专利名称：纳米金银染增强技术检测痕量二恶英的生物学方法
技术领域：
本发明涉及二恶英类污染物的检测，具体地说是一种新的痕量二恶英类化合物检测方法。
背景技术：
二恶英类化学物质(dioxin-like chemicals, DLCs)能与芳香烃受体(aromatic hydrocarbon rec印tor, AhR)结合，并导致机体产生多种生物化学变化，从而引起各种毒 性作用。DLCs主要包括多氯代二苯并二恶英，多氯代二苯并呋喃和共平面多氯联苯，其 中研究最多也是最典型和毒性最强的物质为2，3,7，8-四氯代二苯并二恶英 (2, 3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)。由于DLCs在环境中广泛存在，不易降解、易于生物富集和生物放大，且具有很强的毒性，很低剂量即可对机体产生各种毒性效应， 对人类和生态的危害极大，而DLCs检测是防治DLCs污染及其危害的必需手段，对我国环境 保护和国民经济发展具有重要意义。对DLCs的检测是近代卫生检验分析的一个难点，这是由于这类物质种类繁多、环境中含 量很低、基体效应复杂，检测十分困难。目前DLCs主要的检测方法有色谱法、免疫法和 生物法三大类，高效气相色谱一质谱联用检测(HRGC/MS)是目前国际通用的标准方法，但 检测过程复杂、仪器设备及人员要求高、检测费用昂贵而限制了其推广应用。经济适用的生 物筛选方法可大大减少二恶英检测的难度和成本。因此，除色-质联机检测外，还有利用抗 原-抗体反应建立的免疫学检测方法，但二恶英化合物种类繁多，相应抗体的制备很难满足 检测所需的多样商品化抗体要求。理想的二恶英检测程序是先利用一种简便的方法进行初步 的筛选，如果二恶英浓度超过规定的标准，再利用色-质联机检测具体的二恶英化合物，但 这种简便的筛选方法必须具备两个条件第一是能检测所有的二恶英化合物(不一定要分别 是何种二恶英化合物)；第二是具有极高的灵敏度，其灵敏度甚至要超过色-质联机检测，只 有这样才能保证用该方法排除的阴性样本中的二恶英不超过标准。二恶英以混合物形式存在, 其对健康产生的综合效应并非各组分含量的简单相加，生物法检测为衡量这类混合物总毒 性当量及评价其对健康的潜在影响效应提供了便捷的方法。因此生物检测技术有望成为二恶英类化合物快速筛选手段，从而大大降低DLCs的检测成本。目前的基于活体细胞Ah受体 生物分析法是一种快速的筛选方法，满足了第一个条件，但在灵敏度方面仍显不够。如能建 立一种简便灵敏的生物筛选方法，可大大减少二恶英检测的难度和成本。发明内容本发明的任务是提供一种基于纳米金银染增强技术的二恶英生物学检测方法，使其具有 灵敏度高，检测费用低，快速简便，适于基层单位推广等特点。 实现本发明的技术方案是TCDD与含有Ah受体和Arnt蛋白的SD大鼠肝细胞溶质在20。C水浴环境中孵育一定时间 后，激活Ah受体，形成TCDD—AhR—Arnt复合物。复合物中的Ah受体构像发生改变，暴露 出与纳米金标记的双链DRE探针结合位点，形成TCDD-AhR—Arnt—DRE复合物。在Arnt单 克隆抗体的特异性捕获下，该复合物被固定于酶标板上。用1XPBS溶液和2XPBN溶液洗漆 去除酶标板中的游离探针后，用银染增强液处理，并在490nm波长处实时检测溶液的OD值。 溶液OD值变化的快慢程度与纳米金颗粒量的多少相关，而纳米金颗粒的量与TCDD的浓度相 关。根据TCDD标准品浓度与OD值之间的关系，绘制出相应的时间一效应曲线和剂量一效应 关系曲线，然后由此标准曲线计算得出待测样本中二恶英的量。本发明二恶英检测方法包括以下步骤(1) 以动物肝脏组织制备的含芳香烃受体(AhR)和芳香烃受体核转位子蛋白(Arnt)的细胞 溶质作为二恶英的特异受体；(2) 以纳米金通过共价键合作用标记在巯基修饰的DRE探针上，该探针的核心序列为GCGTG;(3) 将含芳香烃受体(AhR)和芳香烃受体核转位子蛋白(Arnt)的细胞溶质与含二恶英化合 物的待测样本共同孵育形成二恶英一AhR—Arnt复合物；(4) 通过抗原抗体反应，将AhR/Arnt复合物捕获在Arnt抗体包被好的酶标板上；(5) 将所形成的二恶英一AhR—Amt复合物与含有编码为GCGTG序列的纳米金标记DRE探针 共同孵育，使DRE序列与二恶英一AhR—Arnt复合物结合；(6) 洗涤，去除未结合的多余探针，用银染增强技术将结合的纳米金标记信号放大，并实时 读取吸光度值，采用2, 3, 7, 8 —四氯代二苯并二恶英(TCDD)制定标准曲线，从而计 算得出待测样本中二恶英当量(TEQ值)。 