神经集落形成分析的制作方法

专利名称：神经集落形成分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分离、鉴定及鉴别神经干细胞与神经祖细胞的神经集落形成细胞分析方法。
背景技术：
哺乳动物中枢神经系统(CNS)的发育起始于胎儿发育的早期并持续至产后期。在成体的中枢神经系统主要有三种细胞神经元、星形胶质细胞及少突神经胶质细胞。胚胎中神经发育第一期是细胞发生，为具有精确的时间和空间顺序的阶段，干细胞及祖细胞的增殖产生分化为成熟中枢神经系统细胞的前体。第二期是细胞分化和移行阶段，成神经细胞(产生神经元的细胞)及神经胶质胚细胞(产生星形胶质细胞及少突神经胶质细胞的细胞)分化及移行至其最终位置。中枢神经系统发育的第三期在细胞获得特定的成熟表型特征如神经元表达特殊的神经递质时发生。中枢神经系统发育的终末期是选择性细胞死亡阶段，其中特定细胞、纤维及连接死亡和退化“微调”神经系统通路。
和机体的许多其它组织不同，哺乳动物的中枢神经系统传统上几乎不具有为适应损伤或疾病产生新细胞的能力。然而，体外试验成体中枢神经系统中表现干细胞特征细胞的最近发现(Reynolds和Weiss，1992)以及成体脑内小增殖区(Alvarez-Buylla等，2001)的重新检测(Altman，1962；Altman和Das，1965)使人们相信成体哺乳动物中枢神经系统保留产生新细胞的能力，而且神经干细胞是增殖前体的来源。
在中枢神经系统中，具有增殖和分化能力的神经干细胞可以从祖细胞分化而来。根据Potten和Loeffler(Potten和Loeffler，1990)的定义，神经干细胞可以从祖细胞分化而来，具有自稳定能力，产生大量子代细胞并产生神经组织三种基本细胞类型的成熟细胞。
干细胞的关键鉴别特征是其表现自我更新或产生更多自身细胞的能力。在最简单的定义中，干细胞为具有自稳定性能力的细胞。然而，由于考虑到大量细胞可符合这个标准，此定义是有问题的。干细胞更为严格和实用的定义由Potten和Loeffler(1990)提供，他们将干细胞定义为“具有以下能力的未分化细胞a)增殖，b)自稳定性，c)产生大量分化的功能子代细胞，d)损伤后再生组织，以及e)这些选项用途的灵活性”。
已证明培养系统在研究和理解生物学过程和系统的细胞和分子性质的无价工具。关于神经干细胞，已经开发了分离、增殖及扩增神经干细胞以及继后其子代分化为神经系统三种基本细胞类型的组织培养方法(Reynolds和Weiss，1996)。Reynolds和Weiss根据功能标准而鉴定神经干细胞。这些标准包括以下能力1)增殖和产生大量子代细胞，2)长期培养中长时间的自我更新，及3)持续产生来源组织的基本细胞类型。这种方法被称为神经球分析(NA)，它提供了关于神经干细胞生存及其潜在治疗用途的丰富资料。
简言之，神经球分析涉及穿至成体神经系统组织的胚胎显微解剖，接着破坏细胞连接及单细胞悬浮增殖。将细胞铺于(典型地以低浓度)组织培养皿的存在至少一种诱导增殖的生长因子(即表皮生长因子[EFG]，碱性成纤维细胞生长因子[bFGF]，等等)确定的无血清培养基中。在这些条件下，2-5天内，多能神经干细胞开始分裂产生被称作神经球的未分化细胞的同源细胞衍生群(图1)。在增殖诱导因子的持续存在下，神经球中的细胞持续分裂致组成神经球的细胞数量增加，从而神经球的体积增加。可收集神经球，裂解为单细胞悬液，再铺板培养细胞以产生新的神经球。以此方式进行的神经干细胞传代导致有活力的中枢神经系统前体细胞算术增加(图3)。
神经球分析已成为分离哺乳动物中枢神经系统的标准方法，并且形成用于理解神经系统干细胞的细胞和分子生物学的许多分析方法的核心。例如，此方法已被用于筛选对干细胞功能有影响的外源性信号因子(Shimazaki等，2001)，并有助于理解神经干细胞的体内生物学(Morshead等，1994；Alvarez-Buylla等，2001)。尽管在推进本领域中此分析方法是具有价值的，但还是受到显著的限制。
作为细胞群体，神经球可被传代至少10次，导致产生大量子代细胞，继而可被分化为哺乳动物中枢神经系统中发现的三种基本细胞类型-神经元、星形胶质细胞及少突神经胶质细胞，从而满足对干细胞的基本需求(Reynolds和Weiss，1996)。另外，各同源细胞衍生的神经球可被裂解为单细胞，并且在促有丝分裂因子存在下，产生新的神经球(自稳定性)，子代细胞可被分化为神经元、星形胶质细胞及少突神经胶质细胞。目前假定神经球分析中产生的每一神经球衍生于神经干细胞。发明者得到意想不到的结果表明这是不正确的，神经球分析中产生的神经球的增殖潜能不同。因此，尽管神经球分析鉴定神经干细胞，但此方法中并非所有产生的神经球都衍生于神经干细胞。一些(也许大多数)神经球可以是具较有限增殖潜能并也可能是不同分化潜能的神经祖细胞。由神经球分析测定的神经干细胞数是高估的，基于此结果的随后解释可能是不正确的。例如，图2A和图2B代表神经球分析中产生的神经球群体。作为假设的例子，图2A和图2B之间的不同是图2B中添加被称为GF-X的多肽生长因子的结果。在此情况下，似乎GF-X的的添加导致神经球数减少大约34％。在此特殊实验中这可解释为GF-X对神经干细胞的增殖或存活的负调节影响。如果神经球分析中产生的所有神经球都衍生于干细胞，此解释是正确的，然而，如果情况并非如此则结论是不成立的。这样实验的一个例子可见于美国专利US 5,851,832实施例43。在这些情况下，假定神经球数量的变化反映了对神经干细胞的影响，然而，除非神经球分析中产生的所有神经球显示衍生于干细胞，否则此假设是没有事实根据的。因此，目前用于研究神经干细胞的方法存在显著不足。
因此，由先前的体外研究神经干细胞的技术方法伴随的前述不足来看，本领域需要能够鉴别神经干细胞和神经祖细胞的体外分析方法。
还需要能够根据增殖潜能鉴别不同神经干细胞的分析方法。

发明内容
本发明提供了一种可用于对多种类型神经干细胞和神经祖细胞进行鉴定、鉴别、分离及定量的方法。
本发明涉及于三维半固体培养基中(如见图12所示方法)进行体外培养和增殖神经干细胞及神经祖细胞的方法。一方面，本发明涉及一种鉴定神经干细胞并能够鉴别神经干细胞和神经祖细胞的方法。另一方面，本发明涉及一种鉴定具有不同程度增殖潜能的神经干细胞并能够鉴别高增殖潜能神经干细胞和较低或较小增殖潜能的神经干细胞。另一方面，本发明涉及一种根据集落大小、形态及抗原表达而鉴别多种类型神经干细胞和神经祖细胞的方法。
因此，本发明提供了一种鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至集落间可看出大小差别；及(d)估计集落大小，其中较大的集落可能由神经干细胞产生，较小的集落可能由神经祖细胞产生。
作为另一个实施方案，鉴定及鉴别多种类型神经干细胞与神经祖细胞的标准可以基于初始集落内细胞产生的集落形态。
因此，本发明还提供了一种鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)测定集落形态，其中波形集落表明集落可能由神经干细胞产生，具有平滑边缘的集落表明集落可能由神经祖细胞产生。
在本发明的另一实施方案中，神经干细胞或神经祖细胞的存在可通过检测集落上未分化细胞或分化细胞相关标志物的存在而确定。因此，本发明还提供了一种鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)测定集落的抗原表达，其中未分化细胞相关标志物的存在表明集落可能由神经干细胞产生，分化细胞相关标志物的存在表明集落可能由神经祖细胞产生。
未分化细胞及神经谱系相关抗原表达例如神经巢蛋白(nestin)、sox2、Musashi、ABCG2、LeX、PNA、CD24及其它标志物。中枢神经系统分化细胞相关抗原表达例如β微管蛋白、神经胶质酸性蛋白(GFAP)、O4、微管相关蛋白2(MAP2)、髓鞘碱性蛋白(MBP)及其它标志物。
本发明提供了一种于半固体三维基质中分离、增殖和扩增神经干细胞或神经祖细胞及其子代细胞的体外方法。本发明还提供了一种鉴别高增殖潜能(HPP)神经干细胞和低增殖潜能神经干细胞并区别神经干细胞和神经祖细胞的方法。
从下列详细描述本发明的其它特点和优点将显而易见。然而，应该知道由于根据此详细描述本发明精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员将是显而易见的，表示本发明优选实施方案的详细描述和特定实施例仅通过举例说明的方式给出。


