微粒的样品检测活性的确认方法

专利名称：：微粒的样品检测活性的确认方法
技术领域：
：本发明涉及适用于核酸等样品的检测的微粒的样品检测活性的确认方法和利用该确认方法的样品的定量方法以及含有该微粒的样品检测试剂本申请要求2006年7月13日在日本申请的特愿2006-192741号的优先权，并在此援引其内容。
背景技术：
：以往，关于检测作为测定对象物的样品的方法，已知有使样品与作为样品检测试剂的分散性微粒特异性地结合来检测的方法。例如，已知以浓度已知的蛋白质为标准样品来进行蛋白质定量的方法(参照专利文献1)。具体而言，例如在健康诊断等时进行的血液检查中，对各检査项目进行测定时，使用标准血清作为标准样品。另一方面，还提出了样品为核酸时的样品检测方法(参照专利文献2)，但未选定类似上述蛋白质定量法中使用的标准样品。此外，作为将核酸用作标准样品的方法，报道了例如将人工合成多核苷酸作为核酸扩增工序中的标准样品的方法(参照专利文献3)、在基因表达分析中基于基因组DNA的基因来制备标准样品的方法(参照专利文献4)。而且，在上述样品检测方法中，样品检测试剂需要具有正常的检测活性。但是，专利文献3和4中所述的标准样品用于确认在实时PCR等核酸扩增工序中的核酸扩增量。而且，根据标准样品的种类，检测信号有荧光、发光、电泳、凝集、吸光度等各种信号。专利文献3和4中所述的方法因需要改变检测方法和检测系统而存在通用性低的问题。另外，迄今为止未报道有适用于通过使作为样品的核酸与分散性微粒特异性地结合来检测的6标准样品。此外，当使用生物体来源的基因作为标准样品时，根据其保存情况以及检测工序中的条件，有可能出现分解，或难以精制，或混入杂质。如上所述，由于没有具有通用性的适用于核酸检测的标准样品，因此存在以下问题难以确认在标准样品以及样品的检测中使用的试剂是否具有正常的检测活性，并且也难以更正核酸检测值。因此，若有不会分解和混入杂质等的标准样品及其简便的使用方法或试剂盒，就能够解决上述技术问题。专利文献l:日本特开平6-167495号公报专利文献2:日本专利第3545158号公报专利文献3:日本特开2003-265190号公报专利文献4:日本特表2004-532034号公报
发明内容本发明是鉴于上述情况而完成的发明，其目的在于提供适用于以核酸等为代表的生物体相关物质的样品检测的试剂的样品检测活性的确认方法和利用该确认方法的样品定量方法以及含有该试剂的样品检测试剂盒。为了解决上述课题，本发明的第1发明是一种微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将含有2种以上配体的标准样品和含有与各配体特异性地结合的受体且光学上能够区分的2种以上的微粒进行混合，并检测生成的凝集物的光学性质。本发明的第2发明是基于上述第1发明的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，在缓冲液中进行上述标准样品与上述微粒的混合。本发明的第3发明是基于上述第2发明的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将上述标准样品与上述缓冲液混合后，向该混合液中添加上述微粒。本发明的第4发明是基于上述第2发明的微粒的样品检测活性的活性确认方法，其中，将上述微粒与上述缓冲液混合后，向该混合液中添加上述标准样品。本发明的第5发明是基于上述第14发明的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，上述微粒为磁性微粒，并对生成的凝集物施加磁力。本发明的第6发明是基于上述第15发明的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将上述标准样品和上述微粒在44(TC下进行混合。本发明的第7发明是基于上述第16的发明的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将通过微粒的样品检测活性的确认方法检测的标准样品的检测值同与该标准样品为相同种类且相同浓度的标准样品的已知检测值进行比较。