本发明的二恶英检测方法的具体步骤是1.提取含Ah受体的肝细胞溶质(CTC 4'C操作)(1)选取体重200 250g的清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠1只，称重，腹腔注射0. 4g/ml戊巴比妥麻醉；(2) 剖腹，暴露肝脏和心脏，从左心室插管至主动脉，先用0.9%生理盐水灌注，再用HEDG(25 mM HEPES， pH7. 5， 1 mM DTT， 10%甘油)+1.15% KC1灌注直至肝脏发白;(3) 切下肝组织，剪碎，用3倍体积的HEDGK缓冲液匀浆；(4) 匀浆液10, 000g离心20min，收集上清；(5) 再105， OOOg离心60min，小心吸取上清，即为含AhR的细胞溶质；(6) 测定蛋白含量，调整蛋白质含量为10mg/ml,加入10nM PMSF (终浓度0.5mM)后分装， 一80。CIC存。2. 纳米金标记DRE探针(GNP-DRE)(1) 合成含DRE的巯基修饰序列Seq1、 5 ， -SH-(CH2) 6-TACCATTGAGCGGAGTTGCGTGAGAAGAG-3' Seq2、 5， -GACTCTTCTCACGCAACTCCGCTCAATGGTA-3'(2) 取胶体金溶液500ul， 4°C,14, 000rpm离心20min，弃上清；(3) 加巯基标记序列Seql (100uM ，4ul和46ul TE buffer (pH8. 0),混匀成50ul体系，4 。C， 12h;(4) 加等体积(50ul) 0. 2M NaCl，20mM PB(20mM Na2HP04/NaH2P04 buffer ， pH 7. 0 )，使其终浓度为O. 1M NaCl，10mM PB，迅速混匀，4°C， 24h;(5) 取上清，4'C, 14, OOOrpm离心10min，弃上清，加100ul超纯水重悬后再次离心，弃 上清，以去除多余的未标记上的单链DNA;(6) 加訓ul 0. 1M NaCl, lOmM PB(pH7. O)混匀，置4。C储存备用。(7) 取GNP-seql单链45ul ， 100uM seq2 3ul, 5 X杂交缓冲液(1. 5M NaCl ， 50 mM PB, 0. 05%SDS ) 12ul， 25°C杂交4h，得GNP-DRE，置4。C储存备用。3. 酶标板包被Arnt抗体(C-19)用碳酸盐包被液将anti—Arnt抗体(C-19)按1: 100稀释，每孔包被100ul，潮湿环境 下4。C过夜；(碳酸盐包被液Na2C03, 0. 16g, Na线0. 29g， H20 100ml， pH9. 6); 0. 01M PBS (pH7.4)，洗涤2次，拍干。4. TCDD诱导激活AhR/Arnt复合物的制备各取SD雄性大鼠肝细胞溶质(含Ahr及Arnt) 90ul于4个1. 5mlEp管中，分别加入5ul 不同浓度(lnm, 10pm, 0. lpm每100倍稀释系列)的TCDD，混匀后置2(TC水浴摇床上振 荡2小时；同时设立阴性对照(不加TCDD，加5ulDMS0)。5. 激活的AhR/Arnt复合物特异性结合GNP-DRE(1) 取TCDD诱导激活的AhR/Arnt复合物95ul，加5ul 2%Tween20混匀后，移入anti-Arnt 抗体包被好的酶标孔内，抗原抗体结合37 'C温育lh; 0.01M PBS缓冲液(PH7.4)洗涤 3次；(2) 加0.25先(v/v)乙酰酐lOOul (250ul in 100ml 0. 1M三乙醇胺缓冲液，pH8. 0,无自由胺)， RT,10min，再用1XPBS+O. I%tween20洗涤3次，(注通过乙酰化自由胺，可中和蛋白 质正电荷，以减少胶体金与蛋白质的非特异性结合)；(3) 取0.01M PBS缓冲液(pH8.0) 95ul稀释已杂交好的GNP-DRE 5ul，加入酶标孔内，与 AhR/Arnt复合物特异性结合，37。C温育60min,轻摇；0. 01M PBS缓冲液洗涤3次。6. 