凹入表面和通道770A的凹柱状表面。在另一个实施例中，可采用模塑或模压加工，在例如PDMS的聚合材料中形成这些空隙。
半球状空隙750A的内表面包括反射器735B-D(其对应于图6中的反射器635B-D)。随后，可交替沉积数层厚度合适的、具有不同折射率的材料(例如，Si和SiO2)而形成该反射器。沉积物可遍布于整个半球上，在这种情况下可通过除去这些沉积层的一部分而形成部分反射镜，或通过除去所有的这些层而形成透明石英窗口，从而形成了入口窗720和出口窗760。可采用激光烧蚀、蚀刻或用于除去层的其它常规技术而除去这些层。或者，可应用与窗口720和760的大小和位置匹配的一定式样的掩模在非窗口部分上选择性地沉积多层介质镜。在采用DMS聚合物的情况下，可在聚合物中以模塑方式形成蓝宝石、石英或其他透明的窗口，或者对聚合物进行钻孔，以固定方式插入窗口。
图7B示出了沿图6中剖切线7B-7B的腔室650的底视图。如图7A所示，可在诸如硅衬底的衬底705B内形成腔室650底部的半球状空隙750B、半柱形空隙770B和反射器735B。在这些结构形成之后，可采用晶片粘合方式，例如通过其氧化表面的高温融合或通过粘合剂使衬底705A与衬底705B相粘结。
图8示出了本发明实施方式中光谱分析腔850的一个视图，其被设置成可接收调准的源辐射(seed radiation)815B和横向辐射815A形式的输入激发辐射。该输入横向激发辐射可具有合适的频率。该横向辐射的方向与输出辐射885以及谐振的方向垂直交叉。这使得没有照射分子831的那部分横向辐射886可离开腔室。这可有利于检测输出的非弹性散射辐射885。该源辐射通过部分反射器845而进入该腔室内。该源辐射的频率可与由某一特定样品非弹性地散射出的辐射相同，并在样品装入该腔室的情况下能刺激散射。源辐射的方向与输出非弹性散射辐射885的方向是反向的，但成一直线。这使得源辐射可透射过部分反射器而被反射和谐振。该辐射检测器可被设置成可以确定该输出辐射相对于已知强度的输入源辐射在强度上所发生的增益或增加，这种增益或增加可以对受激散射是有贡献的。
因此，请继续参见图1的方法100，在步骤110处照射样品的步骤可包括采用具有不同频率的输入横向辐射和输入源辐射照射样品。同样地，在步骤160处检测辐射的步骤可包括检测相对于源辐射强度的增益。该源辐射频率可在一组对应于不同分子的预定频率中变化，从而确定腔室内的样品是否包含与这些频率中的一个相对应的分子。例如，该源辐射可为腺嘌呤的非弹性散射频率。如果相对于源辐射的增益几乎接近于0，则不存在受激散射，可以推断该样品中不包含腺嘌呤。然后可将源辐射的频率调整至对应于其他核苷酸碱基的频率，直到增益充分地不为0，这表明该样品中可包括该特定的碱基。如果所有的频率均未使得增益充分不为0，则可将该样品移出腔室并另外加入其它样品。
图8中所讨论的源输入辐射和横向输入辐射也可应用于与图5-6中所示系统类似的光谱分析系统。例如，输入的横向激发辐射可穿过窗口620而射入，输入源辐射可可穿过窗口660而射入，而散射辐射可穿过窗口660而射出。可通过位置679处的窗口除去并未照射样品的部分输入横向辐射。
因此，在利用受激拉曼分析的本发明实施方式中，感兴趣的单个分子可放置于谐振腔室中，通过导致谐振增强受激散射事件该谐振腔室能够光学放大非弹性散射受激拉曼辐射的强度，所述谐振增强受激散射事件有助于将信号的强度增加或放大至允许检测和精确鉴定感兴趣的单个分子的程度。作为一个实例，可将感兴趣的单个核酸衍生物放置于具有两个相对的反射器的谐振腔室中。第一反射器对激发辐射和非弹性散射的拉曼辐射都具有高反射率，而第二反射器对激发辐射具有高反射率，对非弹性散射的拉曼辐射具有充足的透光率。在一种方式中，高反射率可大于约99％(例如为99.5％-99.9％)，而充足的透光率可以为不大于99％的反射率。所述两个相对的反射器以足以使非弹性散射的拉曼辐射发生谐振的距离分开。可基于单个核酸衍生物或多个核酸衍生物的非弹性散射的拉曼辐射来确定该距离，从而可采用该腔室来鉴定不同的衍生物。
因此，可采用受激拉曼光谱术对含有感兴趣的单个分子的样品进行分析。除了受激拉曼光谱术之外，其它的合适形式的相干拉曼光谱术是相干反斯托克斯拉曼光谱术(CARS)，其利用了相干反斯托克斯拉曼散射现象。许多其他形式的拉曼光谱术，例如自发拉曼光谱术和表面增强拉曼光谱术(SERS)，涉及随机的和非相干的非弹性散射辐射的自发释放。相反，CARS固有地产生高度方向性的和相干的输出非弹性散射辐射信号。正如在受激拉曼光谱中一样，相干性并非是由于谐振，而是由相位匹配辐射的振幅发生相干增长而提供的。如本文中使用的一样，CARS包括各种方式的CARS，例如随时间分辨CARS、扫描式CARS、OPO CARS、MAD CARS、PARS以及其它。CARS辐射信号的相干性和强度足以允许检测感兴趣的单个分子。CARS输出信号的光谱形状和强度包含样品的光谱特征，可用于鉴定样品。因此，本发明人试图利用CARS来分析和鉴定单个核酸衍生物并进行核酸测序。