本发明的第8发明是基于上述第16的发明的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，使用浓度己知的标准样品每隔任意的时间段进行微粒的样品检测活性的确认方法。本发明的第9发明是一种样品的定量方法，其中，在通过上述第16的发明的方法确认微粒的样品检测活性后，将含有2种以上与该微粒中的受体特异性结合的配体的样品和该微粒混合，并检测生成的凝集物的光学性质，然后再次进行上述微粒的样品检测活性的确认。本发明的第10发明是一种样品的定量方法，其中，用上述第16的发明的方法，使用相同种类且已知的不同的多个浓度的标准样品进行微粒的样品检测活性的确认，导出标准样品检测值与标准样品浓度之间的函数，利用将含有与该标准样品中的配体为相同种类且相同数目的配体的样品与该微粒混合时的样品检测值和所述函数，对样品进行定量。本发明的第11发明是一种样品检测试剂盒，其具备含有2种以上配体的标准样品和含有与各配体特异性结合的受体且光学上能够区分的2种以上的微粒。本发明的第12发明是一种样品检测试剂盒，其具备含有2个以上配体的2种以上混合而成的标准样品和含有与各配体特异性结合的受体且光学上能够区分的2种以上的微粒。本发明的第13发明是基于上述第11或12发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品中的配体是半抗原。本发明的第14发明是基于上述第1113发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品中的配体的种类与样品中的配体的种类相同。本发明的第15发明是基于上述第1114发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品中配体的数目和种类与样品中配体的数目和种类相同。本发明的第16发明是基于上述第1115发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品的种类与样品相同。本发明的第17所述的发明是基于上述第1116发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品中的配体由分子量为18060000的分子形成。本发明的第18发明是基于第1117发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品中的配体具有在至少0IO(TC的温度范围内与上述微粒中的受体特异性结合的能力。本发明的第19发明是基于上述第1118发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品中的配体是选自荧光物质、地高辛配基、氨基酸残基数为6以上的多肽、2个以上单糖结合而成的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、透明质酸(HA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、序列号l表示的肽以及它们的衍生物中的l种以上。本发明的第20发明是基于上述第1119发明的样品检测试剂盒，其中，在上述标准样品中含有具有链状结构的高分子物质。本发明的第21发明是基于上述第20发明的样品检测试剂盒，其中，上述高分子物质为水溶性的。本发明的第22发明是基于第20或21发明的样品检测试剂盒，其中，上述高分子物质在其主链或侧链的末端具有上述配体。本发明的第23发明是基于上述第2022发明的样品检测试剂盒，其中，上述高分子物质是选自多糖、聚乙二醇、多核苷酸、多肽、聚丙烯酸衍生物、聚丙烯酰胺、聚酯、聚醚、聚酰胺以及它们的衍生物中的1种以上。本发明的第24发明是基于上述第2023发明的样品检测试剂盒，其中，上述高分子物质主链的长度为15200nm。本发明的第25发明是基于上述第2024发明的样品检测试剂盒，其中，在上述标准样品与上述微粒的混合中使用的溶液中，上述高分子物质为直链状。本发明的第26发明是基于上述第1125发明的样品检测试剂盒，其中，上述标准样品的分子长度为样品的分子长度的80120%。