专利名称：测定肠炎症疾病疗法功效的方法
技术领域：
本发明涉及肠炎症疾病领域，尤其涉及到筛选肠炎症疾病疗法和测定疗法功效的方法。此外，还提供了实施本发明方法的试剂盒。
背景技术：
肠炎症疾病是一个综合术语，它包括引起肠炎症的疾病如肠道易激综合症(IBS)，和炎症性肠病(IBD)如慢性胃肠道炎症溃疡性结肠炎和局限性肠炎。例如，溃疡性结肠炎是一种IBD，它会导致大肠粘膜发炎，该病通常发生在直肠和结肠的下端，但可能会侵袭整个结肠。局限性肠炎则可能侵袭胃肠道的任何部分(如口腔、食道、胃、小肠、大肠、直肠和肛门)，并且损害到肠壁的所有结构层。上述疾病中有许多的病因仍是未知的。
IBS是一种以腹痛或腹部不适伴排便习惯改变和无规律排便为特征的肠胃功能性疾病。这些症状表明，胃肠道运动与/或感知功能处在一种异常的状态，这可能与社会心理失调有关，它们的相互作用导致胃肠道在几个水平上症状的出现。
IBS被认为是目前最常见的肠胃失调疾病。在西方国家的青少年和成人人口中患病率估计为15％至20％，占肠胃病门诊的20％至50％。
目前对IBS的治疗方法由下列步骤组成鉴定症状与综合征的符合度并排除器质性疾病引起相似症状的可能性，随后是非药物治疗，需要时进行药物治疗。目前的药物治疗方法相当有限，许多方法的功效未经验证。这些方法的基本原理是针对症状进行治疗，或是调节胃肠动力，降低内脏的敏感性，或是治疗相关的心理失调，尤其是焦虑和忧郁。
IBD最常见的症状包括腹痛、里急后重、排便急迫感和出血性腹泻。患者可能会出现感觉疲劳、体重降低、食欲减退、直肠流血、体液和电解质流失等情况。此疾病的症状通常是进行性的，典型的情况是患者会经历好转期和随后的骤然加重期。
尽管IBD发病率高(估计仅在美国就有200万人患此病)，目前对其仍没有有效的治疗方法，也不知道其确切的致病原因。治疗IBD的常规方法包括抗炎药、免疫抑制药和外科手术等。然而，治疗IBD的许多种药物有不良的副作用，如引起呕吐、头晕、贫血、白血球减少、皮疹和药物依赖等，而外科手术则经常采用一些激进的方案，如肠切除和结肠切除等。
这种情况使得一些研究人员尝试着去开发一些新药物来治疗肠炎症疾病。不幸的是，这种疾病的自身性质意味着筛选疗法和测量潜在疗法对人体的功效是非常困难的。人体试验的结果经常依赖于试验对象的主观描述，缺少甚至没有生物化学和生理学的数据来证实这些证言。虽然可以使用动物模型来从患病器官中获得组织切片，但是药物在动物模型中的功效和在人体中的功效并不总是相同。
对炎症疾病可在多个水平上进行控制。控制因子包括激素、前列腺素、活性氧和活性氮介质、白三烯素和细胞因子。细胞因子是低分子量生物活性蛋白质，它参与免疫和炎症反应的产生和控制。许多种细胞能生产细胞因子，其中嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞由于会在受伤部位大量聚集，是炎症反应中细胞因子的主要来源。
发炎部位产生的细胞因子通过多种机制影响炎症反应。趋化性刺激炎性细胞向受伤部位聚集，同时某些特定的细胞因子促使细胞渗透入组织。损伤组织内释放的细胞因子引起炎症浸润的活化。大多数细胞因子是多效性的，表达多种的、有重叠的生物学活性。细胞因子通过级联和网络结构控制炎症反应，而不是通过一种特定的细胞因子作用于一种特定类型的细胞来控制。由于不受控制的炎症反应能引起如肠炎症疾病这样的疾病，因此有理由认为，在这类疾病的患者体内，细胞因子的生产出现了错误。然而，许多种细胞因子既有促炎症活性又有抗炎症活性，因此很难将疾病症状归因于，或是将痊愈原因归功于某种特定的细胞因子。
基于以上所述，提供能筛选肠炎症疾病疗法和测量潜在疗法功效的方法是令人期待的，这种方法应能在人类或是别的哺乳动物试验中提供生物化学或者生理学的数据。这些数据能用来评估治疗方法的功效。更加令人期待的是，能够提供测量与肠炎症疾病发病机制有关的特定细胞因子水平变化的方法，使人们能够对肠炎症疾病患者的预后和疾病的发展进行监控。
发明概述本发明提供了测定哺乳动物肠炎症疾病疗法功效的体内新方法，该方法包括以下步骤a)测量受试哺乳动物生物样品中至少一种抗炎症细胞因子的水平和至少一种促炎症细胞因子的水平；b)测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；c)实施所述疗法；d)在所述疗法实施后的某一时间，在所述受试哺乳动物的生物样品中测量至少一种抗炎症细胞因子水平和至少一种促炎症细胞因子水平；e)所述疗法实施后，测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；其中，如果所述疗法实施后，抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率升高，则指示所述疗法能抑制肠炎症疾病，而如果此比率未发生变化或是降低，则指示所述疗法不能抑制肠炎症疾病。
此外，本发明提供了筛选治疗肠炎症疾病的组合物的体外方法，该方法包括以下步骤a)提供包含至少一种肠源性细胞的生物样品；b)用该组合物体外处理所述生物样品；c)组合物处理后某一时间，测量生物样品中至少一种抗炎症细胞因子与至少一种促炎症细胞因子的水平；d)组合物处理后某一时间，测定生物样品中至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；特征在于，如果组合物处理过的生物样品经步骤(d)测得的比率显著地高于在未经组合物处理的对照样品中同时测得的比率，则指示该组合物是肠炎症疾病的抑制剂，而如果该比率与未经处理的对照样品中同时测得的比率相同或是更低，则指示该组合物不是肠炎症疾病的抑制剂。
本发明也涉及提供本文所述方法的更广泛的应用和实施本文所述方法的试剂盒。
附图概述
图1是一幅条线图，显示IBS患者喂食婴儿双岐杆菌前后经体外刺激的外周血单核细胞(PBMC)中产生的IL-10对IL-12的平均比率。
图2是一幅条线图，显示IBS患者喂食婴儿双岐杆菌前后经体外刺激的外周血单核细胞(PBMC)中产生的IL-10对TNF-α的平均比率。
图3是一幅条线图，显示IBS患者喂食婴儿双岐杆菌前后经体外刺激的外周血单核细胞(PBMC)中产生的IL-10对IFN-γ的平均比率。
表1显示在喂食婴儿双歧杆菌的IBS患者中的IL-10对IL-12比率的变化和腹部疼痛/不适指数变化之间的负相关统计学显著性检验的Pearson线性相关系数和p值。注意患者喂食婴儿双歧杆菌前后，其平均IL-10对IL-12比率升高了，而平均腹部疼痛/不适指数下降了。
