专利名称：大肠癌和/或大肠息肉的诊断以及术后随访和复发的监测药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠癌和/或大肠息肉的诊断以及术后随访和复发的监测方法、以及该诊断药物和监测药物。
背景技术：
在日本，由于饮食生活的欧美化，大肠癌有显著增加的趋势，每年有大约6万人罹患，推测在2015年将超过胃癌，成为女性癌症的第一位，在男性中仅次于肺癌、肝癌而位居第三位。从流行病学推测，相比于遗传因素，大肠癌的病因还为饮食生活，特别是动物性脂肪和蛋白质的过量摄取，作为大肠的部位，易于在S状结肠和直肠上发病。
作为大肠癌和大肠息肉等大肠疾病的检查方法，虽说有(i)血液检查、(ii)便潜血检查、(iii)钡餐检查、(iv)内窥镜检查、(v)PET、胶囊内窥镜等、(vi)基因诊断，但是(i)和(ii)这种简单的检查方法的精度低。而另一方面，虽然(iii)和(iv)可作为最可靠的诊断方法较多被使用，但是其不仅往往给患者带来痛苦，而且，从医疗经济上出发，也与其他疾病的诊断相同，期望开发一种不给患者带来痛苦而能够简便地早期、准确地诊断的方法。
因患者主诉腹部异常而进行各种检查，结果发现大肠息肉或大肠癌。当诊断为大肠息肉时，大部分在经过随访的一段时间后确认没有异常增殖，此时诊断为良性肿瘤。但是，在随访后，一部分患者确认有异常的增殖，而诊断为大肠癌。此时，与其说其为大肠息肉，不如推断其处于癌前状态。如果不经过随访而能够以简便的方法在最初的诊断中判断良性还是恶性，不仅能够改善患者的QOL，而且也对减少医疗费有所贡献。
通过早期发现，大肠癌能够以内窥镜切除和外科治疗来完全治愈，而当发现较晚时，大多发生向肝脏和肺的远处转移，而且术后复发率也升高。因此，早期发现和癌切除术后的诊察是很重要的，期望开发一种不给患者带来痛苦而能够简便地准确诊断的方法。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN(Cystatin SN)是生物体内存在的半胱氨酸蛋白酶抑制剂之一。半胱氨酸蛋白酶抑制剂分为3个家族(Stefins、Cystatins和kinogens)。在半胱氨酸蛋白酶抑制剂类中含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂S、SA和SN，均存在于唾液、泪液、精液中，在分解病态蛋白质的防御中行使重要的功能。半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的基因和蛋白质已经由Saitoh E等阐明(非专利文献1、2和3)，关于抗血清的制备也记载于非专利文献3中。
但是，作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN与疾病关系的研究，由于半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN在唾液和泪液中含有较多，因此仅仅在牙周病(专利文献1)和偏头痛(专利文献2)中进行了研究。
专利文献1WO 2001/79297号公报专利文献2WO 2001/79270号公报非专利文献1FEBS Lett.，1986，Mar 17；198(1)145-9非专利文献2Gene.1987；61(3)329-38非专利文献3J.Biochem.(Tokyo)，1991 Oct；110(4)648-54发明内容在如此情况下，本发明人根据各种癌的基因芯片分析，明确了半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN基因在大肠癌中表达亢进，根据RT-PCR，明确了该基因在大肠癌组织中表达亢进，进而根据对大肠癌组织提取物进行的蛋白质印迹(Western bloting)分析，明确了在蛋白质水平上亢进(日本专利特愿2003-290704)。
虽然已经通过我们的研究明确了在大肠癌组织中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN基因和蛋白质水平亢进，但是若想作为用于临床的使用组织的诊断药物，仍然存在很多问题。即，使患者承受负担的组织切除、从组织提取半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN以及电泳等复杂的操作、还有医疗费增高等问题。
本发明的目的在于提供一种通过使用血液等体液检体等而不使患者承受负担的方法来诊断大肠癌和大肠息肉、术后随访和复发的监测方法。
本发明人开发了针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的新抗体，不仅对大肠癌组织，而且对大肠癌患者血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的浓度进行测定。其结果为，48名健康者的测定值为从0.000到2.303，平均为0.794，与此相对，大肠癌患者血清为从0.000到36.393，平均为1.911。而且，对癌切除术后的血清进行经时监测的结果确认，由于癌切除，血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度降低，以及在复发病例中，血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度升高。进而，成功地对测定体系进行了高敏感化，其结果使大肠息肉的诊断成为可能，从而完成本发明。
即，本发明提供一种含有抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的大肠癌和/或大肠息肉的诊断药物以及术后随访和复发的监测药物。
此外，本发明提供一种大肠癌和/或大肠息肉的诊断以及术后随访和复发的监测方法，其特征在于，使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体测定被检试样中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。
发明效果采用本发明，能够提供一种在使患者承受负担的现有钡餐检查和内窥镜检查之前，在诊断和转移、复发的指标以及治疗效果的判断上可以简便应对的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN测定试剂盒，使得诊断和监测能够以简便的方法进行，及早制定新的治疗计划。
图1表示各种癌细胞株的培养上清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的蛋白质印迹的检测结果。
图2为在ELISA测定体系中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的检量线。
图3表示健康者组和大肠癌患者组的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度分布。
图4表示癌切除后的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度的经时变化之一。
图5表示癌切除后的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度的经时变化之二。
图6表示本发明的ELISA测定体系和现有方法的敏感度比较。
图7表示使用本发明的ELISA测定体系和现有方法的测定结果的相关关系。
图8表示使用本发明测定体系的大肠疾病患者血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度分布。
具体实施例方式
下面，对本发明进行详细的说明。
本发明提供一种通过使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体对被检试样中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN进行测定，对大肠癌和/或大肠息肉的诊断以及术后随访和复发的监测方法。半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN为蛋白酶抑制剂，其氨基酸序列及对其编码的基因序列公开在GenBank号(NM_001898)中(序列编号1和2)。在本发明中，所谓半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质，是指包括全长蛋白质及其片段两种。所谓片段，是指含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质任意区域的多肽，也可以不具有天然半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的功能。
