专利名称：用内部参考斑点减少微阵列变异的制作方法
背景技术：
以下描述提供与本发明有关的信息概述，而不是承认提供的消息或其中参考的出版物中任何一条是本发明的现有技术。
微阵列是以小的斑点(约1mm或更小)沉积到合适的固相支持物上的离散捕获因子的阵列或模式。微阵列的合适固相支持物的例子是具有多个测试区的聚丙烯平板或其它的平板，平板上的测试区内沉积斑点的阵列。试剂和大量样品被添加到所述测试区以检测靶配体。
使用微阵列的分析能够以多种方法进行，包括众所周知夹心技术。在所述夹心技术中，分析中使用靶配体，靶配体检测器，和捕获配体。“靶配体“和“抗-配体”是能够通过结合到其它分子形成复合物的抗原，抗体，结合蛋白，半抗原，激素受体，及其他生物分子。捕获配体是结合到靶配体的抗配体。“靶配体检测器”是还结合到靶配体或靶配体-捕获配体复合物的标记的抗-配体。
在夹心分析中，捕获配体结合到靶配体上至少一个位点以形成第一复合物，从而捕获或连接到所述靶配体。靶配体检测器还结合到靶配体以形成第二复合物。所述夹心复合物中标记的成分能够表明在微阵列中的特定位置存在靶配体。
微阵列可用于检测小体积样品中一种或多种靶配体的存在。然而，微阵列通常确定靶配体是否存在，而不定量所述靶配体。微阵列中各靶配体的定量对于许多应用而言是非常有用的或关键，并将改善和扩展微阵列的用处。
精确的定量在微阵列形式上的靶配体是复杂的；分析过程中任何阶段的可变条件能够影响精确性。这些变量是显著的并减少精确性。可变条件可在分析过程的一个和多个阶段发生，来自1)将捕获因子作为斑点沉积到微阵列上，2)将样品和试剂沉积到微阵列，3)温育样品和试剂，和/或4)在检测和测量对应于各靶配体的信号的过程中。添加样品或捕获因子到微阵列中的过程能够导致可变量的累积。如果使用可见的标记来检测靶配体，那么灰尘，不均匀的照明，调焦问题，和/或仪器问题都可引起所述标记的强度检测和测量的易变性。温度，湿度，温育时间，和振动是在使用微阵列的分析中发生的其它变量。变量还能在阵列内的不同测试区发生。所有这些因素皆影响微阵列在检测和测量靶配体时的性能和精确性。需要考虑和校正靶配体检测和测量中的变量的微阵列分析方法。
由于斑点是小型的，所以对应于直接地或间接地连接于各靶配体的各标记物的信号强度的检测和定量是非常复杂的。精确鉴定各捕获位点在各测试区域内的位置和各靶配体在标记的复合物中对应的身份是关键的。微阵列，通常缺乏使用户能容易和迅速地确定微阵列中在测的对应于各靶配体的斑点的内部标记物或参考点。缺少内部参考点导致使用微阵列时用户不得不以耗时的方式定位或排列对应于微阵列中捕获的靶配体的斑点。根据在微阵列中正在进行测试的不同靶配体的数量，能够延迟对试验结果的分析。
因此，存在对下列微阵列分析方法的需求其是定量的；提高微阵列分析的精确性；便于定向或对齐微阵列以保证点在各阵列中的准确检测；以及无需昂贵的和耗时的方法定量捕获的靶配体。
发明概述本发明满足了需要。本发明提供使用内部参考斑点以提高精确性和减少微阵列变异的系统。本发明的系统包括微阵列装置，分析方法和形成微阵列的方法。
根据本发明，确定样品中多个靶配体的数量的微阵列装置包含，具有多个测试区的固相支持物；多个固定到测试区的不同靶捕获配体；以及至少一个固定到测试区的参考捕获配体，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体。
根据本发明，确定样品中多个靶配体的数量的微阵列装置包含具有多个几何形状基本上相同的测试区的固相支持物；多个固定到测试区的不同靶捕获配体；以及至少一个固定到测试区的参考捕获配体，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体，所述参考捕获配体位于各测试区基本上相同的位置。
上述微阵列装置的实施方案包括具有一种或者多种以下组件的装置至少一个没有参考捕获配体的测试区；至少一个没有靶捕获配体的测试区；以及其中所述靶捕获配体已经放置到预定的阵列中。
在上述微阵列装置的优选实施方案包括的装置中，靶捕获配体和参考捕获配体的位置在预定的阵列中，以及所述参考捕获配体处于阵列中至少两个空间隔开的位置。更优选，参考捕获配体处于阵列中至少两个角落位置。最优选，参考捕获配体处于阵列中至少三个角落位置。
根据本发明，用于确定多个不同靶配体的分析法包括选择如上所述的本发明的微阵列装置的步骤。另一个步骤是在至少一个测试区放置(i)含有靶配体的样品，其中至少一些靶配体被靶捕获配体捕获，(ii)参考配体，其中至少一些参考配体被参考捕获配体捕获，(iii)与捕获的参考配体形成复合物的参考配体检测器，和(iv)与捕获的靶配体形成复合物的靶配体检测器。该方法的另一个步骤是检测复合物中参考配体检测器和靶配体检测器的量。
在上述分析法的实施方案中，靶捕获配体和参考捕获配体固定在微阵列装置预定的阵列中，以及所述参考捕获配体固定到阵列的至少两个角落位置上。
