确定NT－proBNP的分析夹心测试的制作方法

专利名称：确定NT－proBNP的分析夹心测试的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分析夹心测试，特别是一种测试元件，尤其是一种利用夹心原理测定N-末端前脑钠尿肽(NT-proBNP)的呈免疫层析测试条。
NT-proBNP是一种用于诊断和控制心力衰竭的非常有前途的标志物。例如，在WO0045176中的1至4页综述了心力衰竭及NT-proBNP作为心脏病标志物的重要性，给出了作为标志物的实施例，WO0045176在此详细的作为参考。此外，文献US5786163、US6461828、US6117644、EP1151304、WO02083913以及申请日为2003年12月5日的EP专利申请号030105910.0(Klemt等)均涉及NT-proBNP及其抗体和检测方法。
目前，体外诊断市场中唯一可利用的NT-proBNP测试为Roche诊断公司的基于夹心反应及电化学发光检测原理的全自动ElecsysNT-proBNP检测。该检测被设计用于大规模中心实验室，并且为了进行测试，除了须精确计量的液体试剂之外，还需要相对复杂的仪器来定量液体和检测发光信号。目前市场上还没有使用简单的、仅通过显色而无需采用评估仪器的快速检测(如果需要的话)NT-proBNP的方法。
免疫可检测物质的快速检测长期以来已知存在许多不同的参数，例如参见WO9706439、EP0291194、US5591645、US4861711、US5141850、US6506612、US5458852、US5073484。在这些文献中的免疫检测试剂(主要是标记或未标记的抗体或抗原)通常是以存在于载体上的干燥形式提供的，该载体允许样品液体(特别是体液，例如血液、血清、血浆、尿、唾液等)转移至或进入载体中。基于该目的，所述载体优选具有毛细管的效果，例如具有毛细管通道的膜或塑料载体。业内专家通常称其为免疫层析测试条或测试装置。
在患有急性呼吸窘迫症的病人中，尽可能地快速进行NT-proBNP测定有利于排除或诊断心力衰竭作为呼吸窘迫症的原因从而进行正确的治疗。由于ElecsysNT-proBNP检测仅能在中心实验室中进行，从而很难在常规时间以外快速地测定NT-proBNP。因此，如果具有能在常规时间以外能在紧急病房中直接进行快速的检测将对紧急病房十分有利。不过，这种快速检测必须保证具有与中心实验室的参考方法(ElecsysNT-proBNP)相同的参考范围和截止值，从而保证不依赖于具体进行的检测类型的结果的较好的可比性。
用于ElecsysNT-proBNP检测的多克隆抗体(PAB)是NT-proBNP的一种非常特别的部分(“天然”NT-proBNP；参见Klemt等的申请日为2003年12月5日的EP专利申请号030105910.0；根据该文献，测试识别了包括1-21(AA 1-21)和39-50(AA 39-50)位氨基酸的NT-proBNP的表位)。然而，已经证实，这些多克隆抗体不适用于采用颗粒标记例如胶体金作为标记物的NT-proBNP快速检测，因为由于快速检测的组分之间(例如载体物质、基质等)的物理化学相互作用，这类抗体在信号产生方面显示出非常不理想的可变性。这导致在不同的批次间测试效果具有相当大的波动性。
因此，本发明的目的是克服现有技术中存在的缺陷。特别是，本发明的目的是提供一种测定NT-proBNP的快速测试，其能重复生产并与实验方法存在良好的关联。
该目标由本发明的主题内容实现了。
本发明涉及一种免疫测试，尤其是快速检测的形式，例如如在专利的独立权利要求中所表征的分析测试元件。在从属权利要求中描述了优选实施例。
用于在夹心方式中进行免疫测试的本发明的方案以及特别是与Elecsys参考方法十分相关的快速检测采用了一种包括至少两个抗NT-proBNP的抗体的特定抗体的组合，其中至少一个抗体为多克隆抗体(PAB)。根据本发明的另一夹心测试抗体可以是MAB或是多克隆抗体(PAB)。在这种联系中，这些抗体(缩写为AB)之一至少靶向包括38至50氨基酸的NT-proBNP表位部分(如下简写为AB(38-50)或MAB(38-50)或PAB(38-50))。至少有一个另外的抗体至少作用于包括1至37或43至76氨基酸(如下简写为AB(1-37)或AB(43-76)或MAB(1-37)或MAB(43-76)或PAB(1-37)或PAB(43-76))的NT-proBNP的表位部分。被抗体识别的表位可以稍微重叠，优选重叠少于5个氨基酸，尤其优选少于2个氨基酸。
一种抗体的组合优选地包括至少一种抗NT-proBNP的多克隆抗体(PAB)和一种单克隆抗体(MAB)(也称为PAB/MAB组合)。
