专利名称：一种内源性多肽在线富集和自动化分析的方法及专用装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对生物样品中(体液、组织提取物等)内源性多肽的在线富 集和自动化分析的方法，具体的说是发展了一种操作简单，使用方便，无人监管 的样品预处理和分离检测的方法，集成了样品的提取富集，色谱分离和质谱检测 的方法。
背景技术：
多肽组学是近年来发展起来的一个研究领域(Schrader， M. ; Schulz-Kn印pe， P. Trends Biotechnol. 2001， 19, S55-S60)，由于蛋白质组学主要关注分子量 一万以上蛋白，而代谢组学则侧重于分子量在一千一下的小分子代谢物， 一直以 来，介于蛋白质组和代谢组之间的多肽被生物学家所认为无用的信息而被忽略。 2002年，Lancet杂志发表了一篇禾,内源性多肽和低分子量蛋白进行卵巢癌诊断 的文章(Petricoin， E. R ; Ardekani， A. M. ; Hitt, B. A. ; Levine， P. J. ; Fusaro, V. A. ; Steinberg, S. M. ; Mills, G. B. ; Simone， C. ; Fishman， D. A. ; Kohn， E. C. ; Liotta， L. A. Lancet 2002， 359， 572-577)，揭示出血清多肽组魏模 式与临床症状密切相关，从而多肽组学引起了人们的广泛的关注。和蛋白质相比， 对多肽的鉴定无需进行酶解就可以直接进行质谱分析，大大减少了操作歩骤而具 有操作简单，重复性好的特点。然而由于生物样品中存在大量的高丰度蛋白质， 如血清中蛋白含量高达60-100mg/mL,而其中的内源性多肽只占其中的很小一部 分，从而使得多肽的提取非常困难。传统的提取多肽方法如有机溶剂沉淀、固相 萃取、超滤等(Zheng, X. Y. ; Baker， H. ; Hancock, W. S. J. Chromatogr. A 2006， 1120， 173—184， Aristoteli， L. P. ; Molloy， M. P. ; Baker， M. S. J. Proteome Res. 2007, 6， 571-581)，这些方法都是离线进行的，有着样品消耗量大，操作 步骤烦琐等缺点。
P腿介质是一种混合模式固定相，即具有体积排阻和色谱吸附(反相、离子 交换等)的双重功能，这类吸附齐胴时兼具针对大分子的体积排阻功能和针对小 分子分析物的萃取功能。生物样品中的大分子蛋白不能进入吸附剂的内孔中去， 同时亲水性的外表面保证了生物大分子在吸附齐啲外表面不会发生不可逆的变性 和吸附，而同时其内孑L表面通过反相或离子交换机理对小分子进行吸附(Hagestam， I. H. ; Pinkerton， T. C. Anal. Chem. 1985， 57, 1757—1763)，已经被广泛应 用于体液样品中药物的直接进样分析(Boos， K. S. ; Grimm, C. H. Trac-Trends Anal. Chem. 1999, 18, 175-180)。由于大部分药物是疏水性的，C18的P腿介 质被广泛使用，今年来Merck公司开发了离子交换性质的限进介质，而由于只有很少的药物能在离子交换限进介质上进行保留，其没有得到广泛的使用。由于多 肽分子是带电荷的可以在离子交换介质上保留，所以离子交换型限进介质在多肽 样品的富集方面得到了研究者的关注，已有报道将离子交换型P腿介质对多肽样
品进行富集(Wagner， K. ; Miliotis， T. ; Marko-Varga， G. ; Bischoff， R. ; Unger， K. K. Anal. Chem. 2002， 74， 809-820)，然而所报道的系统是基于常规液相色 谱系统的，没有和质谱在线联用，而且系统采用了复杂的阀切换系统，操作复杂， 其他实验^^隹以重复，而且由于系统管路复杂，死体积较大，不會腿行毛细管液 相色i普质谱的分析，只能用常规的液相色谱进行操作。
