专利名称：通过系列组合稀释定量的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于生物分子的复杂混合物中生物分子的定量方法，方法包括将复杂混合物分级为级分，随后将级分进行系列组合稀释以及通过具有定义的灵敏度阈和鉴定能力的方法检测每一初始级分和每一稀释级分中的生物分子。
当前用于生物分子(例如蛋白)的检测方法是进行双向凝胶电泳并随后对经染色凝胶进行容量分析。然而，很难确定被分析的生物分子的量，尤其是如果要比较它在不同样品中的量时。为了解决样品间生物分子浓度的不同，凝胶必须平行处理并且必须进行凝胶对凝胶的匹配。
需要一种用于生物分子的复杂混合物中对生物分子定量的简单方法。
本发明提供了一种用于生物分子的复杂混合物中定量生物分子的方法，其包括a.提供来自于对生物分子的复杂混合物进行分级获得的至少两种级分，其中所述每一级分包含至少一种不同的生物分子组分，b.将所述级分进行系列组合稀释步骤，c.用具有稳定的和充分定义的灵敏度阈和鉴定信息的方法检测和鉴定在每一初始级分和每一稀释级分中的生物分子，以及d.通过考虑各自的稀释因子，加和每一稀释水平上每一级分中生物分子的鉴定数目，从而定量生物分子复杂混合物中的生物分子。
为了归一化，可以用d)的总数除以全部稀释水平上全部级分(初始级分和稀释级分)中全部生物分子的鉴定总数目。
用于定量生物分子的本发明方法提供了将来自一种来源的生物分子复杂混合物中一种或多种生物分子与来自其它来源的复杂混合物中相应的分子进行比较的相对定量法。
生物分子的复杂混合物可以来自任何来源，包括生物来源，生物来源包括细胞、细胞培养上清液、生物液体例如血清、血浆、尿、支气管灌洗液、痰液、活组织解剖物像脑脊髓液。生物分子的复杂混合物包含至少两种不同生物分子。本发明中的生物分子可以是任何生物分子，包括多聚核苷酸、多肽、碳水化合物、脂类、糖蛋白、脂蛋白、或它们的其它修饰形式或代谢物。检测和鉴定方法可以限制为对单种生物分子进行检测和鉴定，或一次可以检测和分析几类生物分子。
用于本发明方法的分级方法应该有效地将生物分子的复杂混合物分离为不同级分。优选地，生物分子的复杂混合物被分级成不同级分，使得每一不同的生物分子至多仅存在于n-1个级分中，其中n是级分的总数并且n等于或大于2。优选地，不同生物分子存在于两个不同的级分中，更优选地在一个级分中。可以用于本发明的分级方法可以选自适用于目标种类生物分子复杂混合物分离的任何方法。可以用于本发明方法的分级方法可以选自基于吸附、重力或沉降速度的分级方法、电泳分级方法或这些方法的组合。例如，在蛋白作为目标分子的情况下，所述分级方法包括但不限于色谱分级法、超速离心法、蛋白沉淀法、亲和纯化法或免疫沉淀法。在肽(例如从蛋白水解消化物得到)作为目标分子的情况下，所述分级方法包括但不限于高压液相色谱法(HPLC)。
级分然后用以系列的组合稀释。所述系列组合稀释要求至少两种级分来开始。优选地，将生物分子的复杂混合物分级为尽可能多的级分，以允许在接着的检测步骤中检测和鉴定足够数量的不同目标生物分子。优选地，初始级分的数目不是素数，更优选地初始级分的数目是偶数，并且优选地，每一初始级分包含至少一种不同的组分。
用来开始系列组合稀释的级分的数目取决于生物分子混合物的复杂度，取决于生物分子复杂混合物中的单个生物分子的浓度、分离方法的效率，以及取决于分级和系列组合稀释后使用的检测和鉴定方法。
对于系列组合稀释，将至少两种不同的包含至少一种不同生物分子的级分进行合并。优选地，合并两种级分。这将改变合并的级分中生物分子的浓度，所述合并级分中生物分子的浓度为将每一级分中生物分子浓度与每一级分的体积相乘所获得的点值除以所有合并级分总体积的比值。一般的，和初始级分中的各个生物分子的最大浓度相比较，这将导致稀释的级分中任何生物分子组分的更小浓度。在下面的稀释步骤中，将单个蛋白质的浓度降低至低于接着进行的检测和鉴定方法的灵敏度阈。