本发明中采用的术语PAB(X-Y)表示一种多克隆抗体，其靶向包括X到Y位的氨基酸的NT-proBNP表位。MAB(X-Y)是一种相应的单克隆抗体。AB(X-Y)一般表示一种靶向包括X到Y位氨基酸的NT-proBNP表位的抗体。
MABa.b.c(X-Y)为一种靶向包括X至Y位氨基酸的NT-proBNP表位的单克隆抗体，其来源于保藏的细胞系a.b.c.。
为了保证抗体一标记缀合物的可重现的质量，优选MAB被固定于颗粒标记物上，特别是金标记物上。
其他合适的颗粒标记物为例如彩色的乳胶、其他的金属溶胶标记物、聚合物标记物或半导体纳米微晶体(也称为量子点)。MAB-标记缀合物优选地以可经样品液体作用而分离的方式存在于快速检测装置中，例如经浸渍合适的载体介质如羊毛状覆盖物、膜等的方式。不过，也可以将MAB-标记的缀合物作为溶液添加至快速检测装置中。
优选地，来源于免疫哺乳动物，尤其是绵羊、山羊或兔子的PAB优选地作为生物素衍生物存在于快速检测系统中，并且可以与抗生物素蛋白或链霉亲和素检测线相连。不过，也可以直接将PAB固定于快速检测装置中，例如以存在于合适的层析膜上的检测线的形式。
根据本发明，也可以采用，虽然不是那么优选，溶于溶液中的标记的AB，特别是标记的MAB，和第二抗体，特别是第二抗MAB或PAB用于快速检测。一种可捕获适当标记的AB的结合伙伴位于测试装置的检测区，从而可以将包括第一抗体、被分析物和第二抗体的夹心复合体结合至快速检测系统的固相上。
如本发明中所采用的MAB无需必须识别在参考系统(Elecsys测试)中检测出的表位(AA 1-21)从而保证与参考测试的良好地关联权利要求1中提到的抗体组合，尤其是MAB/PAB组合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)与采用抗NT-proBNP的AA 1-21和AA 39-50表位的多克隆抗体(PAB(1-21)和PAB(39-50))的Elecsys参考系统关联性很好。
采用本领域熟练技术人员已知的方法，特别是参照WO0045176的实施例2的方法可以获得、定性和鉴定多克隆抗体如PAB(1-21)和PAB(39-50)。
采用本领域熟练技术人员已知的方法，特别是参照WO0045176的实施例3或申请日为2003年12月5日的EP专利申请号030105910.0(Klemt等)中的方法可以获得、定性和鉴定单克隆抗体如MAB(38-42)和MAB(44-50)。
通过本领域熟练技术人员已知的方法(同时也参照WO0045176的实施例2和Klemt等的申请日为2003年12月5日的EP专利申请号030105910.0)，采用如金或其他标记物、生物素等来标记抗体。例如在EP-A0898170中详细描述了采用金标记的过程。
特别是可以根据Klemt等的申请日为2003年12月5日的EP专利申请号030105910.0实施例3的记载来获得优选的单克隆抗体MAB17.3.1(13-16)、MAB 16.1.39(38-42)、MAB 18.29.23(64-67)和MAB18.4.34(27-31)。相应的细胞系保藏于“Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSZM)”(保存编号和日期为MAB 17.3.1(13-16)为DSM ACC2591(2003/05/07)；MAB 16.1.39(38-42)为 DSM ACC2590(2003/05/07)；MAB 18.29.23(64-67)为DSMACC2593(2003/05/07)；和MAB 18.4.34(27-31)为DSM ACC2592(2003/05/07))。
与组合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)一样，组合MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)与参考实验有较好的相关性(也参见实施例2)。
此外，组合MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)被证实对于本发明的测试十分有效这种组合使函数曲线特别适合于特别合适的快速检测系统(参见实施例3).与之相比较，组合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)显示出较差的检测灵敏度。
采用如下实施例和附图进一步阐明本发明。