现根据附图描述本发明图1第一代和第二代神经球。将第14天胚胎皮质离解为单细胞悬液，以500,000个细胞/ml的浓度于确定的含表皮生长因子(EGF)的无血清培养基中铺板培养。铺板培养三天后，鉴定附于基质的小细胞簇群(A)。四天后可见漂浮于悬液中的同源细胞衍生神经球(B)。收集神经球，机械分离成单细胞悬液并再次铺板。第二代7天的神经球(C)。
图2神经球分析中小鼠第14天胚胎皮质产生的神经球。表皮生长因子(EGF)存在下产生的7天神经球的显微照片。图2A是于200ul孔中产生35个神经球培养物的显微照片，而另一培养物中仅产生23个神经球(图2B)。
图3传代大鼠E18皮质神经干细胞的生长曲线。传代10次后产生的总活性细胞理论数。数据代表连续传代10次后，根据每一代计数的整分部分所产生细胞的可能总数。以1×106个细胞开始并在每一代保存所有细胞，通过传代，产生了10，4.03×1015个细胞，这表明10周增加了109倍。
图4分别对半固体胶原基础培养基(神经集落形成细胞分析)或液体悬浮培养(神经球分析)中培养的小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的集落和神经球的生长进行了对照。
(A)在神经球分析中，2DIV(体外培养天数)时，许多附着于基质的小神经球开始形成。左上角是一个2DIV神经球高倍放大。
(B)4DIV时同源细胞簇群已长大，大多数从基质分离并漂浮于悬液中。左上角显示一个4DIV神经球的高倍放大。
(C)5-7DIV时大多数神经球漂浮于悬液中，在这个时期准备传代。
(D)神经集落形成细胞分析1DIV时的一个分裂细胞。
(E)7DIV时神经集落形成细胞分析中的集落得以很好地测定，其直径范围为40um-500um。
(F)14DIV时神经集落形成细胞分析中许多集落仍相对较小，而其它细胞继续长大。
图5神经集落形成细胞分析及神经球分析中的小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的集落/神经球数相似。在神经球分析中2.4±0.9％(均值±标准误铺板的神经球/总细胞数)的细胞形成神经球，而神经集落形成细胞分析中2.8±1.2％(均值±标准误)铺板细胞形成集落。
图6神经集落形成细胞分析中小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的7天及14天集落。铺板培养后7天(A)及14天(B)集落的显微照片。14天时，鉴定三个不同集落大小(箭头)。
图7神经集落形成细胞分析中小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的集落大小比较。此分析中根据各集落直径观察了大范围集落大小。为描述起见，发明者设立了四个分组(A)＞2mm(B)1-2mm(C)0.5-1mm及(D)＜0.5mm。
图8神经集落形成细胞分析中小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的集落于四个大小分类中每一分类的相对频数(A)如下所述，将2500个细胞铺于神经集落形成细胞分析培养基。21天后，计数四个不同大小分类的集落数。
(B)当图6A中数据以集落大小占总集落数的百分数时，大于70％的集落直径＜0.5mm，而大的、高增殖集落占总集落数的大约2％。
(C)细胞总数相关的集落频数(％)(如图7由集落大小再分)显示少于3％的铺板细胞总数增殖并形成集落。此3％中，大多数(2.23％)产生小集落(直径＜0.5mm)，表明较有限的增殖潜能，这些集落继续是小集落，铺板细胞很小一部分(0.06％)是高增殖潜能并形成大集落(＞2mm)。
图9神经集落形成细胞分析中小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生集落的鉴定和切除，及从液体培养基中集落分离细胞的继后传代。
(A)于解剖显微镜下鉴定有关集落，并在无菌条件下，使用显微解剖剪从半固体培养基基质中切除集落。
(B)将切除的集落转移至胶原蛋白酶溶液中并于37℃培育30分钟。
(C)以200ul Gilson移液吸头分散基质来分裂集落，制备单细胞悬液(D)将细胞铺板于24孔培养板的含EGF确定无血清培养基一个单孔中。
(E)7-10天后产生神经球。
图10小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的高增殖潜能(HPP)集落的第二代和第三代神经球(A)切除之前一个高增殖潜能集落(直径2.1mm)。
(B)7DIV时由(A)分离的细胞形成大量神经球(二代集落)。
(C)(B)中一个区域的高倍放大。
(D)来自(B)的神经球于液体培养基中进行传代，于7DIV时产生第三代神经球。
(E)(D)中一个区域的高倍放大。
图11产生第二代和第三代神经球的小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的集落百分数。100％直径＞2mm的集落产生第二代集落，直径为1-2mm、0.5-1mm及＜0.5mm的集落分别有71％、43％及25％产生第二代神经球。第三代集落形成仅见于那些直径＞2mm及1-2mm(分别为100％及50％)，在直径＜1mm的集落未见第三代神经球形成。
图12是本发明方法的一个实施方案的示意图。
图13对于小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的直径＞2mm集落观察到的不同集落形态。直径＞2mm分类的集落中观察到许多种集落形态。
图14对于小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的直径1-2mm集落观察到的不同集落形态。直径1-2mm分类的集落中观察到许多种集落形态。
图15对于小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的直径0.5-1mm集落观察到的不同集落形态。直径0.5-1mm分类的集落中观察许多种集落形态。
图16对于小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的直径＜0.5mm集落观察到的不同集落形态。直径＜0.5mm分类的集落中观察许多种集落形态。
图17产生第二代及第三代神经球的小鼠原始第14天胚胎纹状体细胞产生的集落百分数。100％直径＞2mm的集落产生第二代集落，直径为1-2mm、0.5-1mm及＜0.5mm的集落分别有50％、36％及17％产生第二代神经球。第三代集落形成仅见于直径＞2mm及1-2mm的集落(分别为100％和8.3％)。在直径小于1mm的集落未见第三代神经球形成。
图18直径＞2mm集落产生的第二代神经球的小鼠第14天胚胎纹状体细胞免疫染色。图例说明以β微管蛋白抗体染色的神经元显示红色(A)，以胶质纤维性酸性蛋白质(GFAP)抗体染色的星形胶质细胞显示绿色(B)，以O4抗体染色的少突神经胶质细胞显示蓝色(C)。
图19神经集落形成细胞分析中小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生集落的原位免疫染色。
小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的直径＞2mm(A)、直径1-2mm(B)、直径0.5-1mm(C)及直径＜0.5mm(D)的集落内未分化细胞以神经巢蛋白抗体染色显示红色。
图20神经集落形成细胞分析中四个大小分类每一分类中小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的集落相对频数(A)如下述实施例12中描述，于神经集落形成细胞分析培养基中铺板7500个细胞。21天后，将集落分成四个大小分类，计数四个不同大小分类中的集落数(均值±标准差)。
(B)当给定大小分类的集落数(图20A)以总集落数的百分数表示时，50％的集落直径＜0.5mm，而直径＞2mm的集落占总集落数的大约16％(均值±标准差)。
(C)每细胞总数的集落(给定大小分类)频数(％)显示小于0.6％的总铺板细胞增殖并形成集落。这0.6％中，大多数(0.29％)产生小集落(直径＜0.5mm)，表明较有限的增殖潜能，这些集落继续是小集落。铺板细胞总数的很小一部分(0.08％)为高增殖潜能并形成大集落(直径＞2mm)(均值±标准差)。
图21神经集落形成细胞分析中分离了产生直径＞2mm集落的小鼠第14天胚胎纹状体细胞，离解并于液体悬浮培养基中培养3代(神经球分析)以产生第三代神经球。将第三代神经球分离成单细胞悬液，计数，2500个细胞于神经集落形成细胞分析中铺板培养21天。图21显示了起始神经集落形成细胞分析中由直径＞2mm细胞产生的第三代神经球获得的2500个细胞的集落频数(给定大小的分类中)。神经集落形成细胞分析中来自直径＞2mm集落的细胞当再次铺板培养时能够产生四个分类的集落。细胞总数相关的集落(指定大小分类)频数(％)显示总铺板细胞的2.5％(均值±标准差)增殖并形成集落。这2.5％中，大多数(1.8％)产生产生小集落(直径＜0.5mm)，表明较有限的增殖潜能。这些集落继续是小集落。总铺板细胞的很小一部分(0.02％)为高增殖，并形成大集落(直径＞2mm)。
图22起源自四个直径＞2mm的集落(神经集落形成细胞分析中产生)细胞的小鼠第14天胚胎纹状体细胞于液体培养(神经球分析)的长期扩增。在长期的神经球(超过3代)培养物中对来自四个直径＞2mm的集落(描述为Large(L)1、L2、L3及L4)的细胞进行传代，显示第6次传代时高倍扩增。
图23来自大鼠第18天胚胎(E18)皮质细胞的神经集落形成细胞分析集落。神经集落形成细胞分析中大鼠第18天胚胎(E18)皮质细胞产生直径1-2mm的两个集落。
图24神经集落形成细胞分析中来自大鼠第18天胚胎(E18)皮质细胞的四个大小分类每一分类集落的相对频数(A)如下述实施例16中描述，于神经集落形成细胞分析培养基中铺板7500个细胞。21天后，计数四个不同大小分类中的集落数。
(B)当图24A的数据以集落(在给定大小分类中)/集落总数的百分数表示时，大于77％的集落直径＜0.5mm，而大的、高增殖集落占集落总数的大约0.2％。
(C)集落/细胞总数的(特定大小分类)频数(％)图25神经集落形成细胞分析中成体小鼠室下区(SVZ)细胞产生的不同大小集落(A)＞2mm(B)1-2mm(C)0.5-1mm及(D)＜0.5mm。
图26神经集落形成细胞分析中由人胎儿皮质细胞产生的不同大小集落。与成体及胚胎神经细胞产生的集落相比，所产生的不同集落细胞更为分散(A)＞2mm(B)1-2mm(C)0.5-1mm及(D)＜0.5mm。
图27神经集落形成细胞分析中添加EGF、FGF或EGF+FGF的小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的集落频数(/铺板细胞总数)显示了集落大小分布。
图28神经集落形成细胞分析中小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞产生集落的原位免疫染色。在直径＞2mm(A，B，显示集落轮廓)、直径为1-2mm(C、D)、直径0.5-1mm(D)及直径＜0.5mm(E)的集落中，以β微管蛋白抗体染色显示红色的β微管蛋白+细胞，图29神经集落形成细胞分析中半固体甲基纤维素培养基和小鼠第14天胚胎皮质细胞的使用。使用半固体甲基纤维素培养基的神经集落形成细胞分析中小鼠第14天胚胎皮质细胞形成集落(A-10×、B-10×、C-B的40×放大)。
本发明详细描述本发明提供了对来自胚胎干细胞(ES)、胚胎、出生后或成体中枢神经系统的神经干细胞及祖细胞在三维半固体培养基中进行诱导增殖的方法。本发明涉及了根据增殖潜能对多种类型神经干细胞和神经祖细胞进行区别及鉴别不同神经干细胞。另一方面，本发明涉及了根据集落形态对多种类型神经干细胞和神经祖细胞进行区别及鉴别不同神经干细胞和神经祖细胞。
中枢神经系统的未分化细胞的详细定义可见US patent 5,750,376。然而，简要地，本发明中的细胞可定义如下神经祖细胞-本身非干细胞的未分化细胞。神经祖细胞具有增殖能力及分化为多种细胞类型的能力。因此，神经祖细胞可为单向、双能或多能的。神经祖细胞一个明显的特征是，与干细胞不同，它具有有限的增殖能力并无自稳定性。
神经干细胞-如本发明所使用，是指能无限分裂并能产生最终分化为神经元、星形胶质细胞及少突神经胶质细胞的子细胞的寡能或多能细胞。神经干细胞能够自稳定并产生大量子代细胞。神经干细胞的非干细胞子代被称为神经祖细胞。
前体细胞-如本发明所使用，是指神经干细胞子代，因此包括神经祖细胞和神经干细胞。
鉴定中枢神经系统中未分化细胞的这些术语的不恰当使用已导致研究神经干细胞及神经祖细胞的混乱和曲解。
