技术领域
本发明涉及非豆科植物具有特异亲和性的功能菌的筛选方法。
背景技术：
凝集素(Lectin)是一类广泛存在于各种植物的糖蛋白，具有凝集红血球的特性。凝集素能够识别细菌细胞表面的特定的化合物决定簇，一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力；植物根部分泌的凝集素在特异性识别根际微生物过程中具有重要的作用；凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素等示踪物结合。因此可以采用荧光素等示踪物标记凝集素，将标记的凝集素作为植物和微生物之间相互识别的媒介，在显微镜下或其他技术方法下显示能够被凝集素识别的微生物。已有的凝集素的专利只是涉及到凝集素在植物抵御病虫害中防御作用和在动物疾病中的治疗作用。目前并没有资料证明现在生物肥料生产所用菌种与植株具有特异性或亲和性、能适合不同地区不同作物的具体情况，目前缺乏与此有关的技术。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种利用凝集素筛选与非豆科植物具有特异亲和性的、能促进植物生长的功能菌的方法。
具体的操作方法如下：
利用凝集素筛选与非豆科植物具有特异亲和性的功能菌的方法，包括下述操作步骤
A、以示踪物标记提取纯化的某种植物的凝集素；
B、制取上述某种植物根际土壤悬液和根表土壤悬液；
C、从上述植物根际土壤悬液和根表土壤悬液分离纯化获得对该植物有益的微生物，所述有益微生物为固氮细菌、或为溶磷细菌、或为解磷细菌、或为解钾细菌、或为放线菌、或为酵母菌；
D、用示踪物标记的凝集素对分离纯化取得的有益微生物进行染色，确定可以被示踪物标记的凝集素染色的阳性反应菌株，即为具有特异亲和性的功能菌。
所述示踪物为荧光素，或为生物素。
所述植物根际土壤悬液的制取方法如下，
采集生长的植株，用抖土法去掉植株幼根上的较大的土壤颗粒，将根部连同根上的少量土壤放入含有100ml无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中；室温70～200rpm震荡10～30min，制成植株根际土壤悬液；采用10倍系列稀释法，制成10-2至10-6稀释度的土壤悬液。
所述植物根表土壤悬液的的制取方法如下，
采集生长的植株，用抖土法去掉植株幼根上的较大的土壤颗粒，用无菌水轻微冲洗根部，在无菌环境下将植物根切割成1～2cm的根段，将根段放入含有100ml无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中；室温70～200rpm震荡10～30min，制成植物根表土壤悬液；采用10倍系列稀释法，制成10-2至10-6稀释度的悬液。
用示踪物标记的凝集素对分离纯化取得的有益微生物进行染色，确定可以被示踪物标记的凝集素染色的阳性反应菌株的具体操作方法如下：
在载玻片上加一滴磷酸缓冲液(PBS)，将分离取得的培养到对数生长期的有益微生物菌株分别涂片、固定；用微量移液器取30～100μl用荧光素标记的凝集素溶液加在涂片上，25℃保湿保温30min；然后用0.9％的氯化钠NaCl生理盐水漂洗15min，用蒸馏水稍稍冲洗，干燥后置于荧光显微镜下观察，根据所用的荧光素的种类选择相应波长的激发光激发；对观察到荧光的阳性反应菌株样品应设置对照抑制试验，先加适当稀释的同种未标记凝集素，作用20～30min后洗去，再加示踪物标记凝集素30～50μl染色，阳性菌株样品的荧光应受到明显抑制；选取具有特异荧光的菌株，即获得特异亲和性的功能菌。