本发明的第27发明是基于上述第1126发明的样品检测试剂盒，其中，以已知的不同的多个浓度具备上述标准样品。本发明的第28发明是基于上述第27发明的样品检测试剂盒，其中，上述多个标准样品的浓度为lpMl)iiM的范围。本发明的第29发明是基于上述第1128发明的样品检测试剂盒，其中，上述微粒的粒径为0.110|im。本发明的第30发明是基于上述第1129发明的样品检测试剂盒，其中，上述微粒是磁性微粒。本发明的第31发明是基于上述第30发明的样品检测试剂盒，其中，上述磁性微粒的粒径为0.120pm。本发明的第32发明是基于上述第1131发明的样品检测试剂盒，其具备在上述标准样品与上述微粒的混合中使用的溶液。根据本发明，能够简便、迅速且精度良好地对适用于以核酸等为代表的生物体相关物质的样品检测的微粒的样品检测活性进行确认。而且，能够简便、迅速且精度良好地检测样品。本发明适宜于例如对血液中或经冻结或经固定化处理的组织样品中含有的核酸、或将该核酸处理后的样品进行检测。因此，本发明可用于例如临床检查的简便化和迅速化，也可在从样品的简单检查到全自动分析中得到广泛应用。图1A是表示制备标准样品的方法的概念图。图1B是表示制备标准样品的方法的概念图。图1C是表示制备标准样品的方法的概念图。图1D是表示制备标准样品的方法的概念图。图2A是表示结合有受体的微粒的图。图2B是表示结合有受体的微粒的图。图3是表示与靶核酸连接而产生凝集时的微粒的概念图。图4A是表示两5'末端被生物素修饰的PCR产物的图。图4B是表示两5'末端被FITC修饰的PCR产物的图。图4C是表示一个5'末端被生物素修饰、另一个5'末端被FITC修饰的PCR产物的图。符号说明30标准样品31第1配体32第2配体33第1微粒331第l受体34第2微粒341第2受体具体实施例方式以下，详细说明本发明。另外，下述配体只要没有特殊说明则是指标准样品中含有的配体。在本发明中，标准样品是指含有2种以上的配体，且主要由一个分子或多个分子形成的缔合物。微粒是指分散性微粒，使用2种以上含有与标准样品中的各配体特异性结合的受体且光学上能够区分的微粒。这里，光学上能够区分具体而言是指例如颜色不同即光的吸收/反射/散射、发光、荧光等的波长不同、或粒径不同、形状不同、材质不同等。例如，即使微粒的颜色和浓度相同，若微粒的粒径不同，则光的透射率就不同，因而能够将这些微粒从光学上区分。另外，若微粒的形状不同，则光散射的程度就不同，因此能够将这些微粒从光学上区分。此外，若微粒的材质不同，则微粒的表面物性就不同，使得光学特性不同，因此能够将这些微粒从光学上区分。本发明中使用的微粒也可以采用具有多个以这里列举的要素为代表的光学上能够区分的要素的微粒。而且，微粒通过配体和受体与上述标准样品结合，一个微粒上可以结合多个标准样品，进而各标准样品又与其他微粒结合，从而使多个微粒相互连接，结果产生微粒凝集。以下，标准样品与微粒的结合只要没有特殊说明则是指通过上述配体和受体的结合。另外，在本发明中，特异性结合是指例如如DNA或RNA的互补核苷酸序列间的稳定双链的形成(杂交)、或抗原与抗体或生物素与抗生物素蛋白等那样的在特定物质间选择性地形成的、基于特异性高的分子间作用力的结合。ii而且，通过检测生成的凝集物的光学性质，确认微粒的样品检测活性是否正常。关于光学性质的检测，具体而言，例如可通过紫外可见红外区域的透射率或吸光度的测定、荧光测定、发光测定、光学显微镜观察等来进行，利用该检测值来判断微粒的样品检测活性。若微粒的样品检测活性正常，则生成的凝集物的光学性质反映应与标准样品结合的所有种类微粒的光学性质。另一方面，若生成的凝集物的光学性质未反映应与标准样品结合的微粒中任一种的光学性质，则光学性质未被反映的微粒的样品检测活性存在异常。例如，当使用颜色不同的微粒作为光学上能够区分的2种以上的微粒时，若这些微粒的样品检测活性没有异常，则生成的凝集物的颜色为这些所有微粒的颜色的混合色。但是，若任一种微粒的样品检测活性存在异常，则凝集物的颜色不是所使用的所有微粒的颜色的混合色。标准样品可根据检测对象的样品的种类来选择使用各种标准样品，优选生物体相关物质。