根据本发明，用于确定样品中多个靶配体的数量的微阵列形成方法，所述微阵列包括选择具有多个几何形状基本上相同的测试区的固相支持物的步骤。另一个步骤是将预定阵列中的多个不同的靶捕获配体和至少一个参考捕获配体固定在测试区上，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体。
上述微阵列形成方法的实施方案包括形成其中至少一个测试区没有参考捕获配体；和其中至少一个测试区没有靶捕获配体的微阵列。优选，如上述微阵列形成方法，固定至少一个参考捕获配体的步骤包括参考捕获配体被固定到阵列的至少两个角落位置上。最优选，如上述微阵列形成方法，固定至少一个参考捕获配体的步骤包括参考捕获配体被固定到阵列的至少三个角落位置上。
附图本发明的这些特征，方面和优点通过以下说明书，权利要求书和附图将变得更容易理解，其中
图1描述了微阵列测试区内的阵列，并鉴定阵列内对应于内部参考斑点和检测斑点或靶配体斑点的位置。
图2显示本发明利用基于IL-8微阵列的免疫测定技术的标准化结果并校正分析过程中打印和混合差异后的变异系数(“CV”)的比较图。
图3是类似于图2的图表，本发明的IL-8微阵列分析的标准化结果，其中对不同温育时间比如30，45，60和75分钟的可变量进行调节。
图4描述了使用本发明预定的栅格或模式，以沉积对应于测试区内阵列中待捕捉的特异靶配体的特异性捕获寡核苷酸。
具体实施例方式
以下讨论描述本发明的实施方案和这些实施方案的多个变体。然而该讨论不应被理解为将本发明限制至这些具体的实施方案。本领域技术人员将还识别许多其它的实施方案。
A.定义此处使用的“微阵列”是指以小斑点沉积在合适的固相支持物上测试区中离散的捕获因子的阵列或模式。
此处使用的术语“测试区”是指对应于并且直接围绕微阵列中的阵列的任何表面区域。例如，“测试区”包括微量培养板的微孔内的表面区域或玻璃载玻片的表面区域或珠子的表面区域，其中所述斑点沉积作为阵列。
此处使用的术语“测试孔”是指微量培养板的孔内的表面区域或玻璃载玻片的表面区域，其中所述斑点沉积作为不同的阵列。
此处使用的术语“捕获因子”是指能够在适当条件下杂交到附着于捕获配体的互补寡核苷酸的“捕获配体”或捕获寡核苷酸。
此处使用的术语“捕获配体”是指捕获或结合到“靶配体”的任何生物分子。
此处使用的术语“捕获寡核苷酸”指固定或附着于固相支持物上能够结合附着于捕获配体上的互补寡核苷酸的寡核苷酸。
此处使用的术语“互补寡核苷酸”或“与捕获寡核苷酸互补的寡核苷酸”是指附着于捕获配体的核苷酸序列，其在适于杂交的条件下杂交到捕获寡核苷酸从而形成双链核酸二链体。
此处使用的术语“生物分子”或“靶配体”或“抗-配体”包括任何有机分子，并且包括但是不局限于寡核苷酸，核酸，比如DNA和RNA，多肽，半抗原和糖类。
此处使用的术语“多肽”包括但是不局限于蛋白质的和抗体，以及其任何片段。
此处使用的术语“半抗原”是指小分子，比如药物，激素，以及合成的化合物，包括但不限于与使用治疗性药物和滥用药物相关的化合物。与药物滥用有联系的半抗原的例子包括但是不局限于与可卡因，吗啡，和烟碱的代谢或使用有关的化合物。治疗药物的半抗原的例子包括但是不局限于与托布拉霉素，苯巴比妥，3-二甲基嘌呤，拉诺辛和正泰霉素的利用有关的化合物。
此处使用的术语“靶配体检测器”是指还结合到所述靶配体形成结合物的标记的抗-配体。
此处使用的术语“参考配体”是指与“靶配体”属于相同类型的生物分子，并且用来使阵列中靶配体的微阵列分析结果标准化的“生物分子”。
此处使用的术语“参考配体检测器”是指标记的抗-配体，其还结合到所述参考配体以形成结合物。
此处使用的术语微阵列的“定位”或“定向”或“排列”或“对齐”是指安置所述微阵列或检测仪器以排列阵列中的各点用于检测和测量。斑点在各测试区之内的位置基于沉积方法而稍有变化，而小斑点位置细微变化能够影响准确性。
此处使用的术语“校正信号”是指响应于检出的已知量参考配体的强度，调节与靶配体有关的信号，从而改善靶配体测量的准确性。
B.本发明本发明提供方法用于定量测定微阵列中的靶配体；用于调整能够在微阵列分析过程中产生的变异以改善分析的精确性；和为更准确的分析促进微阵列的定向；和容许使用相对便宜的和节省时间的程序测量捕获的靶配体。
本发明用于比如各种靶配体或生物分子的分析的诊断程序。本发明可被用于，例如包括分析细胞因子的数量和存在，生物体中疾病状态的存在，治疗药物的数量和存在，以及检测造成潜在感染的核酸的测定中。
本发明使用以离散斑点沉积在合适的微阵列基材上的捕获因子。合适的微阵列基材是任何具有适当的化学性质的表面，其中微阵列打印机或其它的装置可用于将捕获因子以显微斑点沉积至基材上。微阵列基材包括但是不局限于下列表面平板状显微镜载玻片；硝酸纤维素，尼龙和PVDF制成的柔性膜；以及玻璃，聚丙烯酸酯类，聚苯乙烯，聚丙烯，和聚碳酸酯制成的微孔滴定板。表面固定有捕获因子的微阵列还可以是可商购的。例如，Pierce Chemical Co.，PO Box 117，Rockford，IL 61105销售含有低密度捕获因子阵列的96孔微量培养板(零件号码84682至84689)。