图4是一幅条线图，显示经体外刺激的肠系膜淋巴细胞(MLNC)中产生的抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率。
图5是一幅条线图，显示经体外刺激的肠道黏膜集合淋巴结细胞(PP)中产生的抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率。
图6是一幅条线图，显示经体外刺激的肠系膜淋巴细胞源的树突细胞(MLNC DC)中产生的抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率。
发明详述除非另外指明，本文中组合物整体的所有重量、尺寸和浓度都在25℃进行测量。
除非另外指明，本文中所有组合物的百分比均为重量百分比，所有的比率均为重量比。
除非另外指明，所有分子量均为重均分子量。
除非另外指明，本文中所有参考文献的内容均全文引入本文以供参考。
除了一些给出实际测量值的特别实施例之外，本文参考的数值均应被认为是“近似值”。
本文中，“肠炎症疾病”包括“肠道易激综合症(IBS)”和“炎症性肠病(IBD)”。
本文中，“炎症性肠病(IBD)”包括引起肠炎症的疾病，如溃疡性结肠炎和局限性肠炎。
方法和用途本发明涉及到提供测定哺乳动物肠炎症疾病疗法功效的体内方法，包括以下步骤a)测量受试哺乳动物生物样品中至少一种抗炎症细胞因子水平和至少一种促炎症细胞因子的水平；b)测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；c)实施所述疗法；d)在所述疗法实施后的某一时间，在所述哺乳动物的生物样品中测量至少一种抗炎症细胞因子水平和至少一种促炎症细胞因子水平；e)所述疗法实施后，测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；其中，如果所述疗法实施后抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率升高，则指示所述疗法能抑制肠炎症疾病，而如果此比率未发生变化或是降低，则指示所述疗法不能抑制肠炎症疾病。本发明所述的方法包括在疗法实施前测量和测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率。这可以包括在治疗实施前测定至少一次细胞因子的水平和比率，理想的时间是第0天，即测定后立即实施治疗。作为选择方案之一，所述细胞因子的水平和比率也可以在治疗实施前的一段给定时间里重复测定，以提供本领域的技术人员所共知的测量基准。本发明的方法还包括，在所述治疗实施后，在相近的时间点重复步骤(d)和(e)至少一次。此外，本发明的方法还包括，对所述受试哺乳动物实施治疗的同时，在相近的时间点重复步骤(d)和(e)至少一次。本发明的方法可用于筛选和临床上评价未知的、新的疗法或组合物对肠炎症疾病的疗效。此外，本发明的方法也可用于检验已知疗法对个体肠炎症疾病患者的疗效。另外，本发明的方法还可用以提供一种用于肠炎症疾病、有助于对该病进行诊断的预测性生物标志物。此外，本发明提供了筛选治疗肠炎症疾病的组合物的体外方法，该方法包括以下步骤a)提供包含至少一种肠源性细胞的生物样品；b)用所述组合物体外处理所述生物样品；c)组合物处理后某一时间测量生物样品中至少一种抗炎症细胞因子和至少一种促炎症细胞因子的水平；d)组合物处理后某一时间测定生物样品中至少一种抗炎症细胞因子与至少一种促炎症细胞因子的比率；特征在于，如果步骤(d)在处理后的生物样品中测得的比率高于在未经组合物处理的对照样品中同时测得的比率，则指示该组合物能抑制肠炎症疾病，而如果该比率与未经处理的对照样品中同时测得的比率相同或是更低，则指示该组合物不能抑制肠炎症疾病。
本文中方法适合应用于筛选和测定治疗肠炎症疾病的疗法和组合物的临床功效。肠炎症疾病包括炎症性肠胃失调和其他一些非限定的疾病，后者包括肠道易激综合症(IBS)和诸如溃疡性结肠炎和局限性肠炎这样的炎症性肠病(IBD)。本文中方法优选用于测定肠道易激综合症(IBS)疗法的功效。
本文中方法包括任何用于治疗肠炎症疾病的疗法和/或组合物。组合物可能包含一种或多种需要测定其疗效的成分，这些成分对肠炎症疾病，优选肠道易激综合症(IBS)，有潜在的疗效。组合物非限定的实施例包括抗炎症药物、益生菌组合物、未知是否对肠炎症疾病有疗效的新组合物和化合物、已知的能减轻肠炎症疾病症状的组合物与化合物和它们的新给药形式，以及上述组合物的混合物。
本发明的体内方法也用于测定个体肠炎症疾病患者对治疗所用组合物的反应。这使得个体肠炎症疾病患者所接受的一种特定疗法的疗效能够得到测定，从而使医生能够监控患者的病情发展并决定是否改变药物或是给药形式，以使对患者的治疗最优化。这将令患者得到更好的治疗，并将减少将治疗方法应用于对其不敏感的肠炎症疾病患患者群所引起的药品和金钱的浪费。
用于体内方法的生物样品本发明的方法包括在所述疗法实施前与实施中或实施后分别测量从受试哺乳动物获得的生物样品的细胞因子水平。适用于本文的受试哺乳动物非限定的实施例包括人、类人猿、犬科动物、猫科动物、牛、绵羊、猪、啮齿动物包括鼠科动物和大鼠、兔或马，优选人。本文使用的生物样品是本领域的技术人员所熟知的。本文所用的“生物样品”包括尿、血浆、血清、唾液、组织切片、脑脊液、体外刺激的外周血单核细胞、未经体外刺激的外周血单核细胞、体外刺激的肠淋巴组织、未经体外刺激的肠淋巴组织、肠灌洗液，以及上述样品的混合物。本发明体内方法所用的优选生物样品包括血清、组织切片、体外刺激的外周血单核细胞、未经体外刺激的外周血单核细胞，以及它们的混合物，更优选体外刺激的外周血单核细胞、未经体外刺激的外周血单核细胞，以及它们的混合物。外周血单核细胞(PBMC)可以通过一些本领域技术人员所知的方法，如Ficoll-Hypaque密度离心法，由经EDTA处理的未凝结的静脉血液获得。还更优选地，本发明的体内方法利用的是包含体外刺激的外周血单核细胞的生物样品。本文所用的经或未经体外刺激的“外周血单核细胞”术语，包括新鲜采集的PBMC、新鲜采集的PBMC的全细胞匀浆、从新鲜采集的PBMC中提取的蛋白质组分、从新鲜采集的PBMC中提取的mRNA、新鲜采集的PBMC的组织培养上清液、冷冻PBMC、冷冻PBMC的全细胞匀浆、冷冻PBMC中提取的蛋白质组分、冷冻PBMC中提取的mRNA、冷冻PBMC的组织培养上清液、采集的PBMC的体外培养物、采集的PBMC的体外培养物的全细胞匀浆、采集的PBMC的体外培养物中提取的蛋白质组分、采集的PBMC的体外培养物中提取的mRNA、采集的PBMC的体外培养物的组织培养上清液，以及它们的混合物。