生物体相关物质是指从生物体提取、分离等得到的物质，不仅包括从生物体直接提取的物质，还包括对它们进行化学处理或化学修饰等而得到的物质。例如，可列举出核酸、蛋白质等以及它们的化学处理物或化学修饰物等。例如，若是核酸，可列举出包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、mRNA、全RNA、hnRAN、合成RNA在内的所有核酸以及核酸类似物，可以是天然存在的核酸，也可以是人工合成的核酸。若是蛋白质，例如可列举出激素类、肿瘤标记物、酶、抗体、抗原、抗体酶、其他蛋白质、具有多个表位的蛋白质，可以是天然存在的蛋白质，也可以是人工合成的蛋白质。其中，本发明优选核酸。另外，还可以优选使用未在此列举的水溶性高分子化合物。在本发明中，标准样品是指含有与微粒中的受体特异性结合的配体的生物相关物质。含有配体的标准样品可用现有公知的方法来制备。作为一个例子，用图1对含有2种配体的核酸即标准样品30的制备方法进行说明，可列举出下述各种方法(i)针对作为对象的核酸10，使用光或铂、或通过接头使第1配体31和第2配体32与该核酸的碱基和/或5'末端共价结合的方法(图1A)，例如使核酸的5'末端的碱基的氨基与配体的羧基共价结合的方法;(ii)在核酸合成时使用结合有第1配体31的第1引物11以及结合有第2配体1232的第2引物12，利用聚合酶链反应(PCR)法延长碱基序列的方法(图IB);(iii)在PCR法中，在分别取至少1个结合有第1配体31的核苷酸13以及至少1个结合有第2配体32的核苷酸14的同时，使碱基序列延长的方法(图1C);(iv)使用末端脱氧核糖核苷酸转移酶，将结合有第l配体31或第2配体32的核苷酸在核酸的3'末端加尾的方法(图1D)等。当使用生物体样品或任意的受试物等那样的作为对象的核酸与其他核酸共存的试样时，优选上述(ii)和(iii)的方法。当作为对象的核酸单独存在时，可以使用任一方法。另外，例如生物样品等中含有的作为对象的核酸可以用PCR法扩增后用于标准样品的制备，也可以不扩增而直接用于标准样品的制备。图1所示为制备以含有2种配体的双链核酸为标准样品的例子，上述(i)和(iv)的方法也可适用于制备以含有2种配体的单链核酸为标准样品的情况。而且，(0(iv)的方法均可适用于含有2种以上配体的核酸的制备。当将核酸以外的例如蛋白质、核酸及蛋白质以外的水溶性高分子化合物等用作标准样品时，也可以通过使配体中的官能团与上述蛋白质、水溶性高分子化合物等中含有的官能团共价结合等现有公知的方法来制备标准样品。配体只要能够与微粒中的受体特异性结合即可，没有特殊限制，作为优选的配体，例如可列举出选自亲水性有机化合物、半抗原、地高辛配基、荧光素、Alexa、异硫氰酸荧光素(FITC)、2，4-二硝基苯酚(DNP)、四甲基罗丹明(TAMRA)、氨基酸残基数为6以上的多肽、2个以上单糖结合而成的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、透明质酸(HA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、序列号1表示的肽(Flag)以及它们的衍生物中的1种以上。生物素、地高辛配基、荧光素、Alexa、DNP等具有易于从市场获得且廉价的优点。另外，糖链和肽具有化学结构的设计自由度高、容易备齐多种的优点。标准样品中配体的数目可以是每种一个或多个，可根据标准样品的检测方法来选择。另外，标准样品中设置配体的位置只要不妨碍配体与受体的特异性结合即可，没有特殊限制，可考虑标准样品制备的容易性来适当选择。例如，当标准样品为核酸时，优选其5'末端部位。另外，当标准样品是由多个分子形成的缔合物时，可以仅在该缔合物中的一个分子中含有配体，也可以在多个分子中含有配体。配体优选在标准样品和微粒混合时通用的温度范围即至少0100°c的温度范围内具有与上述微粒中的受体特异性结合的能力。温度范围进一步优选为44(TC，更优选为1838'C。如后所述，利用本发明的微粒的样品检测活性的确认方法，能够对检测对象的样品进行定量。