在一个实施方案中，可以根据集落大小鉴别神经干细胞与神经祖细胞。因此，本发明提供了一种鉴定神经干细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；
(c)培养铺板细胞至集落间可看出差别；及(d)估计集落大小，其中较大的集落可能由神经干细胞产生。
本发明还提供了一种鉴定神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至集落间可看出差别；及(d)估计集落大小，其中较小的集落可能由神经祖细胞产生。
神经细胞可来自任何合适的来源。在优选的实施方案中，神经细胞来自原始中枢神经系统组织或培养的神经球。神经细胞可来自任何种类的动物，优选地为哺乳动物，更为优选地为啮齿类动物或灵长类动物如小鼠、大鼠或人类。神经细胞可来自神经轴任何部位包括但不限于纹状体、中隔、皮质、腹侧中脑、中脑、小脑或脊髓的原始胚胎、出生后或成体的中枢神经系统组织。
例如，可以使用下列方式而产生神经细胞。使用标准显微解剖技术从小鼠胚胎(如第14天胚胎)切除纹状体或皮质。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，清洗一次，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过，使用合适的培养基稀释成约8.0×104个细胞/mL-7.0×105个细胞/mL浓度，优选地约2×105个细胞/mL浓度，优选地添加EGF(如10-50ng/ml，优选地20ng/ml)。神经干细胞合适的培养基包括NeuroCultTM培养基(NeuroCultTM基础培养基NeuroCult增殖添加物；StemCellTechnologies Inc.)及任何含有基础培养基的培养基(如MEM、DMEM/F12、Iscove’s、McKoy’s、RPMI)，其中添加有葡萄糖、HEPES及碳酸氢钠；增殖添加物包括的成分如胰岛素、脱辅基转铁蛋白、黄体酮、四甲烯二胺、亚硒酸钠、垂体浸膏(O’Connor等，1996)。在优选的实施方案中，培养基为无血清培养基。
另外，来自培养的神经球的细胞也可以用于分析。使用标准显微解剖技术从小鼠胚胎切除纹状体或皮质。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，于合适的培养基如含约20ng/ml EGF的NeuroCultTM完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.)中铺板培养。培养细胞7天以产生用于神经集落形成细胞分析的神经球。从培养物收集第7天的神经球，机械分离成单细胞悬液，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过，使用合适的培养基如优选地含生长因子(如EGF)的NeuroCult完全培养基稀释成优选的约2.0×105个细胞/mL浓度。
然后于半固体培养基中悬浮神经细胞。任何支持细胞生长的半固体培养基均可使用。优选地，半固体培养基是以胶原为基础或以甲基纤维素为基础(IMDM、DMEM/F12、McKoy’s、Iscoves)。半固体培养基可以包括其中添加胶原或甲基纤维素的用于培养神经细胞的同样合适的培养基(如无细胞因子的Neurocult无血清培养基、NeurocultTM增殖添加物及EGF)。在优选的实施方案中，培养基为无血清培养基以使足够数量集落以进行数据统计分析的浓度(如1000-25,000个细胞，优选地2500-7500个细胞/35mm培养皿)进行铺板培养半固体培养基中的细胞。所形成的集落来自单细胞-神经干细胞或神经祖细胞。培养集落至集落大小间可观察到大小和差别(如约10-30天)，于评分板上使用网格进行集落计数并估计集落大小。来自单个神经干细胞的集落将随时间继续增大，而来自神经祖细胞的集落将具有有限的生长能力，因此不会随时间继续增大。集落大小将鉴别高增殖潜能神经干细胞(HPP-NSC)、低增殖潜能神经干细胞(LPP-NSC)及神经祖细胞。因此，所产生的集落大小可预见集落来自神经干细胞还是神经祖细胞以及神经干细胞具有高增殖潜能还是低增殖潜能。特别地，较大的集落(与培养皿上其它集落相比)表明是高增殖潜能神经干细胞，中等大小集落表明是低增殖潜能神经祖细胞，较小集落表明是神经祖细胞。“较大集落”或“较小集落”的实际直径取决于许多因素，如集落培养的时间有多久，等等。例如，2500个细胞/板培养14-28天后，将集落归为根据直径划分的四个分类之一(1)＞2.0mm，(2)1-2mm，(3)0.5-1mm及(4)＜0.5mm。因此，假定集落培养了至少14天，直径＞2.0mm指示表明是产生于神经干细胞的集落。
也可以根据所产生集落的形态鉴别细胞类型。因此，本发明提供了一种鉴定神经干细胞的方法，包括
(a)于支持神经干细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)测定集落形态，其中波形集落的存在表明集落是由神经干细胞产生。
本发明还提供了一种鉴定神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经祖细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)测定集落形态，其中平滑边缘集落的存在表明集落是由神经祖细胞产生。
在上述根据集落形态鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法中，神经细胞来源及分析培养基和条件按照上述根据集落大小的分析方法。
如实施例6中所述，不同大小的集落表现不同的形态。关于直径＞2mm的集落，某些情况下，集落表面边缘含有突出，突出下致密细胞层形成波形。其它直径＞2mm的集落具有由集落的颜色强度所反映的不同程度细胞密度。在某些情况下，大集落中心具有深色的细胞圈。直径为1-2mm和0.5-1mm集落也可观察到不同的集落形态。直径1-2mm的集落特征包括毛状边缘和相差上黑暗的致密中心核。其它直径1-2mm的集落具有更均一的细胞簇群。有些直径0.5-1mm的集落具有密集的中心和平滑的表面，而其它则具有星形外表面。此大小范围的某些集落显示相差上非常黑暗及致密。直径＜0.5mm的某些集落所观察到的集落形态不如其它大小分类的集落所观察到的明显。某些情况下，在直径＜0.5mm的小集落观察到致密中心核。
在另一实施方案中，神经干细胞的存在可以通过测定集落的抗原表达而估计。因此，本发明提供了一种鉴定神经干细胞的方法，包括(a)于支持神经干细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)测定集落的抗原表达，其中未分化细胞相关标志物的存在表明集落是由神经干细胞产生。
本发明还提供了一种鉴定神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经祖细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)测定集落的抗原表达，其中特定神经谱系相关的细胞标志物存在表明集落是由神经祖细胞产生。
在上述根据抗原表达鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法中，神经细胞来源及分析培养基和条件按照上述根据集落大小的分析方法。
集落的抗原表达可通过针对未分化细胞标志物的抗体(如抗神经巢蛋白、sox、sox2、musashi、LexA、CD24)及针对分化细胞抗体标志物的抗体(抗β微管蛋白、GFAP、O4、MAP2、MBP)进行免疫细胞化学染色而测定。本领域技术人员可容易地测定其它合适的标志物。在一个实施方案中，对集落进行了表明神经干细胞的神经巢蛋白表达检测。在另一实施方案中，对集落进行了表明神经祖细胞的的β微管蛋白表达检测。
为便于介绍，本发明上述鉴别神经干细胞和神经祖细胞的分析方法(如大小、形态或抗原表达)可共同称作神经集落形成细胞(NCFC)测定。
考虑到神经集落形成细胞分析能够鉴定不同的神经干细胞并鉴别神经干细胞和神经祖细胞，此方法可用于筛选潜在治疗成分的功效(针对特定神经干细胞亚型的药物)或毒性(针对除神经干细胞外的组织/细胞的药物)。可以不同剂量将目的成分应用于培养细胞，并监测神经干细胞或神经祖细胞的反应。例如，可以测定成分对神经干细胞或神经祖细胞增殖的影响，蛋白质如酶、受体、神经递质及氨基酸的新表达或水平增加可以使用本领域已知技术进行分析。
神经集落形成细胞分析也可用于研究中枢神经系统体内处理的效应(遗传或后生)及其对神经干细胞及神经祖细胞的影响或用于研究治疗非中枢神经系统细胞的成分的非目的效应，及此成分可能对神经干细胞和神经祖细胞的次级效应或副作用。在此情况下，使用成分处理动物，从中枢神经系统分离细胞，采用神经集落形成细胞分析方法评价成分对神经干细胞及神经祖细胞的增殖、基因表达和/或蛋白表达的作用。
神经集落形成细胞分析的应用可包括药物筛选、诊断疾病及中枢神经系统状态、检测周围环境对中枢神经系统的影响，如由辐射、毒物、刺激或环境强化引起的影响，以及评估中枢神经系统疾病动物模型。
神经集落形成细胞分析方法的其它应用是筛选衰老、饮食摄入及运动对中枢神经系统的作用。
神经集落形成细胞分析方法可用于神经干细胞生物学研究及信号、生长因子、激素、信号转导分子及神经递质的鉴定。例如，神经集落形成细胞分析的应用可包括在神经发育生物学、中枢神经系统疾病生物学(肌萎缩性侧索硬化症、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症、癌症、脑肿瘤或瘤转移、进行性肿瘤、亨延顿氏舞蹈病)、中枢神经系统损伤生物学(脊髓，手术修复)、神经学综合征(精神分裂症)生物学及衰老和记忆丧失生物学方面的研究。
神经集落形成细胞分析方法的其它用途包括评估脑功能的增强、疼痛的感觉、损伤后愈合、成瘾、记忆丧失及行为失常。
中枢神经系统疾病或紊乱如神经变性疾病(如多发性硬化症、帕金森氏病、阿耳茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化症、亨延顿氏舞蹈病)及中枢神经系统损伤(如中风、颅脑损伤、脊髓损伤、脑性麻痹)涉及神经细胞的退化、机能障碍或神经细胞丢失。预期神经干细胞移植可用于治疗中枢神经系统的此类疾病或紊乱。因此，本发明的神经集落形成细胞分析方法可用于评价治疗用细胞制品的质量。根据此方法鉴定的神经干细胞也可用于中枢神经系统疾病或紊乱的治疗。
以下非限制性实施例说明了本发明具体实施方式
实施例1使用小鼠第14天胚胎纹状体细胞的神经集落形成细胞分析(NCFC)神经细胞可来自鼠类、啮齿类动物及人类神经轴任何部位(包括但不限于纹状体、中隔、皮质、腹侧中脑、中脑、小脑或脊髓)的原始胚胎、出生后或成体中枢神经系统组织。神经细胞还可从使用神经球分析或神经组织培养领域技术人员已知的任何方法而产生的培养细胞获得。根据培养胚胎干细胞的任何标准程序，神经细胞还可从任何时期的胚胎干细胞培养物获得。
例如，使用标准显微解剖技术从CD1 albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除纹状体和/或皮质。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，清洗一次，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过，使用NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCellTechnologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀释成2.17×105个细胞/mL浓度。
另外，来自培养的神经球的细胞也可用于神经集落形成细胞分析。使用标准显微解剖技术从CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除纹状体。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，于添加20ng/ml EGF的NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.)中铺板。培养细胞7天以产生用于神经集落形成细胞分析的神经球。从培养物收集第7天的神经球，机械分离成单细胞悬液，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过。
使用NeuroCult 完全培养基(StemCell Technologies Inc.)将从上述两个例子任一例产生的神经细胞单细胞悬液稀释成2.17×105个细胞/mL浓度。按给定顺序添加以下组分以制备3.3ml的神经集落形成细胞分析半固体培养基溶液

