专利名称：一种用cd的制作方法
技术领域：
一种用CD25/IL-2Ra抗体标记人肝组织毛细胆管的方法，属于组织细胞染色表达技术领域。
背景技术：
近年来，随着人们对肝脏疾病了解的深入，肝穿刺活检已成为一种常规的诊断手段。穿刺器械和技术的进步，使肝穿刺更加安全，取材更满意。日常工作中肝穿组织已常能达到2cm以上，使肝穿组织病理更有代表性和说服力，并进一步推动了肝病诊治前进的步伐。
日常肝组织病理包括HE(苏木素-伊红染色)，网织纤维染色，Masson染色，免疫组化，特殊染色，原位杂交等。对肝细胞超微结构的观察往往需要电子显微镜，如肝毛细胆管的观察，为临床病理诊断带来了困难。
肝脏疾病种类繁多，有一部分疾病涉及肝毛细胆管(有人称胆小管)，特别是一些有黄疸的病人尤为如此。肝毛细胆管在普通HE切片上是无法辨认的，因此，往往导致对其认识不足。国内有学者给刚离体的动物肝脏的胆总管内灌注墨汁以达到显示毛细胆管的目的，但这在肝活检标本上是无法使用的。成令忠等给兔肝予镀银染色以显示兔胆小管[成令忠，冯京生，冯子强，等。组织学彩色图鉴[M]。第1版。北京人民卫生出版社。2000，137。]，但对人肝毛细胆管未作进一步说明；石玉秀，邓纯忠等用ATP酶染色法显示人肝胆小管[石玉秀，邓纯忠。组织学与胚胎学彩色图谱[M]。第1版。上海上海科学技术出版社。2002，48。]，但结果并不理想；国外同行用CEA作标记物[骆抗先，乙型肝炎临床与活体组织病理[M]。第1版。北京科学出版社。2001，17。]，我们通过试验也证实其往往有非特异性染色，部分血窦内皮细胞也呈阳性表达。
CD25/IL-2Ra[陈丙莺，陈子兴。分子生物学基础与临床[M]。第1版。南京东南大学出版社。2000，208。]，分子量为55KD，在部分T淋巴细胞上表达，这些细胞对自身反应性T淋巴细胞的活化和增殖起着负调节作用，在器官移植后排异等环节发挥一定作用。最近发现CD4+CD25+细胞可以直接作用于B细胞，抑制抗体类别重组转换及抗体的产生。目前对于其他组织表达CD25/IL-2Ra的研究极少。CD25/IL-2Ra在肝毛细胆管表达，目前尚无文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用CD25/IL-2Ra抗体标记人肝组织毛细胆管的方法，通过免疫组化或免疫荧光均证实毛细胆管表达CD25/IL-2Ra，并通过阻断试验进一步证实CD25/IL-2Ra表达的特异性。
本发明的技术方案一种用CD25/IL-2Ra抗体标记人肝组织毛细胆管的方法，是以人肝穿刺活检组织为标本，标本经抗原修复处理，以CD25/IL-2Ra为一抗，经免疫组化或兔疫荧光进行显色摄片，再以阻断试验确定其特异性，确认CD25/IL-2Ra标记人肝组织毛细胆管，步骤为(1)标本抗原修复处理以人肝穿刺活检组织为标本，标本用10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋，4μm薄切片，脱蜡至水，柠檬酸高压锅抗原修复，贴于玻片上用于免疫处理；(2)免疫组化或免疫荧光免疫组化抗原修复处理后的标本用0.3％过氧化氢祛除内源性过氧化物酶，保持10min，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴CD25/IL-2Ra一抗，室温孵育1h，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴广谱二抗Elivision A液保持20min，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴广谱二抗Elivision B液保持30min，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；用DAB显色剂于普通显微镜下控制显色；或免疫荧光抗原修复处理后的标本，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴CD25/IL-2Ra一抗，室温孵育1h，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴FITC荧光素标记山羊抗小鼠IgG，暗处孵育30min，荧光显微镜(波长465-495nm)观察并摄片；(3)阻断试验抗原修复处理后的标本，先滴不带FITC荧光素的CD25/IL-2Ra一抗使之与标本组织CD25/IL-2Ra抗原表位结合，洗涤后再滴CD25/IL-2Ra-FITC，由于先前标本组织CD25/IL-2Ra抗原表位已与不带FITC荧光素的CD25/IL-2Ra一抗结合，使CD25/IL-2Ra-FITC无法结合，荧光显微镜下显示阴性结果。