在本发明中，以对应于用于鉴定阵列中各具体靶配体和参考配体的存在并定量的位置的指定模式将捕获因子以小斑点沉积到微阵列基材上。对应于用于具体靶配体或参考配体的捕获因子的模式中的各斑点或阵列中的斑点可以是空的(即，没有捕获因子)。参考配体在各测试区提供内部参考斑点，其与所述靶配体的捕获因子接受相同的条件。整个分析中，各测试区的内部参考斑点接受影响在该测试区中靶配体的检测和测量的相同条件，比如沉积斑点的变异性，样品，试剂，温度或分析程序中其它变量。
对应于栅格中具体位置的指定模式或“预定栅格”的一个实例在图4中描绘，在该位置靶配体和参考配体被捕获。在图4，所述斑点对应于其中靶配体，或参考配体通过本发明的分析设法被捕获的位置。
图4描绘的模式中待捕获的具体的靶配体是IL-1b(白介素1b)；IL-2(白介素2)；IL-4(白介素4)；IL-6(白介素8)；IL-8(白介素8)；IL-10(白介素10)；IL-12(白介素12)；FGFb(碱性成纤维细胞生长因子)；GM-CSF(粒细胞/单核细胞集落刺激因子)；INFg(γ干扰素)；TNFa(α肿瘤坏死因子)；VEGF(血管内皮生长因子)；和USER(被用户选择的靶配体或空白斑点(没有靶配体))，通常是与上述靶配体不同的靶配体。本领域的一般技术人员将知晓对可处于测试区域的阵列中的指定模式存在各种不同的置换。
图4中名称REF是通常不存在于进行分析的样品中的参考配体。在实施例1描述的实验中，参考配体REF是TNFα，并且未使用USER靶配体(即，空白斑点)。
在本发明中，一种或者多种内部参考斑点可被沉积到测试区域上，并且只受到该测试区域斑点数目的限制。然而，随着在该测试区域内部参考斑点数目增加，相应的可以检测靶配体的斑点数目减少。
在本发明中，内部参考斑点沉积在各测试区内相同的位置。内部参考斑点能够沉积在测试区的任何位置。然而，内部参考斑点优选的位置位于一个或多个角上，如果角以成形的结构存在。图1描述了微阵列测试区内的阵列，并鉴定测试斑点(或靶配体捕获斑点)和参考斑点(或内部参考配体捕获斑点)。
在本发明的优选方案中，用于参考配体的捕获因子沉积在各测试区相同的三个角上。将用于参考配体的捕获因子定位在角上使得所述仪器或微阵列更容易定向或对齐，以对阵列中各斑点更准确的检测。作为改善定量的参照物，参考斑点可以放置在任何地方。将所述斑点放置在4个角中的3个上给出分析软件分散和再现的参考点，以放置用于鉴定和定量剩余斑点的‘映象’。借助于这些分散和可重现的参考点，软件能够被设计或修改为在不介入这部分试验获得数码照片之后自动地定位和映射微阵列。
在本发明的方法中用作捕获因子的生物分子是具有活性基团的分子，其在沉积捕获因子到微阵列上的步骤过程中结合到合适的微阵列基材上。具有至少一个活性氨基，巯基或羟基的生物分子能够结合到微阵列基材供本发明之用。具有至少一个活性氨基、巯基或羟基的多肽、半抗原和糖类，能够购自Sigma，P.O.Box 14508，St.Louis MO63178。在沉积捕获因子到微阵列上的步骤中能够与合适的微阵列基材结合的寡核苷酸包括氨基衍生的寡核苷酸和具有至少一个游离巯基的寡核苷酸。氨基寡核苷酸能够在3’氨基改性剂C7 CPG(购自GlenResearch，22825 Davis Drive，Sterling，佛吉尼亚20164)上按照制造商的规程使用DNA合成仪ABI 394(购自Applied Biosystems，850Lincoln Centre Drive，Foster City，CA 94404)合成。氨基能够放置在寡核苷酸3′末端或5′末端。3′氨基寡核苷酸优选用于本发明氨基寡核苷酸的制备。制备氨基衍生的寡核苷酸的方法还描述于U.S.专利号6,110,669中，其在此引入作为参考。此外，具有至少一个游离巯基的寡核苷酸能够在购自Glen Research的支持物上按照该厂家规程合成。
斑点能够使用各种不同的方法沉积或打印到合适的微阵列基材上。沉积斑点到微阵列上的方法对本领域技术人员而言是公知的。参见例如，美国专利号6,312,960，此处其被引作参考。举例来说，而不是作为限制，喷墨技术和压电微喷印刷技术已经用于输出小量的溶液，并且称为在固相支持物“打印”斑点。打印生物分子到固相支持物上的一个方法描述于美国专利号6,146,833中，其在这里引作参考。另一个沉积斑点的方法是接触印刷，其中针被浸渍到待打印分子的溶液中，并且与释放可重现体积的液体的表面接触。毛细管打印是又一个在微阵列中沉积斑点的方法。