在此情况下，标准样品中配体的种类优选与样品中配体的种类相同，更优选标准样品中配体的数目和种类均与样品中配体的数目和种类相同。这样，能够更高精度地进行样品的定量。标准样品优选其中含有具有链状结构的高分子物质的样品。具体而言，可以在标准样品中含有具有链状结构的高分子物质作为其一部分，更优选标准样品本身为具有链状结构的高分子物质。在主链或侧链的末端具有上述配体的高分子物质由于容易制备，易于规定标准样品中配体的数目，因而优选使用。作为上述高分子物质，优选可列举出选自多糖、聚乙二醇、多核苷酸、多肽、聚丙烯酸衍生物、聚丙烯酰胺、聚酯、聚醚、聚酰胺以及它们的衍生物中的1种以上。作为这种高分子物质，例如可列举出在链状结构的末端结合有配体的聚乙二醇、多肽以及多糖等。另外，结合有配体的合成多核苷酸也易于制备，如上所述，通过使用在5，末端结合有配体的引物进行PCR法，可容易地得到在5'末端结合有配体的核酸。这些在5'末端结合有配体的核酸均是容易制备且标准样品中的配体数目易于规定的高分子物质的一个例子。上述高分子物质主链的长度优选为15200nm。更优选为20180nm，进一步优选为45100nm。当主链是核酸时，核酸碱基数优选为500个碱基对(bp)以下，更优选为50250bp。更优选为55200bp，进一步优选为58120bp。含有配体的分子的分子长度由于会影响配体与受体间特异性结合的形成容易性，因此当在配体结合高分子物质时，通过使主链的长度如上所述，使特异性结合容易形成。另外，在本发明中，作为标准样品，优选生物体相关物质，当将以这种生物体相关物质为代表的水溶性物质作为标准样品使用时，上述高分子物质优选为水溶性的。另外，在上述标准样品与上述微粒的混合中使用的溶液中，上述高分子物质优选为直链状。当不是直链状而例如是环状等时，配体在该溶液中很难露出，有时很难与受体特异性结合。标准样品的分子长度优选与作为检测对象的样品的分子长度为同等程度。具体而言，标准样品的分子长度优选为样品的分子长度的80120%。更优选为90110%，进一步优选为95105%。这样能够更高精度地进行样品的定量。当在抗原和抗体间等形成上述特异性结合时，配体需要为能够进行特异性结合的合适的大小。例如，优选由分子量为18060000的分子形成的配体。分子量更优选为18010000，进一步优选为1801000。本发明中使用的微粒是分散性微粒，例如如胶体粒子那样在溶液中分散的微粒，优选使用乳胶粒子，但不限于此。而且，微粒中含有与标准样品中的各配体特异性结合的受体。作为受体，例如可以使用抗体、凝集素、链霉亲和素等，但不限于这些。其中，优选使用蛋白质，特别是抗体。微粒中含有的受体可以是1种，也可以是2种以上而使微粒能够与标准样品中的多种配体结合。图2表示本发明中使用的微粒的一个例子。这里所示的为在含有第1配体和第2配体这2种配体的标准样品的检测中使用的微粒。图2A是表示只含有多个与第1配体特异性结合的第1受体331的第1微粒33的图，图2B是表示只含有多个与第2配体特异性结合的第2受体341的第2微粒34的图。另外，图2A和图2B均为俯视图，图示了第1受体331和第2受体341均为6个，但不一定限于6个。另外，第1微粒33和第2微粒34是光学上能够相互区分的微粒。微粒的粒径优选为0.1pm10.0nm。更优选为0.1pmlpm，更优选为0.1pm0.35^im。若使用这种粒径的微粒，易于得到稳定的凝集物。胶乳粒子主要由聚苯乙烯构成，与甲基丙烯酸共聚以提高亲水性和分散性。胶乳粒子分为表面上无官能团的单纯型(plaintype)和有官能团的官能团型两种。单纯型的表面的电荷因甲基丙烯酸的存在而带负电荷，能够与蛋白质分子中带正电荷的区域形成离子键。另外，还能够与蛋白质分子形成疏水键。单纯型的胶乳粒子仅通过与蛋白质混合即吸附蛋白质，因此蛋白质的固定操作容易。作为受体，可以使用后述的各种受体，当使用各种蛋白质时，如上所述，优选使用单纯型的胶乳粒子作为微粒。具有官能团的胶乳粒子设计成在表面露出羧基或氨基等的形式，可以使用各种类型的官能团型胶乳粒子。在将官能团型胶乳粒子与受体结合时，只要使官能团型胶乳粒子中的官能团与受体的官能团结合即可，可以采用现有公知的方法。