CARS是四波混合光谱术。在CARS过程中，采用具有第一波长(w1)的第一辐射以及通常具有第二波长(w2)的第二辐射照射和激发腔室内的样品，从而诱导样品发射具有第三波长(w3)的相干反斯托克斯散射辐射，其中的第一辐射和第二辐射是交叠的和相位匹配的(即在空间和时间上交叠)，而第三波长(w3)与第一频率和第二频率的关系为w3＝2w1-w2。
图9示出了本发明的实施方式中用于分析样品分子的CARS过程的能级图。y轴表示分子的能量，而x轴表示CARS过程的进行。为方便起鉴，尽管实践中通常采用含有至少一个光子但通常是含有许多光子的辐射来分析样品，但这里讨论的对象是涉及一个光子。开始时，采用波长(w1)910的第一光子相干地激发分子，从而导致发射波长(w2)920的第二光子。第一光子通常由送往腔室的激光束脉冲提供，以照射分子。如图所示，第一光子使分子从基础的振动状态950激发到较低的虚态970。发射的第二光子使分子从虚态970降低到较低的激发振动状态960。这一激发振动状态与基础的振动状态的差异由拉曼位移(w4)的振动跃迁表示。分子可通过自发或受激发射而反出第二光子，但CARS中采用相干受激发射。通常，该分子将受另一个同样波长(w2)的光子的影响而引起第二光子的受激发射。受激发射的可能性比自发发射相对更大，且受激发射可能会带来更高的CARS信号强度，这有利于分子的检测和鉴定。通常以具有第二波长(w2)的第二辐射照射腔室，同时伴随第一辐射(第一光子)的照射，从而引起受激发射。
随后以具有波长(w1)930的第三光子照射处于较低激发振动状态960的分子。该光子也可由激光束脉冲的辐射提供。第三光子使分子从激发振动状态960被激发到较高的虚态980。分子振动呈同相振动并相长干涉。该分子发射出具有波长(w3)的第四光子，从而从较高的虚态降至基础振动状态。第四光子的波长为第一和第三光子的波长的两倍减去发射的第二光子的波长(即w3＝2w1-w2)。实质上，CARS不对称地将两个(w1)光子分为一个(w2)光子和另一个(w3)光子。相位匹配条件决定了相干CARS信号的方向。如下文即将讨论的一样，本发明人试图运用光束的各种几何结构，利用这一性质来帮助在空间上从输入的激发光束中分离出相干CARS信号，从而方便分子的检测和鉴别。发射的CARS信号的强度与激发辐射的强度直接有关。
将样品暴露于这些光子的不同方式是本领域已知的。一种方式中，可以用具有波长w1的第一激光束脉冲、具有波长w2的第二激光束脉冲，以及具有波长(w1)的第三激光束脉冲同时照射样品。实践中，第一激光束脉冲也可作为第三激光束脉冲，原因是它们具有相同的波长，(w1)。由多道激光器提供并发的激光束脉冲的电子装置可从商业渠道购得。这类同步电子装置包括购自Coherent(Santa Clara，CA)的SynchroLock，或Spectra-Physics(Mountain View，CA)的Lok-to-Clok。或者，在另一种方式下，可以用具有波长(w1)的激光束连续照射样品，并用具有波长(w2)的激光束脉冲或扫描间歇地照射样品。当(w1-w2)这一差值与样品的分子振动波长如振动位移(w4)基本一致或匹配时，CARS信号的强度通常有显著增强。可针对一定范围的波长(w2)或差值(w1-w2)生成光谱。通常，连续改变、变化或扫描(w2)，而使(w1)固定不变，并同时记录相应的CARS信号。或者，连续改变、变化或扫描(w1)，而使(w2)固定不变，并同时记录相应的CARS信号。在另一种方式中，连续改变、变化或扫描(w1)和(w2)以获得所需的(w1-w2)，并同时记录相应的CARS信号。在一种方式中，在所需的波长范围内用可调式宽带染料激光器扫描。另一种方式涉及采用同时覆盖整个频率范围的宽带斯托克斯激光器。或者，可采用来自光参数振荡器的信号和游走光束(idler beam)来扫描(w1-w2)。
为了CARS过程能够有效地发生，能量和动量守恒必须满足。在CARS过程中，通过振幅的相干叠加而增强输出信号。在CARS四波长混合过程中，经常希望输入激发辐射和输出相干反斯托克斯辐射的矢量符合相位匹配条件，从而获得好的输出相干辐射的强度。所述幅度应该基本是同相的，即调准光束而确保具有波长(w1)的两束输入光波总和与具有波长(w2)和(w3)的输出光波总和之间的相位匹配。当满足相位匹配条件时，输出的反斯托克斯光波的强度应该接近于最大。这导致样品射出或发出相干谐振增强了反斯托克斯散射辐射，其通常是具有预定方向的相干、准直、高度方向性的光束，而不是在自发拉曼光谱术中所预想到的弱的和随机的散射信号。CARS信号的预定方向可允许信号为在几何上或构型上不同于激发辐射的各种构型。