根据作为斑点沉积到微阵列上的捕获因子的类型，需要有效进行分析的条件能够改变。然而，使用具体分析的条件是本领域技术人员公知的，包括而不是局限于使用比如寡核苷酸，细胞，多肽比如抗体的捕获因子。参见例如Wang H，Wang H，Zhang W，Fuller GN.，Tissuemicroarraysapplications in neuropathology research，diagnosis，andeducation.(组织微阵列在神经病理学研究、诊断和教育中的应用)，Brain Pathol 2002 Jan；12(1)95-107(组织微阵列)；Mousses S，Kallioniemi A，Kauraniemi P，Elkahloun A，Kallioniemi OP.，Clinical andfunctional target validation using tissue and cell microarrays(使用组织和细胞微阵列的临床和功能靶确认)，Curr Opin Chem Biol 2002 Feb；6(1)97-101(细胞微阵列)；Wilson DS，Nock S.，Functional proteinmicroarrays(功能蛋白微阵列)，Curr Opin Chem Biol 2002Feb；6(1)81-5(总蛋白微阵列)；Schweitzer B，Kingsmore SF.，Measuring proteins onmicroarrays(在微阵列上测量蛋白)，Curr Opin Biotechnol 2002 Feb；13(1)14-9(抗体微阵列)，和Shoemaker，DD，和Linsley，PS Recentdevelopments in DNA microarrays(DNA微阵列最新进展)，Curr OpinMicrobiol 5(3)334-7，June 2002(DNA微阵列)。
当捕获寡核苷酸作为斑点沉积到微阵列上时，分析中在一些点添加连接到互补寡核苷酸的捕获配体。所述连接到互补寡核苷酸的捕获配体能够是抗原，抗体，结合蛋白，半抗原，激素受体，激素，植物血凝素，糖类，代谢物，药物，酶底物，或病毒蛋白质。所述寡核苷酸附着到抗原，抗体，结合蛋白，半抗原，激素受体，激素，植物血凝素，糖类，代谢物，药物，酶底物，和病毒蛋白质是本领域技术人员公知的技术。参见美国专利号5,648,213，此处其被引作参考。将抗体作为结合物连接于寡核苷酸上的优选方法描述在2001年10月24日提交的序列号10,032,592，发明名称为“蛋白质-寡核苷酸结合物的高效合成”的专利申请中，其在这里引作参考。
在使用寡核苷酸的分析中，条件有时必须适于允许互补寡核苷酸杂交以捕获寡核苷酸形成核酸二链体。利于通过寡核苷酸形成核酸复合物的条件本领域普通技术人员是公知的。(正如下列文献所述，例如，Sambrook和Russell，分子克隆实验室手册，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，或Current Protocols in MolecularBiology.Frederick Ausubel编辑，John Wiley and Sons Publishing，NewYork，1987)用于本发明的捕获和互补寡核苷酸的长度为大约15到大约45个碱基寡核苷酸。所述捕获和互补寡核苷酸优选分别为大约20到大约30个碱基寡核苷酸。
优选的捕获寡核苷酸和互补寡核苷酸对，描述于2003年4月18号提交的申请序列号10/419,020，代理人Docket No.13796，发明名称为“用于多重结合阵列的寡核苷酸对”，在这里以其全文引作参考。所述优选的寡核苷酸对在室温下杂交形成核酸二链体，基本不具有交叉杂交。这对存在多重靶配体的分析检测适用。根据本发明检测多重靶配体时，这些是优选的序列。
在本发明的优选实施方案中，沉积到微阵列上的斑点是捕获寡核苷酸，其对于各靶配体和参考配体是不同的。所述捕获和互补寡核苷酸从上面鉴定的寡核苷酸对中选出。
各种不同类型的可检测标记能够被直接地连接于捕获的或互补的寡核苷酸并用于本发明。那些可检测标记包括但是不局限于荧光团，放射性，化学发光，生物发光，酶，浊度，比浊，和可见的标记。可被用于本发明的荧光团的例子包括但是不局限于罗丹明110、rhodal、荧光素、香豆精和罗丹明110、rhodal或荧光素的衍生物。花青染料比如Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7。可被用于本发明的放射性标记的例子包括但是不局限于32P、33P、35S、3H和125I。可被用于本发明的化学发光标记的例子包括但是不局限于吖啶酯、钌复合物、金属络合物、乙二酸酯-过氧化物组合。可被用于本发明的酶标记的例子包括但是不局限于碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶。可被用于本发明的可见标记的例子包括但是不局限于thiopeptolides、anthroquinone染料、硝基四唑蓝、邻硝基苯酚β-D-半乳糖苷-piranoside(ONPG)、胶体金和微颗粒。上面论述的相同类型的标记能用于检测器配体。将可探测标记连接于寡核苷酸上的方法对本领域的技术人员是公知的。比如，上述的方法描述于Yang和Millar，Methods inEnzymology，Vol.278，417-444页，1997。
所述标记的测量和检测依赖于分析中所用标记的类型，和基于本领域技术人员公知的厂家或其它的规程。参见比如，美国专利5,316,906，其描述了形成萤光沉淀的酶底物的应用，其在这里引作参考。当分析中使用荧光团作为标记，数据能够以整个微阵列的数码照片的形式被采集。参考斑点和靶配体特异的斑点能够同时在数码照片中检测到。