图1显示了呈免疫层析测试条形状的本发明的快速检测装置的优选图2显示了Elecsys湿润测试形式的抗体组合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)与Elecsys参考方法PAB(1-21)/PAB(39-50)的相关性。
图3显示了Elecsys湿润测试形式的抗体组合MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)与Elecsys参考方法PAB(1-21)/PAB(39-50)的相关性。
图4显示了采用不同抗体组合的根据实施例1所述的NT-proBNP测试条的函数曲线。
图5显示了采用抗体组合Au-MAB18.4.34(27-31)/Bi-PAB(39-50)的NT-proBNP测试条与ElecsysNT-proBNP测试试剂盒的相关性。
图中的编号表示1.样品加样区2.红血球分离区3.检测区4.吸收区5.载体材料6.样品加样基质(“生物素羊毛状覆盖物”和“金羊毛状覆盖物”)7.红血球分离基质8.检测基质9.线状的固定区10.吸收基质实施例1)用于测定全血中NT-proBNP的检测装置的制备(参考图1)测试装置(图1)由其上装有加样区(1)、红血球分离区(2)、检测区(3)和吸收区(4)的载体材料(5)组成。部分与红血球分离区(7)相重叠的样品加样基质(6)位于样品的加样区(1)中。红血球分离基质(7)又稍稍与检测基质(8)(检测区)重叠，其中检测基质上覆盖有呈线状的(9)固定物质。一种吸收基质(10)稍稍与检测基质(8)重叠。与待检测的被分析物形成复合体形式所需的所有试剂均置于样品的加样基质中(6)。在本技术方案中，样品加样区由两层叠放的羊毛状覆盖物组成，其中第一层(“金羊毛状覆盖物”)浸渍了抗NT-proBNP的金标记的抗体(MAB 18.4.34(27-31))，第二层羊毛状覆盖物(“生物素羊毛状覆盖物”)中浸渍了抗NT-proBNP的生物素化抗体(PAB(39-50))。一由链霉亲和素制成的线(9)位于检测区中。
一层350μm厚的聚酯油(Pütz)作为载体层(5)。一层360μm厚的聚酯羊毛状覆盖物(Roche诊断公司)被用作样品加样基质(6)的“金羊毛状覆盖物”或“生物素羊毛状覆盖物”。一层1.8mm厚的玻璃纤维羊毛状覆盖物(Roche诊断公司)被用作红血球分离基质(7)。一层140μm厚的硝酸纤维膜(Sartorius)被用作检测基质(8)。一层1.8mm厚的玻璃纤维羊毛状覆盖物(Roche诊断公司)被用作吸收基质(10)。如图1所示，单独的组件(6、7、8、10)通过热熔粘合的方式轻微重叠的粘合于载体层上(5)。
“金和生物素羊毛状覆盖物”的浸渍制剂为“金羊毛状覆盖物”100mM Hepes pH7.4，0.1％ Tween，20μg/ml生物素化的PAB(39-50)“生物素羊毛状覆盖物”100mM Hepes pH7.4，OD 4 MAB18.4.34(27-31)金络合物2)Elecsys形式的表位/抗体组合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)与ElecsysNT-proBNP检测试剂盒的相关性(参考图2和3)在Elecsys2010(Roche诊断公司)上通过电化学发光免疫实验来确定MAB/PAB组合MAB 17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)与Elecsys检测试剂盒(PAB(1-21)/PAB(30-50))的相关性。为了进行该实验，将PAB(39-50)用作生物素化的捕获剂，并且MABs的钌化F(ab’)2片段被用作检测试剂。在每一实验中将20μl的样品或标准物与75μl的两种抗体试剂在37℃下温育9分钟。随后，加入35μl的覆盖有链霉亲和素的磁性聚苯乙烯颗粒，并在室温下再温育9分钟。在Elecsys2010上常规检测等量温育溶液的电化学发光信号，并通过标准曲线的方式将其转化为浓度信号。
现在采用两种MAB/PAB的改进测试方法和Elecsys试剂盒来检测来源于患有心力衰竭的病人的临床样本。结果示于图2和3中.两种MAB/PAB的改进测试均获得了与Elecsys试剂盒较好的相关性(r＝0.978和r＝0.957)。