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按2500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿中。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数并估计集落大小。
实施例2半固体培养(神经集落形成细胞分析)与液体悬浮培养(神经球分析)小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生神经集落的生长按上述实施例1详述，从小鼠原始中枢神经系统组织或神经球第7天的培养物分离细胞。简言之，使用标准显微解剖技术从CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除纹状体和/或皮质。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，清洗一次，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过，于NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)中稀释成2.17×105个细胞/mL浓度。
另外，如前所述，来自培养神经球的细胞也可以用于神经集落形成细胞分析。使用标准显微解剖技术从CD1albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除纹状体。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，于含20ng/ml EGF的NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.)中铺板。培养细胞7天以产生用于神经集落形成分析的神经球。从培养物收集第7天的神经球，机械分离成单细胞悬液，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过。
使用NeuroCult完全培养基(StemCell Technologies Inc.)将上述两个例子产生的神经细胞单细胞悬液稀释成2.17×105个细胞/mL浓度。按给定顺序添加以下组分以制备3.3ml的神经集落形成细胞分析半固体培养基溶液

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按2500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小。
图4显示了如图例说明所列的培养数天后神经集落形成细胞分析及神经球分析中形成的神经球的形态。图5显示了神经集落形成细胞分析中产生的集落数与神经球分析中产生的集落数相似。总之，在神经球分析和神经集落形成细胞分析中分别形成了相似数量的神经球和集落。这表明，神经集落形成细胞分析中使用的培养条件不抑制EGF敏感细胞的增殖。
实施例3在使用小鼠第14天胚胎纹状体细胞的神经集落形成细胞分析中集落大小和天数之间的关系按上述实施例1详述，从小鼠原始中枢神经系统组织或神经球第7天的培养物分离细胞。
神经集落形成细胞分析中培养4-7天，神经干细胞和神经祖细胞开始增殖(图6A)形成小集落。14天时，这些小集落已经增大，集落间可看到差别(图6B)。大约10-14天后许多集落停止生长，而其它集落继续扩增。21-28天时，集落可分为至少4类1)直径＞2mm，2)直径为1-2mm，
3)直径为0.5-1mm及4)直径＜0.5mm(图7)。
实施例4神经集落形成细胞分析中小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生不同集落类型的大小和不同大小集落的频数估计集落大小及对集落进行计数，对这些大小分类每一分类的集落频数进行绘图(图8A)。这可以表示为铺板细胞总数的百分数(图8B)或产生总集落数的百分数(图8C)。大多数(76％)产生的集落＜0.5mm，很小一部分(2.3％)形成直径＞2mm的大集落。
实施例5从不同大小集落的小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生不同大小集落分离的细胞的增殖潜能通过以下程序测定不同大小集落细胞的增殖潜能。从胶原基质切除而分离四个大小分类的集落，各自于0.25％胶原蛋白酶溶液中37℃培育30分钟(图9)。然后使用Gilson移液吸头机械分散切离的集落，碎开基质，产生单细胞悬液。将来自单集落的所有细胞铺板至24孔培养板的一个孔中(神经球分析)，于添力EGF的NeuroCult完全培养基中进行培养。10-14天后，在形成新神经球的孔中收集神经球，机械分离并使用新鲜培养基中重新铺板培养。每10-14天重复一次这样的操作。按上面详述(图9)从神经集落形成细胞分析中分离高增殖潜能神经干细胞(HPP-NSC)集落。在这些培养条件下，从直径为2mm或更大的集落(HPP-NSC集落)而非直径＜0.5mm的集落产生生长因子敏感的细胞系(图10B-C)。
实施例6小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生不同的集落形态按上述实施例1详述，从小鼠原始中枢神经系统组织或神经球第7天的培养物分离细胞。
神经集落形成细胞分析中培养4-7天，神经干细胞和神经祖细胞开始增殖(图6A)形成小集落。14天时，这些小集落已经不同程度生长，可观察到不同大小的集落(图6B)。大约10-14天后许多集落停止生长，而其它集落继续扩增。21-28天时，集落可分为至少4类1)直径＞2mm，2)直径1-2mm，3)直径0.5-1mm及4)直径＜0.5mm(图7)。21-28天时，可观察到不同集落大小分类的集落形态差别，通过显微镜直接对来自四个大小分类的集落进行拍照，记录形态差别(图13-16)。从胶原基质切除而分离四个大小分类的集落，各自于0.25％胶原蛋白酶溶液中37℃培育30分钟(图9)。然后使用Gilson移液吸头机械分散切离的集落，碎开基质，产生单细胞悬液。将来自单集落的所有细胞铺板至24孔培养板的一个孔中(神经球分析)，于添加EGF的NeuroCult完全培养基中进行培养。10-14天后，在形成新神经球的孔中收集神经球，机械分散并使用新鲜培养基重新铺板培养。每14天重复一次这样的操作。按上面详述(图9)从神经集落形成细胞分析中分离高增殖潜能神经干细胞(HPP-NSC)集落。在这些培养条件下，从直径为2mm或更大的集落(HPP-NSC集落)而非直径＜0.5mm的集落(图11)产生生长因子敏感的细胞系(图10B-C和图11)。
直径＞2mm的集落所观察的不同集落形态示于图13。在某些情况下，集落表面边缘含有突出，于突出下具有致密细胞层形成波形(图13A)。其它直径＞2mm的集落具有由集落颜色强度反映的不同程度细胞密度(图13B和图13C)。在某些情况下，大集落的中心具有深色的细胞圈(图13D)。
直径1-2mm和0.5-1mm的集落也可观察到不同的集落形态(图14和图15)。直径1-2mm集落的特征包括毛状边缘(图14C)，及相差上为黑暗的致密中心核(图14A和14B)。直径1-2mm的其它集落具有较均一的细胞簇(图14D)。
有些直径0.5-1mm的集落(图15)具有致密中心和平滑表面(分别为15A及15B)，而其他的则具有星状的外表面(图15C)。此大小范围的有些集落在相差上非常黑暗及致密。(图15D)直径＜0.5mm的集落观察到的集落形态不如其它大小分类的集落观察到的明显(图16A-D)。在某些情况下，在直径＜0.5mm的小集落观察到致密中心核(图16D)。
如上所述，在神经干细胞和神经祖细胞的定义中，神经干细胞具有广泛的增殖潜能而神经祖细胞具有有限的增殖潜能。大集落可被重复传代的能力支持其最初来源于神经干细胞的结论，另外，小集落不能持续增殖及产生大量的子细胞支持其非干细胞衍生而是神经祖细胞的结论。因此，神经集落形成细胞分析能够鉴别具有不同增殖潜能(高及低增殖潜能)的细胞。
实施例7神经集落形成细胞分析-小鼠第14天胚胎纹状体中枢神经系统组织神经细胞来自小鼠原始胚胎称作纹状体的神经轴区的中枢神经系统组织。例如，使用标准显微解剖技术从CD1albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除纹状体。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，清洗一次，通过40mm尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过，使用NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀释成2.17×105个细胞/mL浓度。
使用NeuroCult完全培养基(StemCell Technologies Inc.)将从上述例子产生的神经细胞单细胞悬液稀释成2.17×105个细胞/mL浓度。按给定顺序添加以下组分以制备3.3ml的神经集落形成细胞分析半固体培养基溶液