在标记检测之时或之后，对收集自参考斑点数据使用算法以对属于微阵列中其他斑点的数据进行标准化(normalize)或换算(scale)。虽然许多标准化算法是可能的，一个算法被用于产生本发明的表和实施例中显示的数据；即，靶配体特异的信号(斑点)除以来自参考斑点数目结果的平均值。
因为参考斑点的定量基于与同一微阵列上其它斑点接受相同条件的已知量的参考配体，能够换算来自未知浓度的靶配体的结果，和改善它们的孔与孔之间的重复性。图2为利用本发明IL-8微阵列的标准化结果的图，并对测定中打印过程和混合进行调整。图2显示出分析步骤之前打印过程和分析步骤中混合发生变化时通过此方法在1000，100，10和1pg/mL IL-8生成的信号强度的精确度的改进(即，CV的减少)。图3是类似于图2的图表，本发明的IL-8微阵列分析的标准化结果，其中对不同温育时间比如30，45，60和75分钟的可变量进行调节。
本发明提供使用内部参考斑点以减少微阵列变异的系统。本发明的系统包括微阵列装置，分析方法和形成微阵列的方法。
根据本发明，确定样品中多个靶配体的数量的微阵列装置包含，具有多个测试区的固相支持物；多个固定到测试区的不同靶捕获配体；以及至少一个固定到测试区的参考捕获配体，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体。
根据本发明，确定样品中多个靶配体的数量的另一微阵列装置包含，具有多个几何形状基本上相同的测试区的固相支持物；多个固定到测试区的不同靶捕获配体；以及至少一个固定到测试区的参考捕获配体，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体，所述参考捕获配体位于各测试区基本上相同的位置。
上述微阵列装置的实施方案包括具有一种或者多种以下组件的装置至少一个没有参考捕获配体的测试区；至少一个没有靶捕获配体的测试区；以及其中所述靶捕获配体已经放置到预定的阵列中。
在上述微阵列装置的优选实施方案包括的装置中，靶捕获配体和参考捕获配体的位置在预定的阵列中，以及所述参考捕获配体处于阵列中至少两个空间隔开的位置。更优选，参考捕获配体处于阵列中至少两个角落位置。最优选，参考捕获配体处于阵列中至少三个角落位置。
根据本发明，用于确定多个不同靶配体数量的分析法包括选择如上所述的本发明微阵列装置的步骤。另一个步骤是在至少一个测试区放置(i)含有靶配体的样品，其中至少一些靶配体被靶捕获配体捕获，(ii)参考配体，其中至少一些参考配体被参考捕获配体捕获，(iii)与捕获参考配体形成复合物的参考配体检测器，和(iv)与捕获的靶配体形成复合物的靶配体检测器。该方法的另一个步骤是检测复合物中参考配体检测器和靶配体检测器的量。
在上述分析法的实施方案中，靶捕获配体和参考捕获配体固定在微阵列装置上的预定阵列中，以及所述参考捕获配体固定到阵列的至少两个角落位置上。
根据本发明，用于确定样品中多个靶配体的数量的微阵列形成法，所述微阵列包括选择具有多个几何形状基本上相同的测试区的固相支持物的步骤。另一个步骤是将预定阵列中的多个不同的靶捕获配体和至少一个参考捕获配体固定在测试区上，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体。
上述微阵列形成法的实施方案包括形成的微阵列中，至少一个测试区没有参考捕获配体；和至少一个测试区没有靶捕获配体。优选，如上述微阵列形成法中，固定至少一个参考捕获配体的步骤包括参考捕获配体被固定到阵列的至少两个角落位置上。最优选，在上述微阵列形成法中，固定至少一个参考捕获配体的步骤包括参考捕获配体被固定到阵列的至少三个角落位置上。
本发明不局限于本节描述的优选实施例。该实施方式仅为示例性，本领域技术人员会认识到，本发明可能有许多其它的实施方式。刚才概括地描述本发明，其通过对照以下实施例将更容易理解，实施例在此作为例证而提出，并不是对本发明的限制，除非另有规定。
实施例1根据本发明使用微量培养板的微阵列测定的制备和分析在本实施例中，A2(A2是阵列内阵列的缩写)平板是用作微阵列基材的微量滴定板。A2平板市场上不能买到。A2平板是由96个测试孔组成的聚丙烯平板，由Beckman Coulter制造。预处理方法被用于A2微量滴定板表面以产生与寡核苷酸上的胺基反应的化学性质，该方法描述于2001年10月24日提交的专利申请序列号10/033,308，名称为固定生物分子，在这里全文引作参考。
含有捕获寡核苷酸的溶液的42个斑点使用商业的非接触阵列打印机PixSys 4200(Cartesian Technologies，Inc.17851 Sky Park CircleSuite C，Irvine，CA，92614)作为微阵列被印刷到96个测试孔的各孔中。