所述某种植物为小麦、或为棉花、或为水稻、或为油菜、或为玉米、或为小米、或为高粱、或为甘薯、或为其他作物、或为水果类、或为蔬菜类、或为牧草类、或为花卉类。
凝集素能够与细胞膜表面的特定的化合物决定簇结合，一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的能力；凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合。因此本发明采用荧光素等示踪物标记凝集素，将示踪物标记的凝集素作为植物和微生物之间相互识别的媒介，从植物体表、根表、根际筛选出高效固氮、解磷、解钾、促生以及具有其他促进植物生长功能的特异性优良菌株，在显微镜下或其他技术方法下显示能够与凝集素结合的微生物，从而在自然界庞杂的微生物区系中筛选到与植物具有特异亲和性的有益微生物，作为生物肥料的生产菌株，生产适用于不同植物的高效、特异性生物肥料，有利于菌株在特定植物根部定殖。利用这些微生物还可制成植物生长调节剂、土壤改良剂等，从而减少农业生产中的化肥使用量，解决化肥用量过多导致的环境污染问题，以期获得良好的经济效益、生态效益和社会效益。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1：棉花根际特异性功能菌株的筛选
1棉籽凝集素的提取
棉籽含有较多的凝集素，但种子中也含有较多的脂肪，需要采用措施除去材料中的脂肪再提取凝集素。
①将100g棉籽去壳碾成粉末；
②加无水乙醚500ml脱脂10min，重复两次，真空泵抽干多余乙醚；
③加500mlPBS(0.01mol，pH7.2)4℃浸提(72h浸提液活性最强)；
④过滤去粗渣，滤液离心(4000rpm，20min，常温)去细渣；
⑤将上清液置于冰浴中，加入(NH4)2SO4至40％～90％饱和(边加边搅拌，防止蛋白质变性)；
⑥静置过夜，离心(6000rpm，30min，4℃)，弃除上清液；
⑦沉淀用40ml蒸馏水溶解，加10ml正丁醇脱脂，边加边搅拌(4℃；
⑧离心(6000rpm，30min，4℃)，弃油脂层；保留水相，(离心重复3次)；
⑨将水相装入透析袋，用蒸馏水透析过夜；
⑩用适量的PEG8000干粉末吸收透析袋中的水分，浓缩透析液；
(11)将浓缩后的透析液上DEAE-52纤维柱(whatman，16×25cm)；用0.02MPBpH7.8缓冲液洗脱，收集不同的组分，采用血球凝结活性作为指标，确定含有凝集素的有效组分；
(12将含有有效凝集素的洗脱液透析、分装、真空冷冻干燥、-40℃低温保存。
2血红细胞悬液的制备
取新鲜鸡或兔血加入抗凝剂，用0.9％生理盐水离心洗涤5次(2000rpm、5min)，然后用0.9％生理盐水配制成体积比为1％的兔血红细胞悬液，4℃保存备用。
3凝集素盐析分级范围的确定
在9支试管中各加入5ml的粗提液，加入硫酸铵使其饱和度分别达到10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％。将粗提液离心(10000×g，10min，4℃)，弃上清液，将沉淀物溶解于同体积的稀盐酸溶液中，对此溶液充分透析并调节各管溶液至相同浓度，测定不同的粗提液与2％鸡(羊)血红细胞的凝集活性，确定可以沉淀凝集素有效组分的硫酸铵的浓度。
4凝集素的标记
可以采用荧光素类、酶类、生物素、胶体金或铁蛋白等任一方法标记凝集素。
用异硫氰酸荧光素(FITC)标记凝集素