正常对照抗原修复后，PBS洗3min3次，滴CD25/IL-2Ra-FITC(美国BD公司，克隆号2a3)暗处孵育30min，荧光显微镜(波段488nm)观察得阳性结果。
主要抗体来源CD25/IL-2Ra单抗(美国Labvision公司，克隆号IL2R.1；美国Zymed公司，克隆号4c9)；CD4单抗(美国ADI公司，克隆号1F6)；CD8单抗(美国ADI公司，克隆号1A5)；CEA多克隆抗体(美国Zymed公司，编号ZA-0063)；
FITC荧光素标记山羊抗小鼠IgG(美国Vactor公司，编号ZF-0312)；即用型第二代免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒(美国Labvision公司，编号KIT-9902)，又称广谱二抗。
其它试剂细胞通透剂Tritou-x100，PBS液，柠檬酸修复剂，DAB显色剂等均购自迈新公司。
本发明的有益效果引用免疫组化方法观察CD25/IL-2Ra分子在人肝毛细胆管上的表达，用二种不同克隆号的CD25/IL-2Ra作一抗，表达效果均优良。为了防止非特异性染色，我们设立阳性对照(扁桃体)和CD4、CD8之间的片间对照。结果显示免疫组化显色清晰，定位正确。通过同一组织分别用CD25/IL-2Ra和CEA作对照，证明CD25/IL-2Ra比CEA更有特异性，显色效果优于CEA。通过免疫荧光肝毛细胆管呈绿色荧光，进一步确认其表达CD25/IL-2Ra。阻断试验进一步说明肝毛细胆管表达CD25/IL-2Ra特异性，用不带FITC荧光素的CD25/IL-2Ra一抗先与肝组织毛细胆管上的CD25/IL-2Ra抗原位点结合，使后加入的CD25/IL-2Ra-FITC无法与之结合，显示为阴性结果。通过不同病种间的比较，药物性肝炎病人因为肝毛细胆管扩张使其CD25/IL-2Ra标记后呈腔隙状显色，与临床病理一致，使之更具说服力；而肝移植后慢性排异的病例其毛细胆管表达CD25/IL-2Ra明显低下，或许可以作为慢性排异的潜在诊断手段，但此类病人较少，需经更多的病例来证实。
至于肝毛细胆管表达CD25/IL-2Ra的机理，有待通过基因水平，RNA的转录或蛋白质的翻译等水平进行深入研究。通过本发明我们可以观察到CD25/IL-2Ra在肝毛细胆管上的表达，并通过多种方法证明之，其清晰度和定性均优于CEA，具有明确的特异性。
原发性肝癌和继发性肝癌的病理学鉴别诊断主要标记，就是前者有毛细胆管的存在，而后者无此结构，因此，CD25/IL-2Ra标记肝毛细胆管在肝癌的鉴别诊断上有重要的临床意义；对于某些先天性胆管疾病(如Caroli′s病)和黄疸的鉴别诊断(如硬化性胆管炎)也有非常重要的诊断价值。
图1 CD25/IL-2Ra标记肝毛细胆管，毛细胆管呈棕黄色条索状结构。1-a、克隆号IL2R.1，S-P法，×200；1-b、克隆号4c9，S-P法，×200。
图2不同病例的CD25/IL-2Ra标记肝毛细胆管。2-a、PBC(原发性胆汁性肝硬化)肝组织CD25/IL-2Ra(毛细胆管呈阳性表达，S-P法，×200)；2-b、肝移植慢性排异肝组织CD25/IL-2Ra(毛细胆管表达CD25较弱，S-P法，×200)；2-c、正常肝(肝移植供肝标本，毛细胆管表达CD25/IL-2Ra，S-P法，×200)；2-d、药物性肝炎肝组织(显示毛细胆管强表达CD25/IL-2Ra，S-P法，×200)。
图3标记对照。3-a、肝组织CD4表达(汇管区部分淋巴细胞胞浆阳性，部分血窦内皮细胞阳性表达，S-P法，×200)；3-b、肝组织CD8表达(汇管区部分淋巴细胞胞浆阳性，S-P法，×200)；3-c、扁桃体CD25/IL-2Ra(阳性对照，部分淋巴细胞胞浆阳性，S-P法，×200)。
