蛋白质同种型的测定的制作方法

专利名称：蛋白质同种型的测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质测定以及这些蛋白质测定所用的试剂盒，该蛋白质具有两种或者更多种不同糖基化模式的同种型，例如，糖基化与未糖基化同种型或完全糖基化与部分糖基化同种型。
不同的蛋白质以两种或者更多种的不同糖基化模式的同种型存在。不同糖基化同种型的这种差别，或相对比例，可能是疾病和机能紊乱或者药物滥用的征兆，因此需要能够区分不同糖基化同种型的测定系统。
然而，用抗体来区分内源性蛋白质的不同糖基化同种型是比较困难的，因为与内源性糖基化蛋白质的具体同种型特异性或者优先结合的抗体制备成功率比较低。
临床上测定一种内源性蛋白质的不同糖基化同种型的相对浓度有临床意义的一个实例是血液蛋白质的转铁蛋白。转铁蛋白的氨基酸骨架有两个位点(Asn 413和Asn 611)，可以接纳具有末端唾液酸基团的双、或三触角低聚糖侧链。一个健康的病人，大部分的血液转铁蛋白分子带有4个或者5个唾液酸基团；然而，如果该病人酗酒，那么转铁蛋白分子中，没有唾液酸基团、或者含有2个或者3个唾液酸基团的比率就会相对增加。事实上，缺少1个或2个完整聚糖链，也是酗酒者体内转铁蛋白同种型的一个特征。(见例如Arndt in Clinical Chemistry 4713-27(2001))。转铁蛋白同种型的这种非正常的相对丰度，也出现在碳水化合物不足糖蛋白综合症(CDGS)或先天性糖基化疾病(CDG)的病人中，如Keir等在Ann.Clin.Biochem.3620-36(1999).中所讨论的那样。
已经提出这样的“碳水化合物不足转铁蛋白(CDT)”或者“无碳水化合物转铁蛋白(CFT)”的各种测定方法；然而那些适合于自动化的方法一般都依赖于应用离子交换树脂，基于在不同pH时不同转铁蛋白同种型被树脂吸附和释放不同，将具有3个或者更少唾液酸基团的转铁蛋白分子与具有4个或者5个唾液酸基团的转铁蛋白分子进行分离。这些测定方法的实例在US-A-4626355(Pharmacia)，WO 96/26444(Axis)和WO 01/42795(Axis)中有所描述。
翻译后糖基化的任何蛋白质，都可能出现不同的糖基化同种型。因此，除了转铁蛋白外，其他临床上有关的蛋白质也存在不同的糖基化同种型，包括癌症以及其他疾病的糖基化标记，例如碱性磷酸酯酶(AP)(见Magnusson等Clinical Chemistry441621-1628(1998))、α-甲胎蛋白(AFP)、人绒毛膜促性腺激素(HCG))以及可能的朊病毒蛋白(CD230)。
哺乳动物碱性磷酸酯酶包括一个普遍存在的酶家族。AP是一种糖蛋白酶，存在于细胞质膜的外层糖基磷脂酰肌醇部分作为膜锚着点。肝AP、骨AP和肾AP的(天然)分子量经测定分别为152、166和168kDa。除了在正常骨矿化中的作用外，L/B/KAP在生理学和肿瘤学中的其他功能还不为所知。碱性磷酸酯酶在人血清中以几种同种型存在。由于翻译后修饰的多样性，血清中不同同种型的鉴别是很复杂的。两个主要的循环AP同工酶，骨骼和肝脏的，因为是单基因产品，只是糖基化不同，所以难于区分。在常规临床测定中，经常需要总的血清AP来确定骨骼和肝胆管的状况。已经表明，对总AP活性有贡献的不同同种型提供有用的临床信息。事实上，血清中骨AP(BAP)活性的定量测量，能够提供骨形成程度的指数。
α-甲胎蛋白(AFP)是哺乳动物胎儿发育的主要蛋白质，主要由胎儿肝脏和卵黄囊合成。由于肝癌和卵黄囊瘤经常生成这种蛋白质，因此它通常在诊断中作为肿瘤标记使用。具体的说，在肝细胞癌(HCC)和非精原细胞瘤的生殖细胞瘤(NSGCT)诊断中，AFP作为血清学标记而广泛使用。AFP在正常妊娠、良性肝脏疾病以及癌症时也会升高。AFP表现为几种与疾病相关的碳水化合物结构不同的同种型。现有的测定方法还不能容易的区分这些同种型。
