专利名称：基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物样品的制备方法，特别涉及的是一种基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
20世纪80年代原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)发明以后，它在生物领域中的应用也越来越多，其中有不少是利用AFM来观察生物样品超薄切片的精细结构。较早的文献见之于“Imaging of the Surface Structures of EponThin Sections Created with a Glass Knife and a Diamond Knife by the Atomic ForceMicroscope”(Amako K，Takade A，Umeda A et al.J Electron Microsc.1993，42(1993)121-123)、“Atomic force microscopy of embedment-free sections of cellsand tissues”(Ushiki T，Shigeno M & Abe K.Arch Histol Cytol.1994，57(1994)427-432)，他们尝试利用AFM来观察供透射电镜用的超薄切片，获得了一些细胞和组织的初步AFM图像，如采用金刚石刀和玻璃刀分别对包埋块进行切片，并比较两者的差别；采用脱树脂的办法试图暴露超薄切片表面的细胞结构，但他们得到的图像分辨率都不是很高。近些年来不少研究者在这方面有了改进，获得了一些细胞内的超微结构图像，如“Atomic force microscopy ofhistological sections using a new electron beam etching method”(Osada T，ArakawaH，Ichikawa M et al.J Microsc.189(1998)43-49)、“Morphological study of thehealthy human culomotor nerve by atomic force microscopy”(Melling M，Karimian-Teherani D，Behnam M et al.NeuroImage 20(2003)795-801)等。但这些文献中提到的利用AFM观察生物样品超薄切片的制样方法，仍是沿用电镜超薄切片法，典型的步骤如戊二醛、四氧化锇双固定，从低浓度到高浓度的乙醇梯度脱水，渐次提高渗透液比例的逐级渗透等等都是照搬透射电子显微镜生物样品的制备方法。事实上，为了电镜研究发展而来的这套方法对于AFM研究生物样品的精细结构未必是最合适的，其中存在着不少的问题，例如(1)四氧化锇不能提高AFM图像的反差，并且昂贵，有一定毒性；(2)四氧化锇与乙醇、戊二醛能发生氧化还原反应而产生沉淀，对AFM观察细胞的超微结构有不利影响；(3)这套方法步骤较为繁琐，耗时颇长，一般技术人员需要经专业训练才能掌握，不适宜推广使用。因此，发展一种适合于AFM观察的生物样品包埋块的制备方法很有必要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法，步骤较为简洁，成本低廉，所得的图像分辨率不受影响，更适合于AFM使用。
为实现这样的目的，本发明利用2％戊二醛固定液对生物样品进行低温固定，0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗后，按照50％→70％→95％→无水乙醇→绝对乙醇的乙醇梯度进行脱水。环氧树脂618渗透并包埋，加热温度和时间为35℃12小时→45℃12小时→60℃24小时。从而获得了适合于AFM观察的生物样品包埋块。
本发明的方法包括如下步骤1、将生物样品用冰水预冷却的质量百分比为2％的戊二醛固定液低温固定1～2小时。固定液配方为0.2mol/L磷酸缓冲液50ml，质量百分比为25％的戊二醛水溶液8ml，加超纯水至100ml，事先置冰水浴中冷却备用。
所述生物样品如果是组织样品，且取的是脑、脊髓等对缺氧极敏感的组织，可以用血管灌流法，事先用固定液灌流固定，再取出所需组织，放入装有预冷的固定液的盘内，切成小于2mm见方的立方体小块，然后立即用冰水浴冷却的质量百分比为2％的戊二醛固定液固定1～2小时。一般组织可以在动物处死后立即取材，以保证所取的材料尽量在生活状态，整个操作要在半分钟内完成。如果是细胞样品，先倒去培养液，加入0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗几次，再加入预冷的2％戊二醛固定液，低温固定1小时，轻轻刮下细胞，离心收集到成团的细胞团块即可进行后续的操作。