许多现有技术中的相位匹配的光束构型或几何结构在本领域中是已知的，包括共线的CARS几何、BOX CARS几何、Folded BOX CARS几何以及USED CARS几何。这些几何中的任何一种都有被采用的可能。此外，本发明人尝试利用有助于从输入的激发辐射中分离或隔离出CARS辐射信号的构型。图11-13示出了本发明的各种实施方式中激发辐射光束的示范性构型，所述激发辐射光束在相位匹配时可有利于在空间上在辐射检测端处从激发光束中分离和隔离出CARS信号。有利的是，在这些示范性结构中，CARS信号光束在空间上从辐射检测端的激发光束中分离出来，这将有助于样品鉴定。对于具有本领域普通技术水平和受到本发明教导的人员，其它的结构是明显的。
图10示出了本发明实施方式中的交叉光束构型。在该交叉光束构型中，向腔室1050提供输入的第一辐射(w1)和第二辐射(w2)，第一辐射和第二辐射相互呈一定的角度，从而它们照射到腔室内的样品1030，并随后相互分离并与由样品发出的相干反斯托克斯散射辐射(w3)分离。在这一方式中，该构型有利于将输入辐射与输出的相干散射辐射分离开，并可避免选择或过滤波长。该腔室可与本文中公开的其它腔室相类似。该腔室可以是，但无需一定是谐振腔，且可以但无需一定包括反射器或具有有利于谐振的大小或形状。
图11示出了类似于图10所示的交叉光束构型的动量守恒。相位匹配条件决定了相干反斯托克斯辐射的方向。由于四光波混合过程中的能量和动量守恒，对输入的光波和反斯托克斯输出光波的光波矢量强加上相位匹配条件。当充分满足相位匹配条件时，输出的强度接近最大，而相干反斯托克斯光子的方向和动量与激发光子的方向和动量有关。将此示于图11中，其中第一激发波长的两个矢量(2kw1)和第二激发波长的一个矢量(kw2)合并得到相干反斯托克斯辐射的矢量(kw3)，或数学表示为kw3＝2kw1-kw2。这些矢量的长度表示光子的动量。激发辐射方向的构型使得CARS信号光子在几何上可以与输入的激发光子分离开。这可有利于检测发射的CARS光子。
图12示出了根据本发明实施方式的前向散射构型(forward-scattered configuration)。在这一构型中，相干辐射未与输入辐射分离开，可采用波长选择装置，例如滤光器来分离相干辐射。
图13示出了根据本发明实施方式的后向散射(back-scattered)构型。在这一构型中，如同在交叉光束构型中，相干辐射可以与输入辐射分离开。当样品的大小小于激发波长时，这一构型中相干辐射的强度通常可以与前向散射构型中的强度相媲美，尽管在另外一些情况中，可能希望采用前向散射结构和合适的波长选择装置来获得更强的信号。
图14示出了其中可实施本发明的实施方式的核酸测序系统1401。可将核酸提供给采样系统1402。该采样系统可含有酶或其他核酸切割剂(cleavers)以从核酸中取出或得到单个的核酸衍生物。在一个示例中，该系统可包含外切核酸酶，其从链的末端一个一个地移出单个核苷酸，从而使核酸链降解。该采样系统也可包含制备样品的设备，如可在水溶液中稀释核酸衍生物并加入任何添加剂。该样品可加入到光谱分析系统1400，例如通过流体通道1470。该分析系统对样品进行本文中其它地方公开的拉曼光谱分析，从而鉴定核酸衍生物。例如，该分析系统可确定样品是否包含选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和脲嘧啶的单个碱基。可将核酸衍生物的鉴定结果作为输入核酸的有序序列的一部分储存到内存中，作为解决医学问题如诊断或治疗疾病的序列的一部分而加以分析，或者用于其它用途。
在经过一般性描述之后，以下的实施例给出了本发明的特定的具体实施方式
，以解释本发明的一些属性和说明本发明的实践优点，以及使本领域的技术人员能够利用本发明。应该理解，这些实施例理应解释为仅仅是阐释性的。
实施例实施例1利用拉曼检测和纳米粒子进行核酸测序如图15所例示的本发明的某些实施方式，涉及对可以连接到反应腔1501内的固定表面的一个或多个单链核酸分子1509进行测序。该反应腔1501可包含一个或多个外切核酸酶，该外切核酸酶在某一时间内顺次从核酸分子1509未连接的一端移出一个核苷酸1510。
当核苷酸1510被释放出来时，它们可向下移动到微流体通道1502并进入纳米通道1503或微通道1503，经过检测单元。该检测单元可包含发射出激发光束的激发源1506，例如激光器。该激发光束可与释放的核苷酸1510相互作用，从而使电子被激发到较高能态。由电子返回到较低能态而产生的拉曼发射光谱可由拉曼光谱检测器1507，例如光谱仪、单色仪或诸如CCD照相机的电荷耦合器件(CCD)检测得到。