本发明中检测的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质优选为人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质，但是不限于此，也可以是狗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN、猫半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN、小鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN、仓鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN等人以外物种的任何半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。
在本发明中，所谓检测，包含定量或非定量的检测。例如，作为非定量的检测，能够举出仅对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质是否存在进行的测定、对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质是否存在一定量以上进行的测定、将半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的量与其他试样(例如，对照试样等)进行比较的测定等。作为定量的检测，能够举出半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的浓度的测定、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的量的测定等。
作为被检试样，只要为可能含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的试样即可，没有特别限定，优选从哺乳类等生物体中采集的试样，进一步优选从人采集的试样。作为被检试样的具体例子，例如，能够举出血液、间质液、血浆、血管外液、脑脊髓液、滑液、胸膜液、血清、淋巴液、唾液、尿液等，优选为血液、血清、或者血浆。此外，从生物体采集的细胞的培养液等的从被检试样中得到的试样也包含在本发明被检试样中。
被诊断的疾病为大肠癌和/或大肠息肉。
在本发明中，当在被检试样中检测出半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质时，当与阴性对照例或者健康者进行比较，判断为在被检试样中检测出的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的量多时，判断被检者为大肠癌和/或大肠息肉，或者成为大肠癌的可能性高。进而，在大肠癌组织切除术后和化学疗法后的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的测定中，当半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的量比术前减少时，判断手术和化学疗法后的过程良好。另一方面，当手术和化学疗法后的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质量增加时，判断存在复发和转移。
被检试样中所含半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的检测方法通过使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的免疫学方法进行。作为免疫学方法，例如，能够举出放射免疫测定、酶免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定、免疫沉降法、免疫比浊法、蛋白质印迹、免疫染色、免疫扩散法等，优选为酶免疫测定，特别优选为酶联免疫吸附定量法(enzyme-linked immunosorbem assayELISA)(例如，sandwich ELISA夹心酶联免疫分析)。ELISA等的上述免疫学方法可以通过本领域技术人员所公知的方法进行。
作为使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的一般检测方法，例如，能够举出下述的方法将抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体固定在支承体上，向其添加被检试样，进行孵育使抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质结合后，进行洗净，检测通过抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体与支承体结合的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质，由此检测被检试样中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。
在本发明中，作为用于固定抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体使用的支承体，例如，能够举出琼脂糖、纤维素等不溶性的多糖类、硅树脂、聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂、尼龙树脂、聚碳酸酯树脂等合成树脂、玻璃等不溶性的支承体。这些支承体可以以珠子或板等形状使用。当为珠子时，可以使用填充有这些珠子的柱等。当为板时，可以使用多孔板(96孔多孔板等)或生物传感器头等。抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和支承体的结合可以通过化学键或物理吸附等通常使用的方法进行。这些支承体全部可以使用市售品。
抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的结合通常在缓冲液中进行。作为缓冲液，例如，使用磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等。此外，作为孵育条件，为已经被经常使用的条件，例如，在4℃～37℃下进行1小时～24小时的孵育。孵育后的洗净只要不妨碍半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质和抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的结合，可以使用任何物质，例如，可以使用含有Tween20等表面活性剂的缓冲液等。
在本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的检测方法中，除希望检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的被检试样以外，也可以设置对照试样。作为对照试样，有不含半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的阴性对照试样和含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的阳性对照试样等。此时，通过以不含半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的阴性对照试样得到的结果、与以含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的阳性对照试样得到的结果进行比较，就能够检测被检试样中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。此外，制备使其浓度呈梯度变化的一系列对照试样，得到各对照试样对应的检测结果作为数值，作成标准曲线，根据标准曲线也能够从被检试样的数值定量检测被检试样中所含有的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。
作为通过抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体与支承体结合的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的检测的优选方式，例如，能够举出使用以标记物质进行标记的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的方法。例如，使被检试样接触在支承体上固定的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体、洗净后，使用特异性识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的标记抗体进行检测。
抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的标记可以通过通常已知的方法进行。作为标记物质，可以使用荧光色素、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等本领域技术人员公知的标记物质，作为具体例子，能够举出放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等)、荧光素、若丹明、丹酰氯、伞形酮、萤光素酶(luciferase)、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(saccharide oxidase)、微过氧化物酶、生物素(biotin)等。当使用生物素作为标记物质时，优选在添加生物素标记抗体后再添加结合有过氧化物酶等酶的抗生物素蛋白链菌素(StreptAvidin)。在标记物质和抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的结合中，可以使用戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法、过碘酸法等公知的方法。
具体而言，将含有抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的溶液添加于板等支承体上，将抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体固定在支承体上。将板洗净后，为了防止蛋白质的非特异性结合，使用例如BSA、明胶、白蛋白等进行封闭。再次洗净，将被检试样加入板中。孵育后洗净，添加标记抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。适度孵育后，将板洗净，检测残留在板上的标记抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。检测可以通过本领域技术人员公知的方法进行，例如，当以放射性物质标记时，可以通过液体闪烁或RIA法检测。当以酶标记时，添加底物，酶引起的底物的变化，例如显色可以通过吸光度计检测。作为底物的具体例子，能够举出2，2-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，2-苯二胺(邻苯二胺)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)等。当为荧光物质时，可以通过荧光光度计检测。
作为本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质检测方法的特别优选的方式，能够举出使用以生物素标记的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和抗生物素蛋白链菌素的方法。
具体而言，将含有抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的溶液添加在板等支承体上，固定抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。将板洗净后，为了防止蛋白质的非特异性结合，用例如BSA等进行封闭。再次洗净，向板中加入被检试样。孵育后洗净，加入生物素标记抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。适度孵育后，将板洗净，加入与碱性磷酸酶、过氧化物酶等酶结合的抗生物素蛋白。孵育后，将板洗净，加入与结合在抗生物素蛋白上的酶所对应的底物，以酶引起的底物变化等为指标检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。
作为本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质检测方法的其他方式，能够举出使用一种以上的特异识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的一次抗体、和一种以上的特异识别该一次抗体的二次抗体的方法。
例如，使被检试样接触在支承体上固定的一种以上的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体，孵育后洗净，通过一次抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和特异识别该一次抗体的一种以上的二次抗体检测在洗净后结合的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。此时，二次抗体优选通过标记物质进行标记。
作为本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的检测方法的其他方式，能够举出利用凝集反应的检测方法。在该方法中，能够使用将抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体致敏的载体检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。作为将抗体致敏的载体，只要是不溶性的，不引起非特异反应，并且稳定，可以使用任何载体。例如胶乳颗粒、膨润土、火棉胶、高岭土、固定羊红细胞等，优选使用胶乳颗粒。作为胶乳颗粒，例如，可以使用聚苯乙烯胶乳颗粒、苯乙烯-丁二烯共聚物胶乳颗粒、聚乙烯甲苯胶乳颗粒等。优选使用聚苯乙烯胶乳颗粒。将致敏的颗粒与试样混合，搅拌一定时间。由于试样中含有的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质浓度越高，颗粒的凝集度就越大，因此可以通过以肉眼观察凝集来检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。此外，也可以通过以分光光度计等测定凝集引起的浊度进行检测。
作为本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质检测方法的其他方式，例如，能够举出使用利用表面等离子共振现象的生物传感器的方法。利用表面等离子共振现象的生物传感器可以使用微量蛋白质，并且不用标记，实时观察蛋白质-蛋白质之间的相互作用，作为表面等离子共振信号。例如，可以通过使用BIAcore(Biacore International AB社生产)等生物传感器检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质和抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的结合。具体而言，使被检试样接触将抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体固定化的传感器头，可以检测结合于抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质，作为共振信号的变化。
本发明的检测方法也可以使用各种自动检查装置自动化进行，也可以一次对大量试样进行检查。
本发明的目的在于提供一种用于检测被检试样中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的诊断药物或者试剂盒，该被检试样用于诊断大肠癌和大肠息肉，该诊断药物或者试剂盒至少含有抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。当该诊断药物或者试剂盒基于ELISA法等EIA法时，也可以含有将抗体固相化的载体，抗体也可以预先结合在载体上。当该诊断药物或者试剂盒基于使用胶乳等载体的凝集法时，也可以含有吸附有抗体的载体。此外，该试剂盒也可以适当含有封闭液、反应溶液、反应停止液、用于处理试样的试剂等。
抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的制作本发明中使用的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体只要特异结合半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质即可，不论其来源、种类(单克隆、多克隆)和形状。具体而言，可以使用小鼠抗体、大鼠抗体、鸟抗体、人抗体、嵌合抗体、人化抗体等公知的抗体。抗体虽然也可以为多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。
此外，固定于支承体的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和以标记物质标记的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体虽然也可以识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN分子的相同表位，但优选识别不同表位，位点没有特殊限制。
本发明中使用的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体可以使用公知的方法得到多克隆抗体或单克隆抗体。作为本发明中使用的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体，优选为哺乳动物来源或者鸟来源的单克隆抗体。特别优选为哺乳动物来源的单克隆抗体。哺乳动物来源的单克隆抗体包含通过杂交瘤产生的抗体，和通过基因工程方法、以含有抗体基因的表达载体进行转化后的宿主中产生的抗体。