发明内容
本发明采用卩腿介质作为预柱，在这里预柱起到两个作用对内源性多肽的 富集和作为自动进样的预柱，本发明的目的在于可以实现样品预处理和分离分析 的在线进行。卩腿介质预柱在对样品中的内源性多肽进行提取后，通过台阶梯度 的形式洗脱到反相柱上，然后进行梯度分离和质谱分析。由于该系统采取台阶梯 度的洗脱方式，所以大大简化了实验装置，操作简便，而且由于实验装置的简化， 可以采用毛细管柱的系统，有着样品消耗少，灵敏度高的优点。
为实SUd述目的，本发明采用的技术方案为
一种内源性多肽在线富集禾口自动化分析的方法，禾,P艮进介质独特的保留小 分子多肽而排出大分子蛋白的性质对内源性多肽进行在线富集，采用体积浓度
0-5%的甲酸或乙酸的水溶液将样品通过限进介质预柱进行富集，采用含有 10mM-2000mM盐浓度pH值为1-4的缓冲溶液将预柱中富集的样品洗脱到反相柱头 上，将反相柱头的样品采用体积浓度0%到100%水/乙腈或水/甲醇进行分离和质谱 检测。
所述含有10mM-2000mM盐浓度pH值为1_4的缓冲溶液对预柱中富集的样品进 行一次或一次以上的洗脱和反相分离；所述将预柱中富集的样品洗脱至阪相柱头 上，洗脱过程可为台阶梯度洗脱，台阶梯度洗脱的浓度间隔可以是lOmM到1000mM。
戶/M方法的专用装置，由自动进样器、液相色i普泵、微型三通、P腿介质预 柱、六通阀、微型四通、反相分离柱、质谱、废液池组成，液相色谱泵经自动进 样器通过毛细管与微型三通的一个端口相连，微型Hffi的另外两个端口分别接限 进介质预柱的一端和六通阀的c位；限进介质预柱的另一端接微型四通的一个端 口，微型四通的另三个端口分别接Pt电极、反相分离柱的入口端和六通阀的e 位，反相分离柱的出口端接质谱；b位和f位分别与废液池相连；当样品富集时，六通阀的a位禾口 b位相连，c位禾口 d位相连，e位禾口 f位相连， 当样品洗脱和分离时，六通阀的b位和c位相连，d位和e位相连，a位和f 位相连。
本发明的有益效果是
本发明采取毛细管的卩,介质预柱，采取台阶梯度进行洗脱，大大简化了实 验装置，其不但可以和质谱进行在线联用，而且具有操作简单，样品消耗少，可
进行多维分离等特点。
本发明是一种利用限进介质作为预柱的内源性多肽在线富集和自动分析系 统，该系统消除了离线操作模式所带来的费时费力、重复性差、样品损失大等缺 点。推动了采用纳升级毛细管柱高效液相色谱与串联质谱联用进行大规模高效鉴 定多，太的方法的发展。
图1为在线富集和自动化分析系统装置图2为限进介质工作的原理图，图中11为磺酸基阳离子交换型内表面，12 为二醇基亲水性外表面，13为样品中的低分子量多肽，14为样品中的大分子量蛋
白，15为废液池；
图3为富集得到的多肽样品和排除掉的大分子量蛋白MALDI-T0F MS图谱； 图4为一维分离所得到的色谱图； 图5为多维分离所得到的色谱图。 具体实船式
下面用具体实施例说明本发明，但它们不X寸本发明作任何限制。
1.在线富集和自动化分析系统的构建
具体应用过程如下，
1) 量取IO cm长、内径为150 Mm的毛细管，。毛细管内用粒径5 Mm大小的 离子交换型P腿介质固定相(Lichrosphe 60XDS， Merck， Darmstadt, Germany) 填充长约2 cm的预柱；
2) 量取20 cm长、内径为75 Mm的毛细管，其一端烧制成约5 Mm的尖端， 作为电喷雾喷针使用。毛细管内用粒径5Mm、孑L径100 A大小的反相C18固定相 填充长约12 cm的分离柱；
3) 在线富集和自动化分析系统装置构建及流程如图1所示。这个系统由自动 进样器、六通阀、微型三通和微型四通组成。限进介质预柱通过微型四通与反相
