专利名称：：一种动物同位素指纹的检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物同位素指纹的检测方法及该方法在追溯动物生活史和/或来源地中的应用。技术背景同位素指纹是指不同种类同位素的含量及其比率。生物体中同位素指纹受气候、环境、生物代谢类型等因素的影响而发生自然分馏效应，从而使不同来源的物质中同位素自然丰度存在差异。这种差异携有环境因子的信息，反映生物体所处的环境条件。生物体中稳定性同位素组成是物质的自然属性，可作为物质的一种"自然指纹"，区分不同来源的物质。换言之，生物体中同位素指纹是外部环境在生物体中打下的"烙印"。因此，生物体中的同位素指纹分析能为其来源提供一种科学的、独立的、不可改变的身份鉴定信息。但以动物肉样品为材料，利用同位素技术对动物产地溯源的研究常存在一些困难，如肉样品采样比较困难，需要屠宰动物，而且动物经常不在同一地域生长，仅利用肉不能研究动物的喂养历史或者生活史，不利于建立快速、简便的动物生活史追溯技术。食品追溯体系是食品安全风险管理的有效措施之一，有利于在疫病疫情或食源性污染等事件发生时，迅速找到污染源，切断污染途径，防止食源性疾病扩散，并且能迅速、准确地召回不安全食品，有利于不安全食品的召回，以减少经济损失，增加消费者信心。近年来，疯牛病、口蹄疫、禽流感等动物疫病严重爆发，给各国的经济和政府管理体系带来严重影响。因此，追溯动物的迁徙路径和生活史显得尤为重要。目前，国际上主要采用编码系统记录动物的来源和迁徙路径，但在实际应用中还存在一些局限，如由于动物标签的丢失、反复记录过程中出现差错、一些标记图案的模糊不清等客观原因，以及受利益驱动，生产者故意改换标签等主观原因的影响，会导致信息链中断，发生可跟踪性丢失，或者导致欺诈和不确定性，从而使其来源不清。在这些情况下，就需要一套合适的分析技术和方法监督、检查并证实产品的实际来源
发明内容本发明的目的是提供一种检测动物同位素指纹的方法及其应用。本发明所提供的检测动物同位素指纹的检测方法，是通过检测动物尾毛中稳定性同位素的组成，获得可反映动物所处环境的同位素指纹数据。所述方法中，所述检测动物尾毛中稳定性同位素的组成为将动物尾毛分成生长区段，检测动物尾毛不同生长区段的稳定性同位素的组成。可根据需要检测尾毛根部区段的稳定同位素组成，获得反映动物近期生长环境的动物同位素指纹数据，或者依次检测不同生长区段的尾毛，获得反映动物不同生长时期所处环境的动物同位素指纹数据。所述方法中，所述稳定同位素的组成可为S13C值和/或515N值。所述方法中，所述动物优选为牛。上述方法可应用于追溯动物的词料喂养史和/或来源地；其中，追溯动物的饲料喂养史的方法包括下述步骤-1)检测含不同C4植物比例的饲料喂养的动物尾毛的S"C值，建立饲料中C4植物比例与S13C值的相关关系数据库，并建立回归预测模型；2)利用上述检测动物同位素指纹的检测方法，检测待测动物的同位素指纹，根据步骤1)所述的回归预测模型分析待测动物的饲料中的C4植物比例。追溯动物的来源地的方法可包括下述步骤1)检测在不同地域生活的动物尾毛的S值，建立不同地域动物尾毛的S'5N值的数据库；2)利用上述检测动物同位素指纹的检测方法，检测待测动物的同位素指纹，根据步骤1)所述的数据库分析待测动物是来自牧区还是农区。所述追溯动物的来源地的方法还可包括下述步骤1)检测在不同地域生活的动物尾毛的s"c值和s、值，建立不同地域动物尾毛的S"C值和5,值的数据库；2)利用上述检测动物同位素指纹的检测方法，检测待测动物的同位素指纹，根据步骤l)所述的数据库分析待测动物的来源地。本发明的方法是以动物尾毛为分析样品，检测其中稳定性同位素组成数据，即动物同位素指纹数据，实验证明该数据与动物饲料中的C4植物配比和来源地具有极密切的关系，并且证明动物尾毛中的同位素信息受动物个体因素影响很小，动物尾毛中的同位素信息主要与饲料种类和地域来源有关；说明本发明的方法检测得到的稳定同位素组成数据可准确反映动物的饲料喂养历史和来源地。实验还证明，动物尾毛一旦长成，不再与其他部分进行交换，每段毛发记录的同位素信息反映的是当时的生长环境信息；即本发明的方法可以通过对尾毛的分区段分析检测不同生长时期动物尾毛的稳定同位素组成，分析动物饲料或生长环境的改变。