单克隆抗体产生杂交瘤基本上可以使用公知技术，按如下制作。即，使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质作为致敏抗原，依照通常的免疫方法将其免疫，以通常的细胞融合法使得到的免疫细胞与公知的母细胞融合，以通常的筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞，由此能够制作。
具体而言，在制作单克隆抗体时，如下进行即可。
首先，通过表达GenBank号(NM 001898)中公开的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN基因/氨基酸序列，得到作为抗体获得的致敏抗原使用的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。即，将编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的基因序列插入公知的表达载体系中，使适当的宿主细胞转化后，以公知的方法从该宿主细胞中或者培养上清中纯化目的人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。此外，也可以将天然的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质纯化而使用。
然后，使用该纯化的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质作为致敏抗原。或者也可以使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的肽段作为致敏抗原。此时，肽段可以由人半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质的氨基酸序列以化学合成而得到，也可以通过将半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN基因的一部分插入表达载体中而得到，或者也可以通过以蛋白质分解酶将天然的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质分解而得到。用作肽段的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的部分和大小没有限定。
作为用致敏抗原被免疫的哺乳动物，没有特殊限定，但优选为考虑与在细胞融合中使用的母细胞的适合性而选择的动物，一般使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠，或者鸟、兔、猴子等。
将致敏抗原免疫给动物，依照公知的方法进行。例如，作为一般的方法，通过将致敏抗原注射于哺乳动物的腹腔内或者皮下进行。具体而言，将致敏抗原以PBS(Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等适量稀释、悬浮后，根据希望，与通常的佐剂，例如弗式完全佐剂适量混合、乳化后，每4～21天向哺乳动物给药数次。此外，在致敏抗原免疫时也可以使用适当的载体。特别是当将分子量小的肽段用作致敏抗原时，希望使其与白蛋白、钥孔戚血蓝素(Keyhole limpethemocyanin)等载体蛋白质结合进行免疫。
如上所述，对哺乳动物进行免疫，当确认在血清中所希望的抗体水平升高时，从哺乳动物采集免疫细胞，进行细胞融合，作为优选的免疫细胞，特别可以举出脾细胞。
使用哺乳动物的骨髓瘤细胞作为与上述免疫细胞融合的另一母细胞。该骨髓瘤细胞可以适宜地使用公知的各种细胞株，例如，P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123.1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81.1-7)、NS-1(Kohler.G. and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-5 19)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G. et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合基本上依据公知的方法例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G. and Milstein，C.、MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等进行。
更具体而言，上述细胞融合，例如在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，例如，可以添加聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而为了根据希望提高融合效率也可以添加使用二甲基亚砜等辅助剂。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，免疫细胞优选为1～10倍。作为在上述细胞融合中使用的培养液，例如，可以使用适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其他在各种细胞培养中使用的通常的培养液，进而，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补液。
细胞融合如下进行在上述培养液中，将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞混合好，以通常为30～60％(w/v)的浓度添加预先加温至37℃左右的PEG溶液(例如，平均分子量为1000～6000左右)，通过混合形成目的融合细胞(杂交瘤)。接下来，通过反复进行逐次添加适当的培养液、离心、除去上清的操作，除去对杂交瘤细胞生长发育不利的细胞融合剂等。
通过将这样得到的杂交瘤用通常的选择培养液例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培养液)培养而进行选择。在上述HAT培养液中的培养持续充分的时间(通常为数日～数周)，使目的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡。然后，实施通常的有限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
此外，识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的抗体的制作也可以使用在国际公开公报WO 03/104453号公报中所述的方法制作。
目的抗体的筛选和单克隆以公知的基于抗原抗体反应的筛选方法进行即可。例如，使抗原结合在以聚苯乙烯等制成的珠子或市售的96孔微量滴定板等载体上，使其与杂交瘤的培养上清反应，将载体洗净后，使其与酶标记的二次抗体等反应，由此能够确定在培养上清中是否含有与致敏抗原反应的目的抗体。通过有限稀释法等能够将产生目的抗体的杂交瘤克隆化。此时，使用在免疫中使用的物质作为抗原即可。
此外，除将抗原免疫给人以外的动物得到上述杂交瘤以外，也可以将人淋巴球在体外以半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN致敏，然后使致敏淋巴球与人源的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞融合，能够得到对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN具有结合活性的所期望的人抗体(参照日本专利特公平1-59878号公报)。进而，也可以将半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN作为抗原给予具有人抗体基因全部库的转基因动物，得到半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体产生细胞，从将其永生化的细胞中得到针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的人抗体(参照国际专利申请公开号WO 94/25585号公报、WO 93/12227号公报、WO 92/03918号公报、WO 94/02602号公报)。
这样所制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中继代培养，或者可以在液氮中长期保存。