本文所用“体外刺激”术语包括在供体体外对生物样品进行刺激，典型的是在一个实验室的组织培养装置中。优选的刺激物包括有丝分裂原、益生菌、本领域技术人员所知的抗CD3分子，以及它们的混合物。更优选地，刺激物包括有丝分裂原、益生菌，以及它们的混合物。
本文中，“有丝分裂原”包括能以高的比例诱导T细胞或者B细胞分裂的物质。本文所用的有丝分裂原包括外源凝集素、细菌脂多糖、超级抗原，以及它们的混合物。本文所用术语“超级抗原”包括这样的物质甚至当T细胞受体不能识别结合到MHC II类分子上的抗原肽时，它们也能结合到T细胞受体的V区(可变区)残基上，并能结合到抗原结合槽外面的MHC II类分子的残基上。本文所述的超级抗原的适当实施例包括葡萄球菌肠毒素、毒素性休克综合症毒素-1，以及它们的混合物。优选地，有丝分裂素包括外源凝集素、细菌脂多糖，以及它们的混合物。本文所述的外源凝集素的适当实施例包括伴刀豆球蛋白A(来源于刀豆)、植物血球凝集素(来源于菜豆)、美洲商陆有丝分裂原(来源于美洲商陆)，以及它们的混合物，其中优选植物血球凝集素(PHA)。本文中所述的细菌脂多糖的适当实施例包括大肠杆菌(E.coli)O111:B4、E.coli O55:B5、E.coli K-235(均购自Sigma(St Louis，MO))、明尼苏达沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺菌、肺炎克鲁伯氏菌、铜绿假单胞菌，以及它们的混合物。
益生菌是指对宿主有益的微生物或经加工后的微生物组合物。益生菌有益于宿主的机理目前仍然未知。除非另外指明，本发明中所述的“益生菌”还包括微生物发酵过程中产生的代谢物。这些代谢物或者被释放到发酵培养基中，或者储存于微生物体内。本文中所用的“益生菌”术语还包括用在治疗剂中时能对宿主产生有益作用的细菌、细菌匀浆、细菌蛋白、细菌提取物、细菌上清液，以及它们的混合物。因此，益生菌可包括酵母菌、霉菌和细菌。EP 0862863列出了一些当前已知的益生菌。本文使述的益生菌的适当实施例包括如下菌株婴儿长双歧杆菌(NCIMB 35624)、约氏乳杆菌(CNCM I-1225)、乳酸双歧杆菌(DSM20215)、乳酸乳杆菌(CNCM I-2216)，以及它们的混合物。本文中更多非限定的适用的益生菌参见WO 03/010297 A1，WO 03/010298 A1，WO 03/010299 A1(均公布于2003年2月6日并转让给了Alimentary Health Ltd.)。
用于体外方法的生物样品本发明的体外方法利用包含至少一种肠源性细胞的生物样品。使用肠源性细胞的体外方法已被发现优于以前所用的、使用别的组织如外周血单核细胞的体外方法。不受理论的约束，这种情况被认为是由两方面的相互作用造成治疗肠炎症疾病的组合物经过了筛选并且肠更能指示体内的正在发生的事件。本文的体外筛选方法被发现更易于识别潜在的肠炎症疾病疗法，并且与临床疗效有更好的相关性。不受理论的约束，这种情况被认为是由于在肠炎症疾病中，肠组织对调节炎症反应起主要作用，因而那些在体外能有益地改变肠源性细胞中细胞因子比率的组合物在体内有疗效的可能性更高。
本文中所用“肠源性细胞”术语包括来源于哺乳动物的肠或是肠相关组织的各类型细胞和细胞株，所述的相关组织包括胃、十二指肠、空肠、回肠、淋巴组织、肠系膜、腋窝、腹股沟、腿弯部、骨髓、盲肠、结肠、阑尾和直肠。此外，这些细胞类型也包括从所述组织中新鲜提取的细胞和提取后在体外经过了常规培养的各类型细胞，后者包括非永生细胞系和致癌永生细胞系。优选地，体外方法利用的生物样品包括新鲜提取的或是对其进行体外培养得到的肠相关的淋巴组织。更优选地，生物样品包括新鲜提取的或是对其进行体外培养得到的肠系膜淋巴结细胞。
此外，本发明的体外方法另外还包括在上述步骤(c)之前刺激生物样品的步骤。本文中所用“体外刺激”术语包括在取样对象的身体以外刺激生物样品，典型的是在一个实验室组织培养装置中。优选地，刺激物包括有丝分裂原、益生菌、本领域研究人员所知的抗CD-3分子，以及它们的混合物。更优选地，刺激物包括有丝分裂原、益生菌，以及它们的混合物。
本文中的“有丝分裂原”包括能以高的比例诱导T细胞或B细胞分裂的物质。本文中使用的有丝分裂原包括外源凝集素、细菌脂多糖、超级抗原，以及它们的混合物。本文中所用的“超级抗原”术语包括这样的物质甚至当T细胞受体不能识别结合到MHC II类分子上的抗原肽时，它们也能结合到T细胞受体的V区(可变区)残基上，并能结合到抗原结合槽外面的MHC II类分子的残基上。本文中所述的超级抗原的适当实施例包括葡萄球菌肠毒素、毒素性休克综合症毒素-1，以及它们的混合物。优选地，有丝分裂原包括外源凝集素、细菌脂多糖，以及它们的混合物。本文所述的外源凝集素的适当实施例包括伴刀豆球蛋白A(来源于刀豆)、植物血球凝集素(来源于菜豆)、美洲商陆有丝分裂原(来源于美洲商陆)，以及它们的混合物，优选植物血球凝集素(PHA)。本文中所述的细菌脂多糖的适当实施例包括E.coli O111:B4、E.coli O55:B5、E.coli K-235(均购自Sigma(St Louis，MO))、明尼苏达沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、弗氏志贺菌、肺炎克鲁伯氏菌、铜绿假单胞菌，以及它们的混合物。
益生菌是指对宿主有益的微生物或经加工后的微生物组合物。益生菌有益于宿主的机理目前仍然未知。除非另外指明，本发明中所述的“益生菌”还包括微生物发酵过程中产生的代谢物。这些代谢物或者被释放到发酵培养基中，或者储存于微生物体内。本文中所用的“益生菌”术语还包括用在治疗剂中时能对宿主产生有益作用的细菌、细菌匀浆、细菌蛋白、细菌提取物、细菌上清液，以及它们的混合物。因此，益生菌可包括酵母菌、霉菌和细菌。EP 0862863列出了一些当前已知的益生菌。本文中所述的益生菌的适当实施例包括如下菌株婴儿长双歧杆菌(NCIMB35624)、约氏乳杆菌(CNCM I-1225)、乳酸双歧杆菌(DSM20215、乳酸乳杆菌(CNCM I-2216)，以及它们的混合物。本文中更多非限定的适用的益生菌，参见WO 03/010297 A1，WO 03/010298 A1，WO 03/010299 A1(均公布于2003年2月6日并转让给了Alimentary Health Ltd.)。