混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按2500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小。
实施例8神经集落形成细胞分析中使用小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞产生的不同集落类型的大小及不同大小集落的频数估计集落大小及对集落进行计数，这些大小分类每一分类的集落频数总结于表1中。此结果以铺板细胞总数的百分数表示(表1)。铺板细胞总数的0.52-1.1％不同程度增殖并形成不同大小的集落。铺板细胞总数的很小一部分(0.09％)形成大集落(＞2mm)。大多数形成的集落＜1mm(0.5％)表明较有限的增殖潜能。
实施例9不同大小集落中小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞的增殖潜能通过以下程序判断不同大小集落的增殖潜能。从胶原基质切除而分离四个大小分类的集落，各自于0.25％胶原蛋白酶溶液中于37℃培育30分钟(图9)。然后使用Gilson移液吸头机械分散切离的集落，碎开基质，产生单细胞悬液。将来自单集落的所有细胞铺板至24孔培养板的一个孔中(神经球分析)，于添加EGF的NeuroCult完全培养基中进行培养。10-14天后，在形成新神经球的孔中收集神经球，机械分离并使用新鲜培养基重新铺板。每10-14天重复一次这样的操作。直径＞2mm的集落始终产生第二代和第三代神经球(图17)。长期培养中，来自第三代神经球的细胞增殖、扩增及保持多谱系潜能，表明最初的神经集落形成细胞为神经干细胞。直径1-2mm、直径0.5-1mm及直径＜0.5mm的集落中的细胞分别有50％、36％和17％产生第二代神经球。直径1-2mm的集落细胞有8.3％产生第三代神经球，然而这些细胞不能被传代。直径＜1mm的集落细胞不产生第三代神经球，表明最初的神经集落形成细胞无发明背景中描述的神经干细胞的所有特征，为神经祖细胞。
实施例10小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞直径＞2mm集落产生的第二代神经球的多谱系分化潜能通过以下程序判断直径＞2mm集落的多谱系增殖潜能。从胶原基质切除而分离直径＞2mm的各集落，各自于0.25％胶原蛋白酶溶液中37℃培育30分钟(图9中方法图示)。然后使用Gilson移液吸头机械分散切离的集落，碎开基质，产生单细胞悬液。将来自单集落的所有细胞铺板至24孔培养板的一个孔中(神经球分析)，于使用添加EGF的NeuroCult完全培养基中进行培养。10-14天后，在形成新神经球的孔中收集神经球，机械分离，将来自集落的所有细胞铺于含0.8mL添加1％血清的NeuroCultTM完全培养基的#35-4688Becton Dickinson BioCoat 8孔小室载玻片(预先包被多聚-D-赖氨酸层粘连蛋白)上。在这些培养条件下细胞分化，然后使用以下程序进行进一步的免疫染色处理。6-8天后使用倒置光学显微镜观察培养物以确定细胞是否已分化及具有活力。在分化过程中根据铺板的细胞数量及培养基是否变为酸性(变成黄色/橙黄色)而更换培养基。通过去除大约50％的培养基并代以新鲜的添加1％血清的NeuroCult TM完全培养基更换培养基。
培养10天后，从含分化细胞的每小室去除培养基(小心不要去除所有培养基而将未固定细胞暴露于空气)，将1mL 4％的对甲醛溶液直接添加至小室中。于室温培育细胞30分钟。通过连接至真空抽气机的吸引系统抽吸对甲醛溶液，于标本中添加PBS(pH 7.2)并培育5分钟。再重复此清洗过程三个步骤2次。然后，通过于每孔添加1mL含0.3％Triton X-100的PBS透化细胞，室温培育5分钟。5分钟后，通过抽吸去除PBS/TritonX-100，用PBS进行两次5分钟清洗。
标本以针对神经元的特定谱系标志物β微管蛋白、针对星形胶质细胞的特定谱系标志物GFAP及针对少突神经胶质细胞的特定谱系标志物O4的一抗进行标记，用含10％山羊血清的稀释溶液以最佳工作稀释度(β微管蛋白抗体以1∶1000使用，GFAP抗体以1∶100使用及O 4抗体以1∶50使用)稀释一抗。将250ul稀释抗体直接添加至小室中，所有样本于37℃培育2小时。培育之后，使用PBS进行三次5分钟的清洗，以去除一抗。然后，以含2％血清(与一抗所用稀释液相同的血清)的PBS稀释二抗-德克萨斯红染料标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)、AMCA标记的山羊抗兔IgG(H+L)及μ链特异的FITC标记的山羊抗小鼠IgM，并添加至每孔载玻片上，于37℃与250ul二抗培育样本30分钟，培育之后，使用PBS进行三次5分钟的清洗，以去除二抗。依照厂家说明书从载玻片去除小室。于每一小室孔添加5ul封固剂，然后盖上75mm盖玻片以免产生气泡。于荧光显微镜下使用适于每种荧光基团的滤光片观察免疫荧光。
由直径＞2mm集落产生的第二代神经球所分离的细胞能够产生中枢神经系统的三种细胞表现型-神经元、星形胶质细胞及少突神经胶质细胞(图18)，表明原始神经集落形成细胞为神经干细胞。
实施例11神经集落形成细胞分析中小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞产生集落的原位免疫染色由于胶原凝胶可被干燥及染色，神经集落形成细胞分析中形成的集落还可进行直接原位免疫细胞化学染色。神经集落的生长、脱水、固定及染色均在35mm培养皿及超大(75mm×50mm)载玻片上进行。根据以下程序进行神经集落形成细胞分析中的集落的原位染色。将装有大约200ml丙酮的容器置于冰上最少15分钟。从培养箱中取出神经集落形成细胞分析中使用的35mm培养皿，并去除培养皿盖。含胶原凝胶及包埋集落的每个培养皿翻转至75mm×50mm超大载玻片上。将预切的聚丙烯隔膜连同一白色厚滤光卡片置于胶原凝胶上以使液体浸透卡片。然后去除白色厚卡片，保留原先的聚丙烯隔膜。将含有胶原凝胶和隔膜的整个载玻片水平放入一合适的充满约200ml冷丙酮的塑料容器中。聚丙烯隔膜浮出，留下胶原凝胶在载玻片上。将载玻片置丙酮中5分钟。从固定剂中取出载玻片，垂直风干。将载玻片置于装有4％对甲醛溶液的塑料容器中，标本于室温培育30分钟。倒出对甲醛溶液，于标本中添加约20ml PBS(pH 7.2)，室温培育5分钟。再重复此清洗过程三个步骤2次。然后，通过于含载玻片的塑料容器中添加20mL含0.3％Triton X-100的PBS透化细胞，标本于室温培育5分钟。5分钟后，倒出PBS/Triton X-100，用PBS清洗两次，每次5分钟。
然后以针对未分化神经细胞标志物神经巢蛋白的一抗标记标本，以含10％山羊血清的PBS 1∶50稀释抗神经巢抗体，然后向载玻片上的脱水胶原凝胶直接添加约500ul稀释的抗体，于抗体溶液上铺一层石蜡膜。所有标本于37℃培育2小时。培育之后，使用PBS进行三次5分钟的清洗，以去除一抗。然后，以含2％山羊血清的PBS稀释二抗-得克萨斯红标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)，直接添加至载玻片上的脱水胶原凝胶上。于抗体溶液上铺一层石蜡膜。将标本与二抗在37℃培育30分钟。培育之后，使用PBS进行三次5分钟的清洗以去除二抗，在每一脱水的胶原凝胶中心添加5ul封固剂，然后盖上盖玻片以免产生气泡。于荧光显微镜下使用适于每种荧光基团合的合适滤光片观察免疫荧光。
直径＞2mm集落的细胞神经巢蛋白表达强阳性，这些集落的大多数细胞为神经巢蛋白染色(图9A)。与直径＞2mm的集落细胞相比，直径1-2mm(图19B)和直径0.5-1mm(图19C)的集落含有较少数量神经巢蛋白表达阳性的细胞，而直径＜0.5mm的集落神经巢蛋白阳性细胞数最少(图19D)。这表明与直径＜2mm的集落相比，直径＞2mm的集落含有包括神经干细胞和神经祖细胞的未分化细胞数量较多。
实施例12使用数量增加的小鼠第14天胚胎纹状体细胞的神经集落形成细胞分析神经细胞来自小鼠原始胚胎称作纹状体神经轴区的中枢神经系统组织。例如，使用标准显微解剖技术从CD1albino小鼠第14天胚胎(CharlesRiver)切除纹状体。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，清洗一次，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过，使用NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀释成6.51×105个细胞/mL浓度。此细胞浓度是实施例1中用于第2次2传代的第14天胚胎纹状体神经球及实施例7中原始纹状体细胞浓度(2.17×105个细胞/mL)的三倍。6.51×105个细胞/mL浓度产生7500个铺板细胞总数/35mm培养皿，发现可产生合适数量进行评分的集落。
使用NeuroCult完全培养基(StemCell Technologies Inc.)将从上述例子产生的神经细胞单细胞悬液稀释成6.51×105个细胞/mL浓度。按给定顺序添加以下组分以制备3.3ml的神经集落形成细胞分析半固体培养基溶液