5C18分离柱相连。电喷雾喷针上所需的电压通过微型四通上连接的铂丝提供。通 过自动调节六通阀来控制在线富集和分离模式。
戶;M方法的专用装置，由自动进样器l、液相色i普泵2、微型三通3、 P腿介 质预柱4、六通阀5、微型四通6、反相分离柱7、质谱8、废液池9组成，液相 色谱泵2经自动进样器1通过毛细管与微型HM 3的一个端口相连，微型Hil 3 的另外两个端口分别接限进介质预柱4的一端和六通阀5的c位；「)腿介质预柱 4的另一端接微型四通6的一个端口，微型四通6的另三个端口分别接Pt电极10、 反相分离柱7的入口端和六通阀5的e位，反相分离柱7的出口端接质谱8; b 位和f位分别与废液池9相连；
当样品富集时，六通阀5的a位和b位相连，c位和d位相连，e位和f位相
连，
当样品洗脱和分离时，六通阀5的b位和c位相连，d位和e位相连，a位禾口 f位相连。
2.在线富集和自动化分析系统在在多肽组学分析的应用 具体应用过程如下
在线富集和自动化分析系统①六通阀阔在虚线位置时，在分流后分析柱上 箭速为200nL/min状态下平衡自动进样系统。此时流动相的组成为0. 1%甲酸； ②六通阀阀转换至实线位置时，利用IO A/min流速下，将20 A的样品上载到 P腿介质预柱上J腿介质工作原理如图2所示，由于大分子量的蛋白不能进入限 进介质的孑L道内，此时大分子量的蛋白从排空柱流出，而分子量较小的多肽被保 留在卩腿介质预柱上。(D六通阀阀转换至虚线位置时，在分流后分析柱上的涼遞 为200nL/min状态下，低分子量的多肽样品从卩腿介质预柱洗脱到分离柱上。此 时流动相组成为1000 mM乙酸铵(pH3);④六通阀阀保持在虚线位置，在分流后 分析柱上,速为200nL/min状态下，样品采用梯度洗脱法分离。
实施例1.
1. 血清样品的制备血清样品用去离子水稀释10倍后用0. 22 Mm的膜进行过 滤后备用。
2. 血清在线富集和自动化分析
(l)在线富集和自动化分析系统①六通阀在虚线位置时，在分流后分析柱 上流速为200nL/min状态下平衡自动进样系统10分钟。此时流动相的组成为0. 1%
6甲酸；②六通阔转换至实线位置时，禾佣10 ri7min流速下，将20 的样品上 载到限进介质预柱上，进样时间10分钟。此时大分子量的蛋白不被保留，均从排 空柱流出，如图3a所示；③六通阀转换至虚线位置时，在分流后分析柱上的流速 为200nL/min状态下，样品从卩腿介质预柱洗脱到分离柱上。此时流动相组成为 1000rnM乙酸铵(pH3)，洗脱时间10分钟，不接分离柱，直接将样品收集所得样 品做MALDI-TOF MS分析，可见肽段被洗脱下来，如图3b所示；④六通阀保持在 虚线位置，在分流后分析柱上流速为200nL/min状态下，先用0. 1%甲酸平衡10 分钟，然后样品采用梯度洗脱法分离，实验重复三次，所得色谱图如图4所示， 可见样品得到良好的分离和较好的重复性。
(2)多维色谱的自动化分析系统①，②同上；③阀转换至虚线位置时，在 分流后分析柱上的,魂为200nL/min状态下，样品从卩KS介质预柱洗脱到分离柱 上，然后采用50mM乙酸铵(pH3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上分离；然后采 用100mM乙酸铵(pH3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上分离；然后采用150mM 乙酸铵(pH 3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上分离；然后采用200 mM乙酸铵(pH 3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上分离；然后采用250mM乙酸铵(pH3)，洗脱 时间10分钟，在分析柱上分离；然后采用300 mM乙酸铵(pH 3)，洗脱时间10 