稀释步骤的数目取决于初始级分中生物分子的起始浓度、分级后初始级分的数目以及检测和鉴定方法的检测限。
本发明方法还包括检测和鉴定方法。检测方法必须描述明确的灵敏度阈和提供关于被检测生物分子的鉴定信息。因此，可确定初始级分或稀释的级分中特定生物分子的存在或不存在。本发明的检测和鉴定方法可以依赖生物分子的化学组成、结构，或序列以及由此产生的物理-化学或酶促特性。这些包括使用特定探针的杂交、与特定抗体或凝集素反应、和特定分子探针的酶促或化学反应、等电点、分子量、从生物分子的酶消化物中产生的片断的分子质量、NMR谱或它们的组合。以蛋白质定量为例，本发明的检测和鉴定方法可以选自单向或双向凝胶电泳和质谱的组合、免疫检测法(例如western印迹法)、气相色谱/质谱联用法(GS/MS)、或使用特定标记分子例如荧光标记、化学标记(例如生物素)或放射性标记的电泳法的这类方法。
为了得到生物分子的定量，对每一稀释步骤的级分的鉴定或特定指纹谱(肽质量指纹谱)进行了计算，其中考虑了每个稀释步骤各自的稀释因子。得到的生物分子的鉴定数目在全部稀释水平上得以加和。为了归一化，可以用这个总数处以全部级分(初始级分和稀释级分)中的全部生物分子的鉴定总数目。
相对量(q)=Σ(di×Ni)Ntotal]]>其中Ni是稀释水平i上的单种生物分子的鉴定数目N，di是各个稀释水平i的稀释因子d，以及Ntotal是全部稀释水平上全部级分中全部生物分子的鉴定总数目N。
本发明与不同生物分子的特性无关。对多核苷酸和多肽或碳水化合物均同样可定量。本发明的其它优势是它以简单的方式将定量和鉴定结合而不需要针对生物分子定量进行额外努力。而且，如果需要将来自一种来源的生物分子的量与来自另一来源的生物分子的量进行比较，则可对生物分子混合物相互独立地处理。
现在已经一般地描述了本发明，通过参考具体的实施例及下列附图将能更好地理解本发明，其中所述的具体实施例除非另有说明在此仅是为了阐述的目的而不用于限制本发明。
图1说明了本发明的方法在第一步中将复杂混合物分级成不同级分。然后将这些级分进行系列组合稀释。在第二步中对样品库用例如双向凝胶电泳法和随后的质谱法鉴定检测生物分子。(AU吸收单位；8到23级分)图2展示了生物分子的相对量的计算。
q生物分子的相对量；Ni稀释水平i上单个生物分子的鉴定数目N；di各个稀释水平i的稀释因子d；Ntotal全部稀释水平上所有级分中的所有生物分子的鉴定总数目N。(图解N1未稀释，N22倍稀释，N34倍稀释，N48倍稀释)图3显示了在双向凝胶电泳中从水平1(未稀释)、水平2(2倍稀释)、水平3(4倍稀释)和水平4(8倍稀释)上对糖蛋白磷酸化酶(a)，波形蛋白和热休克蛋白105(c)的鉴定的数目。从重复三次进行的试验加和值。(对照5mM葡萄糖；高葡萄糖10mM)实施例除非另外指出，实施例中涉及的市售试剂根据生产商指导手册使用。
实施例1细胞培养将INS-1细胞(Asfari，Janjic等，1992)培养于补充有10％FCS(Invitrogen，热灭活)、10mM Hepes溶液(Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Sigma)、50μM β-巯基乙醇(Sigma)、1％青霉素/链霉素溶液(SIGMA)和低(5mM)或高(10mM)浓度葡萄糖(SIGMA)的RPMI1640培养基(Invitrogen)中。细胞一般培养于低葡萄糖浓度中。为了准备培养，将细胞传代然后在低葡萄糖浓度培养基中孵育直到细胞融合。然后将培养基换成低葡萄糖或高葡萄糖培养基，并且继续孵育四天。为了收获细胞，将细胞首先用Hanks平衡盐溶液(HBSS，Invitrogen)洗涤一次，然后用胰蛋白酶/EDTA溶液覆盖1-2分钟直到细胞变圆并从瓶表面分离。弃去胰蛋白酶/EDTA溶液，并将细胞悬浮于胰蛋白酶抑制剂溶液中(SIGMA)，转移进离心管中并在1200×g下离心5分钟。之后，将细胞在HBSS中洗涤三次，用同样的参数再次离心。吸出上清液并弃去，然后将细胞沉淀在-80℃下冷冻储存直到用于细胞溶质制备。