用于本实施例的打印溶液由20μM捕获氨基寡核苷酸组成，所述捕获氨基寡核苷酸通过使用10nL滴、20μM的50mM碳酸盐+4％w/v硫酸钠的碱性缓冲液而产生。捕获寡核苷酸在低尘，高湿环境被印刷到A2平板被预处理的表面上。一旦沉积到表面上，斑点在被洗去以前温育过夜(大约16小时)。然后平板上的剩余致活化学性质通过将平板与过量含胺分子的溶液反应而失活。在冲洗和干燥之后，平板备用。
捕获寡核苷酸的42个斑点在各测试孔中对应如下a.在各斑点待检测和定量的12个不同靶配体；b.1套参考斑点；和c.1套用于除了上面指定的12个靶配体之外的靶配体的斑点，对应于图4所示格子中用户选定的靶配体或用户选定的没有捕获靶配体的斑点(USER)。
上述各捕获寡核苷酸被一式三份沉积到所述阵列预定的位置。因此，3×(倍)14个斑点等于阵列中总数42个斑点。三个参考斑点被沉积在角落，并提供微阵列定向和位置的信息。
对应于实施例1所用阵列中的特异靶配体，用于打印捕获寡核苷酸的预定格子(位置)显示于说明书之前鉴定过的图4。在图4，REF是指参考配体，和USER是指用户选定的靶配体或上面描述的空位置。用于实施例1的参考配体是TNFα，USER斑点没有捕获靶配体。
在本实施例中，对13个不同斑点组分别沉积不同的捕获寡核苷酸，USER斑点没有沉积捕获寡核苷酸。捕获寡核苷酸选自预先鉴定的优选序列对，并打印到微阵列基材上。各序列对的(其它的)互补寡核苷酸使用下列文献描述的方法被结合到对应于其靶配体的抗体上2001年10月24号提交的专利申请序列号10,032,592，专利名称为蛋白质-寡核苷酸结合物的高效合成，其在这里预先引作参考。在适当的条件下，所述序列对杂交形成核酸二链体。
杂交缓冲液Superblock缓冲液根据厂商(Pierce Biotechnology，邮政信箱117.Rockford，IL，61105)的说明制备。Superblock缓冲液与甲酰胺按Superblock∶甲酰胺＝3∶1混合。该缓冲液制备后立即使用。
方法a)在杂交缓冲液2中制备所需的单克隆-寡核苷酸结合物(分别1.4μg/mL)的混合物。所有12个分析物特异结合物加上卵清蛋白参考结合物被用于本实施例。
b)孔用洗涤缓冲液稍加冲洗，然后各孔加入70μl抗体-寡核苷酸结合物混合物。
c)平板用聚苯乙烯盖子覆盖并在室温下混合1小时。
d)平板通过添加200μl洗涤缓冲液到各孔而洗涤，并混合1分钟。通过迅速在水槽中倒置平板而除去洗涤缓冲液。所述平板放到多层纸巾上轻敲以除去剩余的缓冲液。本过程被重复两遍，总计三次。
e)制备1∶10 SuperBlock的TBS稀释液用于下一步。
f)35μl稀释的SuperBlock被添加到各孔，随后添加35μl样品到各孔。
g)如上述步骤(c所述进行温育。
h)如上述步骤(d进行洗涤。
i)制备所需的多克隆抗体-生物素结合物(分别0.25μg/mL)在稀释的SuperBlock缓冲液中的混合物。
j)70μl所述多克隆抗体-生物素结合物被添加到各孔。
k)如上述步骤(c所述进行温育。
l)如上述步骤(d进行洗涤。
m)用稀释的SuperBlock缓冲液制备链亲和素-PBXL 1(MartekBiosciences Corporation，哥伦比亚，MD)的稀释液至6.7μg/mL(1mg/mL储备溶液1∶150稀释)。
n)70μl稀释的链亲和素-PBXL 1被添加到各孔。
o)如上述步骤(c所述进行温育。
p)如上述步骤(d进行洗涤。
q)200μl洗涤缓冲液被添加到各孔，平板在暗处4℃存储直到成像。各孔的洗涤缓冲液在成像过程中不除去以保存PBXL荧光。
用于测量荧光的仪器是Beckman Coulter A2读板仪的试验板形式，其尚末可商购。仪器由容纳平板的自动化镜台，CCD摄像机(RoperCoolsnap CF)，和白光源组成。平板使用550nm激发光源照明，并用装有675nm发射滤光片的CCD摄像机显象以检测用于阵列中结合的抗原的PBXL 1标记。与格子上鉴定的位置相关的抗原显示于图4。使用Roper Coolsnap CF对阵列拍摄数码照片。
所得到的图像使用上述商业软件Imagene根据厂家说明书而定量。用来使结果标准化的公式是靶配体特异信号(斑点)除以参考斑点数目结果的平均值。
实施例2根据本发明使用微量培养板和生物素基团的微阵列测定的制备和分析在本实施例中，A2平板是用作微阵列基材的微量滴定板。A2平板市场上不能买到。A2平板是由96个测试孔组成的聚丙烯平板，由Beckman Coulter制造。预处理方法被用于A2微量滴定板表面以产生与寡核苷酸上的胺基反应的化学性质，该方法描述于2001年10月24日提交的专利申请序列号10/033,308，名称为固定生物分子，在这里全文引作参考。
含有捕获寡核苷酸的溶液的42个斑点使用商业的非接触阵列打印机PixSys 4200(Cartesian Technologies，Inc.17851 Sky Park CircleSuite C，Irvine，CA，92614)作为微阵列被印刷到96个测试孔的各孔中。
用于本实施例的打印溶液由20μM捕获氨基寡核苷酸组成，所述捕获氨基寡核苷酸通过使用12nL滴、20μM的碱性缓冲液而产生。捕获寡核苷酸在低尘，高湿环境被印刷到A2平板被预处理的表面上。一旦沉积到表面上，斑点在被洗去以前温育过夜(大约16小时)。平板上的剩余致活化学性质然后通过将平板与过量含胺分子的溶液反应而失活。在冲洗和干燥之后，平板备用。