分钟，在分析柱上分离；然后采用350mM乙酸铵(pH3)，洗脱时间10分钟，在 分析柱上分离；然后采用400mM乙酸铵(pH3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上 分离；然后采用450mM乙酸铵(pH3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上分离；然 后采用500 mM乙^l安(pH 3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上分离；然后采用 1000 mM乙酸铵(pH 3)，洗脱时间10分钟，在分析柱上分离。
在分析柱上分离过程为 阀保持在虚线位置，在分流后分析柱上流速为 200nL/min状态下，先用0. 1%甲酸平衡10分钟，然后样品采用梯度洗脱法分离； 每次分离结束后返回(Da行盐的台阶梯度洗脱，11次反相分离所得色谱图如图5 所示，ll个台阶梯度洗脱的色谱图各不相同，正交性良好，样品得到充分分离。
权利要求
1. 一种内源性多肽在线富集和自动化分析的方法，其特征在于利用限进介质独特的保留小分子多肽而排出大分子蛋白的性质对内源性多肽进行在线富集，采用体积浓度0-5％的甲酸或乙酸的水溶液将样品通过限进介质预柱进行富集，采用含有10mM-2000mM盐浓度pH值为1-4的缓冲溶液将预柱中富集的样品洗脱到反相柱头上，将反相柱头的样品采用体积浓度0％到100％水/乙腈或水/甲醇进行分离和质谱检测。
2. 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述含有10mM-2000mM盐浓度 pH值为1-4的缓冲溶m预柱中富集的样品进行一次或一次以上的洗脱和反相分 离。
3. 按照权禾腰求2所述的方法，其特征在于所述将预柱中富集的样品洗脱 到反相柱头上，洗脱过程可为台阶梯度洗脱，台阶梯度洗脱的浓度间隔可以是 lOmM到1000mM。
4. 一种权利要求1所述方法的专用装置，其特征在于其由自动进样器(1 )、 液相色谱泵(2)、微型三通(3)、 P腿介质预柱(4)、六通阀(5)、微型四通(6)、 反相分离柱(7)、质谱(8)、废液池(9)、 Pt电极(10)组成，液相色谱泵(2) 经自动进样器(1)通过毛细管与微型HM (3)的一个端口相连，微型三通(3) 的另外两个端口分别接P腿介质预柱(4)的一端和六通阀(5)的c位；P腿介 质预柱(4)的另一端^m型四通(6)的一个端口，微型四通(6)的另三个端口 分别接Pt电极(10)、反相分离柱(7)的入口端和六通阀(5)的e位，反相分 离柱(7)的出口端接质谱(8); b位和f位分别与废液池(9)相连；当样品富集时，六通阔(5)的a位和b位相连，c位和d位相连，e位禾口f 位相连，当样品洗脱和分离时，六通阀(5)的b位和c位相连，d位和e位相连，a 位和f位相连。
全文摘要
本发明提供了一种内源性多肽在线富集和自动化分析的方法及专用装置，利用限进介质独特的保留小分子多肽而排出大分子蛋白的性质对内源性多肽进行在线富集，采用体积浓度0-5％的甲酸或乙酸的水溶液将样品通过限进介质预柱进行富集，采用含有10mM-2000mM盐浓度pH值为1-4的缓冲溶液将预柱中富集的样品洗脱到反相柱头上，将反相柱头的样品采用体积浓度0％到100％水/乙腈或水/甲醇进行分离和质谱检测。本发明采取毛细管的限进介质预柱，采取台阶梯度进行洗脱，大大简化了实验装置，其不但可以和质谱进行在线联用，而且具有操作简单，样品消耗少，可进行多维分离等特点。
文档编号G01N30/02GK101464430SQ20071015910
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月21日 优先权日2007年12月21日
发明者叶明亮, 胡良海, 蒋小岗, 邹汉法 申请人:中国科学院大连化学物理研究所