取适量提纯的凝集素，用生理盐水和浓度为0.5mol·L-1、pH9.5的碳酸盐缓冲液(9∶1)稀释为20mg/ml。在通风橱内，将容器放置冰浴；按每毫克凝集素加0.01～0.02mgFITC的比例加入荧光素。用分析天平称取所需量的FITC，先溶解于少量碳酸盐缓冲液，再逐滴缓慢加入凝集素溶液内。边加边搅拌混匀，避免产生气泡，约在5-10min内加完。将容器(瓶口加塞密闭)及电磁搅拌器移置4-6℃冰箱内，继续缓慢搅拌结合12-18h(亦可改为在20-25℃室温下搅拌结合2-4h)。
将标记后的凝集素与残留的FITC混合物离心(3000×g、20min)除去少量沉淀物，取上清液置透析袋内，用0.01mol·L-1，pH7.2磷酸盐缓冲盐水(PBS)于4℃透析3～5d(PBS液量应为结合物100倍，并需多次更换PBS)，直至溶液中无游离的FITC。将标记的凝集素稀释分装，-20℃保存。
5带有微生物菌株的样品的制备
5.1植物样品
将可能带有附生、互生或共生微生物的植物(秸秆、根段)置于无菌的容器中，充分磨碎、剪碎；将植物样品放入含有100ml无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中，室温70～200rpm震荡10～30min，制成悬液；采用10倍系列稀释法，无菌操作制成10-2至10-6稀释度的悬液。
5.2根际土壤样品
采集生长在大田、室内盆钵或网袋里的植株，用抖土法去掉植株幼根上的较大的土壤颗粒，将根部连同根上的少量土壤放入含有100ml无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中；室温70～200rpm震荡10～30min，制成植株根际土壤悬液；采用10倍系列稀释法，制成10-2至10-6稀释度的土壤悬液。
5.3根表土壤样品
采集生长在大田、室内盆钵或网袋里的植株，用抖土法去掉植株幼根上的较大的土壤颗粒，用无菌水轻微冲洗根部，在无菌环境下将根切割成1～2cm的根段，将根段放入含有100ml无菌水和适量玻璃珠的三角瓶中；室温70～200rpm震荡10～30min，制成植物根表土壤悬液；采用10倍系列稀释法，制成10-2至10-6稀释度的悬液。
6有益微生物纯培养物的初筛
采用微生物菌种分离纯化技术从上述各类样品中分离纯化各种有益微生物。
6.1固氮细菌的筛选
采用阿须贝无氮培养基，配方如下：KH2PO40.2g；NaCl0.2g；K2SO4·2H2O0.2g；MgSO4·7H2O0.2g；CaCO35.0g；葡萄糖5.0g；甘露醇5.0g；放线菌酮(或其他抑制真菌的抗生素)50mg；琼脂15~20g；蒸馏水1000ml；pH7.0。
分别取上述各种样品悬液在阿须贝无氮培养基上涂平板，每一稀释度每皿加0.1ml菌液到上述培养基中的平皿中，3次重复；在28℃下培养5天，分别挑取透明圈比较大的菌株，纯化分离，选取长势较好的菌株保藏，以待进一步研究。
6.2溶磷细菌的筛选
采用溶磷细菌培养基，配方如下：NaCl0.3g；MgSO4·7H2O0.3g；MnSO4·4H2O0.03g；KCl0.3g；(NH4)2SO40.5g；FeSO4·7H2O0.03g；Ca3(PO4)25.0g；蔗糖10g；放线菌酮(或其他抑制真菌的抗生素)50mg；琼脂15～20g；蒸馏水1000ml；pH7.0～7.5。
分别取上述各种样品悬液在溶磷细菌培养基上涂平板，每一稀释度每皿加0.1ml菌液到上述培养基中的平皿中，3次重复。在28℃下培养5天，分别挑取透明圈比较大的菌株，纯化分离，选取长势较好的菌株保藏，以待进一步研究。
6.3解磷细菌的筛选