纳米金标记信号银染增强(避光) 取银染增强液0.5 g AgN03/2ml H20, 12ul， 1.7 g hydroquinone/30 ml H20 , 300ul，2.55 g citric acid/2.35 g trisodium citrate/10 ml H20， lOOul现配现用，混匀后 迅速加入4个酶标板孔内，每孔lOOul，反应一定时间后，置入超纯水中，终止反应。 银染增强反应最好在避光或弱光下反应，以减少银自身成核反应，增强特异性。7. 酶标仪实时检测银染增强的OD值(490nm) 通过测量不同浓度TCDD标准品，检测吸光度值实时变化情况，绘制标准曲线，结果显示 该方法剂量效应相关性良好(y = 0. 1493x + 2.5753, R2 = 0.9611)。8. 本方法与现有方法的比较 用本方法nano-DRE和现有的生物分析方法(CALUX)测定TCDD标准品，分别绘制剂量效 应曲线。结果表明本方法灵敏度高，线性范围宽，重复性好。
图1为本发明纳米金标记探针技术nano-DRE检测痕量二恶英的原理图，本发明纳米 金标记探针技术nano-DRE检测痕量二恶英的原理是TCDD与含有Ah受体和Arnt蛋白的 肝细胞溶质20'C孵育后，形成TCDD—AhR—Arnt复合物。该复合物在Arnt单克隆抗体的 捕获下，被固定于酶标板上，再特异识别纳米金标记的双链DRE探针。洗涤后，用银染 增强液处理，实时检测溶液的OD值，结合纳米金探针的量与TCDD的浓度呈正相关。图2为银染增强的实时剂量效应曲线图，反应不同浓度TCDD的银染增强信号随时间 变化情况，显示TCDD浓度越高，银染增强信号强度变化率越高。图3为nano-DRE与CALUX方法的比较，通过测定标准浓度TCDD，结果显示nano-DRE较CALUX方法的灵敏度提高了3个数量级，且线性范围更宽。
具体实施方式
实施例1利用本方法测定二恶英标准样品1. 提取含Ah受体的肝细胞溶质((TC 4。C操作)(1) 选取体重20G 250g的清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠1只，称重，腹腔注射0. 4g/ml 戊巴比妥麻酔；(2) 剖腹，暴露肝脏和心脏，从左心室插管至主动脉，先用0.9%生理盐水灌注，再用HEDG(25 raM HEPES， pH7. 5, 1 mM DTT, 10%甘油)+1.15% KC1灌注直至肝脏发白；(3) 切下肝组织，剪碎，用3倍体积的HEDGK缓冲液匀浆；(4) 匀浆液10, 000g离心20min，收集上清；(5) 再105， OOOg离心60min，小心吸取上清，即为含AhR的细胞溶质；(6) 测定蛋白含量，调整蛋白质含量为10mg/ml,加入10nM PMSF (终浓度0.5mM)后分装， 一80。C贮存。2. 纳米金标记DRE探针(GNP-DRE)(1) 合成含DRE的巯基修饰序列Seq1、 5' -SH-(CH2) 6-TACCATTGAGCGGAGTTGCGTGAGAAGAG-3' Seq2、 5， -GACTCTTCTCACGCAACTCCGCTCAATGGTA-3，(2) 取胶体金溶液500ul， 4°C，14， OOOrpm离心20min，弃上清；(3) 加巯基标记序列Seql (馳M ， 4ul和46ul TE buffer (pH8.0)，混匀成50ul体系，4 。C, 12h;(4) 加等体积(50ul) 0. 2M NaCl,20mM PB(20mM Na2HP04/NaH2P04 buffer , pH 7. 0 ),使其 终浓度为O. 1M NaCl, 10mM PB，迅速混匀，4'C， 24h;(5) 取上清，4°C， 14， OOOrpm离心10min,弃上清，加100ul超纯水重悬后再次离心，弃上 清，以去除多余的未标记上的单链DNA;(6) 加100ul 0. 1M NaCl, 10mM PB(pH7. O)混匀，置4。C储存备用。(7) 取GNP-seql单链45ul， 100uM seq2 3ul， 5 X杂交缓冲液(1. 5M NaCl， 50 mM PB, 0. 05%SDS) 12ul, 25°C杂交4h，得GNP-DRE,置4。C储存备用。3. 酶标板包被Arnt抗体(C-19)用碳酸盐包被液将Arnt抗体(C-19)按1: 100稀释，每孔包被100ul，潮湿环境下4'C过夜；(碳酸盐包被液Na2C03， 0. 