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按7500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小。
实施例13神经集落形成细胞分析中小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞中枢神经系统组织产生不同集落类型的大小及不同大小集落的频数如实施例12所述，在神经集落形成细胞分析中培养来自原始胚胎中枢神经系统组织的细胞。估计集落大小及对集落进行计数，对这些大小分类的每一分类的集落频数绘图(图20)。这可以表示为铺板细胞总数的百分数(图20C)或产生总集落数的百分数(图20B)。大多数(50％)产生的集落＜0.5mm，16％形成直径＞2mm的大集落，铺板总细胞中很小一部分(0.08％)形成的大集落(直径＞2mm)。所形成集落大多数＜1mm(0.4％)，表明较有限的增殖潜能。
实施例14神经集落形成细胞分析中直径＞2mm的集落细胞产生不同集落类型的大小及不同大小集落的频数-小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞中枢神经系统组织如实施例12所述，在神经集落形成细胞分析中培养来自原始胚胎中枢神经系统组织的细胞。通过以下程序检测直径＞2mm集落细胞再次铺板生长神经集落形成细胞时产生不同集落类型的能力。从胶原基质切除而分离直径＞2mm集落，各自于0.25％胶原蛋白酶溶液中37℃培育30分钟(图9)。然后使用Gilson移液吸头机械分散切离的集落，碎开基质，产生单细胞悬液。将来自单集落的所有细胞铺板至96孔培养板的一个孔中(神经球分析)，于添加EGF的NeuroCult完全培养基中进行培养。10-14天后，在形成新神经球(第二代神经球)的孔中收集神经球，机械分离并使用新鲜培养基于24孔板重新铺板培养以产生第三代神经球。10-14天后，在形成第三代神经球的孔收集神经球，机械分离并使用台盼蓝排除进行活力细胞计数。然后神经集落形成细胞分析中根据以下程序将细胞铺板培养。使用NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)调整细胞浓度至2.17×105个细胞/mL，按给定顺序添加至神经集落形成细胞分析半固体培养基中