采用有机磷细菌培养基，配方如下：葡萄糖，10g；(NH4)2SO4，0.5；NaCl，0.3；KCl，0.3；MgSO4·7H2O；FeSO4·7H2O，0.03g；MnSO4·4H2O，0.03g；CaCO3，5.0g；卵磷脂，0.2g；琼脂15～20g；放线菌酮(或其他抑制真菌的抗生素)50mg；蒸馏水1000ml；pH7.0～7.5。
分别取上述各种样品悬液在解磷细菌培养基上涂平板，每一稀释度每皿加0.1ml菌液到上述培养基中的平皿中，3次重复。在28℃下培养5天，分别挑取透明圈比较大的菌株，纯化分离，选取长势较好的菌株保藏，以待进一步研究。
6.4解钾细菌的筛选
采用解钾细菌培养基，配方如下：MgSO4·7H2O0.2g；Na2HPO42.0g；FeCl30.05g；蔗糖5.0g；CaCO30.1g；玻璃粉1.0g；放线菌酮(或其他抑制真菌的抗生素)50mg；琼脂15～20g；蒸馏水1000ml；pH7.0～7.5。
分别取上述各种样品悬液在解钾细菌培养基上涂平板，每一稀释度每皿加0.1ml菌液到上述培养基中的平皿中，3次重复。在28℃下培养5天，分别挑取透明圈比较大的菌株，纯化分离，选取长势较好的菌株保藏，以待进一步研究。
6.5放线菌的筛选
采用的培养基如下：可溶性淀粉20.0；KNO31.0；K2HPO40.5；MgSO4·7H2O0.5；NaCl0.5；FeSO4·7H2O0.01；放线菌酮(或其他抑制真菌的抗生素)50mg；重铬酸钾10mg；琼脂18；PH7.2～7.4。
分别取上述各种样品悬液在解磷细菌培养基上涂平板，每一稀释度每皿加0.1ml菌液到上述培养基中的平皿中，3次重复。在28℃下培养5天，分别挑取具有明显不同特征的各类菌株，纯化分离，选取长势较好的菌株保藏，以待进一步研究。
6.6酵母菌的筛选
筛选酵母菌可采用豆芽汁培养基：蔗糖(或葡萄糖)，10～30g；黄豆芽，100g；链霉素50mg；青霉素50mg；(或其他抑制细菌的抗生素)；自来水，1000ml；pH7.2。
分别取上述各种样品悬液在解磷细菌培养基上涂平板，每一稀释度每皿加0.1ml菌液到上述培养基中的平皿中，3次重复。在28℃下培养5天，分别挑取具有明显不同特征的各类菌株，纯化分离，选取长势较好的菌株保藏，以待进一步研究。
7具有凝集素亲和性菌株的复筛
在载玻片上加一滴磷酸缓冲液(PBS)，将分离保藏的培养到对数生长期的固氮菌、溶磷细菌、解磷细菌、解钾细菌、放线菌和酵母菌等有益菌株分别涂片、固定；用微量移液器取50μl用荧光素标记的凝集素溶液加在涂片上，25℃保湿保温30min；然后用0.9％的NaCl生理盐水漂洗15min，用蒸馏水稍稍冲洗，干燥后置于荧光显微镜下观察，根据所用的荧光素的种类选择相应波长的激发光激发光；如采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记则选择蓝色光(λ＝495nm)激发。对阳性菌株样品应设置对照抑制试验，方法如后：先加适当稀释的同种未标记凝集素，作用一定时向后洗去，再加标记凝集素染色，阳性菌株样品的荧光应受到明显抑制。选取具有特异荧光的菌株保藏备用。
8筛选结果
经过以上步骤，共获得与棉花具有特异亲和性的功能菌固氮菌16株、解磷细菌12株、溶磷细菌11株、解钾细菌18株、放线菌10株、酵母菌7株。
实施例2：小麦根际特异性解钾菌株的筛选
1麦胚凝集素的提取纯化
采用含少量脂肪材料中凝集素的提取的方法。
①麦胚100g
②加入1000ml0.05mol·L-1HCl抽提，搅拌1h，常温，离心2000×g10min，丢弃残渣，上清液即为凝集素粗提液；