细胞溶质制备将所有溶液冷却至4℃(HBSS除外)而且所有步骤在冰冷环境中进行(冰浴)。将约108个细胞重悬于细胞匀浆培养基(CHM；150mMMgCl2，10mM KCl，10mM Tris，0.25M葡萄糖，1mM EDTA，pH7.4)中。然后置于冰上2分钟。将细胞悬液转移到Potter Elvehjem匀浆器容器中。将Potter Elvehjem匀浆器的冷的杵和高架高扭矩电动机连接，然后1000转/分钟下用10冲程将细胞匀浆化。通过相差显徽技术确认匀浆化效率(＞90％的破裂细胞)。1000×g离心5分钟除去细胞碎片和细胞核。5000×g离心分离线粒体。200000×g离心并通过将上清液转移至洁净试管内，最后富集的细胞溶质级分得以回收。在该制备物中最终的蛋白质浓度为2.5-5.0mg/ml。
色谱分级全部分级步骤用KTAexplorer 10色谱系统(Amersham)在室温下进行。将细胞溶质制备物(10mg的全部蛋白质)通过0.45μM Milex-HV针筒式过滤器，上样到脱盐柱上(串联连接的三个5ml HiTrap脱盐柱，Amersham)。用缓冲液A(25mM NaHPO4-pH7.5；1mM EDTA；0.5mM二硫赤藓糖醇；1×Complete EDTA-free(购自Roche Diognostics的蛋白酶抑制剂混合片剂；pH调整到7.5))以1.5ml/分钟流速洗脱蛋白质。以UV吸光值(280nm)增加和最小电导率作为蛋白质级分的界限，将蛋白质回收在20ml注入式套管(injectionloop)中。然后通过使用TSK DEAE-5PW7.5cm×7.5mm柱(TOSOH BIOSEP)的阴离子交换色谱在1ml/分钟流速下分离蛋白质。将缓冲液A用作结合缓冲液，缓冲液B(25mM NaHPO4-pH7.5；1mM EDTA；0.5mM二硫赤藓糖醇；1×Complete EDTA-free(购自Roche Diognostics的蛋白酶抑制剂混合片剂；1M NaCl，pH调整到7.5))作为洗脱缓冲液。将样品上样到柱上，用7个柱体积(CV)的缓冲液A洗脱未结合物质。随后用三段梯度(第一段3CV0-11％的缓冲液B；第二段10CV11-30％的缓冲液B；1.5CV30-50％的缓冲液B)洗脱结合的蛋白。最后用5CV50％的缓冲液B洗涤柱子。以1ml的量收集级分并且加上流透液组合形成八个库。电导率边界为FTUV280增加到电导率的增加；1(电导率增加开始到12ms)；2(12到15ms)；3(15到18ms)；4(18到21ms)；5(21到24ms)；6(24到27ms)；7(27到30ms)；8(30到40ms)。
双向电泳通过使用充填有100mg POROS 20 R1材料(PerSeptive Biosystems)的自填充针筒式小型柱(MoBiTec M1002)进行反相色谱将级分浓缩和脱盐。用10ml 0.1％的三氟乙酸(TFA)和用70％乙腈/0.1％TFA洗涤柱。上样样品后，柱用10ml 0.1％TFA洗涤，并用2ml 70％乙腈/0.1％TFA洗脱。洗脱物随后在SpeedVac蒸发器中干燥然后置于IEF样品缓冲液(7M尿素，2M硫脲，50mM Tris pH7.5，2％(w/v)CHAPS，0.4％(w/v)二硫赤藓糖醇，0.5％(w/v)两性电解质)。将包含0.5mg蛋白的等分试样从各个级分中留出并标记为样品1到8。后面的样品从剩余级分制备样品90.25mg级分1+0.25mg级分2；样品100.25mg级分3+0.25mg级分4；样品110.25mg级分5+0.25mg级分6；样品120.25mg级分7+0.25mg级分8；样品130.125mg级分1+0.125mg级分2+0.125mg级分3+0.125mg级分4；样品140.125mg级分5+0.125mg级分6+0.125mg级分7+0.125mg级分8；样品150.0625mg级分1+0.0625mg级分2+0.0625mg级分3+0.0625mg级分4+0.0625mg级分5+0.0625mg级分6+0.0625mg级分7+0.0625mg级分8；因而，样品1-8包含0.5mg蛋白质级分，样品9-12各自对应这些样品的两倍稀释，样品13和14对应四倍稀释，以及样品15对应这些初始级分的八倍稀释。