设置激发源1506和检测器1507的位置，使核苷酸1510能受到激发，并在它们通过纳米通道1503或微通道1503中的纳米粒子1511区域时被检测到。该纳米粒子1511可被交联以形成拉曼检测的“热点(hotspots)”。核苷酸1510穿过纳米粒子1511热点，拉曼检测的灵敏度可以增加许多个数量级。或者，可将核苷酸传递进入谐振腔。
反应腔、微流体通道和微通道的制备在等离子体增强的化学气相沉积(PECVD)系统(PEII-A，TechnicsWest，San Jose，CA)中沉积无定型硅牺牲层之前，在浓HF(氢氟酸)中短时间内预先蚀刻浮法硼硅(Borofloat)玻璃晶片(Precision Glass &Optics，Santa Ana，CA)，然后进行清洁。晶片可以用六甲基二硅氮烷(HMDS)打底，用光阻材料(Shipley 1818，Marlborough，Mass)旋转涂覆并进行软烘干。可采用接触型掩模对准器(Quintel Corp.SanJose，CA)使光阻层暴露于一个或多个掩模设计图案下，可采用Microposit显影剂浓缩物(Shipley)和水的混合物除去暴露的光阻材料。显影的晶片可被硬烘干，在PECVD反应器中采用CF4(四氟化碳)等离子体除去暴露的无定型硅。可采用浓HF化学蚀刻晶片而得到反应腔1501、微流体通道1502和微通道1503。可剥离掉剩余的光阻材料，除去无定型硅。
可采用这种方法的一种变体来形成纳米通道1503。可采用标准的光刻法来形成集成芯片的微标度特征。可将光阻材料的薄层涂覆到芯片上。可采用原子力显微镜/扫描穿隧探针尖端从芯片表面除去5到10nm宽的光阻条带。可采用稀释的HF对芯片进行简单蚀刻而在芯片表面形成纳米级凹槽。在本发明的非限定性实施例中，可制备直径为500nm至1μm的通道1503。
可采用金刚石钻头(Crystalite，Westerville，OH)钻入蚀刻的晶片中而形成可连通的孔。在可编程的真空炉(Centurion VPM，J.M.Ney，Yucaipa，CA)中使两块互补的经蚀刻和钻孔的板相互进行热粘合，可制备得到完成了的芯片。制造整合了反应腔1501、微流体通道1502和纳米通道1503或微通道1503的芯片的另一种示范性方法公开于美国专利5,867,266和6,214,246中。可在反应腔1501和微流体通道1502之间插入分子量截值为2,500道尔顿的尼龙滤光器，以防止外切核酸酶和/或核酸1509离开反应腔1501。
制备纳米粒子可按照Lee和Meisel(J.Phys.Chem.863391-3395，1982)的方法制备银纳米粒子1511。而金纳米粒子1511可购自Polysciences，Inc(Warrington，PA)、Nanoprobes，Inc(Yaphank，NY)或Ted-pella Inc(Redding，CA)。在一个非限制性实施例中，可采用60nm的金纳米粒子1511。本领域技术人员应认识到，也可采用其它大小的纳米粒子1511，例如为5、10或20nm。金纳米粒子1511可与链长为5nm到50nm的二硫醇烷烃(alkane dithiols)反应。该连接化合物(linkercompounds)可包括两端都为巯基的链烷，它可与金纳米粒子1511进行反应。可使用相对于连接化合物为过量的纳米粒子1511，将连接化合物缓慢加给纳米粒子1511而避免形成大的纳米粒子聚集体。在室温孵育2小时之后，可在1M蔗糖中通过超速离心法将单个的纳米粒子1511与纳米粒子1511的聚集体分离开。电子显微镜法分析表明，这种方法制备得到的聚集体中每个聚集体包括2到6个纳米粒子。通过微流体流可将聚集的纳米粒子1511装载入微通道1503中。可在微通道1503的末端使用压缩或过滤器，以将纳米粒子聚集体1511保持在适当位置。
制备核酸和外切核酸酶处理可按照Sambrook等(1989)的方法纯化人染色体DNA。在用BamH1消化之后，可将基因组DNA片段插入pBluescriptII噬粒载体(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)的多克隆位点，并在埃希氏大肠杆菌中生长。在平板接种到含有氨苄青霉素的琼脂板上之后，可挑选出单个克隆，并使其生长以用于测序。可通过用辅助噬菌体(helper phage)进行共转染而保住基因组DNA插入物的单链DNA拷贝。在蛋白酶K十二烷基磺酸钠(SDS)的溶液中进行消化之后，可对DNA进行苯酚提取，然后加入乙酸钠(pH 65，约0.3M)和0.8体积的2-丙醇进行沉淀。含有DNA的沉淀球团在Tris-EDTA缓冲液中重悬，在使用前储存于-20℃。