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按2500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小。直径＞2mm的集落细胞能够再生成不同大小分类的集落(图21)。
实施例15直径＞2mm的集落细胞的长期增殖潜能和扩增-小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞中枢神经系统组织如实施例12所述，在神经集落形成细胞分析中培养来自原始胚胎中枢神经系统组织的细胞。通过以下程序检测直径＞2mm集落在长期神经球培养(超过第三代神经球)中自我更新和生成大量子代细胞的能力。从胶原基质切除而分离直径＞2mm集落，各自于0.25％胶原蛋白酶溶液中37℃培育30分钟(图9)。然后使用Gilson移液吸头机械分散切离的集落，碎开基质，产生单细胞悬液。将来自单集落的所有细胞铺板至96孔培养板的一个孔中，于添加EGF的NeuroCult完全培养基中进行培养(神经球分析)。10-14天后，在形成新神经球(第二代神经球)的孔中收集神经球，机械分离并使用新鲜培养基于24孔板重新铺板培养以产生第三代神经球。10-14天后，在形成第三代神经球的孔收集神经球，机械分离并于含有添加EGF的NeuroCult完全培养基的6孔培养板中铺板培养。10-14天后，在形成神经球的孔收集神经球，机械分离并使用台盼蓝排除进行活力细胞计数。然后使用含添加EGF的NeuroCult完全培养基T-25cm2培养瓶培养所有细胞(第四代)。每10-14天重复此再次铺板培养过程以产生长期培养物。在每一培养代次，计数细胞数，通过每代接种活力细胞总数除此代活力细胞总数计算扩增倍数。然后从第6代的起始细胞数开始计算活力细胞总数的累积扩增倍数(6-10代)(图22)。四个直径＞2mm的单独集落的细胞显示不管细胞生长速率如何变化，活力细胞总数的扩增倍数均增加。直径＞2mm集落的细胞在8代以上能够自我更新并且产生子代数量增加，此为神经干细胞的两个重要特征。
实施例16使用大鼠第18天原始胚胎(E18)皮质细胞的神经集落形成细胞分析神经细胞可来自鼠类、啮齿类动物及人类神经轴任何部位(包括但不限于纹状体、中隔、皮质、腹侧中脑、中脑、小脑或脊髓)的原始胚胎、出生后或成体中枢神经系统组织。
使用标准显微解剖技术从Sprague-Fischer 344大鼠第18天胚胎(BrainBits，Illinois，USA)切除皮质。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用带一次性塑料移液吸头的p200Gilson吸管机械分离成单细胞悬液，清洗一次，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过，使用NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM NS-A基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纤维细胞生长因子-bFGF及2ng/μl肝素)稀释成6.51×105个细胞/mL浓度。
按给定顺序添加以下组分以制备3.3ml的神经集落形成细胞分析半固体培养基溶液

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按7500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小(图23)。
实施例17大鼠第18天原始胚胎皮质细胞的神经集落形成细胞分析集落大小和天数之间的关系如上述实施例16所详述，从大鼠第18天原始胚胎皮质中枢神经细胞组织分离细胞并于神经集落形成细胞分析中培养。21-28天时，集落可分为至少4类1)直径＞2mm，2)直径1-2mm，3)直径0.5-1mm及4)直径＜0.5mm(图7)。图23显示在神经集落形成细胞分析中观察到的两个直径1-2mm的大鼠第18天胚胎细胞集落。
实施例18使用大鼠第18天原始胚胎皮质细胞的神经集落形成细胞分析所产生不同集落类型的大小和不同大小集落的频数估计集落大小及对集落进行计数，对这些大小分类每一分类的集落频数绘图(图24A-C)。这也可以表示为铺板细胞总数的百分数(图24C)或产生总集落数的百分数(图24B)。大多数(77％)产生的集落＜0.5mm，很小一部分(0.2％)形成直径＞2mm的大集落。
实施例19使用小鼠原始的成体室下区(SVZ)细胞的神经集落形成细胞分析可从成体小鼠称为室下区(包含增殖的神经干细胞和神经祖细胞)的神经轴区的中枢神经系统组织获得神经细胞。例如，使用标准显微解剖技术从6只CD1albion小鼠(Charles River)切除室下区，将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，用解剖刀切碎，然后使用胰蛋白酶和DNA酶溶液于37℃酶解处理15分钟。培育15分钟后，向细胞添加类卵粘蛋白胰蛋白酶抑制剂并轻轻混合。细胞悬液于8000rpm离心5分钟，弃去上清液，使用150ul NeuroCult完全培养基(NeuroCultTMNS-A基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纤维细胞生长因子-bFGF及2μg/ml肝素)重悬细胞沉淀，使用带一次性使用塑料移液吸头的p200Gilson吸管机械分离成单细胞悬液，清洗细胞悬液两次(离心)，使用1ml NeuroCult完全培养基(NeuroCultTMNS-A基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纤维细胞生长因子-bFGF及2μg/ml肝素)重悬细胞终沉淀，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过。由于污染有细胞碎片、髓磷脂及其它细胞类型计数成体小鼠细胞是非常困难的，因此细胞计数不可靠。神经集落形成细胞分析中从最终的1ml细胞悬液使用了150ul。按给定顺序添加以下组分以获得神经干细胞分析的半固体培养基

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小(图25)。
实施例20使用小鼠原始的成体室下区(SVZ)细胞的神经集落形成细胞分析如上述实施例19所述，从小鼠中枢神经细胞组织的室下区细胞分离细胞并于神经集落形成细胞分析中培养。21-28天时，集落可分为至少4类1)直径＞2mm，2)直径1-2mm，3)直径0.5-1mm及4)直径＜0.5mm(图25)。
实施例21人胎儿皮质细胞的第4代神经球的神经集落形成细胞分析神经细胞可来自鼠类、啮齿类动物及人类神经轴任何区域(包括但不限于纹状体、中隔、皮质、腹侧中脑、中脑、小脑或脊髓)的初生胚胎、生后或成体的中枢神经系统组织。
来自人第4代神经球的细胞用于神经集落形成细胞分析(参照方法)。简言之，第4代神经球于400rpm离心5分钟并弃去上清液。于200ulNeuroCult完全培养基(NeuroCultTMNS-A基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纤维细胞生长因子-bFGF及2μg/ml肝素)中重悬细胞沉淀，然后使用一次性塑料移液吸头机械分离成单细胞悬液，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过。使用台盼蓝排除进行细胞计数，并使用NeuroCult完全培养基(NeuroCultTMNS-A基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF、10ng/ml基本的成纤维细胞生长因子-bFGF及2μg/ml肝素)将细胞稀释成2.17×105个细胞/mL浓度。
按给定顺序添加以下组分以制备3.3ml的神经集落形成细胞分析半固体培养基溶液

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按7500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小(图26)。
实施例22人胎儿皮质细胞产生的不同的神经集落形成细胞集落大小如上述实施例21详述，于神经集落形成细胞分析中培养人胎儿神经球单细胞悬液。21-28天时，集落可分为至少4类1)直径＞2mm(图26A)，2)直径1-2mm(图26B)，3)直径0.5-1mm(图26C)及4)，直径＜0.5mm(图26D)。图26显示了神经集落形成细胞分析中人胎儿皮质细胞单细胞悬液衍生的不同集落大小。神经集落形成细胞分析中人胎儿皮质细胞产生集落的形态不同于小鼠细胞(图7)及大鼠细胞(图23)产生的集落。不同大小集落的细胞较分散，在直径＞2mm及直径1-2mm的集落中可见较少的细胞。
实施例23使用不同生长因子的神经集落形成细胞分析使用神经集落形成细胞分析检测认为存在于胚胎及成体小鼠中枢神经系统中的EGF、FGF及EGF+FGF敏感的干细胞和祖细胞亚群。使用标准显微解剖技术从CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除纹状体。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，清洗一次，通过40um尼龙细胞滤过器(Falcon)滤过。使用NeuroCult 完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCell Technologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀释成6.51×105个细胞/mL浓度。使用下列成分配制3.3ml的神经干细胞分析半固体培养基溶液，各生长因子单独或联合添加