实验证明本发明的方法检测牛尾毛根部的同位素指纹数据(反映近期动物生活环境的同位素指纹数据)与所取动物肌肉、粗脂肪进行同位素指纹分析的结果呈极显著相关关系，利用此相关关系可建立利用动物尾毛根部同位素指纹预测肌肉、粗脂肪组织中同位素指纹的预测模型；即本发明的方法可以通过对动物尾毛根部稳定同位素的检测分析，并利用动物尾毛与动物肌肉、粗脂肪之间的同位素指纹预测模型，建立动物肌肉、粗脂肪中同位素指纹数据库，用于肉品的地域溯源。综上所述，本发明的方法具有取材方便，信息准确，并且可以获得动物不同生长时期的稳定性同位素组成信息。通过本发明方法获得的数据可以快速、简便的对动物的生活史进行追溯分析，并获得可靠的结果。图1为牛尾毛取样方案示意2为不同喂养阶段的牛尾毛段位S13C值变化趋势图3为不同喂养阶段的牛尾毛段位S15N值变化趋势具体实施方式实施例l、牛同位素指纹检测方法的建立1、各区段牛尾毛中同位素指纹受其生长时期喂养伺料配比的影响实验2006年3月，从吉林省榆树市五棵树镇经济开发区牛交易市场购买9头10~12月龄的牛犊，编号为1号-9号。购买牛犊后，在每头牛的尾部选一部位紧贴皮层剪取牛尾毛，作为初始的牛尾毛样品。再按照不同的饲料配比分3个阶段喂养，每个阶段喂养3个月(具体饲料配比见表l)。每个阶段结束后屠宰其中3头牛，自l号一9号依次屠宰(每头牛的具体信息及饲养信息见表2)。在前一阶段剪取牛尾毛的部位取牛尾毛样品，测量其长度，保存待分析。并取该阶段的饲料样品以及牛组织样品(脱脂肌肉、粗脂肪)。表1.不同阶段喂养牛的饲料配比<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>牛尾毛样品按照每月的平均生长速度(表3)分段取样，取样方法如图1所示，即从尾毛根部取每个月生长的区段作为样品。利用同位素比率质谱仪(型号为DELTAPlusThermoFinnigan)检测样品中S"C96。值和S"N96。值，分析不同段位牛尾毛中同位素组成受个体、饲料等因素影响的变化规律。513(:值检测结果如图2所示，S"N值检测结果如图3所示，结果表明，从每头牛不同段位牛尾毛的S"C、S值随喂养时间的变化趋势图中可以看出，随着饲料成分的改变，不同段位牛尾毛的S13(3、S"N值有很大差异，这种差异证实牛尾毛一旦长成，不再与其它部分进行交换，每段毛发记录的饲料信息为当时生长的饲料信息，它是记录牛饲料改变信息的档案库，这说明利用牛尾毛可以追溯牛的喂养历史。而且随着相同伺料喂养时间的延长，不同个体牛尾毛中的同位素组成差异减小，不同牛的相同区段的牛尾毛的5"C、S"N值差异减小，这说明饲料对牛尾毛中S^C、S"N值的影响远大于个体对其的影响。所以可以利用牛尾毛的不同生长区段检测该牛整个生长时期的不同生长阶段的同位素指纹，这种同位素指纹与其各个生长阶段喂养饲料中C4饲料占的比例密切相关。表3.牛尾毛每月平均生长速度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、各区段牛尾毛中同位素指纹与其脱脂肌肉、粗脂肪稳定性同位素组成的相关关系利用SAS统计分析软件，对不同段位牛尾毛、脱脂肌肉、粗脂肪之间的S1^、S"N值进行相关性分析，具体结果见表4。表4中的结果表明，不同段位牛尾毛中碳、氮同位素与脱脂肌肉、粗脂肪相关性差异很大，从根部到末端，相关性依次降低。对于碳同位素而言，距离根部1.5cm-3.0cm段位的牛尾毛S'3c值与脱脂肌肉、粗脂肪中5"C值相关性最高，而对于氮同位素，距离根部0-1.5cm段位的牛尾毛5、值与脱脂肌肉、粗脂肪中S值相关性最高，且均达到极显著水平。可见，牛尾毛一般在距离根部0—3cm段位与肌肉组织中碳、氮同位素相关性较高。这说明可以利用此段牛尾毛中的碳、氮同位素为研究材料，预测肌肉中的同位素组成，进而追溯牛肉的来源。综上所述，牛尾毛可以代替牛肉为研究材料，建立追溯牛或牛肉来源的数据库。表4.牛尾毛与牛组织S"C、5相关系数<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(r7.n分别表示自由度为7和4的相关系数临界值，"表示有极显著相关性，'表示有显著相关性)3、牛尾毛中同位素指纹与牛的地域来源和来源地饲料的相关性分析从不同地域取牛尾毛样品和饲料样品，分析不同地域牛尾毛、饲料中同位素组成差异。