细胞因子本发明的方法包括测量从受试哺乳动物获得的生物样品中至少一种抗炎症细胞因子和至少一种促炎症细胞因子的水平的步骤。在体内方法中，所述的样品在用待测组合物处理前和处理后都进行收集。本领域的技术人员知道，细胞因子是多效性的并表达多种的、有重叠的生物学活性。相应地，也应该懂得虽然本文中使用的细胞因子根据当前系统中各自的炎症反应进行分类，一些细胞因子能在某些病例中导致多于一种免疫反应的发生。因此，本文中的分类法是为了方便起见。
本发明使用的抗炎症细胞因子包括本领域已知的所有抗炎症细胞因子。本文中所述的抗炎症细胞因子的适当实施例包括白介素-4、白介素-5、白介素-13、白介素-10、转化生长因子-β，以及它们的混合物。本发明中优选的抗炎症细胞因子包括白介素-10(IL-10入藏号码CAA55201；GI收录ID14625940))，转化生长因子-β异构体1，2，3 and 4，以及它们的混合物。本发明使用的促炎症细胞因子包括本领域已知的所有促炎症细胞因子。本文中所述的促炎症细胞因子的适当实施例包括白介素-2、异二聚体白介素-12、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、干扰素-γ，以及它们的混合物。本文中优选的促炎症细胞因子包括异二聚体白介素-12(IL-12入藏号码chain A；1F45A，chain B；1F45B；GI收录IDchain A；1479640；chain B；1479641)、肿瘤坏死因子-α(TNF入藏号码AAC03542；GI收录ID2905634)、干扰素-γ(INF入藏号码NP_000610；GI收录ID10835171)，以及它们的混合物。
测量细胞因子水平的方法根据本发明的方法，需测量生物样品中至少一种抗炎症细胞因子和至少一种促炎症细胞因子的水平。测量抗炎症细胞因子水平或者促炎症细胞因子水平或者对二者均进行测量的方法包括本领域技术人员所知的所有方法。测量所述的抗炎症细胞因子和促炎症细胞因子的水平能通过测量mRNA的表达或是蛋白质的表达来进行，这一点已经为本领域的技术人员所知。这些方法的非限定性的实施例包括免疫吸附法、酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、基于微阵列平台的多重ELISA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、生物测定法、Westernblots、色谱分离系统、RT-PCR、竞争性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、mRNA直接测量法以及上述方法的联合使用。优选酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、色谱分离系统、Western blots以及这些方法的联合使用。更优选的方法包括编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA。本发明适用的ELISA方法包括本领域技术人员所知的所有方法，非限定性的实施例包括直接ELTSA、间接ELISA、直接夹心ELISA、间接夹心ELISA以及这些方法的联合使用。本文使用的编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA的一个非限定的、有可用商品的实施例，是LINCOplex分析试剂盒(购自Linco Research Inc.，Missouri，USA)联合BIOPLEXBEAD FLOW CYTOMETERTM(购自Bio Rad GmbH)一起使用。
比率本发明的方法包括测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率的步骤。在体内方法中，细胞因子的水平在治疗实施前与实施中或实施后都进行测定。在体外方法中，在经处理的生物样品中测定至少一种抗炎症细胞因子和至少一种促炎症细胞因子的水平，同时在未经处理的对照样品中进行同样的测定。对照样品的来源和处理组中使用的生物样品必须相同，并且必须使用本领域技术人员所知的方法和原则进行对照处理。本文中所述的抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率，意思是抗炎症细胞因子的水平除以促炎症细胞因子的水平，公式表达如下 不受理论的约束，据信根据本发明，如果在治疗后或治疗过程中测定的比率同治疗前或是未处理的对照样品中测定的比率相比出现升高的情况，则这种疗法被认为能抑制肠炎症疾病。本文中所述的比率可通过测定本文所述的任何抗炎症细胞因子和促炎症细胞因子来得到。优选地，本文所述的比率包括IL-10/IL-12的比率、IL-10/IFN-γ的比率、IL-10/TNF-α的比率，以及它们的组合。不受理论的约束，据信本文所述的特定比率对肠炎症疾病的发展和缓解来说是关键的，因而本文所述比率的变化，对所研究的疗法究竟是促进还是抑制疾病的发展起指示性作用。肠炎症疾病患者似乎有细胞因子分布偏移的现象，这是炎症的指示性特征。相似地，本文所用的在肠炎症疾病抑制剂处理后水平呈现最大变化的细胞因子指示，患者的PBMC向有更大的Th-1活性偏移，从而改变了正常的Th-1/Th-2平衡。令人惊奇的发现是，通过提高本文所述的比率，肠炎症疾病的症状可以得到减轻。不受理论的约束，据信这是由于通过提高本文所述的比率，治疗能使肠炎症疾病患者的该比率返回到或是接近于健康受试者的比率。