位于基因组DNA插入物附近、与已知的pBluescript序列互补的M13正向引物可购自Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)。可对所述引物进行共价修饰，使其含有连接到该寡核苷酸5’端的生物素部分。该生物素基团可通过(CH2)6间隔物(spacer)与引物的5’-磷酸基团共价连接。生物素标记的引物可被允许与由pBluescript载体制备的单链DNA模板分子进行杂交。可按照Dorre等(Bioimaging 5139-152，1997)的方法将引物-模板复合物连接到被链霉抗生物素蛋白涂覆的珠子上。在合适的DNA稀释浓度，单个的引物-模板复合物连接到单个的珠子上。含有单个引物-模板复合物的珠子可插入到测序装置1500的反应腔1501内。
可采用改性的T7 DNA聚合酶(United States Biochemical Corp，Cleveland，OH)孵育引物-模板。反应混合物可含有未标记的脱氧腺苷-5′-三磷酸(dATP)和脱氧鸟苷-5′-三磷酸(dGTP)、地高辛标记的脱氧尿苷-5′-三磷酸(地高辛-dUTP)和罗丹明标记的脱氧胞苷-5′-三磷酸(罗丹明-dCTP)。聚合反应可在37℃进行2小时。在合成地高辛和罗丹明标记的核酸之后，可将标记的核酸与模板链分离，从反应腔室1501中洗掉模板链、DNA聚合酶和未被整合的核苷酸。或者，用于聚合的所有脱氧核苷都可以是未标记的。在其他替换方案中，在不聚合形成互补链的情况下对单链核酸进行直接测序。
向反应腔室1501中加入外切核酸酶III，启动外切核酸酶的活性。可将反应混合物维持在pH 8.0和37℃。当核苷酸1510从核酸的3′端释放出来时，它们可通过微流体流动向下传送至微流体通道1502。在微通道1503的入口处，可采用由电极对1504，1505产生的电势梯度来驱动核苷酸1510流出微流体通道1502并进入微通道1503。当核苷酸1510穿过纳米粒子1511或进入谐振腔时，它们可被暴露于由激光器1506产生的激发辐射中。可以用下文所述的拉曼检测器1507检测拉曼发射光谱。
核苷酸的拉曼检测可采用实施例2公开的拉曼检测单元。该拉曼检测器1507能检测和鉴定移动穿过检测器1507的dATP、dGTP、罗丹明-dCTP和地高辛-dUTP的单个核苷酸1510。可以汇编和分析标记核苷酸检测在时间进程上的数据，得到核酸序列。在另一种实施方式中，检测器1507能检测和鉴定单个的未标记核苷酸。
实施例2核苷酸的拉曼检测方法和装置在一个非限制性实施例中，拉曼检测单元的激发光束由钛蓝宝石激光器(Coherent生产的Mira)在近红外波长(750-950nm)处或由砷化镓铝二极管激光器(Process Instruments制造的PI-ECL系列)在785nm或830nm处产生。采用脉冲的激光束或连续的激光束。激发光束透过分色镜(Kaiser Optical制造的全息带阻滤波器或Chroma或Omega Optical制造的分色干涉滤波器)而成为与聚集光束的共线几何构型。穿透的光束穿过显微镜物镜(Nikon LU系列)，聚焦到存在有目标分析物(核苷酸或嘌呤或嘧啶碱基)的拉曼活性衬底上或谐振腔中。
由同一显微镜物镜收集来自分析物的拉曼散射光，该拉曼散射光透过分色镜到达拉曼检测器。该拉曼检测器包括聚焦透镜、光谱摄制仪和阵列式检测器。聚焦透镜使拉曼散射光聚焦，穿过光谱摄制仪的入口狭缝。光谱摄制仪(Acton Research)包括使光按照其波长发生色散的光栅。色散光在阵列式检测器(RoperScientific制造的后照射式深损耗CCD照相机)上成像。阵列式检测器连接到控制电路中，而控制电路与用于数据传输和控制检测器功能的计算机相连接。
对于表面增强拉曼光谱(SERS)，拉曼活性衬底由金属涂覆的纳米结构组成。利用Lee和Meisel(J.Phys.Chem，863391，1982)的方法制造大小为5到200nm的银纳米粒子。或者，将样品与金属纳米粒子混合，放置到处于显微镜物镜下的铝衬底上。下列的讨论针对的是铝衬底上的静止样品。由被照射样品的光学收集到的体积和被照射样品的平均浓度来确定被检测分子的数目。
也可通过利用微流体通道的SERS来检测单个的核苷酸。在本发明的各个实施方式中，核苷酸可穿过微流体通道(约5到200μm宽)而被传送到拉曼活性衬底上。可采用Anderson等(“Fabrication oftopologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS byrapid prototyping，”Anal.Chem.723158-3164，2000)的技术，通过模塑聚二甲基硅氧烷(PDMS)制造出微流体通道。在存在银纳米粒子的情况下进行SERS时，将核苷酸、嘌呤或嘧啶分析物与LiCl(最终浓度为90μM)和纳米粒子(银原子最终浓度为0.25M)相混合。使用室温分析物溶液来收集SERS数据。
结果采用上述的系统对单磷酸核苷、嘌呤和嘧啶进行SERS分析。表1示出了各种感兴趣的分析物的示例性检测范围。
表1对单磷酸核苷、嘌呤和嘧啶的SERS检测