捕获寡核苷酸的42个斑点在各测试孔中对应如下a.在各斑点待检测和定量的12个不同靶配体；b.1套参考斑点；和c.1套用于除了上面指定的12个靶配体之外的靶配体的斑点，对应于图4所示格子中用户选定的靶配体或用户选定的没有捕获靶配体的斑点(USER)。
上述各捕获寡核苷酸被一式三份沉积到所述阵列预定的位置。因此，3x(倍)14个斑点等于阵列中总数42个斑点。三个参考斑点被沉积在角落，并提供微阵列定向和位置的信息。
对应于实施例1所用阵列中的特异靶配体，用于打印捕获寡核苷酸的预定格子(位置)显示于说明书之前鉴定过的图4。在图4，REF是指参考配体，和USER是指用户选定的靶配体或上面描述的空位置。用于实施例2的参考配体是TNFa，USER斑点没有捕获靶配体。
在本实施例中，对13个不同斑点组分别沉积不同的捕获寡核苷酸，包括参考斑点。捕获寡核苷酸选自预先鉴定的优选序列对，并打印到微阵列基材上。各序列对的互补寡核苷酸使用下列文献描述的方法被结合到对应于其靶配体的抗体上2001年10月24号提交的专利申请序列号10/032,592，专利名称为蛋白质-寡核苷酸结合物的高效合成，除了与连接于微阵列上的参考斑点的序列互补的寡核苷酸之外。互补到参考斑点的序列用生物素基团在3’位置合成。在适当的条件下，所述序列对杂交形成核酸二链体。
杂交缓冲液Superblock缓冲液根据厂商(Pierce Biotechnology，邮政信箱117.Rockford，IL，61105)的说明制备。Superblock缓冲液与甲酰胺按Superblock∶甲酰胺＝3∶1混合。该缓冲液制备后立即使用。
方法a)在杂交缓冲液中制备所需的单克隆-寡核苷酸结合物(分别1.4μg/mL)和20nM生物素化的参考寡核苷酸的混合物。
b)孔用洗涤缓冲液稍加冲洗，然后各孔加入70μl抗体-寡核苷酸结合物/参考生物素化寡核苷酸的混合物。
c)平板用聚苯乙烯盖子覆盖并在室温下混合l小时。
d)平板通过添加200μl洗涤缓冲液到各孔而洗涤，并混合1分钟。通过迅速在水槽中倒置平板而除去洗涤缓冲液。所述平板放到多层纸巾上轻敲以除去剩余的缓冲液。本方法被重复两遍，总计三次。
e)制备SuperBlock的TBS 1∶10稀释液用于下一步。
f)35μl稀释的SuperBlock被添加到各孔，随后添加35μl样品到各孔。
g)如上述步骤(c所述进行温育。
h)如上述步骤(d进行洗涤。
i)制备所需的多克隆抗体-生物素结合物(分别0.25μg/mL)在稀释的SuperBlock缓冲液中的混合物。
j)70μl所述多克隆抗体-生物素结合物混合物被添加到各孔。
k)如上述步骤(c所述进行温育。
l)如上述步骤(d进行洗涤。
m)用稀释的SuperBlock缓冲液制备链亲和素-PBXL 1(MartekBiosciences Corporation，哥伦比亚，MD)的稀释液至6.7μg/mL(1mg/mL储备溶液1∶150稀释)。
n)70μl稀释的链亲和素-PBXL 1被添加到各孔。
o)如上述步骤(c所述进行温育。
p)如上述步骤(d进行洗涤。
q)200μl洗涤缓冲液被添加到各孔，平板在暗处4℃存储直到成像。各孔的洗涤缓冲液在成像过程中不除去以保存PBXL荧光。
用于测量荧光的仪器是Beckman Coulter A2读板仪的试验模形式，其尚末可购得。仪器由容纳平板的自动化平台，CCD摄像机(RoperCoolsnap CF)，和白光源组成。平板使用550nm激发光源照明，并用装有675nm发射滤光片的CCD摄像机显象以检测用于阵列中结合的抗原的PBXL 1标记。与格子上鉴定的位置相关的抗原显示于图4。使用Roper Coolsnap CF对阵列拍摄数码照片。
所得到的图像使用上述商业软件Imagene根据厂家说明书而定量。用来使结果标准化的公式是靶配体特异信号(斑点)除以参考斑点数目结果的平均值。
实施例3使用本发明基于抗体的测定的预期实施例由不同特异性抗体组成的微阵列能够使用目前用于蛋白质微阵列的技术、化学性质和表面来制备。这些由抗体组成的微阵列随后用于通过竞争或非竞争分析法对特异性抗原的定量。竞争分析法通过使抗原在样品中与限制量的标记的(通常是生物素化的)抗原或抗原类似物竞争结合到特异性抗体而进行。结合到特异性抗体的标记抗原的量与样品中抗原浓度逆相关。由针对不存在于样品中的被分析物的抗体组成的参考斑点连同仔细控制浓度的标记参考抗原可用于提供用于微阵列内其它分析结果的标准化的内部参考和作为数据自动收集的一组内部参考点。非-竞争分析法能够通过使样品中的抗原结合到固定化的特异性抗体而进行。过量材料能够通过洗涤除去，之后特异性针对相同抗原性分子上的不同位点的第二抗体或抗体组能够被添加并允许结合。这些抗体能够直接地用荧光或酶的‘标签’分子标记或间接地用基团(比如生物素)标记，所述基团随后在后一步骤标记。在任一情况下，结合到所述位点的第二抗体的量与样品中抗原的浓度成正比。参考斑点由以下组成(1)针对不存在于样品中的被分析物的抗体可与仔细控制浓度的参考抗原连用，和(2)针对所述参考抗原上不同位点的第二参考抗原-特异性抗体以提供用于微阵列内其它分析结果标准化的内部参考和作为用于数据自动收集的一组内部参考点。