为了从该杂交瘤中得到单克隆抗体，采用如下方法依照通常的方法培养该杂交瘤，作为该培养上清而得到的方法，或者将杂交瘤给予与其适合的哺乳动物，使其增殖，作为其腹水而得到的方法等。前者的方法适合得到高纯度的抗体，另一方面，后者的方法适合抗体的大量生产。
在本发明中，作为单克隆抗体，可以使用将抗体基因从杂交瘤中克隆化，插入适当的载体中，将其导入宿主中，以基因重组技术产生的重组抗体(例如，参照Vandamme，A.M.et al.，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。
具体而言，从产生抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的杂交瘤中分离mRNA，该mRNA编码抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体的可变(V)区。以公知的方法，例如，通过胍超速离心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P. et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNAPurification Kit(Pharmacia生产)等制备目的mRNA。此外，也可以通过使用QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia生产)直接制备mRNA。
使用逆转录酶从所得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成使用AMV Reverse Transcriptase Fist-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工业社生产)等进行。此外，为了进行cDNA的合成和扩增，可以使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech生产)和利用PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002、Belyavsky，A.et al.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)等。
从所得到的PCR产物纯化目的DNA片段，与载体DNA连接。进而，由此制作重组载体，导入大肠杆菌等中，选择群体(colony)，制备所期望的重组载体。然后，以公知的方法，例如双脱氧核苷酸链终止法(dideoxynucleotide chain termination method)等确认目的DNA的碱基序列。
在得到编码目的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体V区的DNA后，将其插入含有编码所期望抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体中。
为了制造在本发明中使用的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体，将抗体基因插入表达载体中，使其在表达控制区例如增强子、启动子的控制下表达。然后，以该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
抗体基因的表达可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别插入表达载体中，同时转化宿主细胞，或者也可以将编码H链和L链的DNA插入同一表达载体中，转化宿主细胞(参照WO94/11523号公报)。
此外，为了产生重组型抗体，不仅可以使用上述宿主细胞，而且也可以使用转基因动物。例如，将抗体基因插入到编码乳汁中固有产生的蛋白质(山羊β酪蛋白等)的基因之中，制备融合基因。将含有抗体基因插入的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎中，将该胚胎导入雌山羊中。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊或其子孙产生的乳汁中得到所期望的抗体。此外，为了增加由转基因山羊产生的含有所期望的抗体的乳汁量，也可以将适当激素用于转基因山羊(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
在本发明中，除上述抗体外，可以使用人为改变后的基因重组抗体，例如，嵌合抗体、人源化(Humanized)抗体。这些改变抗体可以使用已知的方法制造。
嵌合抗体可以通过将如上述那样得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其插入表达载体，导入宿主中而产生。使用该已知方法可以得到在本发明中有用的嵌合抗体。
人化抗体也称为重构(reshaped)人抗体，它是将人以外的哺乳动物，例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR；complementarity determiningregion)移植到人抗体的互补性决定区后的抗体，其一般的基因重组方法也是已知的(参照欧洲专利申请公开号EP 125023号公报、WO96/02576号公报)。
具体而言，以连接小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区(frameworkregion；FR)的方式设计的DNA序列，使用以在CDR和FR双方的末端区具有重叠部分的方式制作的多个寡核苷酸作为引物，通过PCR法合成(参照WO 98/13388号公报所述的方法)。
通过CDR连接的人抗体的框架区，选择互补性决定区形成良好的抗原结合部位的框架区。根据需要，也可以取代抗体可变区中的框架区的氨基酸，使得重构人抗体的互补决定区形成适合的抗原结合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗体和人源化抗体的C区中，使用人抗体的区，例如，在H链中，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4，在L链中，可以使用Cκ、Cλ。此外，为了改善抗体或其产生的稳定性，也可以修饰人抗体的C区。
嵌合抗体由人以外的哺乳动物来源的抗体的可变区和人抗体来源的恒定区构成。另一方面，人源化抗体由人以外的哺乳动物来源的抗体的互补性决定区、人抗体来源的框架区和C区构成。由于人化抗体在人体内的抗原性被降低，因此作为治疗剂的有效成分是有用的。
在本发明中使用的抗体不限于抗体的全体分子，只要与半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN结合，也可以为抗体的片段或其修饰物，也包含二价抗体和一价抗体。例如，作为抗体片段，能够举出Fab、F(ab’)2、Fv、具有一个Fab和完整Fc的Fab/c、或者将H链或L链的Fv以适当的接头连接后的单链Fv(scFv)。具体而言，以酶例如木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶处理抗体，使其产生抗体片段，或者构筑编码该抗体片段的基因，将其导入表达载体后，使其在适当的宿主细胞中表达(例如，参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976、Better，M.&Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.、Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.、Lamoyi，E.，Methods inEnzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.et al.，Methods inEnzymology(1989)121，663-669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。在该scFv中，H链V区和L链V区通过接头，优选通过肽接头连接(Huston，J.S.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。在scFv中的H链V区和L链V区来源于本说明书中记载的抗体的任一种均可。作为连接V区的肽接头，例如，可以使用由氨基酸12～19个残基构成的任意单链肽。
编码scFv的DNA通过以下方法得到在编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、和编码L链或L链V区的DNA之中，以其序列中的全部或编码所期望的氨基酸序列的DNA部分为模板，使用规定其两端的引物，采用PCR法进行扩增，接着组合编码肽连接物部分的DNA和以其两端分别与H链、L链连接的方式规定的引物对，进行增幅。
此外，一旦制作了编码scFv的DNA，就可以根据常规方法得到含有这些的表达载体和以该表达载体转化后的宿主，而且，通过使用该宿主，可以根据常规方法得到scFv。