试剂盒本发明提供实施本发明方法的试剂盒。优选地，试剂盒包括第一测量单元或系统，用于在治疗前和治疗中或治疗后的至少一个时间点上，各测量受试哺乳动物生物样品中的至少一种抗炎症细胞因子，试剂盒还包括第二测量单元或系统，用于在治疗前和治疗中或治疗后的至少一个时间点上，各测量受试哺乳动物生物样品中的至少一种促炎症细胞因子，这样即可测定抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率在治疗前后的变化。这些测量单元或系统包括所有为本领域技术人员所知的测量单元或系统，非限定性的实施例包括免疫吸附法、酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、基于微阵列平台的多重ELISA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、生物测定法、Western blots、色谱分离系统、RT-PCR、竞争性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、mRNA直接测量法以及上述方法的联合使用，优选ELISA、RIA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、Western blots、色谱分离系统、直接测量法以及上述方法的联合使用，更优选编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA。本发明的试剂盒可以进一步包括从受试对象获取生物样品的方法和设备。这些方法和设备可包括静脉血液采集管和采集上述血液所需设备、尿或唾液采样管、从静脉血液中分离外周血单核细胞(PBMC)的方法以及上述方法设备的联合使用。
此外，本发明的试剂盒还可以包括使用说明书。使用说明书可以包括说明如何根据本发明测定比率的内容，和/或指示根据方法获得的结果有何意义的内容。关于使用说明书的一个非限定的实施例包括说明抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率增高指示此疗法抑制了肠炎症疾病的内容。
实施例体内方法给10名健康的成年人和13名自报到的肠道易激综合症(IBS)患者每日喂食100ml益生菌乳制剂，制剂中含浓度为108CFU/ml的婴儿双歧杆菌35624(一种潜在的IBS治疗物质)，持续三个星期。在治疗实施前和实施后分别从每位受试者体内抽取静脉血。将静脉血收集进血液采集管(CPTMVACUTAINER细胞分离管，含有肝素钠，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)。外周血单核细胞(PBMC)随后通过400xg离心从血液中分离出来，而后在本领域技术人员所知的适宜细胞培养条件下进行体外培养。本文中所有的细胞培养均使用含有100U/ml的青霉素G/100μg/ml链霉素(Gibco)、2.5μg/ml两性霉素B(Gibco)、292μg/ml L-谷氨酸盐(Gibco)和10％胎牛血清(#1103155，Gibco)的Dulbecco的基本培养基(DMEM)，但在测量TGF-β时不使用胎牛血清。分离出的PBMC混悬液稀释至活细胞量为1.3×106/ml，然后进行单独培养(无刺激物)或者和0.1μg/ml E.coli O111B4脂多糖(Sigma，StLouis，MO)、1μg/ml植物血球凝集素(PHA-Sigma，St Louis，MO)或107CFU/ml的完整婴儿双歧杆菌35624共同培养3天。随后将细胞上清液收集进离心管，在MRX-152离心机(Tomy Tech，Palo Alto，CA)中4℃，10 000rpm离心3分钟。取上清液进行分析。
上清液中的细胞因子数量使用LINCOplex分析试剂盒(购自LincoResearch Inc.，Missouri，US)在BIOPLEX BEAD FLOW CYTOMETERTM(Bio Rad，Hercules，CA)中进行分析。25μl上清液在微球板中进行孵育，微球表面有细胞因子如白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF)、干扰素-γ(INF)和转化增长因子-β(TGF)的特异性抗体涂层(LINCOplex分析试剂盒，购自LincoResearch Inc.，Missouri，US)。清洗过的微球混合物同链霉亲和素-藻红蛋白室温共孵育30分钟。同时已进行过梯度稀释的对照样品和标准样品也照上述步骤进行孵育。清洗过的微球混悬液用缓冲液重悬，用BIOPLEX系统进行读数。细胞因子水平计量单位为pg/ml。细胞因子水平。用Student的配对t-test统计分析普通人群和喂食人群细胞因子的水平和喂食的效果。
每日喂食益生素婴儿双歧杆菌35624三个星期后，在IBS患者经婴儿双歧杆菌35624体外刺激的PBMC细胞中，IL-10/IL-12比率从11.2±3.9(平均值±标准偏差)升高到了409.5±95.2。相似地，用别的益生菌如乳酸菌299V和乳酸菌GG对患者的PBMC细胞进行体外刺激，也能观察到IL-10/IL-12比率相似程度的升高(见图1)。
此外，喂食后的IBS患者的PBMC经益生菌(双歧杆菌)刺激后，IL-10/TNF-α的比率出现了从0.1±0.0到2.0±0.5的增长；在别的益生菌如乳酸菌4331和乳酸菌299V进行刺激后也能观察到类似的结果(见图2)。同样地，喂食后婴儿双歧杆菌35624的刺激也能引起IL-10/IFN-γ比率从0.7±0.1增长到14.1±2.3(见图3)。
此外，喂食婴儿双歧杆菌的IBS患者的平均腹部疼痛/不适程度下降了，而平均IL-10/IL-12比率则升高了。这种腹部疼痛/不适变化趋势和IL-10/IL-12比率变化趋势的负相关现象指示了IL-10/IL-12比率的升高是和腹部疼痛/不适这一IBS症状的减轻相关联的(见表1)。
体外方法本研究经Cork University Hospital的道德委员会批准。肠系膜淋巴结取自10名IBD患者(n＝10年龄19至41岁(平均32.2岁)，3女7男5名患CD；5名患UC)。所有患者均正在服用5′-氨基水杨酸。所有患者均因为病情恶化和类固醇反应失败而需要进行外科切除手术。外周血单核细胞(PBMC)来自于肠炎症疾病患者(n＝12)。年龄范围是20至51岁(平均28岁)。5女7男，5名患CD；7名患UC。
肠系膜淋巴细胞(MLNC)的提取选择肠系膜淋巴结(MLN)用于本研究是因为仔细考虑到其解剖学位置与肠炎症区域有关。所选的肠系膜淋巴结直接对肠炎症区域导流。就本组中所研究的3名患者来看，获得MLN排出的发炎的和未发炎的肠片断是可能的。MLN单细胞悬浮液通过将组织轻柔的推过一个网眼孔径180μ的金属网线筛而获得。细胞经清洗后再次悬浮在含有10％FCS(Invitrogen，Paisley，UK)的DMEM培养基(Dulbecco的改良细胞培养基)中。单细胞通过Ficoll-Hypaque密度离心进行分离，并用含有25mM葡萄糖，10％FCS，1％非必需氨基酸，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的DMEM完全培养基(Invitrogen，Paisley，UK)重悬，细胞浓度为1×106cell/ml。这些单细胞定义为肠系膜淋巴结细胞。