仅仅针对腺嘌呤核苷酸作了条件条件。决定采用LiCl(最终浓度90μM)来提供腺嘌呤核苷酸的最优化SERS检测。采用其它的碱金属卤化物盐，如NaCl、KCl、RbCl或CsCl也有利于检测其他核苷酸。所要求保护的方法不限于所采用的电解质溶液，预期也可采用其它类型的电解质溶液，如MgCl2、CaCl2、NaF、KBr、LiI，等等。本领域技术人员应认识到，不显示强的拉曼信号的电解质溶液将对核苷酸的SERS检测产生最小的干扰。这些结果表明，以上公开的拉曼检测系统和方法能检测和鉴定核苷酸和嘌呤碱基的单个分子。这表明了可在单个核苷酸水平上对未标记的核苷酸进行拉曼检测。
实施例3核苷酸、嘌呤和嘧啶的拉曼发射光谱采用实施例2的方法得到感兴趣的各种分析物的拉曼发射光谱，但作了以下指明的修改。图16示出了四个核苷单磷酸中每一个的100mM溶液在缺少表面增强和不带拉曼标记物的情况下的拉曼发射光谱。未向溶液中加入LiCl。所采用的数据收集时间为10秒。在采用更长的收集时间，采用表面增强，采用标记的核苷酸和/或加入电解质溶液的条件下可检测更低浓度的核苷酸。在514nm处发生激发。下列图中的每一个都采用785nm的激发波长。如图16所示，未增强的拉曼光谱示出了四个未标记的核苷单磷酸中的每一个的特征发射峰。
图17示出了鸟嘌呤的1nM溶液在LiCl和银纳米粒子存在的情况下的SERS光谱。鸟嘌呤由dGMP通过酸处理而得到，如Nucleic AcidChemistry，Part 1，L.B.Townsend和R.S.Tipson(eds.)，Wiley-Interscience，New York，1978中所述。使用100毫秒的数据采集时间获得SERS光谱。
图18示出了由dCMP通过酸性水解而得到的10nM胞嘧啶溶液的SERS光谱。使用1秒的收集时间收集数据。
图19示出了由dTMP通过酸性水解而得到的100nM胸腺嘧啶溶液的SERS光谱。使用100毫秒的收集时间收集数据。
图20示出了由dAMP通过酸性水解而得到的100pM腺嘌呤溶液的SERS光谱。使用1秒的收集时间收集数据。
图21示出了dATP的500nM溶液(较低的迹线)和荧光素标记的dATP(较高的迹线)的SERS光谱。dATP-荧光素购自Roche AppliedScience(Indianapolis，IN)。该图示出了由于荧光素标记而导致SERS信号的强增长。
实施例4单个分子的谐振增强拉曼检测这一实施例说明了，可利用各种已知的辐射检测装置来检测谐振腔中单个分子产生的拉曼散射光的能量。这些结果是基于本发明人采用购自Natick，Massachusetts的MathWorks，Inc.的MATLAB进行的模拟。
图22示出了根据本发明的一种实施方式，比较由光谐振腔内部含有的单个分子分别产生的拉曼散射光的能量(曲线A和B)或处于不进行谐振增强的自由空间中的单个分子产生的拉曼散射光的能量(曲线C)的曲线。Y轴表示以焦耳为单位的能量，而x轴表示以秒为单位的时间。
曲线A和B绘制了光谐振腔中存储的拉曼散射光能量与时间的函数关系。对于这两条曲线，光谐振腔能使激发光和拉曼散射光发生谐振，从而提供用于检测的更大谐振增强和更强的信号。在该模拟中所采用的激发光和拉曼散射光的腔室品质因数(cavity quality factor)均为约106。更高的腔室品质因素是本领域已知的。例如，Spillane等在Nature，415621-623(2002)中已经报道了约为109的腔室因数。模拟采用了约为10-29cm2的拉曼截面(cross-section)。所提供的激发光为1W的连续波。时间步长为100纳秒。
采用拉曼增益系数存在很大差异的不同的假设分子来生成曲线A和B。拉曼增益系数基本上量化了分子产生受激拉曼发射的可能性。曲线A是基于具有相对较高的拉曼增益系数约20×10-8cm/W的分子，这对硅是典型的。曲线B是基于拉曼增益系数为0的分子。这样，曲线A和B分别提供了接近包括核酸衍生物在内的大多数分子的受激拉曼行为的上限和下限。在给定的该段时间内产生的累积拉曼散射光的能量绘制在曲线C中。曲线C中无谐振增强。
正如所示出的，从谐振腔中的单个分子产生的拉曼散射光的能量明显高于处于自由空间中的分子的拉曼散射光能量(无谐振增强)。当引起受激拉曼过程时观察到最大的能量(曲线A)。受激拉曼(曲线A)的能量大约比无谐振(曲线C)的能量高出8个数量级。即使在未引起受激拉曼过程的情况下，谐振自发拉曼过程(曲线B)的能量仍然大约比无谐振(曲线C)的能量高出6个数量级。这类可用于检测的能量上的增强是相当明显的。
10-20J处的虚线表明了各种商购的高品质辐射检测装置的典型检测水平。雪崩式光电二极管、光电倍增管以及放大电荷耦合装置通常具有至少这样的灵敏性。在大约100微秒之内，曲线A和B中光谐振腔内产生的拉曼散射光便超出了所指示的检测水平。相反，在无光学谐振(曲线C)的自由空间中的分子的拉曼散射光的能量在1秒钟过后仍然低于检测水平。