2、将样品用冰水预冷的0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗两次后，将样品依次转入质量百分比为50％的乙醇→70％乙醇→95％乙醇→无水乙醇→绝对乙醇，进行乙醇梯度脱水，每次10～15分钟。其中，无水乙醇和绝对乙醇要分别各换一次，50％和70％乙醇水溶液需要事先用冰水预冷，其它浓度的脱水可在室温下进行。
通常市售的无水乙醇含有微量水分，为此在无水乙醇中加入烤干的无水硫酸铜或无水硫酸钠，吸去水分，或必要时将无水乙醇重新蒸馏除去水分，以制得所谓的“绝对”乙醇。
3、样品脱水完后，直接转入环氧树脂618混合液∶绝对乙醇＝1∶1的体积比的液体中并置摇床上渗透1～2小时，然后将此液倒去，用滤纸吸去残余，随后加入环氧树脂618混合液，置35℃的温箱中渗透3～5小时。中间晃动几次，以利于渗透完全。环氧树脂618混合液配方为环氧树脂618∶十二烷基琥珀酸酐(DDSA)∶甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐(MNA)∶2，4，6-二甲氨基甲基苯酚(DMP-30)＝4∶1∶3∶0.2，该比例为体积比。
4、将样品挑出，滤纸吸去残余，用环氧树脂618混合液把组织块包埋在预先干燥过的胶囊或包埋板中，然后置烘箱中加热聚合，聚合温度和时间为35℃12小时，45℃12小时，60℃24小时，得到所需的生物样品包埋块。
本发明方法中，样品经冰水浴冷却的戊二醛固定液固定之后，无需进行四氧化锇(OsO4)的后固定，采用乙醇进行梯度脱水，无需块染，并且无需使用环氧丙烷过渡，方法步骤较为简单，使用的试剂常见、价格便宜且无毒，与一般供电镜观察的包埋块制备步骤相比，无需昂贵的锇酸固定，省去了一些对保存精细结构和提高分辨率无关的步骤，使得整体的制样时间大为缩短，成本低廉，适合各种动物组织和细胞样品。
图1为本发明实施例1中制备的样品在原子力显微镜空气中观察的图像。
图2为本发明实施例2中制备的样品在原子力显微镜空气中观察的图像。
图3为本发明实施例3中制备的样品在原子力显微镜空气中观察的图像。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实施例1人舌鳞状细胞癌组织样品取自某医院口腔颌面外科临床手术，切成小于2mm见方的小块后，以冰水预冷的2％戊二醛固定液固定2小时。固定液配方为0.2mol/L磷酸缓冲液50ml，25％戊二醛水溶液8ml，加超纯水至100ml，事先置冰水浴中冷却备用。然后用0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗两次，再进行乙醇梯度脱水，脱水过程如下在冷冻条件下(0℃～4℃)，50％乙醇水溶液、15分钟，70％乙醇水溶液、15分钟，在室温条件下，95％乙醇水溶液、15分钟，无水乙醇更换一次、每次10分钟，绝对乙醇更换一次、每次10分钟。
样品脱水完后，直接转入环氧树脂618混合液∶绝对乙醇＝1∶1的体积比的渗透液中并置摇床上渗透2小时，然后将此液倒去，用滤纸吸去残余，随后加入环氧树脂618混合液，置35℃的温箱中渗透5小时。中间晃动几次，以利于渗透完全。其中环氧树脂618混合液配方为环氧树脂618∶十二烷基琥珀酸酐∶甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐∶2，4，6-二甲氨基甲基苯酚＝4∶1∶3∶0.2，该比例为体积比。将样品挑出后，用滤纸小心吸去残余液体，再用环氧树脂618混合液进行包埋。放入烘箱中加热聚合，在35℃温度下加热12小时，在45℃温度下加热12小时，在60℃温度下加热24小时，得到所需的生物样品包埋块。
将所得的包埋块切片后转移到云母片上置AFM轻敲模式下观察。所得图像见图1视野中可见呈分裂相的细胞核，核内染色质活跃，相对细胞质较少，核质比大，细胞形态异常，这些都是肿瘤细胞的典型特征。扫描范围30μm×30μm。
实施例2将C6细胞培养后倒去培养液，先用0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗两次，再加入冰水预冷的2％戊二醛固定液低温固定1小时，离心后得到的细胞团用乙醇溶液进行梯度脱水，依次为50％→70％→95％→无水乙醇→绝对乙醇，每次10分钟，其中无水乙醇和绝对乙醇分别要更换一次，50％和70％的乙醇需要冰水预冷并在低温下进行脱水。样品脱水完后，直接转入环氧树脂618混合液∶绝对乙醇＝1∶1的体积比的液体中并置摇床上渗透1小时，然后倒去该液体，用滤纸吸干残余，随后加入环氧树脂618混合液，置35℃的温箱中渗透3小时。中间晃动几次，以利于渗透完全。将样品挑出，用滤纸小心吸去残余混合液，用环氧树脂618混合液包埋于塑料包埋板中。然后加热聚合，加热温度和时间为35℃12小时，45℃12小时，60℃24小时。得到的样品包埋块切片后贴附在云母表面。AFM接触模式下成像。所得图像见图2。