本发明的其他目的糖蛋白包括α-1-酸糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、结合球蛋白、甲状腺球蛋白、前列腺特异性抗原、HEMPAS红细胞带形核粒细胞3(它与先天性红细胞生成不良性贫血II型相关)、PC-1浆细胞膜糖蛋白、CD41糖蛋白II b、CD42b糖萼素、CD43白细胞唾液糖蛋白、CD63溶酶体膜结合糖蛋白3、CD66a胆糖蛋白、CD66f妊娠特异性b1糖蛋白、CD164多-糖基化核蛋白质24，和CD235血型糖蛋白族。
我们已经发现，采用抗体或者其他配偶体来识别测定中的不同糖基化蛋白质同种型的问题，可以通过在测定中附加使用蛋白水解酶来解决，该蛋白水解酶可以使目的蛋白质裂解成很多肽片段，所得片段的图谱具有样品分析物中糖基化图谱的特征。分析物蛋白质同种型的这种蛋白水解作用，可以产生其他同种型水解不能产生的片段，并且该片段能够相应的被特征片段的特异性结合配偶体所识别；或者一种同种型的蛋白水解作用可以产生一系列的片段，在应用碎片分离技术(例如色谱、质谱等)时，这些片段显示出与其他同种型产生的碎片系列不同的分布类型(光谱)。具体地说，蛋白水解酶是一种在特异性位点，例如在特异性的氨基酸残基或者在特异性的氨基酸残基序列上起裂解肽链作用的酶。通过这样的方式，当酶处于目的同种型中时，该同种型就会在这样的位点发生裂解，但当酶处于其他同种型中，由于其他同种型中糖基化么模式不同，使酶被例如碳水化合物侧链或者不同三级结构所遮蔽，就不会发生裂解。
如果一种同种型蛋白水解产生的片段不能由其他同种型蛋白水解所产生，那么就可以提供特征抗原表位，这些特征片段的特异性结合配偶体，可以用来测定样品中其母体同种型的浓度。如果蛋白质水解产生的片段相似(例如抗原性或者沿分离中轴位置相似)但相对浓度不同时，可以测定两种或者更多种这样片段的相对浓度，并且用其来测定该样品中不同同种型的相对丰度以及相应浓度。
因此从一方面来看，本发明提供一种用于具有至少两种含不同糖基化模式同种型的蛋白质的测定方法，所述方法包括使含有所述蛋白质的样品与蛋白水解酶接触，该蛋白水解酶优选蛋白质位点特异性蛋白水解酶，并且检测由该蛋白质的水解产生的至少一种肽片段的含量或者相对含量。
本发明的方法优选包括对样品或者产生样品的物质(例如血液)中目的蛋白质同种型浓度或者相对浓度示数，例如定量、半-定量、或者定性的示数的测定。例如该同种型的浓度可以测定，以该同种型存在的蛋白质的片段可以测定，或者该同种型的浓度或片段可以简单的通过在预定的阈值，例如病人健康或者不健康情况的阈值之上或之下来测定。然而，一般优选以糖类缺乏同种型的百分比(例如摩尔百分比)来代表糖类的缺乏。为此目的，本发明的测定方法优选包括糖蛋白总量的测定，例如不使用蛋白水解酶平行操作测定。
因为在很多环境下，样品在含有目的蛋白质的同时还会含有很多其他蛋白质，当蛋白水解产生目的蛋白质某一同种型的特征片段时，会出现“干扰”，例如其他蛋白质所得的肽片段，因此尽管不是严格必要，也希望在与蛋白水解酶接触之前，将目的蛋白质与其他蛋白质分离，以避免这些干扰。这可以通过色谱法、选择性的吸附到底物上以及从底物上释放、离心分离、以及其他的标准蛋白质分离技术来实现。然而，为了简化测定操作，优选采用样品与底物接触的方法来实现，该底物上结合着至少对目的蛋白质的目的同种型有特异性结合的配偶体，特别优选用于捕获目的蛋白质所有同种型的特异性结合配偶体。在此情况下，特异性结合的配偶体优选为抗体或者是抗体片段。那么底物结合蛋白质就会与非结合蛋白质分离例如通过漂洗分离，并且可以任选的在与蛋白水解酶接触之前，从底物中释放出来。
因此，从另一方面来看，本发明提供一种用于本发明测定方法的试剂盒，该试剂盒包括蛋白水解酶和用于所述蛋白质的至少两种和优选所有同种型的底物结合的特异性结合的配偶体(sbp)。该底物结合的sbp优选是在远离糖基化位点的位点与蛋白质结合sbp。在特别优选的实施方案中，将底物结合的sbp固定在多孔膜上。
只要蛋白质水解发生，就可以通过任何常规技术对特征片段或者特征裂解图进行测定。然而，为了简化测定操作，优选对特征片段与特异性结合的配偶体形成的片段sbp结合物进行测定，从而对特征片段进行直接或间接测定。在一个优选实施方案中，本发明的试剂盒进一步含有至少一种任选的标记了的特异性结合的配偶体，该配偶体对于目的蛋白质的一种同种型经酶蛋白水解作用而产生的肽片段具有特异性。