因此，如这些模拟所表明的，可采用各种已知的辐射检测装置来检测由谐振腔中单个分子产生的拉曼散射光的能量。值得注意的是，这对于自发拉曼(曲线B)和受激拉曼(曲线A)都是成立的。
实施例5对多个分子的谐振增强拉曼检测这一预期的实施例说明了如何采用多个分子而不是单个分子获得比实施例4中的报道更高的检测能量。在这个方法中，可将多个分子引入谐振腔。例如，将至少100个或至少1000个分子引入谐振腔。在一种方式中，可引入足量的分子，可采用所需的辐射检测装置检测特定类型的分子。为有利于鉴定，包括多数或绝大多数的同一类型分子是恰当的。
对谐振腔每个额外的分子来说，总检测能量通常都会增加。因此，每个额外分子应进一步增加谐振腔中的拉曼散射光的总能量。通常，在分子数量较少时，谐振腔中产生的拉曼散射光的总能量在开始时可基本呈线性增加，而分子数目更多时，则呈更剧烈(非线性)的增长。因此，可使用多个分子以提供更强的拉曼发射信号。
因此，本发明公开了光谱分析腔和在这些腔室内分析样品的方法。尽管本发明以几个实施方式的形式公开，本领域的技术人员将认识到本发明并不限于所述的实施方式，可在权利要求书的精神和范围内加以修饰和改变而实践本发明。应该认识到本发明的部件的最佳空间关系，包括大小、材料、形态、功能和工作方式、装配和使用对本领域普通技术人员都是明显的，附图中所示和说明书中所述的关系的等价关系都包含在本发明的范围内。因此说明书应理解为阐释性而非限制件的。
权利要求
1.一种方法，包括利用拉曼光谱术在谐振光谱分析腔中对含有感兴趣的单个分子的样品进行分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该分析包括采用受激拉曼光谱术进行分析。
3.根据权利要求2所述的方法，其中该分析包括对溶液中含有单个核酸衍生物的样品进行分析。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括在该分析的基础上鉴定该核酸衍生物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中该分析包括在微尺寸的光谱分析腔中进行分析；并且进一步包括通过使该样品穿过微尺寸的流体通道而流入光谱分析腔中，来向该腔室加入样品。
6.一种方法，包括向微尺寸的谐振光谱分析腔中加入在溶液中的含有感兴趣分子的样品；通过使该光谱分析腔内的非弹性散射辐射发生谐振来用谐振增强拉曼光谱术对样品进行分析；在该分析的基础上鉴定该样品。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该感兴趣的分子包括单个的核酸衍生物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该分析包括采用受激拉曼光谱术进行分析。
9.一种方法，包括照射谐振腔中含有感兴趣的单个分子的样品；使来自样品的辐射发生散射；在该腔室中使该散射辐射发生谐振；从该腔室发射出散射辐射；以及检测发出的散射辐射。
10.根据权利要求9所述的方法其中散射包括使来自分子的辐射发生非弹性散射；其中谐振包括采用多层介质镜反射该非弹性散射辐射，该多层介质镜包含其厚度基于分子的非弹性散射辐射的波长的层；进一步包括通过利用被反射的非弹性散射辐射照射该样品而激发额外的非弹性散射辐射；以及其中发射出散射辐射包括使该受激的非弹性散射辐射透射穿过部分反射器。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该感兴趣的单个分子包括核酸衍生物。
12.根据权利要求9所述的方法，进一步包括通过用被谐振的辐射照射该样品而激发额外的非弹性散射辐射。
13.根据权利要求9所述的方法，其中照射样品包括采用具有第一频率的第一辐射和具有第二频率的第二辐射照射该样品。
14.根据权利要求9所述的方法，进一步包括在检测到的非弹性散射辐射的基础上鉴定该样品。
15.分析腔系统，包括谐振空腔，其可以盛放用于分析的样品；开向该空腔的至少一个窗口，其可以将具有第一频率的第一电磁辐射传送入该空腔和将具有第二频率的第二电磁辐射传送出该空腔；以及固定在该空腔壳体上的多个反射器，其可以反射具有预定频率的辐射，所述多个反射器以足以使该预定频率的辐射发生谐振的距离分开。
16.根据权利要求15所述的系统，其中该空腔包括包含在固体衬底内的微尺寸空腔；该微尺寸空腔具有不大于1微升的体积；以及该空腔与微尺寸的流体通道相连接，从而可以接收用于分析的样品。
17.根据权利要求15所述的系统，其中所述的至少一个窗口包括多个反射器中的一个部分反射器，其可以将第二电磁辐射传送出该空腔。