③将上清液置于冰浴中，加入硫酸铵至40％-90％饱和度，搅拌1h；4℃10000g离心15min，丢弃上清液；
④在沉淀加入45ml0.05mol·L-1HCl溶解，滴加正丁醇15ml，搅拌1h脱脂，3000g离心30min，保留水相，(脱脂重复2次)；
⑤将离心上清液对0.05mol·L-1HCl透析过夜；
⑥在透析后的样品中加入硫酸铵达40％-70％饱和度，搅拌1h，4℃、10000g离心15min，弃上清液；
⑦用0.05mol·L-1HCl20ml溶解沉淀，对蒸馏水透析过夜；
⑧用适量的PEG8000干粉末吸收透析袋中的水分，浓缩透析液；
⑨用适量的PEG8000干粉末吸收透析袋中的水分，浓缩透析液；
⑩将浓缩后的透析液上DEAE-52纤维柱(whatman，16×25cm)；用0.02MPBpH7.8缓冲液洗脱，收集不同的组分，采用血球凝结活性作为指标，确定含有凝集素的有效组分；
(11)将含有有效凝集素的洗脱液透析、分装、真空冷冻干燥、-40℃低温保存。
2用异硫氰酸荧光素(FITC)标记凝集素
取适量提纯的凝集素，用生理盐水和浓度为0.5mol·L-1、pH9.5的碳酸盐缓冲液(9∶1)稀释为20mg/ml。在通风橱内，将容器放置冰浴；按每mg凝集素0.01～0.02mgFITC的比例加入荧光素。用分析天平称取所需量的FITC，先溶解于少量碳酸盐缓冲液，再逐滴缓慢加入凝集素溶液内。边加边搅拌混匀，避免产生气泡，约在5～10min内加完。将容器(瓶口加塞密闭)及电磁搅拌器移置4～6℃冰箱内，继续缓慢搅拌结合12～18h(亦可改为在20～25℃室温下搅拌结合2～4h)。
将标记后的凝集素与残留的FITC混合物离心(3000×g、20min)除去少量沉淀物，取上清液置透析袋内，用0.01mol·L-1，pH7.2磷酸盐缓冲盐水(PBS)于4℃透析3～5d(PBS液量应为结合物100倍，并多次更换PBS)，直至溶液中无游离的FITC。将标记的凝集素稀释分装，-20℃保存。
3小麦根际细菌的分离纯化
3.1小麦根际土壤悬液的制备
采集生长在麦田或网袋里的小麦，用抖土法去掉小麦幼根上的较大的土壤颗粒，放入含有100ml无菌水的三角瓶中，制成小麦根际的细菌悬液，采用10倍系列稀释法，制成10-2至10-6稀释度的细菌悬液两份，一份不加热；另一份60℃处理7min杀死活菌体，仅保留芽孢。
3.2解钾细菌的分离纯化
采用解钾细菌培养基，配方如下：MgSO4·7H2O0.2g；Na2HPO42.0g；FeCl30.05g；蔗糖5.0g；CaCO30.1g；玻璃粉1.0g；放线菌酮(或其他抑制真菌的抗生素)50mg；琼脂15～20g；蒸馏水1000ml；pH7.0～7.5。分别取上述不加热和加热后的小麦根际细菌悬液在解钾细菌培养基上涂平板，每一稀释度每皿加0.1ml菌液到上述培养基中的平皿中，三次重复。在28℃下培养5天，分别挑取透明圈比较大的菌株，纯化分离，并多次传代培养，选取长势较好的菌株27株保藏，以用于进一步研究。
4复筛具有凝集素亲和性的菌株
在载玻片上加一滴PBS缓冲液，将分离保藏的培养到对数生长期的解钾细菌菌株分别涂片、固定；用微量移液器取50μl用FITC荧光素标记的凝集素溶液加在涂片上，25℃保湿温育30min；然后用0.9％的NaCl生理盐水漂洗15min，用蒸馏水稍稍冲洗，干燥后置于荧光显微镜下观察，选择蓝色光(λ＝495nm)激发。对阳性反应菌株样品应设置对照抑制试验，方法如后：先加适当稀释的同种未标记凝集素，作用一定时向后洗去，再加标记凝集素染色，阳性反应菌株样品的荧光应受到明显抑制。选取到具有特异荧光的K0104、K0405、K0411、K0603、K1205、K1215、K1218、K1816等8个解钾活性较高的菌株保藏备用。