实施例4使用本发明基于细胞的测定的预期实施例细胞或组织微阵列还可以通过在固体表面上分配来自特异组织的不同细胞类型或薄切片而组装。这些微阵列的内容然后可以通过用DNA或RNA探针的原位杂交对遗传学意义进行研究或通过标记的抗体免疫染色对特定蛋白质进行研究。重复微阵列的使用允许相同样本通过各种不同探针和/或抗体进行表征。一组由标准细胞或组织制剂组成的参考斑点除提供用于定量软件的定向标志之外，将准许被靶向的分析物的相对定量。
如此描述本发明，明显的是可以进行许多的修改和调整而不偏离上文说明书和权利要求书描述的本发明的范围和本意。
虽然本发明参考某些优选的方案已经相当详细描述，其他的实施方案是可能的。因此，权利要求书的实质和范围将不会限于这里描述的优选的实施方案。
说明书，包括权利要求，摘要，和附图公开的所有特征，和公开的任何方法或过程中的步骤，可以任何的组合合并，除了其中至少有些上述的特征和/或步骤是相互抵触的组合之外。说明书，包括权利要求，摘要，和附图公开的各特征除非有相反说明，能够被起相同，等同或相似目的的替换特征替代。因此，除非另外说明，公开的各特征仅仅是一系列等同的或相似的特征中的一个例子。
任何在权利要求中未清楚表明的用于执行指定功能的“方法”或用于执行指定功能的“步骤”的要素，将不会被理解为35U.S.C.§112规定的“方法”或“步骤”条款。
权利要求
1.用于检测和定量样品中多个靶配体的微阵列装置，所述微阵列包含a)具有多个测试区的固相支持物；b)固定到测试区上的多个不同靶捕获配体；和c)至少一个固定到测试区的参考捕获配体，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体，所述参考捕获配体位于各测试区基本上相同位置。
2.权利要求1所述的微阵列装置，其中多个测试区是多个测试孔。
3.权利要求1所述的微阵列装置，其中多个测试区是多个具有基本上相同几何形状的测试孔。
4.权利要求3所述的微阵列装置，其中至少一个测试孔没有参考捕获配体。
5.权利要求或3或4所述的微阵列装置，其中至少一个测试孔不包含靶捕获配体。
6.权利要求2或3所述的微阵列装置，其中靶捕获配体置于预定的阵列中。
7.权利要求3所述的微阵列装置，其中靶捕获配体和参考捕获配体置于预定的阵列中，以及参考捕获配体位于阵列中至少两个空间分开的位置。
8.权利要求3所述的微阵列装置，其中靶捕获配体和参考捕获配体置于预定的阵列中，以及参考捕获配体位于阵列中至少两个角落位置。
9.权利要求3所述的微阵列装置，其中靶捕获配体和参考捕获配体置于预定的阵列中，以及参考捕获配体位于阵列中至少三个角落位置。
10.确定样品中多个不同靶配体的数量的分析法，包含以下步骤a)选择权利要求2或3所述的微阵列；b)在至少一个测试孔放置(i)含有靶配体的样品，其中至少一些靶配体被靶捕获配体捕获，(ii)通常不存在于样品中的参考配体，其中至少一些参考配体被参考捕获配体捕获，(iii)与捕获的参考配体形成复合物的参考配体检测器，以及(iv)与捕获的靶配体形成复合物的靶配体检测器；和c)检测和定量复合物中参考配体检测器和靶配体检测器的数量。
11.权利要求10所述的分析法，其中放置在至少一个测试孔的步骤还包含将靶捕获配体和参考捕获配体固定在预定的阵列中；和将参考捕获配体固定到阵列中至少两个角落位置上。
12.用于检测和定量样品中多个靶配体的微阵列的形成方法，包含以下步骤a)选择具有多个几何形状基本上相同的测试孔的固相支持物；b)将预定阵列中的多个不同的靶捕获配体和至少一个参考捕获配体固定在测试孔上，所述参考捕获配体被选择以捕获正常情况下不存在于样品中的参考配体。
13.权利要求12所述的微阵列的形成方法，其中至少一个孔不具有参考捕获配体。
14.权利要求12或13所述的微阵列的形成方法，其中至少一个孔不包含靶捕获配体。
15.权利要求12所述的微阵列的形成方法，其中固定至少一个参考捕获配体的步骤还包含将参考捕获配体固定到阵列中至少两个角落位置上。
16.权利要求12所述的微阵列的形成方法，其中固定至少一个参考捕获配体的步骤还包含将参考捕获配体固定到阵列中至少三个角落位置上。
全文摘要
本发明提供使用内部参考斑点以减少微阵列分析变异的系统。用于定量样品中多个靶配体的微阵列装置包括具有多个测试区的固相支持物；固定到测试区上的多个不同靶捕获配体；和至少一个固定到测试区上的参考捕获配体。所述参考捕获配体捕获通常不存在于样品中的参考配体。
文档编号G01N33/543GK1771333SQ200480009265
公开日2006年5月10日 申请日期2004年5月14日 优先权日2003年5月16日
发明者帕拉梅斯瓦拉·梅达·雷迪, 库尔特·布里尔哈特, 菲尔杜斯·法欧齐, 丹尼儿·A·基斯 申请人:贝克曼考尔特公司