18.根据权利要求15所述的系统，其中所述的多个反射器包括反射器和部分反射器，该反射器对第一和第二辐射的反射率高于99％，而该部分反射器对第二辐射的反射率不高于99％。
19.根据权利要求15所述的系统，其中所述的多个反射器包括多层介质镜；以及所述第二辐射包括非弹性散射的拉曼辐射。
20.根据权利要求15所述的系统，进一步包括包含在该空腔内的样品，该样品包括溶液中的单个核酸衍生物，该核酸衍生物包含选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的单个碱基。
21.光谱分析系统，包括电磁辐射源，其可提供第一电磁辐射；光谱分析腔，包括谐振空腔，其可盛装用于分析的样品，开向该空腔的至少一个窗口，其可以将第一电磁辐射传送入该空腔和将第二电磁辐射传送出该空腔，和固定在该空腔壳体上的多个反射器，其可以反射具有预定频率的辐射，所述多个反射器以足以使该预定频率的辐射发生谐振的距离分开设置；电磁辐射检测器，其可以检测第二电磁辐射。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述第一电磁辐射包括适合于拉曼光谱术的辐射；所述空腔包括包含在固体衬底内的、体积不大于1微升的微尺寸空腔；所述空腔和微尺寸的流体通道相连接，从而可以接收用于分析的样品；以及所述多个反射器包括对第二辐射的反射率高于99％的第一多层介质镜，以及对第二辐射的反射率不高于99％的第二多层介质镜；以及所述第二辐射包括这样的辐射，基于与样品的非弹性相互作用，其具有的频率相对于第一辐射的频率发生了偏移。
23.根据权利要求21所述的系统，进一步包括含有该分析系统的核酸测序系统，所述核酸测序系统包括采样系统，其可以向该分析系统提供样品；以及处于该空腔内的样品，该样品包括在溶液中的单个核酸衍生物，所述核酸衍生物包含选自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的单个碱基。
24.一种方法，包括采用相干拉曼光谱术对含有感兴趣的单个分子的样品进行分析。
25.根据权利要求24所述的方法，其中该相干拉曼光谱术选自受激拉曼光谱术和相干反斯托克斯拉曼光谱术。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述分析包括采用相干反斯托克斯拉曼光谱术对单个核酸衍生物进行分析。
27.根据权利要求26所述的方法，其中采用相干反斯托克斯拉曼光谱术进行分析包括采用具有第一波长的第一辐射和具有第二波长的第二辐射照射核酸衍生物，其中该第一和第二辐射基本上是相位匹配的；随后采用具有第一波长的第三辐射照射该核酸衍生物；以及在第三辐射的照射之后检测由该核酸衍生物发射的第四辐射，该第四辐射含有具有预定方向和第三波长的相干光束，所述第三波长与第一和第二波长有关。
28.根据权利要求26所述的方法，进一步包括在该分析的基础上鉴定该核酸衍生物。
29.根据权利要求27所述的方法，进一步包括在几何学上将第一和第二辐射与第四辐射分离开。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述的几何学上的分离包括采用来自预定方向的第一、第二和第三辐射的光束照射核酸衍生物，这允许光束的光子遵循动量守恒被合并，从而导致核酸衍生物按照预定的方向发射光子。
31.一种方法，包括采用拉曼光谱术在谐振光谱分析腔中对多个感兴趣的分子进行分析。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述分析包括通过使腔内的非弹性散射辐射发生谐振来利用谐振增强拉曼光谱术对样品进行分析。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述分析包括采用受激拉曼光谱术进行分析。
34.根据权利要求33所述的方法，其中该样品包括核酸衍生物。
35.根据权利要求34所述的方法，进一步包括在该分析的基础上鉴定该核酸衍生物。
全文摘要
公开了用于分析样品的光谱分析系统和方法。分析系统可包含提供辐射的电磁辐射源、产生相干拉曼光谱(如受激拉曼或相干反斯托克斯拉曼光谱)的光谱分析腔，以及检测基于该光谱术的辐射的辐射检测器。光谱分析腔可具有盛放分析样品的谐振腔、将第一辐射传送至腔室内而将第二辐射传送出空腔的至少一个空腔窗口、固定在腔室壳体上可以反射预定频率的辐射的多个反射器，所述多个反射器以足以使辐射发生谐振的距离分开。该光谱分析系统可与核酸测序系统相连接，可以接收溶液中的单个核酸衍生物，并鉴定该衍生物而对核酸进行测序。
文档编号G01N21/05GK1685217SQ03823371
公开日2005年10月19日 申请日期2003年9月30日 优先权日2002年9月30日
发明者A·伯林, C·格斯, T-W·丘 申请人:英特尔公司