用具有pH3到10的固相pH梯度(IPG)胶条(IPG3-10L；Amersham)在Protean IEF Cell(BioRad)中20℃下进行等电聚焦。将干胶条在包含7M尿素、2M硫脲、2％(w/v)CHAPS、0.4％(w/w)二硫赤藓糖醇和0.5％(w/v)两性电解质的溶液中重泡胀。在胶条的阴极端将蛋白质级分杯状上样。将电压在8小时内直线上升到5000V，接着在5000V的稳定水平进行10小时。通过依次在平衡溶液I(6M尿素，50mM Tris pH7.5，30％甘油，2.0％SDS，30mM二硫赤藓糖醇)和平衡溶液II(6M尿素，50mM Tris pH8.8，30％甘油，2.0％SDS，0.23M碘乙酰胺)中洗涤，各10分钟，胶条得以平衡和烷基化。将胶条上样到11％丙烯酰胺/PDA(37∶1)梯度凝胶(240mm×200mm×1.5mm)上。在80V O/N下于ETTAN Dalt电泳仪器(Amersham)中，伴随持续冷却(20℃)，通过电泳使蛋白质得以分辨。
凝胶染色和处理将凝胶在50％甲醇/10％乙酸中固定并用考马斯蓝(胶体蓝，Invitrogen，Carlsbad，CA)染色过夜，接着在超高纯水中多次洗涤总共7小时。扫描凝胶并且用自动胶点挖取设备切取直径为1.2mm的凝胶点。在包含100mM碳酸氢铵和30％乙腈的溶液中退染凝胶点。干燥的退染凝胶片在5μl 10μg/ml胰蛋白酶溶液(Roche Diagnostics)中室温下消化过夜。加入10μl超高纯水后，用5μl包含75％乙腈和0.3％(v/v)TFA的溶液提取蛋白质。将肽溶液点样到MALDI靶上，它和α-氰基-4-羟基肉桂酸一起作为基质。
质谱分析和蛋白质鉴定在Bruker Ultraflex Instrument(Bruker，Bremen，德国)上，用促肾上腺皮质激素(ACTH)和缓激肽(Bradykinin)作为内部质量标准。如下面解释，单种同位素的肽段质量从质谱中自动监测并且和来自蛋白质序列数据库(例如SwissProt或NCBI大鼠基因组草图)的源自计算机产生的全部蛋白质的胰蛋白酶消化液的肽的理论质量比较。
MALDI质谱的峰值注释质谱分析数据用低通中值参数样条滤波器两次过滤以便确定仪器的基准线。将对基准线的平滑化的残余平均标准偏差用于数据中仪器噪音水平的估计。
在基线校正和噪音水平上的坐标中的数据重新调节后，具有对基准线最大偏差的数据点被用来产生一个非线性(Levenberg-Marquardt算法)数据拟合程序以检测可能的肽峰。特别地，拟合程序准备用于产生最好拟合的用峰高度、分辨率和单种同位素质量参数化的平均理论肽同位素分布。用平常的方法通过跟踪σ值确定收敛到有效的拟合。
收敛成功之后，通过使用十六次重复1/3的数据点的随机交换的引导程序可以产生对经确定参数的误差估计。
将得到的拟合值从数据中减除，将拟合值附近的噪音水平调整到外推的噪音水平和对峰值拟合值的偏差之和，并且将此过程迭代，只要候选的峰多于五倍的噪音水平，就找到下一个峰。当找到多于50个峰停止这一过程。
自检测的内部标准峰线性外推校正飞行时间对质量换算的第零和第一阶，并且从峰的质量精确度和标准评价对单种同位素质量的置信区间。