所述试剂盒也优选含有本测定方法的操作说明书，还可以任选含有其他任选标记的能够与蛋白质sbp结合物和/或片段结合的sbp相结合的第二配偶体。
本发明测定中所使用的sbp典型地为抗体或者抗体片段、寡肽、寡核苷酸、或者小的有机分子。抗体和抗体片段优选，尤其是单克隆抗体。在一个具体实施方案中，可以制备抗体来抗具有与特征蛋白质片段的全部或者部分氨基酸序列相符合(或者相似)的序列的寡肽免疫结合物，如US-A-5773572中所述的那样。
由蛋白质片段形成的结合物的测定，如上所述，可以是直接或者间接的。可以测定结合物或sbp的特性(例如放射吸收、发射、或散射)，或者可应用其他具有可测定性质或者能够引起可测定性质或事项的试剂。该其他结合试剂是与所述结合物结合或者与自由sbp结合的试剂，或者是在与其他底物结合中与所述结合物竞争的试剂。采用任选标记的结合试剂对分析物进行的这种直接或者间接测定在诊断测定领域是常规的。
所述蛋白质片段的测定方式，当然要取决于结合试剂的性质，亦即它们是否用报道分子部分，例如放射性标记、发色团、或者荧光染料(亦即荧光基团)标记；它们是否是酶活性的(亦即能催化过程可以测定的反应，例如通过产生光或者是产生可测定的物质)；它们是否形成用光散射可以测定的聚集物，等等。这样的测定系统在诊断测定领域是常规的。
在本发明方法的优选实施方案中，将特征蛋白质片段的sbp固定在多孔底物上，例如任选具有也固定在相同底物上的目的蛋白质sbp的膜，并且随着蛋白水解以及特征片段与底物的结合，片段-sbp或者片段-sbp片段结合物的标记的结合配偶体与底物相接触。随着对底物的漂洗，底物保留的标记可以直接或间接的表示出特征片段的浓度以及产生该片段的同种型的浓度。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，将特征片段与特征片段形成大小足够被多孔膜保留的结合物的标记sbp与样品相接触，样品在水解之后，通过多孔膜(该膜也可以任选是固定有该蛋白质sbp的膜)。漂洗之后，该膜就可以提供保留在其上的片段标记sbp的直接示数，以及产生该片段的同种型的相应示数。
在类似的实施方案中，可以使用竞争性抗原(例如粒子，如带有抗原的乳胶粒子)，该抗原与片段-sbp结合产生可被膜保留的结合物。在该实施方案中，最好竞争抗原和片段-sbp中的一个或者两个要被标记，并且膜的孔径应该足够大，不能保留未结合的片段-sbp，并且如果片段-sbp被标记，那么对该片段-sbp片段结合物也不能保留。漂洗之后，该膜可以提供保留的抗原片段-sbp结合物的浓度示数，并间接提供该片段的浓度示数。
在这后两个实施方案中，优选的标记为发色团、荧光染料，或者尤其是微粒，例如胶体金，如在US-A-5691207、US-A-5650333和EP-A-564449中所述的那样。
这三个实施方案都尤其适用于在WO 02/090995中所述的平板测定。
正如前面提到过的，对片段的测定也可以通过不需要使用特异性结合配偶体的方法来进行，例如色谱、质谱、核磁共振等。
本发明测定方法中所用的蛋白水解酶，可以是能够裂解蛋白质的任何酶。然而，尤其优选那些只在特异性位点裂解蛋白质的酶，例如靠近特性异氨基酸残基或者序列的位置。这样的特异性蛋白酶的一个实例为天冬酰胺内肽酶类，例如豆球蛋白，它在天冬酰胺部分的C端侧裂解酰胺键。这种内肽酶的制备例如在US-A-5094952中说明，并且可以从Takara Shuzo Co.Ltd.，Kyoto，Japan商业获得该酶。其他可以使用的蛋白酶包括，例如无色肽酶、酰氨肽酶、曲霉胃蛋白酶、羧肽酶(A、B或者C)、组织蛋白酶(B、D、G或者H)、木瓜凝乳蛋白酶、二肽基肽酶(I和IV)、内肽酶K、内蛋白酶精氨酸-C、肠肽酶、无花果蛋白酶、明胶酶、γ-Glu-X羧肽酶、谷氨酰基内肽酶、亮氨酰氨肽酶、膜丙氨酰胺氨基肽酶、膜Pro-C羧肽酶、微生物胶原酶、多催化内肽酶复合物、胰弹性蛋白酶、胃蛋白酶A、肽基-Asp金属内切肽酶、肽基二肽酶、血浆激肽释放酶、纤维蛋白质溶酶、t-纤溶酶原活化剂、u-纤溶酶原活化剂、焦谷氨酰肽酶、肾素、逆胃蛋白酶、茎菠萝蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、组织激肽释放酶、胰凝乳蛋白酶、钙蛋白酶、蛋白酶K、梭菌蛋白酶、凝固因子Xa、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶。如果需要，可以同时或者顺序使用两种或者更多种这样的蛋白酶。尤其优选使用胰凝乳蛋白酶。