16g, NaHC03 0. 29g， H20 1 00ml， pH9. 6); 0. 01M PBS (pH7. 4)， 洗涤2次，拍干。4. TCDD诱导激活AhR/Arnt复合物的制备各取SD雄性大鼠肝细胞溶质(含Ahr及Arnt) 90ul于4个1. 5mlEp管中，分别加入 5ul不同浓度(lnra， 10pm， 0. lpm每100倍稀释系列)的TCDD，混匀后置20。C水浴摇 床上振荡2小时；同时设立阴性对照(不加TCDD，加5ulDMS0)。5. 激活的AhR/Arnt复合物特异性结合GNP-DRE6. 取TCDD诱导激活的AhR/Arnt复合物95ul，加5ul 2%Tween20混匀后，移入anti-Arnt 抗体包被好的酶标孔内，抗原抗体结合37 。C温育lh; O.OIMPBS缓冲液(pH7.4)洗涤 3次；7. 加0.25劣(v/v)乙酰酐100ul (250ul in 100ml 0.1M三乙醇胺缓冲液，pH8.0，无自由胺)， 室温，10min,再用1 XPBS + O. I%tween20洗涤3次；8. 取0.01M PBS缓冲液(pH8.0) 95ul稀释已杂交好的GNP-DRE 5ul，加入酶标孔内，与 AhR/Arnt复合物特异性结合，37。C温育60min，轻摇；0. 01M PBS缓冲液洗涤3次。9. 纳米金标记信号银染增强(避光) 取银染增强液0.5 g AgN(V2ml H20, 12ul， 1.7 g hydroquinone/30 ml H2() ， 300ul，2.55 g citric acid/2.35 g trisodium citrate/10 ml H20， lOOul现配现用，混匀后 迅速加入4个酶标板孔内，每孔lOOul,反应一定时间后，置入超纯水中，终止反应。 银染增强反应最好在避光或弱光下反应，以减少银自身成核反应，增强特异性。10. 酶标仪实时检测银染增强的OD值(490nm) 通过测量不同浓度TCDD标准品，检测吸光度值实时变化情况，绘制标准曲线。 实施例2本发明方法测定某化工产品中二恶英及与标准方法CALUX比较(TEQng/kg):样本纳米金标记探针技术检测法虫荧光素酶报告基因检测法Nano-DRE/ CALUXNano-DRECALUXl号0.3350.2761. 212号0. 110. 0941. 173号0. 4850. 3981. 224号0. 9720.9181.065号0. 5310.4541. 176号1.561.2521.257号3. 373.0371. 118号0. 3320. 2841. 179号0. 2780. 2221.25用本方法检测了某化工产品中的二恶英含量，同时与国际上通用的生物分析法(CALUX 法)比较，结果表明利用本方法检测的结果与CALUX结果有很好的一致性，本方法检测得 到的TEQ值略高于CALUX，主要是由于其检测的是所有Ah受体的激动剂。样本中存在的 一些未去除的多环芳类化合物和17种二恶英异构体之外的二恶英类化合物，也在本实验检 测范围内。另外，Nano-DRE方法操作规程更简便，且检测周期明显缩短，检测时间只要4 5小时，具有更高的推广价值。该方法可用于大量环境和生物样本二恶英检测的初筛，从而 很大程度上节约检测成本及时间。
权利要求
1. 一种二恶英检测方法，包括以下步骤(1)以动物肝脏组织制备的含芳香烃受体(AhR)和芳香烃受体核转位子蛋白(Arnt)的细胞溶质作为二恶英的特异受体；(2)以纳米金通过共价键合作用标记在巯基修饰的DRE探针上，该探针的核心序列为GCGTG；(3)将含芳香烃受体(AhR)和芳香烃受体核转位子蛋白(Arnt)的细胞溶质与含二恶英化合物的待测样本共同孵育形成二恶英-AhR-Arnt复合物；(4)抗Arnt或AhR抗体包被在酶标孔板载体，通过抗原抗体反应，将激活的AhR/Arnt复合物固定于该载体上；(5)将载体上所形成的二恶英-AhR-Arnt复合物与含有编码为GCGTG序列的纳米金标记DRE探针共同孵育，使之相结合；(6)利用银染增强技术使因复合物结合而保留下的探针的纳米金标记信号得以放大，并实时读取吸光度值，根据保留下的纳米金标记探针的量与诱导激活该复合物的二恶英的量成正比例关系的特点，采用2，3，7，8-四氯代二苯并二恶英(TCDD)制定标准曲线，从而计算得出待测样本中二恶英当量值(Toxic Equivalent Quantity，TEQ)。