谱峰对计算机产生的蛋白质酶解物的概率匹配将质谱的峰质量列表直接和对于整个蛋白质序列数据库的理论酶解物比较。对每个理论酶解物，计算[1-П(1-NP(pi))]cMatches，其中N是酶解物中肽的数目，p(pi)是匹配对于峰的单种同位素质量的置信区间的肽的数目除以序列数据库中所有肽的数目，cMatches是酶解物和质谱之间匹配的数目。可以看出这个值与获得酶解物和质谱之间的假阳性匹配概率成比例。将概率值进一步过滤寻找产生匹配的谱峰高的显著性。第一轮鉴定后，将在同一条件下获得的质谱鉴定的偏差用来校正飞行时间对质量换算的第二和第三阶项。得到的质量值通常具有不到10ppm的绝对偏差。这些质量值接着用于最后一轮的匹配，其中所有具有不到0.01/N蛋白(用Bonferoni校正具有1％显著水平)的Pmism的匹配得以接受。
数据库分析对数据库中的每个蛋白质，统计本研究中分析的每一2D-PAGE胶的鉴定数目。在本实例中将稀释水平1设为参考。然后得到下列值●稀释水平1鉴定的数目(未稀释样品，样品1-8)＝N1；●稀释水平2鉴定的数目(2倍稀释，样品9-12)＝N2；●稀释水平3鉴定的数目(4倍稀释，样品13，14)＝N3；●稀释水平4鉴定的数目(8倍稀释，样品15)＝N4；正如期望的，对于大多数蛋白质N值从一级到下一级降低大概两倍。考虑稀释因子以及为了得到对于每个蛋白质的粗略绝对量，用下式计算量值qq＝(N1+2×N2+4×N3+8×N4)/对全部稀释水平上同一来源的所有样品确定的蛋白点的总数目除以对同一来源的所有样品鉴定的总数目，被用来解决蛋白质浓缩物中样品间的不同。
对于每个蛋白质，计算和比较对于混合物样品(高和低糖)两者的q值。
选择下列三种蛋白质作为实例以说明本定量方法的可行性糖原磷酸化酶(肝脏中的形式)；波形蛋白和热休克蛋白105(表1，图3)。
表1对于三个实例蛋白从三个实验获得的细胞溶质中存在的蛋白质的相对量(q值)。
实施例2胶原蛋白αI(IV)来自三个胰岛素抗性和胰岛素敏感病人(白种人，女性)的血清样品按下面描述分级。如通过高胰岛素正常血糖钳方法(Garvey等Diabetes34(1985)222-234)测定的体重指数(BMI)和葡萄糖处理率(GDR)在表2中有简要说明。组合系列稀释按专利申请中描述的实施而且得到的样品按下面描述用于双向-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)。将所有可检测的蛋白斑点从每一凝胶上切取。将蛋白用胰蛋白酶降解并且将所得的肽用于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-MS)。蛋白鉴定可以通过如下面描述的肽质量指纹图谱分析得到，而且将蛋白列表如实施例1中描述的比较。
表2六个受试者的通过高胰岛素正常血糖钳方法检测的体重指数(BMI)和葡萄糖处理率(GDR)。对于GDRs，认为15以上为胰岛素抗性鉴定的断点，在方格左边的病人归为胰岛素敏感(IS)，而在右边的那些为胰岛素抗性(IR)。来自这些个体的血浆通过系列组合稀释，随后进行2D-PAGE、斑点切取、胰酶处理、MALDI-MS，并且最后通过肽质量指纹图谱比较鉴定蛋白质而得以分析。
样品制备通过应用蛋白质组学技术建立一种方法用来搜索人类血浆中的胰岛素抗性标记。用蛋白质组学技术很难分析血浆，因为血浆包含约十种高丰度蛋白，它表现了大约98％的总蛋白质量。通过应用色谱技术除去高丰度蛋白、清蛋白和抗体链，并在离子交换器上分级流通级分。描述的方案包括三个层析步骤(matrix blue、G蛋白和离子交换)，并且是高度可重复的。所有层析步骤在FPLC系统(Pharmacia)上实施。
通过在Mimetic Blue上亲和层析除去清蛋白和通过在G蛋白上亲和层析除去免疫球蛋白从三个对照个体和三个患糖尿病II型的病人获得人类血浆。将蛋白酶抑制混合剂(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)加至血浆(每片剂对50ml)。用25mM MES，pH6.0，三倍稀释血浆，以减少盐的浓度并调整PH至约6.0。顺序连接两个柱，Mimetic Blue SA P6XL(50ml，ProMetic生物科学有限公司)和HiTrap G蛋白HP(5ml，Amersham生物科学)，并用25mM MES，pH6.0平衡。