专利名称：：自动蛋白杂交洗脱仪的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学
技术领域：
，特别涉及一种自动蛋白杂交洗脱仪。二、
背景技术：
现有技术蛋白杂交(Westernblot)是现代生命科学领域经常使用的一种实验技术，即将目的蛋白行电泳分开后转移到PVDF膜上，再与已知的蛋白配体(如抗体等)杂交，通过酶系统显色后检测目的蛋白的有无和定量。它包括封闭、杂交和洗脱三个过程，其中封闭和杂交过程可合称孵育过程。目前，蛋白杂交常规的做法是摇床法，即将电泳转膜后的PVDF膜放于玻璃平皿中，然后将平亚放置在脱色摇床上。用含牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉的封闭液慢速摇动封闭，然后用含抗体的孵育液慢速摇动孵育。用洗脱液快速摇动洗脱4~6次，每次5—10分钟。如果使用酶标的二抗，应在含抗靶蛋白的一抗孵育液孵育并洗脱后，换含酶标抗第一抗体的二抗孵育液慢速摇动孵育。用洗脱液快速摇动洗脱4一6次，每次5—10分钟。最后用DAB或化学发光法显色以检测目的蛋白的有无和定量。常规做法的缺点是1.费时费力，操作烦瑣；2.抗体量较少时不便于实验；3.不便于M^莫化操作。三、
发明内容本发明针对上述技术问题，提供一种操作简单，在抗体量少时也不影响结果，能够做到规模化大批量蛋白杂交的自动蛋白杂交洗脱仪。本发明的技术解决方案为一种自动蛋白杂交洗脱仪，由孵洗系统、进样系统、出样系统和动力系统组成，其中孵洗系统包括溶液筒和转轴，转轴设于溶液筒内；进样系统包括进液管、恒流泵和试剂容器，进液管一端与溶液筒上部相连，另一端通过恒流泵与试剂容器相连；出样系统包括出液管H、出液管L、开关和废液收集器，出液管H和出液管L的一端分别与溶液筒下部相连，另一端与废液收集器相连，开关设于出液管上；动力系统包括电动机、调速开关和电源，电动机由调速开关控制，并与转轴相连。孵洗系统可与若干进样系统连接。溶液筒上分设有进膜口和出膜口。溶液筒可与4根进液管相连。转轴上设有膜固定装置，膜固定装置上设有磁膜夹和膜片托。将电泳转膜后的PVDF膜用胶带固定在一个可以旋转的转轴上，将转轴放于溶液筒内，通过进样系统将封闭液加入到溶液筒内，转轴以2—10转/分钟的低速旋转封闭。通过出样系统将封闭液;j文出，然后通过进样系统将抗体溶液加入到溶液筒内，转轴以2—10转/分钟的低速旋转孵育。孵育完毕后将抗体溶液通过出样系统放出，然后通过进样系统将洗脱液持续地加入到溶液筒内，转轴以100—200转/分钟的高速旋转洗脱。当加入的洗脱液达到出液管H的顶端时，多余的洗脱液由出液管H排到废液瓶中，这样新的洗脱液不断进入，多余的洗脱液不断排出，从而实现了连续洗脱。连续洗脱省去了常规方法中不断更换洗脱液的步骤，节省了时间和人力。由于转轴和溶液筒之间的空隙腔可以很小，因此可以在抗体量较少的情况下进行实验，节省了抗体。同一转轴可平行附贴多张PVDF膜，从而可以实现规模操作。孵育和洗脱的过程便于控制，实验条件保持一致，所以结果的重复性好。转动孵育的方法可以增加抗原抗体接触的机会，因此可以提高了杂交效率。结合自动控制系统，可以实现自动封闭孵育和洗脱，从而实现实验自动。本蛋白杂交洗脱仪包含四个系统，即进样系统、动力系统、出样系统和孵洗系统。进样系统包括进液管、恒流泵和试剂瓶三部分。试剂瓶是盛装封闭液、抗体溶液和洗液的容器，一个试剂瓶盛装一种溶液。在恒流泵的推动下，溶液经由进液管进入到溶液筒和转轴之间的空隙腔中。动力系统包括电源、电动机和调速开关三部分。调速开关可以调节电动机的转速，孵育时电动才几转速丰支低，洗脱时电动机转速4交高。电动机和孵洗系统的转轴相连，从而带动转轴转动。出样系统包括出液管H、出液管L、开关和废液瓶四郜分。孵育时溶液液面低于出液管H的顶端，出液管L的开关处于关闭状态；洗脱时溶液液面与出液管H的顶端相平，出液管L的开关处于关闭状态，同时进液系统处于工作状态；排放废液时打开出液管L的开关，废液由出液管L排到废液瓶中。