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按7500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行EGF、FGF及EGF+FGF集落的计数并估计其大小。
实施例24小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞于使用不同生长因子神经集落形成细胞分析中产生不同大小集落的频数根据实施例23描述的程序使用小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞添加EGF、bFGF及EGF+bFGF进行神经集落形成细胞分析。对生长因子敏感细胞形成的集落估计大小并进行集落计数，对这些大小分类每一分类每铺板细胞总数的集落频数绘图(图27)。在EGF、FGF及EGF+FGF存在下，直径＜0.5mm的集落频数最高，很小一部分(0.2％)形成直径＞2mm的大集落。结果表明在EGF和FGF存在下，获得较多集落，而大多数集落＜0.5mm，并按照对这些集落细胞进行的功能性分析确定其来自神经祖细胞。
实施例25神经集落形成细胞集落以带有小鼠第14天原始胚胎纹状体分化细胞特异标志物的血清覆盖进行的原位免疫染色神经集落形成细胞分析中形成的集落也可用血清覆盖以诱导不同集落的细胞分化为成熟神经谱系，然后进行直接原位免疫细胞化学染色。根据实施例12描述的程序于神经集落形成细胞分析中培养小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞21天。在培养期末，于每一神经集落形成细胞培养皿上覆盖1ml含1％胎牛血清的NeuroCultTM完全培养基(StemCellTechnologies Inc.)，培育10天。然后根据实施例11描述的程序进行神经集落形成细胞分析中胶原及嵌入集落的原位脱水、固定及透化。然后以针对幼稚及成熟神经元特异的标志物-β微管蛋白的一抗标记标本。使用含10％山羊血清的PBS以1∶1000稀释抗β微管蛋白抗体。然后将约500ul稀释抗体直接添加至载玻片的脱水胶原凝胶上，于抗体溶液之上置一层石蜡膜。所有样本于37℃培育2小时。培育之后，以PBS进行三次5分钟清洗去除一抗，然后，以含2％山羊血清的PBS稀释二抗-德克萨斯红染料标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)，直接添加至载玻片的脱水胶原凝胶上。于抗体溶液之上置一层石蜡膜。标本与二抗于37℃培育30分钟。培育之后，以PBS进行三次5分钟清洗以去除二抗，于每一脱水的胶原凝胶中心添加5ul封固剂，然后盖上盖玻片以免产生气泡。于荧光显微镜下使用适于每种荧光基团的滤光片观察免疫荧光。
直径＞2mm集落中很少细胞表达β微管蛋白(图28A和图28B)。与直径＞2mm的集落相比，直径1-2mm(图28C及图28D)、直径0.5-1mm(图28D)及直径＜0.5mm(图28E)的集落含有较多β微管蛋白表达阳性的细胞。此操作程序可以进行神经集落形成细胞集落分化细胞暴露于血清后的检测。
实施例26神经集落形成细胞分析中甲基纤维素和小鼠第14天原始胚胎纹状体细胞的使用上述神经集落形成细胞分析中使用的半固体培养基为胶原培养基。其它类型半固体培养基如甲基纤维素也可用于从单细胞悬液产生神经集落。对小鼠中枢神经系统组织分离的神经细胞在甲基纤维素半固体培养基中形成集落的能力与在胶原培养基中形成集落的能力进行了比较(实施例1)使用标准显微解剖技术从CD1albino小鼠第14天胚胎(Charles River)切除纹状体。将组织收集于含2％葡萄糖的磷酸盐缓冲盐水中，清洗一次，然后使用火抛光的玻璃吸管机械分离成单细胞悬液，使用NeuroCult完全培养基(NeuroCultTM基础培养基和NeuroCult增殖添加物；StemCellTechnologies Inc.添加20ng/ml EGF)稀释成6.51×105个细胞/mL浓度。按给定顺序添加以下组分以制备3.3ml的半固体胶原培养基溶液

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。按7500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小。
同时，按给定顺序添加以下组分生成1％终浓度的甲基纤维素来制备甲基纤维素培养基

充分混合生成的溶液以于整个培养基均匀分配细胞。使用按7500个细胞/培养皿的终浓度将1.5ml悬液铺入各35mm组织培养皿。将培养物置于设定37℃、100％湿度及5％CO2的组织培养箱中。于14-28天进行集落计数及估计集落大小。图29显示小鼠第14天胚胎纹状体细胞产生的三个直径＜0.5mm的集落尽管根据目前认为是优选的实施例描述了本发明，应该知道本发明不限于已公开的实施例。相反，本发明旨在涵盖包括在附加权利要求书精神及范围内的各种修改及等同处置。
所有出版物、专利及专利申请书全部以参考文献形式完整合并在本文中，如同每一单独的出版物、专利或专利申请书被特别单独指明通过参考文献完整合并。
表1神经集落形成细胞分析中4个大小分类每一分类集落的相对频数

来自小鼠原始胚胎纹状体的单细胞悬液在低浓度下于含EGF的无血清半固体培养基中进行铺板培养。培养21天后将同源细胞衍生的集落归为4个大小分类，相对于铺板细胞总数相关的神经集落形成细胞频数(％)通过神经集落形成细胞频数(％)＝(集落数/铺板细胞总数)×100进行计算。0.52-1.1％的铺板细胞总数不同程度增殖并形成集落。铺板细胞总数很小一部分(0.09％)形成大集落(＞2mm)，大多数形成的集落＜1mm(0.5％)，表明较有限的增殖潜能。
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权利要求
1.一种鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至集落间可看出差别；及(d)估计集落大小，其中较大的集落可能由神经干细胞产生，较小的集落可能由神经祖细胞产生。
2.一种鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)确定集落形态，其中波形集落表明集落可能由神经干细胞产生，具有平滑边缘的集落表明集落可能由神经祖细胞产生。
3.一种鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至形成集落；及(d)确定集落的抗原表达，其中未分化细胞相关标志物的存在表明集落可能由神经干细胞产生，分化细胞相关标志物的存在表明集落可能由神经祖细胞产生。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述的神经细胞来自哺乳动物。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的神经细胞来自人类、大鼠或小鼠。
6.根据权利要求1-5任一项的方法，其中所述的神经细胞来自原始中枢神经系统组织或培养的神经球。
7.根据权利要求1-6任一项的方法，其中对高增殖潜能神经干细胞与低增殖潜能神经干细胞进行了鉴别。
8.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述的半固体培养基为胶原培养基。
9.根据权利要求1-7任一项的方法，其中所述的半固体培养基为甲基纤维素培养基。
10.根据权利要求1-9任一项的方法，其中在步骤(a)之前神经细胞以培养基稀释。
11.根据权利要求10的方法，其中向培养基添加促进特定类型神经干细胞及神经祖细胞生长的细胞因子。
12.根据权利要求10的方法，其中向培养基添加促进特定类型神经干细胞及神经祖细胞生长的激素。
13.根据权利要求12-14任一项的方法，其中所述的培养基为无血清培养基。
14.根据权利要求1-13任一项的方法，其中在步骤(b)细胞以约1000-25,000个细胞/35mm培养皿的浓度铺板。
15.根据权利要求1-14任一项的方法，其中在步骤(c)培养细胞大约10-28天。
16.根据权利要求1及4-15任一项的方法，其中在步骤(d)中直径＞2.0mm的集落表明是神经干细胞。
17.根据权利要求1及4-15任一项的方法，其中在步骤(d)中直径＜2.0mm或直径＝2.0mm的集落表明是神经祖细胞。
18.根据权利要求3-15任一项的方法，其中使用原位免疫染色方法测定集落的抗原表达。
19.根据权利要求3-15任一项的方法，其中使用摘除或离体的神经干细胞或神经祖细胞集落免疫染色方法测定集落的抗原表达。
20.根据权利要求18或19的方法，其中所述的免疫染色使用针对未分化细胞的抗体。
21.根据权利要求20的方法，其中所述的抗体结合神经巢蛋白、sox1、sox2、musashi或LexA/SSEA-1。
22.根据权利要求18或19的方法，其中所述的免疫染色使用针对神经细胞谱系特异细胞标志物的抗体。
23.根据权利要求22的方法，其中所述的抗体结合β微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、O4或髓磷脂碱蛋白(MBP)。
24.根据权利要求1-23任一项的分析方法在检测潜在治疗成分中的用途。
25.根据权利要求1-23任一项的分析方法在诊断中的用途。
26.根据权利要求1-23任一项的分析方法在评价环境介质影响中的用途。
全文摘要
描述了一种神经集落形成细胞(NCFC)分析方法，此方法可以鉴别神经干细胞(NSC)与神经祖细胞。在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴定神经干细胞或神经祖细胞的方法，包括(a)于支持神经细胞生长的半固体培养基中悬浮神经细胞；(b)于半固体培养基中以可产生集落的浓度铺板细胞；(c)培养铺板细胞至集落间可看出差别；及(d)估计集落大小，其中较大的集落可能由神经干细胞产生，小集落可能由神经祖细胞产生。在另一实施方案中，通过测定集落的形态或抗原表达可鉴别神经干细胞与神经祖细胞。
文档编号G01N33/50GK1867678SQ200480030526
公开日2006年11月22日 申请日期2004年9月10日 优先权日2003年9月12日
发明者布伦特·A·雷诺, 莎朗·A·路易斯 申请人:干细胞技术公司