将对应大约一克血浆蛋白的体积(15ml，66mg/ml)滤过0.22μm过滤器并以5ml/分钟施加到Mimetic Blue柱上。将此柱子的流透液直接上样到G蛋白柱上并且收集来自后面柱的流透级分(约120mg)。用100ml的25mM MES，pH6.0，洗涤这两个柱，随后将它们分开。Mimetic Blue柱用分步梯度以在50mM Tris-HCL，pH7.5中的2M NaCl洗脱以及用100mM甘氨酸-HCL，pH2.8洗脱G蛋白并且用1M Tris碱中和洗出液。通过双向凝胶分析此流透级分和这两个洗出液并且通过MALDI-MS鉴定蛋白。在来自Mimetic Blue的洗出液中，检测到了主要为全长和片断化的清蛋白。在来自G蛋白柱的洗脱液中，主要检测到重和轻的Ig链。在流透级分中大多数其它血浆蛋白得以回收。
通过离子交换层析进行蛋白质分级将来自Mimetic Blue和G蛋白柱的流透级分和洗涤级分合并，用2MTris碱调整到pH8.0并施加到HiTrap Q HP柱(5ml，AmershamBiosciences)，用50mM Tris-HCL，pH8.0，以5ml/分钟平衡。用在50mMTris-HCL，pH7.5中的从0到1M NaCl的线性梯度上升的盐浓度洗脱柱子。收集5ml级分并用单向凝胶分析。大约50mg总蛋白从此柱得以回收。基于凝胶分析，将级分合并以形成八种组合，使得每种组合包括约5mg的总蛋白。用Utrafree-15离心过滤器(5kMWCO，Millipore)浓缩并且通过2-D凝胶分析八个组的每一个。从各个胶上切取大约400个斑点并用MALDI-MS分析。
2D-PAGE从Amersham Biosciences(Uppasla，瑞典)购买固相PH梯度(IPG)胶条。从Biosolve(Valkenswaard，荷兰)获得丙烯酰胺并且用于聚丙烯酰胺凝胶制备的其它试剂来自Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA，美国)。CHAPS来自Roche Diognostics(Mannheim，德国)，尿素来自Applichem(Darmstadt，德国)，硫脲来自Fluka(Buchs，瑞士)以及二硫赤藓糖醇来自Merck(Darmstadt)。
将0.5mg总蛋白的样品施加到3-10NL IPG胶条上，在它们的碱性和酸性端位于样品杯中。在200V开始聚焦，并且用计算机-控制电源将电压以3V/分钟逐渐上升到5000V，并接下来保持恒定6小时。40mA/胶下在12％的恒定SDS聚丙酰胺凝胶(18×200×1.5mm)上实施双向凝胶电泳分离。在40％的包含5％磷酸的甲醇中固定蛋白12小时后，用胶体考马斯蓝(Novex，San Diego，CA，美国)染色凝胶24小时。用H2O将多余的染料从凝胶上洗掉，并且将凝胶用Agfa DUOSCAN光密度计(分辨率400)扫描。凝胶的电子图像用Photoshop(Adobe)软件记录。图像以tiff(约5兆字节/文件)和jpeg(约50千字节/文件)格式存储。凝胶保存在4℃直到用于MS分析。
MALDI-MS用国产斑点挖取器(在欧洲申请EP 1 384 994中描述)切取1.2mm直径的经选取斑点，放入96-孔微量滴定板并且用100μl在50mM碳酸氢铵中的30％乙腈在CyBiTM-Well仪器(Cybio AG，Jena，德国)中将每一凝胶块脱色。脱色后，用100μl H2O洗涤凝胶块5分钟，并在speedvac蒸发器中不加热干燥5分钟。每个干燥凝胶块用5μl包含50ng胰蛋白酶(RocheDiognostics，Mannheim，德国)的1mM碳酸氢铵重泡胀。室温下16小时后，将20μl 50％的乙腈(其包含0.3％三氟乙酸)加至每一凝胶块。将凝胶块孵育15分钟，保持恒定摇动。将肽混合物(1.5μl)和1μl基质溶液同时施加至AnchorChipTM，其中所述基质溶液由0.025％的α-氰基-4-羟基肉桂酸(Sigma)组成，并且包含在65％乙醇、32％乙腈和0.03％三氟乙酸中的标准肽脱精氨酸血管舒缓激肽(des-Arg-bradykinin)(Sigma，20nM，904.4681Da)和促肾上腺皮质激素片段18-39(Sigma，20nM，2465.1989Da)。用CyBi-Well仪器进行样品施加。样品以反射模式在飞行时间质谱仪(Ultraflex TOF-TOF，Bruker Daltonics)中分析。使用20KV的加速电压。基于肽-质量匹配鉴定蛋白。