孵洗系统包括溶液筒和转轴两部分。PVDF膜通过胶带固定在转轴上。溶液筒是一个外部的容器，内容纳着转轴。本发明的有益效果是封闭液、蛋白杂交液、洗脱液等依次连续地经进样系统输入溶液筒，再依次从出样系统放出，洗脱时新的洗脱液不断由进液管进入溶液筒，多余的洗脱液不断由出液管排出，从而实现了连续洗脱，省去了常规方法中不断更换洗脱液的步骤，实验中自动封闭、杂交和洗脱，节省了时间和人力。由于转轴和溶液筒之间的空隙腔可以很小，因此可以在抗体量较少的情况下进行实验，节省了抗体。同一转轴可平行附贴多张PVDF膜，从而可以实现规模操作。孵育和洗脱的过程实现自动控制，有利于保持实验条件的一致性，结果的重复性好。转动孵育的方法可以增加抗原抗体接触的机会，因此可以提高了杂交效率。四图1蛋白杂交洗脱仪结构示意图。图2蛋白杂交洗脱仪孵育状态简图。图3蛋白杂交洗脱4义洗脱状态简图。图4评价实验结果图。图5自动蛋白杂交洗脱仪孵洗部件构造侧视简图。图6PVDF膜固定装置简图。图中l.进液管，2.恒流泵，3.试剂容器，4.电动机，5.调速开关，6.电源，7.出液管H,8.开关，9.出液管L，IO.废液收集器，ll.溶液筒，12.转轴，13.PVDF膜，14a,第一进液管，14b,第二进液管，14c第三进液管，14d第四进液管，16.磁膜夹17.进膜口，18.出膜口，19.膜片托。五具体实施方式实施例1:一种自动蛋白杂交洗脱仪，由孵洗系统、进样系统、出样系统和动力系统组成，其中孵洗系统包括溶液筒11和转轴12,转轴12设于溶液筒11内；进样系统包括进液管1、恒流泵2和试剂容器3，进液管1一端与溶液筒11上部相连，另一端通过恒流泵2与试剂容器3相连；出样系统包括出液管H7、出液管L9、开关8和废液收集器10,出液管H7和出液管L9的一端分别与溶液筒11下部相连，另一端与废液收集器10相连，开关8设于出液管上；动力系统包括电动机4、调速开关5和电源6,电动机6由调速开关5控制，并与转轴12相连。孵洗系统可与若干进样系统连接。溶液筒上分^L有进膜口17和出膜口18。溶液筒上步分别与第一进液管14a,第二进液管14b，第三进液管14c和第四进液管相连14d。转轴上设有膜固定装置，膜固定装置上设有磁膜夹16和膜片托19。实施例2:本蛋白杂交洗脱仪包含四个系统，即进样系统、动力系统、出样系统和孵洗系统。进样系统包括进液管1、恒流泵2和试剂容器3三部分。试剂容器3是盛装封闭液、抗体溶液和洗脱液的容器，一个试剂#瓦盛装一种溶液。在恒流泵2的推动下，溶液经由进液管1进入到溶液筒11和转轴12之间的空隙腔中。动力系统包括电动机4、调速开关5和电源6三部分。调速开关5可以调节电动机4的转速，孵育时电动机4转速较低，洗脱时电动机4转速较高。电动机4和孵洗系统的转轴12相连，从而带动转轴12转动。出样系统包括出液管H7、开关8、出液管L9和废液瓶10四部分。孵育时溶液液面低于出液管H7的顶端，出液管L9的开关8处于关闭状态；洗脱时溶液液面与出液管H7的顶端相平，出液管L9的开关8处于关闭状态，同时进液系统处于工作状态；排;改废液时打开出液管L9的开关8，废液由出液管L9排到废液瓶10中。孵洗系统包括溶液筒11和转轴12两部分。PVDF膜13通过胶带固定在转轴12上。溶液筒11是一个外部的容器，内容纳着转轴12。如图5所示为自动蛋白杂交洗脱仪孵洗部件构造侧视简图。自动蛋白杂交洗脱仪设有多个进液管，可以分别进封闭液，洗脱液和抗体溶液等。进膜时将装有PVDF膜13的膜片托放于进膜口17,由磁膜夹16吸附在转轴12上。赙育时孵育液由相应的进液管进入孵洗腔，出液管处于关闭状态，转轴12低速旋转；洗脱时洗脱液由相应的进液管持续进入孵洗腔，出液速度与进液速度相同，从而维持孵洗腔内恒定量的洗脱液，转轴12高速旋转。实验完成后，PVDF膜由出膜口18的阀们妒出自动蛋白杂交洗脱仪。如图6所示为PVDF膜固定装置简图。PVDF膜13由两端的磁膜夹16固定在膜片托19上，然后依据磁膜夹16对铁质转轴的磁力而吸附于其上。