这些抗体片段可以和上述相同地得到并表达该基因，通过宿主产生。在本发明的“抗体”中，也包含这些抗体片段。
作为抗体的修饰物，也可以使用与标记物质等各种分子结合后的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。在本发明的“抗体”中，也包含这些的抗体修饰物。这样的抗体修饰物可以通过对得到的抗体施行化学修饰而得到。而且，抗体的修饰方法在本领域中已经确立。
进而，在本发明中使用的抗体也可以为双重特异性抗体(bispecificantibody)。双重特异性抗体可以具有识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN分子上的不同表位的抗原结合位点，也可以一个抗原结合位点识别半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN，另一个抗原结合位点识别标记物质等。双重特异性抗体可以使两种抗体的HL对结合而制作，也可以使产生不同单克隆抗体的杂交瘤融合，制作产生双重特异性抗体的融合细胞而得到。进而，也可以通过基因工程的方法制作双重特异性抗体。
如上述构筑的抗体基因，可以通过公知的方法表达获得。当采用哺乳类细胞时，可以使通常被使用的有用的启动子、要表达的抗体基因、其3’侧下游的多A信号功能性结合并使其表达。例如，作为启动子/增强子，能够举出入巨细胞病毒早期启动子/增强子(humancytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
此外，作为在本发明中使用的可用于抗体表达的启动子/增强子，能够举出逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子，或者人延伸因子-1α(HEF1α)等来源哺乳类细胞的启动子/增强子等。
当使用SV40启动子/增强子时，可以通过Mulligan等的方法(Nature(1979)277，108)，或者，当使用HEF1α启动子/增强子时，可以通过Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)而容易地进行基因表达。
当采用大肠杆菌时，可以将被通用的有用的启动子、用于抗体分泌的信号序列和要表达的抗体基因功能性结合而使该基因表达。作为启动子，例如，能够举出lacZ启动子、araB启动子。当使用lacZ启动子时，可以通过Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASEBJ.(1992)6，2422-2427)，或者当使用araB启动子时，可以通过Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)进行表达。
作为用于抗体分泌的信号序列，当使其在大肠杆菌的周质产生时，使用pelB信号序列(Lei，S.P. et al J.Bacteriol.(1987)169，4379)即可。然后，分离在周质产生的抗体后，将抗体的结构适当地重折叠(refold)而使用。
作为复制起点，可以使用SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等来源的复制起点，进而，为了在宿主细胞系中扩增基因拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
为了制造在本发明中使用的抗体，可以使用任意的表达体系，例如真核细胞或原核细胞系。作为真核细胞，例如，能够举出已建立的哺乳类细胞系、昆虫细胞系、真丝菌细胞和酵母细胞等动物细胞等，作为原核细胞，例如，能够举出大肠杆菌细胞等细菌细胞。
在本发明中使用的抗体优选在哺乳类细胞例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero、HeLa细胞中表达。
接下来，在in vitro或者in vivo培养转化后的宿主细胞，产生目的抗体。宿主细胞的培养依照公知的方法进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补液。
如上述这样表达、产生的抗体可以从细胞、宿主动物中分离，进行纯化达到均一。在本发明中使用的抗体的分离、纯化可以使用亲和柱进行。例如，作为使用蛋白A柱的柱，能够举出Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia生产)等。此外，使用通常的在蛋白质中所使用的分离、纯化方法即可，没有任何限制。例如，通过适当选择、组合上述亲和柱以外的色谱柱、过滤、超滤、盐析、透析等，可以分离、纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
实施例下面，根据实施例对本发明进行详细的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1(半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的cDNA的克隆)为了制作半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的单克隆抗体，进行了其抗原的制作。首先，尝试了含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的全长ORF区的序列的克隆。作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN表达组织的唾液腺单链cDNA文库与上述相同制备，将其作为模板，使用根据GenBank号(NM 001898)设计的引物Cystatin SN-f(序列号3)和Cystatin SN-r(序列号4)，通过PCR法单离全长ORF基因。然后，以该半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN全长序列为模板，以含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN全长ORF基因的形式，制作Cystatin SN-F(Hind)引物(序列号5)和Cystatin SN-R(His-BamHI)引物(序列号6)，再次以PCR法扩增目的片段，插入phCMV载体(Stratagene社)。以常规方法实施了碱基序列解析后，将在HindIII和BamHI位点切断后的片段插入phCMV载体，完成转移载体phCMV-Cystatin SN-His的制作。
实施例2(半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗原的制备)根据TransIT(TaKaRa社)的实验设计，在转染(transfection)前一天将1×105cell的CHO细胞接种在6孔培养皿中，培养一夜，第二天，将8μg的表达载体phCMV-Cystatin SN-His和16μL的TransITreagent混合在100μL的无血清DMEM培养基中，在室温下孵育20分钟，然后加入细胞培养液中进行转染。此外，在使用FUGENE6时，根据Roche Diagnostics社的实验设计，在转染前一天将8×105cell的CHO细胞接种在10cm培养皿中，培养一夜，第二天，将8μg的表达载体phCMV-Cystat在使用FUGENE6时，根据Roche Diagnostics社的实验设计，在转染前一天将8×105cell在10cm培养皿中in SN-His和16μL的FUGENE6 reagent混合在400μL的无血清DMEM培养基中，在室温下孵育20分钟，然后加入细胞培养液中进行转染。转染第二天，使用有限稀释法和选择试剂G418开始克隆。对各克隆的培养上清进行抽样，测定培养上清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的表达量，其结果为，存在大约5～10μg/mL的表达半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的稳定克隆，选择这些克隆。
将选择的稳定表达克隆在150cm2的培养瓶、20mL无血清培养基CHO-S-SFM-II(Invitrogen社)中培养48小时，回收培养上清。使用TARON His标签纯化树脂(BD Bioscience社)，或者His Trap HP(Amersham Bioscience社)，从得到的培养上清中纯化Cystatin SN-His Tag融合蛋白质。将纯化后的融合蛋白质对PBS进行透析，用作免疫用抗原和在ELISA测定中的标准品。
实施例3(半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN单克隆抗体的制作)将悬浮在PBS中的相当于100μg蛋白质量的Cystatin SN-His和弗式完全佐剂混合，腹腔注射于BALB/c小鼠，由此进行初次免疫。同样将制备好的相当于50μg蛋白质量的Cystatin SN-His和弗式完全佐剂混合，进行腹腔注射，由此实施第二次免疫。将相当于50μg蛋白质量的Cystatin SN-His进行静脉注射，由此实施最终免疫。从该小鼠制备脾细胞，以通常的使用聚乙二醇的方法进行与小鼠P3U1细胞的细胞融合。以使用Cystatin SN-His的ELISA进行筛选，制作特异结合的抗体。