MALDI质谱的谱峰注解质谱分析数据用低通中值参数样条滤波器两次过滤以便确定仪器的基准线。将对基准线的平滑化残差平均标准偏差用于数据中仪器噪音水平的估计。在基准线校正和噪音水平上的坐标中的数据重新调节后，具有对基准线最大偏差的数据点被用来产生一个非线性(Levenberg-Marquardt算法)数据拟合程序去检测可能的肽峰值。特别地，拟合程序尝试用来产生最好拟合的用峰值高度、分辨率和单种同位素质量参数化的平均理论肽同位素分布。用常规的方法通过跟踪σ值确定收敛到有效的拟合。收敛成功之后，通过使用十六次重复1/3数据点的随机交换的引导程序可以产生对所确定参数的误差估计。将得到的拟合值从数据中减除，将拟合值附近的噪音水平调整到外推的噪音水平和对峰值拟合值的偏差之和，并且将此过程迭代，只要候选的峰多于五倍的噪音水平，就找到下一个峰。当找到多于50个峰停止这一过程。用从检测内部标准峰的线性外推校正飞行时间对质量换算的第零和第一阶，并且从峰的质量精确度和标准评价对单种同位素质量的置信区间。
谱峰对计算机产生的蛋白质酶解物的概率匹配将质谱的峰质量列表直接和对于整个蛋白质序列数据库的理论酶解物比较。对每一理论酶解物，计算[1-П(1-NP(pi))]cMatches，其中N是酶解物中肽的数目，p(pi)是匹配对于峰的单种同位素质量的置信区间的肽的数目除以序列数据库中所有肽的数目，cMatches是酶解物和质谱之间匹配的数目。可以看出这个值与获得酶解物和质谱之间的假阳性匹配概率成比例。将概率值进一步过滤寻找产生匹配的谱峰高的显著性。第一轮鉴定后，将在同一条件下获得的质谱鉴定的偏差用来校正飞行时间对质量换算的第二和第三阶项。得到的质量值通常具有不到10ppm的绝对偏差。这些质量值接着用于最后一轮的匹配，其中所有具有不到0.01/N蛋白(用Bonferoni校正具有1％显著水平)的Pmism的匹配得以接受。
结果在两个胰岛素抗性病人(IR2和IR3，见表3)中独有地检测到胶原蛋白αI(IV)(胶原蛋白IV；Swissprot登录号P12109；O00117；O00118；Q14040；Q14041；Q16258)。在一个病人(IR2)中，在第二水平上(二倍稀释样品)检测到斑点，然而在第二个病人(IR3)中在第四水平(八倍组合稀释)上检测到蛋白两次。将鉴定数目和稀释因子相乘(在这个例子，分别是一和四)并且用各自样品鉴定的蛋白斑点的总数校正。
另外按照供应商的方法用免疫检测法(Biotrin胶原蛋白IV EIA；目录号NoBIO82；Biotrin，Dublin，爱尔兰)测定胶原蛋白IV水平。来自两种检测法的结果在表3中比较。
表3来自系列组合稀释的结果和来自免疫检测的结果比较。
IS＝胰岛素敏感病人，IR＝胰岛素抗性病人。
系列组合稀释用稀释因子和全部斑点数目调整鉴定的数目。
免疫检测(胶原蛋白IV EIA)通过使用Biotrin胶原蛋白IVEIA检测胶原蛋白IV水平。所给出的结果是重复测量的平均。
描述的蛋白质组学方法的检测限度在用于免疫检测的限度之上，其大约是150ng/ml。在此水平以上，通过与描述的鉴定方法相结合的系列组合稀释，蛋白质可以得以检测并且能粗步定量。虽然没有观察到绝对的定量，但有一些等级相关性，也就是具有最高和第二高水平的样品得以正确的鉴定。
与蛋白质组学相结合进行系列组合稀释而进行大规模蛋白鉴定是一种有效的工具，用以平行定量成百上千的蛋白和鉴定在浓度上具有显著不同的能用于差异蛋白表达分析例如用于生物标记物鉴定研究的蛋白。