5平板法复筛解钾细菌
对K0104、K0405、K0411、K0603、K1205、K1215、K1218、K1816等8个解钾活性较高的菌株，在解钾细菌培养基平板上栽培小麦，同时设置不接菌的空白对照，检验其对小麦的生长是否具有促进作用。小麦播种六天后，进行一次查苗，将每个平皿中的麦苗按高度、叶色分成四等：优、良、中、差。播种10天后收获，将苗贴培养基处剪下，分别测定鲜重、干重和株高。测定结果显示K0104、K1205、K1215菌株具有明显促生作用。
6小麦盆栽试验
在直径10cm，高10cm的塑料盆中装土300g，将培养好的解钾细菌发酵液10ml拌入土壤，施加适量的氮肥和磷肥，浇水使其含水量达60％，每盆均匀种植小麦种子15粒，设置灭活菌液作对照，并设置空白对照I和施加氮、磷和钾肥的对照II，每样4个重复。待小麦生长21天取样，比较各处理的小麦的干重、鲜重，发现K1205菌株对小麦生长的促进效果达到显著水平。
实施例3：水稻根际特异性解磷菌株的筛选
1水稻凝集素的提取纯化
采用与实施例2中相同的“含少量脂肪材料中凝集素的提取的方法”提取纯化水稻凝集素。
2用生物素标记水稻凝集素
①将纯化的凝集素(10ml)在标记缓冲液(0.1Mol/LNaAc，pH值5.5，0.1mol/LNaCl)中4℃透析过夜；
②吸取5ml至离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度为10mmol/L，置冰浴上避光30min，使凝集素分子上的糖基氧化；
③用PBS平衡SephadexG25PD-10预装柱，将氧化的凝集素过柱，收集具有凝血活性的凝集素组分；
④向凝集素管中加入生物素至终浓度5mmol/L，置混摇器上25℃反应1h；
⑤用含0.02％NaN3的PBS平衡SephadexG25预装柱，将生物素标记反应物过柱，收集蛋白组分，分装，保存于-20℃。
3水稻根际细菌的分离纯化
参考分离小麦根际微生物的程序分离获得解磷菌株16株。
4复筛具有凝集素亲和性的菌株
利用生物素-亲和素系统来检测用生物素标记的凝集素，可以用不同的技术路线来进行特异性菌株的筛选。
①采用BA(生物素-亲和素)系统，先用生物素标记的凝集素对微生物菌株样品进行反应，再用带有过氧化物酶(或碱性磷酸酶)的亲和素对样品第2次染色，进而加进酶的底物进行显色反应；观察的方法可采用光学显微镜观察、采用化学发光法裸眼观察、或者用酶标仪(ELISA)检测。
②采用BAB(生物素-亲和素-生物素)系统，先用生物素标记的凝集素对菌株样品进行反应，再用亲和素复染，然后用过氧化物酶(或碱性磷酸酶)标记的生物素对样品第3次染色，进而加进酶的底物进行显色反应；采用光学显微镜观察、采用化学发光法裸眼观察、或者用酶标仪(ELISA)检测。
③采用ABC(亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)系统，先用生物素标记的凝集素对菌株样品进行反应，再用亲和素+生物素+过氧化物酶(或碱性磷酸酶)的复合物对样品进行复染，进而加进酶的底物进行显色反应；采用光学显微镜观察、采用化学发光法裸眼观察、或者用酶标仪(ELISA)检测。
④以上3种方法中的标记所用的酶都可以用荧光素来代替。
选取到具有特异显色反应的11株解磷菌株保藏备用。
5盆栽实验
采用类似实施例2中的第5步和第6步进一步从保藏的11株解磷菌株中筛选对水稻特异性的功能菌株，获得对水稻具有促生效果的解磷菌株7株。