树突细胞提取来自肠系膜淋巴结和外周血液的树突细胞(DC)通过同样的程序进行分离。细胞以5×107cell/ml的浓度重悬在含4％FCS的PBS(无Ca2+或Mg2+)中。为使DC活力得到最佳的恢复，所有培养基中加入1mM EDTA，且细胞悬浮液加入抗-CD32抗体(StemCell，Meylan，France)进行封闭。根据制造商的操作规程，使用一个DC阴性提取试剂盒(StemSepTMdepletion cocktail，StemCell，Meylan，France)，从该细胞混悬液中分离DC。DC被重悬在Stemspan无血清培养基中(StemCell，Meylan，France)，细胞浓度为1×106cell/ml。其通过台盼蓝染色排除法(trypan blue exclusion)测定的成活力始终不低于98％。所制备DC的纯度通过流式细胞计数器进行估定。HLA-DR阳性的和CD3/CD14/CD16/CD19/CD20/CD56阴性的细胞定义为树突细胞。所有抗体均购自BD Biosciences(Oxford，UK)。
菌株我们以前报道过对唾液乳杆菌UCC118(L.salivarius)和婴儿双歧杆菌35624(B.infantis)的选择标准。L.salivarius和B.infantis通常在分别加入0.05％半胱氨酸(Sigma，Dublin，Ireland)的deMann，Rogosa和Sbarpe培养基，MRS(Oxoid，Basingstoke，UK)厌氧培养24至48小时。鼠伤寒沙门氏菌UK1(S.typhimurium)在大豆胰蛋白酶肉汤中(Oxoid，Basingstoke，UK)中需氧培养18至24小时。通过离心(3,000g×15min)获得细菌培养物，而后用PBS清洗，最后用DMEM稀释成浓度分别为1×107、1×105和1×103cfu/ml的组合物。
生物样品的体外处理所有细胞均接种于24孔组织培养板中(Costar，Schiphol-Rijk，Netherlands)，浓度为1×106cell/ml。MLNC用包含L.salivarius、B.infantis或S.typhimurium的组合物，在1×107CFU、1×105CFU和1×103CFU 3个细菌浓度下分别刺激72小时。由于1×107CFU的细菌浓度能明显刺激细胞因子的产生，在随后的一系列试验中均采用了此细菌浓度。提取自未发炎的肠中的MLNC用1×107CFU的细菌组合物刺激72小时。MLN源的DC用L.salivarius、B.infantis或S.typhimurium刺激24小时。未处理的对照生物样品则用以评估自然状态下分泌的细胞因子水平。培养板在37℃条件下，含5％CO2的潮湿空气中孵育，随后采集上清液进行细胞因子分析。根据制造商说明书，使用ELISA试剂盒(购自R&D Systems，Abington，UK)测量细胞因子的产量。需测量的细胞因子包括TNF-α、IL-12 p40、IL-10和TGF-β。
统计学分析使用ANOVA分析工具分析结果。数值表示为平均值±平均标准差形式。未受刺激细胞(对照)和细菌刺激细胞在细胞因子产量上的统计学显著差异当p＜0.05时能被接受。
结果从图4、5和6中可以看出，在体外受到益生菌(Bif.35624和Lb.118)刺激的肠源性细胞中的抗炎症细胞因子与促炎症细胞因子的比率大于未受刺激的对照样品中此两种细胞因子的比率。虽然这种趋势并不总是能达到统计学上的显著性，但它指示益生菌组合物和其他一些通常有助于治疗肠炎症疾病的组合物，在体内和肠组织间的相互作用与病原菌相比是不同的。据信这种趋势指示此组合物抑制了肠炎症疾病。从图4、5和6中可以看出，与对照相比，病原菌(沙门氏菌)刺激或者不能引起抗炎症细胞因子与促炎症细胞因子的比率的差异，或者出现所述比率降低这种更典型的结果。同样地，虽然这种差异并不总是能到达统计学上的显著性，它仍然指示了此种组合物不是肠炎症疾病的抑制物。
权利要求
1.一种用于测定治疗哺乳动物肠炎症疾病疗法功效的体内方法，所述体内方法包括以下步骤a)测量采自受试哺乳动物的生物样品中至少一种抗炎症细胞因子水平和至少一种促炎症细胞因子的水平；b)测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；c)实施所述疗法；d)在所述疗法实施后的某一时间，在所述哺乳动物的生物样品中测量至少一种抗炎症细胞因子水平和至少一种促炎症细胞因子水平；e)所述疗法实施后，测定至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；其中所述疗法实施后，抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率升高指示所述疗法抑制了肠炎症疾病，抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率不变或降低指示所述疗法不抑制肠炎症疾病。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子选自白介素-10、转化生长因子-β、白介素-4、白介素-5、白介素-13，以及它们的混合物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子选自白介素-10、转化生长因子-β，以及它们的混合物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述促炎症细胞因子包括白介素-12、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、白介素-2，以及它们的混合物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述促炎症细胞因子包括白介素-12、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ，以及它们的混合物。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率是白介素-10/白介素-12的比率。