通过该筛选，成功制作了对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的特异性高的单克隆抗体PPMX0201和PPMX0202，由于PPMX0201可以在ELISA测定体系中利用，所以，在2004年12月8日，作为FERM P-20316保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305—8566)，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN存在多种类似蛋白质。特别是担心与半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN同源性高的半胱氨酸蛋白酶抑制剂S、半胱氨酸蛋白酶抑制剂SA和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的交叉性。因此，针对已经制作的8种单克隆抗体，再加上新制作的20种单克隆抗体，确认交叉性后，确认了3种较弱，但是与半胱氨酸蛋白酶抑制剂C有交叉。针对没有交叉性的抗体选择适合固相和标记的抗体，结果在使用PPMX0203作为固相抗体、使用PPMX0204作为标记抗体的ELISA测定体系中成功高敏感化。PPMX0203和PPMX0204分别作为FERMBP-10451和FERM BP-10452，在2005年11月17日保藏在日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)，独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心。
实施例4(抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN多克隆抗体的制作)使用纯化Cystatin SN-His制作兔多克隆抗体。以公知的方法进行制作。使用佐剂将纯化Cystatin SN-His乳化后，皮下给药进行免疫。重复给药数次，确认抗体效价升高后，进行采血，得到血清，然后通过硫酸铵沉淀得到多克隆抗体。
实施例5(通过蛋白质印迹检测各种癌细胞株培养液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN)为了研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN是否特异存在于大肠癌细胞株培养液中，针对各种癌细胞株SW480(大肠癌细胞株)、Panc-1(胰脏癌细胞株)、MCF7(乳癌细胞株)、KatoIII(胃癌细胞株)、Hep G2(肝癌细胞株)、H157(肺癌细胞株)、PC3(前列腺癌细胞株)的培养上清进行了蛋白质印迹(Western blot)。即，在每个泳道应用8μL的细胞培养上清。使用纯化Cystatin SN-His作为阳性对照。在还原状态下进行SDS-PAGE，以抗Cystatin SN抗体与膜上的Cystatin SN反应。然后，与HRP标记的抗小鼠IgG抗体反应，检出Cystatin SN的条带。其结果为，如图1所示，在大肠癌细胞株SW480中能够确认Cystatin SN的条带，而在大肠癌以外的细胞株Panc1、MCF7、Hep G2、KatoIII、H157、PC3中不能确认半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的条带。
实施例6(半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的ELISA测定体系的构筑)使用PIERCE社的Sulfo-NHS-LC-Biotin对各种针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的单克隆抗体或多克隆抗体进行生物素标记。以100μL/well将10μL/mL的各针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的单克隆抗体添加于Nunc社的Maxi sorp 96孔板中，4℃一夜使其吸附。以含有0.05％Tween-20的PBS(后文称作wash液)将板洗净，以ABibiotechnologies社的Immunoassay stabilizer 150μL/well在室温下封闭板上未吸附部分1小时。以wash液洗净后，以100μL/well添加各浓度的纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和空白(blank)，在室温下反应1小时。以wash液洗净后，以100μL/well使1μg/mL的上述生物素标记的各针对半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的单克隆抗体或多克隆抗体在室温下反应1小时。以wash液洗净后，以100μL/well使1.0μg/mL的Vector社的抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶在室温下反应1小时。以wash液洗净后，以TMB试剂在暗处室温下反应30分钟后，以STOP液停止反应。然后，测定ELISA板在450nm的吸光度。其结果为，在信号随纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度成比例地增加、并且空白显示低测定值的板上，选出了吸附的抗体与生物素标记抗体的组合。进而，研究了以血清为检体的测定条件，其结果明确需要稀释，因此以30％正常牛血清(NCS)/PBS/1.0mM EDTA进行稀释。
实施例7(大肠癌患者和健康者血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的检测)为了研究大肠癌患者血清中是否存在半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN，针对215例大肠癌患者和48名健康者，以使用PPMX0201作为固相抗体、使用实施例4中制作的多克隆抗体作为生物素标记抗体的三明治ELISA进行了研究。根据各浓度的纯化半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN和从其测定值减去空白的测定值后的值(NET)，制成图2的检量线。将血清检体5倍稀释，从检量线计算出血清中所含半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的浓度。得到的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度的分布表示在图3中。其结果为，48名健康者的测定值从0.000至2.303，平均为0.794，与此相对，大肠癌患者血清从0.000至36.393，平均为1.911。由该结果显示，通过以ELISA测定血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度，可以诊断大肠癌。
实施例8(大肠癌患者癌摘除后血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的监测)针对5名大肠癌患者，经时监测癌摘除后血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。作为代表例，其结果表示在图4和图5中。图4为手术后发生肝脏转移的病例，随着术后时间的推移，血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度增加，显示可以监测术后的转移。图5为手术后反复复发，再次实施4次手术的病例。血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度反复在每次手术后短暂少许降低，在复发时增加。即，显示通过监测术后的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度可以推定复发。
实施例9(ELISA测定体系的比较)比较以使用PPMX0201作为固相抗体、使用多克隆抗体作为生物素标记抗体的现有方法的三明治ELISA体系，和使用固相抗体FERMBP-10451和生物素标记抗体FERM BP-10452的本发明ELISA体系得到的标准曲线。其结果为，如图6所示，在现有方法中，y＝0.051x-0.0032，在本发明测定体系中，y＝0.1349x+0.0361，成功开发了高敏感的测定体系。
通过将患者血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN浓度绘图，确认了现有方法ELISA测定体系和本发明ELISA测定体系的相关关系。y＝0.8378x+0.1276，R2＝0.8753，除去在低浓度的一部分例外，得到良好的相关性(图7)。