图2所显示的是若干肿瘤细胞，示细胞内巨大的核，膜结构清晰，可见核仁，近核区域细胞器丰富，细胞外的平整区域为环氧树脂。扫描范围30μm×30μm。
实施例3Tca8113细胞培养后，弃培养液，用0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗后，加入冰水预冷的2％戊二醛固定液低温固定1.5小时，离心后得到的细胞团用乙醇溶液进行梯度脱水，依次为50％→70％→95％→无水乙醇→绝对乙醇，每次12分钟，无水和绝对乙醇分别更换一次，50％和70％的乙醇需要冰水预冷并在低温下进行脱水。样品脱水完后，直接使用环氧树脂618混合液∶绝对乙醇＝1∶1的体积比的液体中置摇床上渗透1.5小时，然后将该液倒去，用滤纸吸去残余，随后加入环氧树脂618混合液，置35℃的温箱中渗透3.5小时。将样品从中挑出，用滤纸小心吸去残余，用环氧树脂618混合液进行包埋。然后进行加热聚合，加热温度和时间为35℃12小时，45℃12小时，60℃24小时。得到的样品包埋块切片后贴附在云母表面。AFM接触模式下成像。所得图像见图3膜结构清晰，核仁完整，与Osada、Melling等使用的制样方法相比，分辨水平相似，局部胞内的超微结构甚至更为清晰。扫描范围30μm×30μm。
权利要求
1.一种基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法，其特征在于包括如下步骤1)将生物样品用冰水预冷却的质量百分比为2％的戊二醛固定液低温固定1～2小时；2)将样品用冰水预冷的0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗两次后，依次转入质量百分比为50％的乙醇、70％乙醇、95％乙醇、无水乙醇及绝对乙醇，进行乙醇梯度脱水，每次10～15分钟，其中，无水乙醇和绝对乙醇分别各换一次，50％和70％乙醇水溶液需要事先用冰水预冷；3)样品脱水后直接转入环氧树脂618混合液∶绝对乙醇＝1∶1的体积比的液体中并置摇床上渗透1～2小时，然后将此液倒去，加入环氧树脂618混合液，置35℃的温箱中渗透3～5小时；其中环氧树脂618混合液配方为环氧树脂618∶十二烷基琥珀酸酐∶甲基内次甲基四氢邻苯二甲酸酐∶2，4，6-二甲氨基甲基苯酚＝4∶1∶3∶0.2，该比例为体积比；4)将样品挑出，用环氧树脂618混合液进行包埋，然后加热聚合，聚合温度和时间为35℃12小时，45℃12小时，60℃24小时，得到所需的生物样品包埋块。
2.权利要求1的基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法，其特征在于所述固定液采用0.2mol/L磷酸缓冲液50ml，质量百分比为25％的戊二醛水溶液8ml，加超纯水至100ml配制而成。
3.权利要求1的基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法，其特征在于所述生物样品为切成小于2mm见方小块的组织样品。
4.权利要求1的基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法，其特征在于所述生物样品为经0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗后的细胞样品。
全文摘要
一种基于原子力显微镜观察的生物样品包埋块的制备方法，属于生物工程技术领域。利用2％戊二醛固定液对生物组织样品或细胞样品等进行低温固定，经0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗后，按照50％→70％→95％→无水乙醇→绝对乙醇的乙醇梯度进行脱水，经环氧树脂618渗透后进行包埋，然后加热聚合，加热温度和时间为35℃12小时→45℃12小时→60℃24小时。从而获得了适合于原子力显微镜观察的生物样品包埋块。本发明方法步骤较为简单，所用试剂多为国产，易得且价格低廉，适合各种动物组织和细胞样品的包埋块制作。
文档编号G01N1/44GK1587959SQ20041006658
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月23日 优先权日2004年9月23日
发明者李鑫辉, 季彤, 胡晓芳, 刘苹, 张晓东, 胡钧 申请人:上海交通大学