在本发明的方法中，优选用蛋白水解酶在使蛋白质被裂解的条件下，将蛋白质培养一定时间，以释放出不同同种型产生的特征片段。
培养一般要持续1～120分钟，优选为5～40分钟，尤其优选温度从室温到42℃之间，特别是从室温到38℃之间。
对于任一种具体的目的蛋白质，为了确定哪些片段要作为分析物应用，通常希望将糖基化和非糖基化同种型裂解，将用色谱方法产生的片段分离后对它们进行比较。之后可以用光谱学来鉴别要选择的合适片段，并且，如果该蛋白质序列是已知的，且该蛋白酶的裂解是位点特异性的，那么这个被选择的片段序列就能从一系列可能的片段中被鉴别出来。如此鉴别得到的片段，它的sbp就可以用常规技术来制备。
特别优选采用二模式分离和光谱技术，例如色谱与质谱、或核磁共振联用对特征片段进行鉴别。
在本发明的一个实施方案中，可以通过表面细胞质基因组共振技术(SPR)来进行测定，该技术是一种非侵入性光学技术，当分子结合或者离解时，SPR感应可以反映出测定器表面上质量浓度的变化。
SPR可以通过叫做Biacore分析(可以从Biacore AB，Uppsala，Sweden获得)的专用系统来进行。
本发明的方法尤其适合于多样品测定，例如使用多孔微量滴定板(典型地为n×m孔板，其中n和m是正整数，最大值为20，尤其是96孔微量滴定板)。
本发明测定方法中所用的样品，典型的为机体组织、器官或体液(例如尿、唾液、粘液、血液等)样品或者它们产生的样品。优选样品为血液或者血液产生的样品，例如血清。采集样品的受试种属，优选为哺乳动物、爬行类动物、鸟类、鱼类或甲壳类动物，更优选哺乳动物(特别是人类)。
如果该糖蛋白是细胞结合的、或者是被细胞包囊的，样品可以用常规方式处理以释放该糖蛋白。类似的，如果需要，糖蛋白可以进行金属化(例如如果该蛋白质是一种结合铁的蛋白质，可以加入铁离子)、去金属化或者变性。经预先处理样品的准确性质取决于所要测定的具体糖蛋白。
本发明中转铁蛋白测定方法的一个实例如附图的

图1所示。附图的图2和图3表示糖基化和非糖基化转铁蛋白被胰凝乳蛋白酶消化后所得蛋白质片段的反相HPLC图谱。图1表示本发明测定方法的原理，亦即如何通过它们蛋白质水解的不同，将无唾液酸转铁蛋白与正常转铁蛋白区分开。柱A是四唾液酸转铁蛋白，柱B表示无唾液酸转铁蛋白。步骤1表示从血清中固相捕获转铁蛋白。非糖基化和糖基化的转铁蛋白同种型都被捕获。步骤2是抗体-转铁蛋白复合物的消化。只有非糖基化的被消化生成独特的片段图谱，步骤3是对特异性蛋白质片段的测定。抗体将辨认出肽上的抗原表位，而不是完整的完全糖基化转铁蛋白上的抗原。图2表示糖基化转铁蛋白的图谱，图3表示非糖基化转铁蛋白的图谱。如图所示，非糖基化同种型有几个特征碎片(即基本上是独特的)。图4是非糖基化转铁蛋白肽序列的一个实例，该肽序列由胰凝乳蛋白酶裂解产生，通过MALDI-TOF和MS-MS进行鉴别。
下表1～3中列出了分子量大于500g/mol的肽片段，这些片段理论上可以由转铁蛋白分别经胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、溶媒体-C裂解而得到。通过将片段的免疫结合物应用到载体分子上的抗体制备方法，如US-A-5773572中所述的那样，可以很容易的制备这些片段的抗体。此测定方法可以简单的通过HPLC并测定非糖基化转铁蛋白特征峰出现的量来实现。
表1
表2
表3
图4显示由MALDI-TOF和电喷雾MS-MS实验测定的肽序列实例，该肽序列是从非糖基化转铁蛋白用胰凝乳蛋白酶裂解释放得到的。该序列是NKSDNCEDTPEAGYF。