3)采用两种不同MAB/PAB组合的NT-proBNP测试条的函数曲线按照实施例1的方法制备NT-proBNP测试条。采用了如下用于试剂羊毛状覆盖物的浸渍制剂“生物素羊毛状覆盖物”100mM Hepes pH7.4，0.1％ Tween，20μg/ml生物素化的PAB(39-50)“金羊毛状覆盖物”100mM Hepes pH7.4，OD 4 MAB 18.4.34(27-31)或MAB 17.3.1(13-16)金络合物向来源于健康捐赠者的肝素化的血液样品中加入来源于患心力衰竭病人的含NT-proBNP的血清，并将其等分。取150μl的混合血样加样至测试条上，并利用CARDIAC Reader(Roche诊断公司)检测。样品检测后的反应时间为12分钟。为了确定样品的NT-proBNP浓度，从同一等分样品离心获得血浆并通过ElecsysNT-proBNP试剂盒(Roche诊断公司)进行检测。通过这种方式获得的两种测试条改进系统MAB17.3.1(13-16)/PAB(39-50)和MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)的函数曲线示于图4中。其中改进系统MAB 18.4.34(27-31)/PAB(39-50)具有相当陡峭得多的标准曲线因此测试更灵敏。
4)采用AB组合Au-MAB18.4.34(27-31)/Bi-PAB(39-50)的NT-proBNP测试条与ElecsysNT-proBNP试剂盒的相关性将来源于患有心力衰竭的病人的含NT-proBNP的血清加入肝素化的来源于健康捐赠者的血液样品中，并被等分。取150μl的这种混合血样加样至测试条上，并按照标准方法利用CARDIAC Reader(Roche诊断公司)进行检测。从相同样品中离心获得血浆，并采用ElecsysNT-proBNP试剂盒(Roche诊断公司)在Elecsys1010分析系统中进行检测。采用这种方式制备了60份样品并采用两个系统检测。图5显示了两个系统的测量值。其相关性很好，r＝0.95.。
权利要求
1.用于测定NT-proBNP的免疫夹心测试，其特征在于采用至少两种抗NT-proBNP的抗体，其中一种这类抗体为MAB，并且这些抗体中的一种至少靶向包括38至50位氨基酸的NT-proBNP的表位，并且这些抗体中的一种至少靶向包括1至37位或43至76位氨基酸的NT-proBNP表位的几个部分，其中被抗体识别的表位可以稍微重叠。
2.如权利要求1所要求保护的免疫测试，其特征在于它采用如下抗体组合中的一种AB(39-50)与AB(1-21)或AB(13-16)或AB(22-38)或AB(27-31)或AB(51-76)或AB(64-67)；或AB(38-42)与AB(1-21)或AB(22-37)或AB(43-76)；或AB(44-50)与AB(1-21)或AB(22-43)或AB(51-76)。
3.如权利要求1或2所要求保护的免疫测试，其特征在于肽采用如下PAB/MAB组合中的一种PAB(39-50)与MAB(1-21)或MAB(13-16)或MAB(22-38)或MAB(27-31)或MAB(51-76)或MAB(64-67)；或PAB(38-42)与MAB(1-21)或MAB(22-37)或MAB(43-76)；或PAB(44-50)与MAB(1-21)或MAB(22-43)或MAB(51-76)。
4.如权利要求1所要求保护的免疫测试，其特征在于它优选采用如下的抗体组合MAB 18.4.34(27-31)与PAB(39-50)或PAB(38-42)或PAB(44-50)或MAB 17.3.1(13-16)与PAB(39-50)或PAB(38-42)或PAB(44-50)。
5.如权利要求1所要求保护的免疫测试，其特征在于它优选采用如下的抗体组合MAB 18.4.34(27-31)与MAB(38-42)；或MAB 18.9.8(27-31)与MAB(38-42)。
6.如权利要求5所要求保护的免疫测试，其特征在于MAB(38-42)为MAB 16.1.39(38-42)。
7.如权利要求1至6中任意一项所要求保护的免疫测试，其特征在于它是一种免疫快速检测。
8.如权利要求7所要求保护的免疫快速检测，其特征在于所述的抗体之一以抗体-金络合物的形式存在。
9.如权利要求7所要求保护的免疫快速检测，其特征在于所述的抗体之一以生物素化的抗体形式存在。
10.一种检测NT-proBNP的方法，其特征在于应用如权利要求1至9中任意一项所要求保护的免疫测试。
全文摘要
本发明涉及采用特殊抗体组合的用于测定NT－proBNP的免疫快速测试。本发明中的快速测试可以有利地呈现为免疫层析测试条。
文档编号G01N33/577GK1641352SQ200410095878
公开日2005年7月20日 申请日期2004年11月26日 优先权日2003年11月28日
发明者J·施平克, A·尼希特尔, V·克勒姆特, K·哈勒迈尔, M·格罗尔, A·博格亚, A·加鲁塞尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司