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率是转化生长因子-β/白介素-12的比率。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率是白介素-10/干扰素-γ的比率。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包括尿、血浆、血清、唾液、组织切片、脑脊液、体外刺激的外周血单核细胞、未经体外刺激的外周血单核细胞、体外刺激的肠淋巴组织、未经体外刺激的肠淋巴组织、肠灌洗液，以及它们的混合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述生物样品包括血清、体外刺激的外周血单核细胞、未经体外刺激的外周血单核细胞，以及它们的混合物。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述生物样品包括体外刺激的外周血单核细胞、未经体外刺激的外周血单核细胞，以及它们的混合物。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述体外刺激包括有丝分裂原、益生菌、抗CD-3分子，以及它们的混合物。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述体外刺激包括有丝分裂原。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述有丝分裂原包括脂多糖、外源凝集素、超级抗原，以及它们的混合物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述外源凝集素包括伴刀豆球蛋白A、植物血球凝集素、美洲商陆有丝分裂原，以及它们的混合物。
16.如权利要求1所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种抗炎症细胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微阵列平台的多重ELISA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、生物测定法、Western blots、色谱分离系统、RT-PCR、竞争性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接测量法，以及上述方法的联合使用。
17.如权利要求16所述的方法，其中测量所述生物样品中抗炎症细胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法RIA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA以及上述方法的联合使用。
18.如权利要求17所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种抗炎症细胞因子水平的方法包括编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA。
19.如权利要求1所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种促炎症细胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微阵列平台的多重ELISA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、生物测定法、Western blots、色谱分离系统、RT-PCR、竞争性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接测量法，以及上述方法的联合使用。
20.如权利要求19所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种促炎症细胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA，以及上述方法的联合使用。
21.如权利要求20所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种促炎症细胞因子水平的方法包括编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一测量单元或系统，用于在治疗前和治疗中或治疗后的至少一个时间点上，测量采自受试哺乳动物的生物样品中的至少一种抗炎症细胞因子，试剂盒还包括第二测量单元或系统，用于在治疗前和治疗中或治疗后的至少一个时间点上，测量采自所述受试哺乳动物的生物样品中的至少一种促炎症细胞因子，其中可确定抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率在治疗施行后发生的变化，试剂盒还包括指导使用者测定抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子在治疗前后的比率的使用说明书，所述的抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率升高指示疗法抑制了肠炎症疾病。
23.如权利要求22所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括在治疗前后获取所述生物样品的用具。
24.一种用于筛选治疗肠炎症疾病的组合物的功效的体外方法，所述体外方法包含以下步骤a)提供包含至少一种肠源性细胞的生物样品；b)用组合物体外处理所述生物样品；c)组合物处理后某一时间测量生物样品中至少一种抗炎症细胞因子与至少一种促炎症细胞因子的水平；d)组合物处理后某一时间测定生物样品中至少一种抗炎症细胞因子对至少一种促炎症细胞因子的比率；特征在于，如果组合物处理过的生物样品经步骤d)测得的比率高于在未经组合物处理的对照样品中同时测得的比率，则指示该组合物是肠炎症疾病的抑制剂，如果组合物处理过的生物样品经步骤d)测得的比率与未经组合物处理的对照样品中同时测得的比率相同或是更低，则指示该组合物不是肠炎症疾病的抑制剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述生物样品包括肠关联的淋巴组织。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述肠关联的淋巴组织包括肠系膜淋巴结细胞。