该序列是制备只识别非糖基化转铁蛋白的裂解产物的单克隆抗体的理想候选物。该序列与去酰胺基的非糖基化15残基肽结合(compound)，经反相HPLC分离的峰部分MALDI-MS测定的单同位素分子量(mass value)为1690。该肽片段与表1中列出的第9片段紧密结合。
实施例1测定1.向预先涂有抗转铁蛋白单克隆抗体的96孔微滴定板单个孔中，加入150μL的血清试验样品或者对照样品，并且于37℃温和混合下培养大约30分钟。
2.用200μL 100mM pH7.8含有0.05％的吐温20的tris HCl缓冲液洗涤孔2次。再用200μL 100mM pH7.8的不含吐温20的tris HCl缓冲液洗涤1次。
3.向每个孔中加入150μL预热的100mM pH7.8的tris HCl缓冲液，然后加入10μL测序级胰凝乳蛋白酶(2μg/μL)，并且于37℃培养30分钟。
4.通过加入10μL于4℃预冷的乙酸终止反应。
5.加入30μL 100mM的TCEP，并继续培养10分钟。
6.将每个孔的内容物转移到预先涂有肽的新孔中。
7.加入50μL125I标记的抗肽抗体，并在37℃培养60分钟。
8.用100Mm pH7.8含0.05％吐温20的tris HCl缓冲液洗涤孔3次，并测定结合在板上的125I标记的抗肽抗体的量。
9.将结合抗体的量与标准曲线相比较，测定肽以及最初样品中相应CDT的量。
实施例2荧光偏振免疫1.向适当容器中加入50μL血清试验样品或者对照样品，用150μL预热100mM pH7.8含测序级胰凝乳蛋白酶(40μg)tris HCl缓冲液，于35℃培养30分钟。
2.通过加入标准抗胰凝乳蛋白酶抑制剂(例如100μM的TPCK或抑肽酶)来终止反应。
3.加入30μL 100mM的TCEP，并继续培养10分钟。
4.将蛋白水解的裂解混合物转移到新孔中，新孔内含有预先规定量的已知荧光标记的肽。
5.测量偏振荧光程度，mP。
6.加入50μL抗肽抗体，并于35℃培养5分钟。
7.第二次测量偏振荧光程度mP’。
8.偏振荧光的差值，反映了与抗体结合的肽的相对量，将差值与标准曲线相比较，测定肽以及最初样品中相应CDT的量。
权利要求
1.一种用于具有至少两种含不同糖基化模式的同种型蛋白质的测定方法，该方法包括使含有所述蛋白质的样品与蛋白水解酶接触，并且检测由所述蛋白质的水解产生的至少一种肽片段的含量或者相对含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质选自转铁蛋白、碱性磷酸酯酶、绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述酶为蛋白质位点特异性蛋白水解酶。
4.根据前述各项权利要求中任一项所述的方法，其中目的蛋白质在与蛋白水解酶接触之前，与其他蛋白质分离。
5.一种用于前述各项权利要求中任一项的测定方法的试剂盒，该试剂盒包括蛋白水解酶以及底物结合的对所述蛋白质的至少两种同种型特异性结合的配偶体(sbp)。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述sbp适用于所述蛋白质的所有同种型。
7.根据权利要求5或6任一所述的试剂盒，其中所述sbp为抗体或者抗体片段。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的试剂盒，其中所述sbp在远离糖基化位点的位点与蛋白质结合。
9.根据权利要求5～8中任一项所述的试剂盒，其中检测是指对特征肽片段sbp结合物的检测。
10.根据权利要求5～9中任一项所述的试剂盒，其中所述的sbp是标记的。
11.根据权利要求5～10中任一项所述的试剂盒，其中所述的sbp是用荧光染料标记的。
全文摘要
本发明提供一种具有至少两种含不同糖基化模式的同种型蛋白质的测定方法，该方法包括使含有所述蛋白质的样品与蛋白水解酶接触，并且检测由所述蛋白质水解后产生的至少一种肽片段的含量或者相对含量。
文档编号G01N33/68GK1768269SQ200480009126
公开日2006年5月3日 申请日期2004年2月6日 优先权日2003年2月6日
发明者菲利普·D·赖伊 申请人:阿克西斯-希尔德公司