具体方法为检测不同地域来源牛尾毛(样本数见表5)、饲料样品中的S13C、S,值，利用SAS统计分析软件进行Duncan极差多重比较分析，具体结果见表5和表6。结果表明，不同地域牛尾毛中S13C、S、值有极显著差异，这主要与不同地域喂养牛的主饲料种类有极显著差异(表6)有关。牛尾毛中的513(:值主要与饲料种类有关，尤其与C4植物与C3植物所占的比例有关。从牧区(贵州、河北)和农区(吉林、宁夏)来源的牛尾毛中S'5N值有极显著差异(表5)，这说明S、值可区分牧区与农区喂养的牛。表5.不同地域牛尾毛中同位素比值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表中的不同大写字母表示有极显著差异(P<0.01)，不同小写字母表示有显著差异(P<0.01)表6.不同地域牛主词料中的S，值和S、值<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4、本发明检测动物同位素指纹方法的建立上述实验表明，可以通过检测不同生长区段牛尾毛的同位素组成，反映其在该段牛尾毛生长时期的外部环境及饲料(C4、C3植物配比)的情况，因此建立一种检测动物生长各阶段的同位素指纹的方法，即为检测不同生长区段动物尾毛的C、N稳定性同位素组成。利用本发明的动物同位素指纹分析方法可以正确追溯动物喂养历史和地域生活史。实施例2、本发明检测动物同位素指纹方法的应用效果验证1、利用本发明检测动物同位素指纹的方法预测牛词料中C4植物饲料所占的比例分析C4植物饲料所占比例与该喂养条件下生长的牛尾中S"C(具体数值见表7，此数据从前面牛模型试验和不同地域牛尾毛同位素分析结果中得出)的相关关系，结果表明它们之间具有极显著相关性，相关系数为0.961(P<0.01)。进而用SAS数理统计软件进行回归分析，建立牛尾毛中S13C值与饲料中G植物所占比例的关系方程，具体如下Y=-12.19X2+23.15X-22.79(R2=0.992，P<0.01)式(1)式(1)中，Y为牛尾毛中S"C值；X为饲料中C4植物词料所占的比例表7.C4植物饲料所占的比例及牛尾毛的S"C值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>方程(1)经过检验，达到极显著水平，且其决定系数R2为0.992，这说明所建的回归方程预测效果比较好。当牛尾毛中S"C值已知时，对方程(1)进行求解得到方程(2)，利用方程(2)可预测出词料C4植物所占的比例。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(2)对此方程进行回代检验，具体结果见表8，预测值和实际值非常接近。这说明本发明方法检测的牛同位素指纹数据能比较好地预测牛饲料中C4植物所占的比例。表8.牛尾毛中S13C值及C4饲料比例预测值和实际值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、利用本发明检测动物同位素指纹方法对牛来源于牧区还是农区的正确判别率分别从代表牧区的内蒙和代表农区的吉林取牛尾毛样品32和30个，检测其中的S'5N值。然后从每个地域随机选取67%的样本作为训练样本建立判别模型，33%作为盲样代判，即从内蒙和吉林分别随机选取10个样本作为盲样，用SAS数据分析软件进行判别分析。判别分析是根据若干因素对预报对象进行分类的一种方法，通过分析可建立用于定性预报的数学模型。本章研究采用距离判别分析方法。距离判别分析方法简单直观，有四个步骤①计算出K个类别的方差协方差矩阵的逆阵。②计算出各个训练样本到K个类别的马氏距离，并进行比较，把训练样本归到距离最短的类中。③计算判别错误的样本数占总样本数的百分率，即错判率，如果错判率太大，说明要么原来的分类不可靠，因而用它的信息发展出来的判别结果也不会可靠；要么尽管原来的分类是正确的，但用距离判别得不到正确的结果。这样，在使用下一步的判别结果要特别小心。④如果还有新的带判样本，计算各个新样本到这K个类别的马氏距离，比较K个距离，把新样本归到距离最短的类中。具体结果见表9。20个盲样中有5个样本被错判，其中内蒙样本被错判3个，吉林样本被错判2个，整体正确判别率为75%。