实施例3:如图2所示，PVDF膜通过胶带固定在转轴上，封闭液或抗体溶液通过进样系统进入溶液筒和转轴之间的空隙腔中，其液面低于出液管H的顶端，出液管L的开关处于关闭状态。进样后关闭恒流泵。调节调速开关，使转轴以2—10转/分钟的低速旋转，图中以空心箭头表示。孵育结束时将出液管L的开关打开，使孵育液通过出液管L排放到废液瓶中。实施例4:如图3所示为蛋白杂交洗脱仪洗脱状态实施例。出液管L的开关处于关闭状态，洗脱液通过进样系统进入溶液筒和转轴之间的空隙腔中，当液面到达出液管H的顶端时，多余的洗脱液由出液管H排放到废液瓶。调节调速开关，使转轴以100~_200转/分钟的高速旋转，图中以双空心箭头表示。在整个洗脱过程中恒流泵持续处于工作状态，这样新的洗液不断进入，多余的洗液不断排出，从而实现了连续洗脱。图中实心箭头所示为洗液流动方向。洗脱结束时将出液管L的开关打开，使洗脱液通过出液管L排放到废液瓶中。实施例5:如图4所示为评价实验结果图。样品为重组HLA-A*0181重链分子，一抗为HC-10,1:10000稀释于PBST中。二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，1:10000稀释于PBST中。常规(RM)方法和蛋白杂交洗脱(IW)方法的具体操作在下表中对照列出。图中1、2和3泳道所加样品量分别为lpL、2pL和3pL。图A中所用底物为Pico级，曝光时间为118秒。图B中所用底物为96%的Pico级加4%的Femto级，曝光时间为18秒。评价实验结果显示，与常规方法相比，蛋白杂交洗脱仪孵洗方法的曝光背景底，杂交信号强，说明杂交效率高。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1.一种自动蛋白杂交洗脱仪，其特征在于由孵洗系统、进样系统、出样系统和动力系统组成，其中孵洗系统包括溶液筒(11)和转轴(12)，转轴(12)设于溶液筒(11)内；进样系统包括进液管(1)、恒流泵(2)和试剂容器(3)，进液管(1)一端与溶液筒(11)上部相连，另一端通过恒流泵(2)与试剂容器(3)相连；出样系统包括出液管H(7)、出液管L(9)、开关(8)和废液收集器(10)，出液管H(7)和出液管L(9)的一端分别与溶液筒(11)下部相连，另一端与废液收集器(10)相连，开关(8)设于出液管上；动力系统包括电动机(4)、调速开关(5)和电源(6)，电动机(6)由调速开关(5)控制，并与转轴(12)相连。2.根据权利要求1所述的自动蛋白杂交洗脱仪，其特征在于所述转轴(12)为磁性金属材料。3.根据权利要求1所述的自动蛋白杂交洗脱仪，其特征在于所述孵洗系统可与若干进样系统连接。4.根据权利要求1所述的自动蛋白杂交洗脱仪，其特征在于所述溶液筒上分设有进膜口(17)和出膜口(18)。5.根据权利要求1所述的自动蛋白杂交洗脱仪，其特征在于所述溶液筒上部分别与第一进液管(14a),第二进液管(14b)，第三进液管(14c)和第四进液管相连(14d)。6.根据权利要求1所述的自动蛋白杂交洗脱仪，其特征在于所述转轴上设有膜固定装置，膜固定装置上设有磁膜夹(16)和膜片托(19),磁膜夹(16)设在膜固定装置的两端。全文摘要一种自动蛋白杂交洗脱仪，其特征在于由孵洗系统、进样系统、出样系统和动力系统组成，其中孵洗系统包括溶液筒和转轴，转轴设于溶液筒内；进样系统包括进液管、恒流泵和试剂容器，进液管一端与溶液筒上部相连，另一端通过恒流泵与试剂容器相连；出样系统包括出液管H、出液管L、开关和废液收集器，出液管H和出液管L的一端分别与溶液筒下部相连，另一端与废液收集器相连，开关设于出液管上；动力系统包括电动机、调速开关和电源，电动机由调速开关控制，并与转轴相连。该洗脱仪在抗体量少时也不影响结果，能够做到规模化大批量蛋白杂交的自动蛋白杂交洗脱仪。文档编号G01N33/68GK101153874SQ20071013140公开日2008年4月2日申请日期2007年8月28日优先权日2007年8月28日发明者孟凡岩,张建琼,沈传来,维谢申请人:东南大学