2. 根据权利要求1所述的二恶英检测方法，其特征在于，所述的以纳米金通过共价键合 作用标记在烷巯基修饰的DRE探针上的具体方法是合成含DRE的巯基修饰序列Seql及其 互补序列Seq2;取纳米金(GNP)溶液500ul， 4。C, 14， 000rpm离心20min,弃上清；加巯 基标记序列Seql (100uM，4ul)和46ul TE buffer (pH8. 0)，混匀成50ul体系。4'C, 12h;加等体积(50ul) 0. 2M NaCl， 20mM PB(20mM Na2HP04/NaH2P04 buffer ， pH 7. 0 )，迅速混匀，4°C, 24h;取上清，4。C， 14， OOOrpm离心10min，弃上清，加lOOul超纯水重悬后再次离 心，弃上清加lOOul 0.1M NaCl, 10mM PB(pH7.0)混匀，置4。C储存备用；取GNP-seql单 链45ul， lOOuM s'3q2 3ul, 5X杂交缓冲液(1.5M NaCl， 50 mM PB, 0. 05%SDS) 12ul， 25°C 杂交4h,得GNP-DRE,置4'C储存备用。
3. 根据权利要求1所述的二恶英检测方法，其特征在于，所述的将抗Arnt或AhR抗体 包被在酶标孔板载体上，通过抗原抗体反应，将激活的AhR/Arnt复合物固定于该载体上的 具体方法是用碳酸盐包被液将anti—Arnt抗体按合适比例稀释(根据不同的实验条件选 择稀释度)，每孔包被100ul,潮湿环境下4'C过夜；(碳酸盐包被液Na2C03 0. 16g, NaHC03 0. 29g， H20 lOOml， pH9. 6); O.OIM PBS (pH7.4)，洗涤2次，拍干。取TCDD诱导激活的AhR/Arnt 复合物95ul，移入anti-Arnt抗体包被好的酶标孔内，抗原抗体结合37 。C温育lh; O.OIM PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3次。
4. 根据权利要求1所述的二恶英检测方法，其特征在于，所述的将载体上所形成的二 恶英一AhR—Arnt复合物与含有GCGTG序列的纳米金标记的DRE探针共同孵育使之结合的具 体方法是加0.25先(v/v)乙酰酐lOOul (250ul in 100ml 0. IM三乙醇胺缓冲液，pH8. 0，无 自由胺)，室温，10min，再用1XPBS + 0. 1Xtween20洗涤3次；取0. OIM PBS缓冲液(pH8. 0) 95ul稀释己杂交好的GNP-DRE 5ul，加入酶标孔内，与AhR/Arnt复合物特异性结合，37°C 温育60min，轻摇；0. OIM PBS缓冲液洗涤3次。
5. 根据权利要求1所述的二恶英检测方法，其特征在于，所述的利用银染增强技术纳 米金标记信号得以放大的具体方法是取银染增强液(0.5 g AgN03/2ml H20, 12ul， 1.7 g hydroquinone/30 ml H20 ， 300ul， 2.55 g citric acid/2.35 g trisodium citrate/10 ml H20) lOOul，现配现用，混匀后迅速加入4个酶标板孔内，每孔100ul，用酶标仪实时检测 银染增强的OD值(490nm)，反应一定时间，置入超纯水中，终止反应。该银增强反应在避 光或弱光下进行。
全文摘要
本发明提供了一种纳米金银染增强技术检测痕量二恶英的生物学方法，该方法根据二恶英诱导芳香烃受体形成的复合物所具有的特异核酸结合特性，利用纳米金银染增强技术的高灵敏度，实现了对二恶英类污染物的简单、灵敏、快速检测，二恶英诱导所激活的芳香烃受体复合物经特异性抗体结合而被捕获在固相载体上，然后识别以纳米金为报告基团的二恶英反应元件探针，再通过纳米金催化的银染增强效应产生高灵敏的识别信号，适时记录其吸光度值，从而实现二恶英类物质的定量检测，该方法操作简便，检测周期短，可用于大量环境和生物样本二恶英检测的初筛，节约检测成本及时间。
文档编号G01N33/547GK101266245SQ20071005165
公开日2008年9月17日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者徐顺清 申请人:华中科技大学