图4 CEA表达与CD25/IL-2Ra表达对照。4-a、肝毛细胆管CD25/IL-2Ra(毛细胆管呈阳性表达，克隆号4c9，S-P法，×200)；4-b、同一标本肝毛细胆管CEA(多克隆抗体)(部分毛细胆管呈阳性表达，部分血窦内皮细胞也呈阳性表达，S-P法，×200)。
图5免疫荧光。5-a、肝组织CD25/IL-2Ra免疫荧光(免疫荧光毛细胆管呈索状绿色荧光表达，×100)；5-b、肝组织CD25/IL-2Ra免疫荧光(免疫荧光毛细胆管呈索状绿色荧光表达，×200)。
具体实施例方式
实施例1免疫组化毛细胆管CD25/IL-2Ra标记呈棕黄色条索状结构，同一组织同时做CD4、CD8淋巴细胞对照，以扁桃体组织作阳性对照。所入选病例包括慢性乙型肝炎、PBC(原发性胆汁性肝硬化)、肝移植二年后慢性排异、正常肝供体、药物性肝炎等组织。以上组织均由二种不同克隆号的CD25/IL-2Ra作一抗，表达效果均优良。
实施例2用国际公认的CEA(多克降抗体)与CD25/IL-2Ra对照，同一肝组织CD25/IL-2Ra显色效果优于CEA。
实施例3荧光免疫组化染色肝组织和正常人血自细胞涂片。
实施例4阻断试验正常对照抗原修复后，PBS洗3min3次，滴CD25/IL-2Ra-FITC(美国BD公司，克隆号2a3)暗处孵育30min，荧光显微镜(波段488nm)观察得阳性结果。
阻断试验抗原修复后先滴CD25/IL-2Ra一抗(美国BD公司，克隆号2a3)孵育1h使之与组织CD25结合，PBS洗3min3次，再滴入CD25/IL-2Ra-FITC，由于先前组织CD25表位已与CD25/IL-2Ra一抗结合，使CD25/IL-2Ra-FITC无法结合，荧光显微镜下示阴性结果。
权利要求
1.一种用CD25/IL-2Ra抗体标记人肝组织毛细胆管的方法，其特征是以人肝穿刺活检组织为标木，标本经抗原修复处理，以CD25/IL-2Ra为一抗，经免疫组化或兔疫荧光进行显色摄片，再以阻断试验确定其特异性，确认CD25/IL-2Ra标记人肝组织毛细胆管，步骤为(1)标本抗原修复处理以人肝穿刺活检组织为标本，标本用10％中性福尔马林液固定，石蜡包埋，4μm薄切片，脱蜡至水，柠檬酸高压锅抗原修复，贴于玻片上用于免疫处理；(2)免疫组化或免疫荧光免疫组化抗原修复处理后的标本用0.3％过氧化氢祛除内源性过氧化物酶，保持10min，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴CD25/IL-2Ra一抗，室温孵育1h，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴广谱二抗ElivisionA液保持20min，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴广谱二抗Elivision B液保持30min，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；用DAB显色剂于普通显微镜下控制显色；或免疫荧光抗原修复处理后的标本，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴CD25/IL-2Ra一抗，室温孵育1h，PBS冲洗保持3min，冲洗3次，甩干；滴FITC荧光素标记山羊抗小鼠IgG，暗处孵育30min，荧光显微镜观察并摄片；(3)阻断试验抗原修复处理后的标本，先滴不带FITC荧光素的CD25/IL-2Ra一抗使之与标本组织CD25/IL-2Ra抗原表位结合，洗涤后再滴CD25/IL-2Ra-FITC，由于先前标本组织CD25/IL-2Ra抗原表位已与不带FITC荧光素的CD25/IL-2Ra一抗结合，使CD25/IL-2Ra-FITC无法结合，荧光显微镜下显示阴性结果。
全文摘要
一种用CD
文档编号G01N21/78GK101021528SQ20071002072
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月21日 优先权日2007年3月21日
发明者陆忠华, 印永强, 黄利华, 居朝霞, 胡锡琪, 邢益平, 蒋祥虎, 华惠琦 申请人:无锡市传染病医院