27.如权利要求24所述的方法，所述方法还包括在步骤(c)之前体外刺激生物样品的附加步骤。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子从以下范围内选择白介素-10、转化生长因子-β、自介素-4、白介素-5、白介素-13，以及它们的混合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子选自白介素-10、转化生长因子-β，以及它们的混合物。
30.如权利要求24所述的方法，其中所述促炎症细胞因子包括白介素-12、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、白介素-2，以及它们的混合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述促炎症细胞因子包括白介素-12、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ，以及它们的混合物。
32.如权利要求24所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率是白介素-10/白介素-12的比率。
33.如权利要求24所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率是转化生长因子-β/白介素-12的比率。
34.如权利要求24所述的方法，其中所述抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率是白介素-10/干扰素-γ的比率。
35.如权利要求27所述的方法，其中所述体外刺激包括有丝分裂原、益生菌、抗CD-3分子，以及它们的混合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述体外刺激包括有丝分裂原。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述有丝分裂原包括脂多糖、外源凝集素、超级抗原，以及它们的混合物。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述外源凝集素包括伴刀豆球蛋白A、植物血球凝集素、美洲商陆有丝分裂原，以及它们的混合物。
39.如权利要求24所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种抗炎症细胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微阵列平台的多重ELISA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、生物测定法、Western blots、色谱分离系统、RT-PCR、竞争性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接测量法，以及上述方法的联合使用。
40.如权利要求39所述的方法，其中测量所述生物样品中抗炎症细胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA，以及上述方法的联合使用。
41.如权利要求40所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种抗炎症细胞因子水平的方法包括编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA。
42.如权利要求41所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种促炎症细胞因子水平的方法包括ELISA、放射免疫法、基于微阵列平台的多重ELISA、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA、生物测定法、Western blots、色谱分离系统、RT-PCR、竞争性RT-PCR、Northern blots、基因芯片、m-RNA直接测量法，以及上述方法的联合使用。
43.如权利要求42所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种促炎症细胞因子水平所述的方法包括ELISA、放射免疫法、编码的微球结合流式细胞仪检测系统的多重ELISA，以及上述方法的联合使用。
44.如权利要求43所述的方法，其中测量所述生物样品中所述至少一种促炎症细胞因子水平的方法包括编码的微球结合流式细胞仪检测系统的ELISA。
45.一种用于筛选治疗肠炎症疾病的组合物的功效的试剂盒，所述试剂盒包括第一测量单元或系统，用于测量包含肠源性细胞的生物样品中的至少一种抗炎症细胞因子，试剂盒还包括第二测量单元或系统，用于测量包含肠源性细胞的生物样品中的至少一种促炎症细胞因子，其中抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率在经组合物刺激的样品和对照样品间的差异可以被测定，试剂盒还包括指导使用者测定抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率的使用说明书，处理样品中抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率高于对照样品中抗炎症细胞因子对促炎症细胞因子的比率，指示是肠炎症疾病的抑制剂。
全文摘要
本发明提供了测定治疗哺乳动物肠炎症疾病的疗法功效的新方法。本方法用于筛选肠炎症疾病的疗法，并测定疗法的功效，还用以测定肠炎症疾病患者个体对给定治疗的疗效反应。此外，还提供了实施本方法的试剂盒。
文档编号G01N33/68GK1764838SQ200480008149
公开日2006年4月26日 申请日期2004年3月31日 优先权日2003年4月1日
发明者K·－S·陈, J·K·柯林斯, B·P·基利, F·罗, L·D·奥马奥尼, R·P·菲利浦森, F·沙纳汉 申请人:宝洁公司, 营养卫生有限公司