实施例10(大肠癌、大肠息肉以及健康者血清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN的检测)使用本发明ELISA体系，检测58名大肠癌患者、37名大肠息肉患者和70名健康者血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。在大肠癌患者中，平均为1.93，标准偏差为1.98。在大肠息肉患者中，平均为1.43，标准偏差为1.52，至于健康者，平均为0.69，标准偏差为0.28。如图8所示，通过测定体系的高敏感化，不仪提高了大肠癌的阳性率，而且也可以诊断包含前癌状态的大肠息肉。
序列表<110>株式会社英仙蛋白质科学；国立大学法人东京大学<120>大肠癌和/或大肠息肉的诊断以及术后随访和复发的监测药物<130>CPJPL70490<140>日本2004-364731<141>2004-12-16<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>780<212>DNA<213>智人<400>1gctccctgcc tcgggctctc accctcctct cctgcagctc cagctttgtg ctctgcctct 60gaggagacca tggcccagta tctgagtacc ctgctgctcc tgctggccac cctagctgtg120gccctggcct ggagccccaa ggaggaggat aggataatcc cgggtggcat ctataacgca180gacctcaatg atgagtgggt acagcgtgcc cttcacttcg ccatcagcgagt ataacaag240gccaccaaag atgactacta cagacgtccg ctgcgggtac taagagccag gcaacagacc300gttggggggg tgaattactt cttcgacgta gaggtgggcc gcaccatatg taccaagtcc360cagcccaact tggacacctg tgccttccat gaacagccag aactgcagaa gaaacagttg420tgctctttcg agatctacga agttccctgg gagaacagaa ggtccctggt gaaatccagg480tgtcaagaat cctagggatc tgtgccaggc cattcgcacc agccaccacc cactcccacc540ccctgtagtg ctcccacccc tggactggtg gcccccaccc tgcgggaggc ctccccatgt600gcctgcgcca agagacagac agagaaggct gcaggagtcc tttgttgctc agcagggcgc660
tctgccctcc ctccttcctt cttgcttcta atagccctgg tacatggtac acaccccccc720acctcctgca attaaacagt agcatcgcct ccctctgaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa780<210>2<211>141<212>PRT<213>智人<400>2Met Ala Gln Tyr Leu Ser Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ala Thr Leu Ala1 5 10 15Val Ala Leu Ala Trp Ser Pro Lys Glu Glu Asp Arg Ile Ile Pro Gly20 25 30Gly Ile Tyr Asn A1a Asp Leu Asn Asp Glu Trp Val Gln Arg Ala Leu35 40 45His Phe Ala Ile Ser Glu Tyr Asn Lys Ala Thr Lys Asp Asp Tyr Tyr50 55 60Arg Arg Pro Leu Arg Val Leu Arg Ala Arg Gln Gln Thr Val Gly Gly65 70 75 80Val Asn Tyr Phe Phe Asp Val Glu Val Gly Arg Thr Ile Cys Thr Lys85 90 95Ser Gln Pro Asn Leu Asp Thr Cys Ala Phe His Glu Gln Pro Glu Leu100 105 110Gln Lys Lys Gln Leu Cys Ser Phe Glu Ile Tyr Glu Val Pro Trp Glu115 120 125
Asn Arg Arg Ser Leu Val Lys SerArg Cys Gln Glu Ser130135 140<210>3<211>33<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于Cystatin SN基因设计的引物<400>3ggaattcatg gcccagtatc tgagtaccct gct 33<210>4<211>32<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于Cystatin SN基因设计的引物<400>4ctcgagggat tcttgacacc tggatttcac ca 32<210>5<211>34<212>DNA<213>人工合成序列<220>
<223>基于Cystatin SN基因设计的引物<400>5cgcaagctta tggcccagta tctgagtacc ctgc34<210>6<211>65<212>DNA<213>人工合成序列
<220>
<223>基于Cystatin SN基因设计的引物<400>6cgcggatcca tggtgatggt gatggtgatg atgtcgtcgt cgggattctt gacacctgga60tttca6权利要求
1.一种大肠癌和/或大肠息肉的诊断药物，其特征在于含有抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。
2.一种大肠癌术后复发和转移的监测药物，其特征在于含有抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。
3.如权利要求1所述的诊断药物，其特征在于使用固定在支承体上的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和以标记物质标记的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。
4.如权利要求2所述的监测药物，其特征在于使用固定在支承体上的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体和以标记物质标记的抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体。
5.一种大肠癌和/或大肠息肉的诊断方法，其特征在于使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体测定被检试样中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。
6.一种大肠癌术后复发和转移的监测方法，其特征在于使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体测定被检试样中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN。
7.如权利要求5或6所述的诊断方法和监测方法，其特征在于被检试样为血液、血清或血浆。
全文摘要
本发明涉及大肠癌和/或大肠息肉的诊断方法以及术后随访和复发的监测方法，其特征在于，使用抗半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN抗体检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN蛋白质。采用本发明，能够提供一种在使患者承受负担的现有钡餐检查和内窥镜检查之前，在诊断和转移、复发的指标以及治疗效果的判断上可以简便应对的半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN测定试剂盒，使得大肠癌和/或大肠息肉的诊断和监测能够以简便的方法进行，能够及早制定新的治疗计划。
文档编号G01N33/574GK101095054SQ200580043330
公开日2007年12月26日 申请日期2005年12月14日 优先权日2004年12月16日
发明者油谷浩幸, 岛村隆浩, 渡边清高, 浅野岳晴, 大西真, 浜窪隆雄, 杉山晓, 细见直树, 岩成宏子, 石井敬介 申请人:株式会社英仙蛋白质科学, 国立大学法人东京大学