权利要求
1.用于在生物分子的复杂混合物中定量生物分子的方法，所述方法包括a.提供来自于对生物分子的混合物进行分级获得的至少两种级分，其中所述每一级分包含至少一种不同的组分，b.将所述级分进行系列组合稀释，c.通过提供灵敏度阈和鉴定信息的方法检测和鉴定在每一初始级分和每一稀释级分中的生物分子，以及d.通过考虑各自的稀释因子，加和每一稀释水平上每一级分中生物分子的鉴定数目，从而定量复杂混合物中的生物分子。
2.根据权利要求1的方法，其中将d)的和除以全部稀释水平上全部级分中全部生物分子的鉴定总数目。
3.根据权利要求1或2的方法，其中a)的级分数目取决于生物分子混合物的复杂度。
4.根据权利要求1或2的方法，其中a)的级分数目取决于生物分子的复杂混合物中不同生物分子的浓度。
5.根据权利要求1或2的方法，其中a)的级分数目取决于c)的检测和鉴定方法。
6.根据权利要求1到5中任意一项所述的方法，其中b)的稀释水平数目取决于级分中生物分子的起始浓度。
7.根据权利要求1到5中任意一项所述的方法，其中b)的稀释水平数目取决于分级后级分的数目。
8.根据权利要求1到5中任意一项所述的方法，其中b)的稀释水平数目取决于检测和鉴定方法的检测限度。
9.根据权利要求1到8中任意一项所述的方法，其中生物分子至多存在于n-1个级分中，其中n是级分的总数并且其中n等于或大于2。
10.根据权利要求1到8中任意一项所述的方法，其中生物分子存在于两个级分中。
11.根据权利要求1到8中任意一项所述的方法，其中生物分子存在于一个级分中。
12.根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其中c)的检测和鉴定方法包括双向凝胶电泳。
13.根据权利要求12的方法，其中c)的检测和鉴定方法额外包括质谱分析。
14.根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其中c)的检测和鉴定方法包括免疫检测法。
15.根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其中c)的检测和鉴定方法包括结合质谱的气相色谱法。
16.根据权利要求1到11中任意一项所述的方法，其中c)的检测和鉴定方法包括使用特定标记分子的电泳法。
17.根据权利要求1到16中任意一项所述的方法，其中a)的级分通过色谱分级法、超速离心法、蛋白沉淀法或免疫沉淀法分离。
18.根据权利要求1到17中任意一项所述的方法，其中生物分子是多肽。
19.根据权利要求1到17中任意一项所述的方法，其中生物分子是多核苷酸。
20.根据权利要求1到17中任意一项所述的方法，其中生物分子是碳水化合物。
21.根据权利要求1到17中任意一项所述的方法，其中生物分子是脂类。
22.根据权利要求1到17中任意一项所述的方法，其中生物分子是糖蛋白。
23.根据权利要求1到17中任意一项所述的方法，其中生物分子是脂蛋白。
全文摘要
本发明提供了用于对生物分子的复杂混合物中定量生物分子的方法，其包括将生物分子混合物分级以提供至少两个级分，其中每个级分具有至少一种不同组分。这些级分随后接受系列组合稀释。接着，通过提供了灵敏度阈和鉴定信息的方法使在级分中的生物分子得以检测和鉴定。通过考虑各自的稀释因子，加和各个稀释水平上各个级分中鉴定的生物分子数目，生物分子的量得以确定。为了归一化，用此和除以所有稀释水平上所有级分中所有生物分子的鉴定总数目。
文档编号G01N33/92GK1629638SQ200410101309
公开日2005年6月22日 申请日期2004年12月16日 优先权日2003年12月18日
发明者P·伯恩特, S·埃弗斯, H·朗根 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司