这说明本发明方法检测的牛同位素指纹数据对牛来源于牧区还是农区的正确判别效果比较好。表9.氮同位素指标对牛来源牧区和农区的正确判别率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>3、利用本发明检测动物同位素指纹方法对牛产地来源的正确判别率从内蒙、吉林、陕西分别取牛尾毛样品32个、30个、45个，检测其中的S"C、S"N值。然后从每个地域随机选取67%的样本作为训练样本建立判别模型，33%作为盲样代判，即从内蒙和吉林分别随机选取10个样本作为盲样，从陕西随即选取15个样本作为盲样代判，用SAS数据分析软件进行判别分析(判别分析方法同步骤2)，具体结果见表IO。牛尾毛中S"C和S^两项指标组合能提高对牛产地来源的正确判别率，35个盲样中有7个样本被错判，其中内蒙4个样本被错判、陕西3个样本被错判，吉林的盲样全部被正确判别，整体正确判别率为80%。这表明本发明方法检测的牛同位素指纹数据对牛产地来源的正确判别效果比较好。表10.牛尾毛同位素指标对牛肉产地的正确判别率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>综上所述，利用本发明的同位素指纹分析方法可以追溯牛的生活史和地域来源。权利要求1、一种动物同位素指纹的检测方法，是检测动物尾毛中稳定同位素的组成。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测动物尾毛中稳定同位素的组成为将动物尾毛分成生长区段，检测动物尾毛不同生长区段的稳定同位素的组成。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述稳定同位素的组成为S"C值和/或S"N值。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述动物为牛。5、权利要求l一4中任意一项所述检测动物同位素指纹的检测方法在追溯动物的词料喂养史和/或来源地中的应用。6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述追溯动物的饲料喂养史的方法包括下述步骤1)检测含不同C4植物比例的饲料喂养的动物模型的尾毛的s13c值，建立词料中C,植物比例与S13C值的相关关系数据库，并建立回归预测模型。2)利用权利要求1一4中任意一项所述检测动物同位素指纹的检测方法，检测待测动物的同位素指纹，根据步骤l)所述的回归预测模型分析待测动物的饲料中的G植物比例。7、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述追溯动物的来源地的方法包括下述步骤-1)检测在不同地域生活的动物模型尾毛的S、值，建立不同地域动物尾毛的S"N值的数据库；2)利用权利要求1一4中任意一项所述检测动物同位素指纹的检测方法，检测待测动物的同位素指纹，根据步骤l)所述的数据库分析待测动物是来源于牧区还是农区。8、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述追溯动物的来源地的方法包括下述步骤1)检测在不同地区生活的动物模型的尾毛的s'3c值和s、值，建立不同地域动物尾毛的513C值和515N值的数据库；2)利用权利要求1一4中任意一项所述检测动物同位素指纹的检测方法，检测待测动物的同位素指纹，根据步骤l)所述的数据库分析待测动物的来源地区。全文摘要本发明公开了一种动物同位素指纹的检测方法及其应用。该方法是检测动物尾毛中稳定同位素的组成。所述检测动物尾毛中稳定同位素的组成为将动物尾毛分成生长区段，检测动物尾毛不同生长区段的稳定同位素的组成。所述稳定同位素的组成为δ<sup>13</sup>C值和/或δ<sup>15</sup>N值。本发明的方法具有取材方便，信息准确，并且可以追溯动物不同生长时期的稳定性同位素组成信息。通过本发明方法获得的数据可以快速、简便的对动物生活史进行追溯分析，并获得可靠的来源地结果。文档编号G01N33/48GK101158678SQ20071017836公开日2008年4月9日申请日期2007年11月29日优先权日2007年11月29日发明者潘家荣,郭波莉,魏益民申请人:中国农业科学院农产品加工研究所