例如有，用水溶性碳二亚胺使羧酸与氨基结合的EDAC法、将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)预先混合后使羧酸与氨基结合的方法、使用具有双极性的接头使氨基彼此交联的方法、将活化后的醛基或甲苯磺酰基与受体中的官能团结合的方法等。在本发明中，在不有损本发明效果的范围内可以使用现有公知的任何方法，特别优选EDAC法。而且，与单纯型的胶乳粒子同样，当使用各种蛋白质作为受体时，优选使用官能团型胶乳粒子。另外，即使是胶乳粒子以外的微粒，也可以根据微粒的种类通过现有公知的方法与受体结合。另外，关于微粒，使用光学上能够区分的2种以上的微粒，可以按照现有公知的方法赋予微粒以光学性质。例如，当使用颜色不同的微粒时，可以将预先染成各自颜色的上述材质成型来制作微粒，也可以在微粒成型后染成各自的颜色来制作。当使用粒径不同的微粒、形状不同的微粒时，可以按各自规定的粒径、规定的形状进行成型来制作。而且，当使用材质不同的微粒时，可以使用规定的材质来制作。此外，可以对上述粒径、形状、材质不同的成型后的微粒表面实施聚合物等的涂布处理。在本发明中，作为微粒，也可以使用磁性微粒。此时，通过对生成的凝集物施加磁力，使该凝集物的聚集、与溶液的分离以及多余杂质的除去变得容易，更容易进行凝集物的光学性质的确认。作为使用的磁性微粒，例如可列举出由四氧化三铁(Fe304)、三氧化二铁(Y-Fe203)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属或含有钴、镍、锰等的合金形成的磁性微粒、或在内部含有这些磁性微粒的聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯等疏水性聚合物、或聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯垸酮、聚乙烯醇、聚(丙烯酸(2-羟乙基)酯)、聚(甲基丙烯酸(2-羟乙基)酯)、聚(丙烯酸(2，3-二羟丙基)酯)、聚(甲基丙烯酸(2，3-二羟丙基)酯)、聚乙二醇甲基丙烯酸酯等交联得到的亲水性聚合物、或上述聚合物的单体的2-4种左右的共聚物等的胶乳、明胶、脂质体、或将上述磁性微粒固定化到乳胶、明胶、脂质体等表面上而得到的粒子等。使用上述方法可赋予磁性微粒以光学性质。磁性微粒的粒径没有特殊限制，但优选为0.1pm20拜。更优选为0,1]aml(om，进一步优选为0.1(im0.35|im。作为在磁性微粒上结合受体的方法，可列举出使该受体进行物理吸附的方法或使其化学担载的方法。作为物理吸附的方法，例如可列举出使受体直接吸附于磁性微粒而固定化的方法、使受体与白蛋白等其他蛋白质化学结合后吸附而固定化的方法。作为化学担载的方法，例如可列举出将存在于磁性微粒表面的氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、环氧基等各种官能团活化后，使之与受体上的各种官能团结合从而直接将受体固定在磁性微粒上的方法；通过使磁性微粒和受体通过间隔分子化学结合而固定化的方法；使受体与白蛋白等其他蛋白质化学结合后，使该蛋白质与磁性微粒化学结合的方法。这里任一种化学结合方法釆用现有公知的方法即可。另外，作为上述间隔分子，例如可列举出烷基链、聚乙二醇、聚氧乙烯、多糖、聚丙烯酸衍生物、聚酰胺等。对于在标准样品与微粒混合时生成凝集物的过程，以将含有2种配体的核酸作为标准样品使用的情况为例，结合图3进行详细说明。图3中，符号30为标准样品，标准样品30的一个5'末端结合有第l配体31，另一个5'末端结合有第2配体32。另外，符号33为第1微粒，其只含有多个与第1配体31特异性结合的第1受体331。符号34为第2微粒，其只含有多个与第2配体32特异性结合的第2受体341。标准样品30通过第1配体31与第1受体331的结合而与第1微粒33结合，通过第2配体32与第2受体341的结合而与第2微粒34结合。因此，虽然在此省略了图示，但上述第1微粒33和第2微粒34分别通过配体与受体的结合而与多个标准样品结合，上述多个标准样品又分别与第1微粒和第2微粒结合。这样，多个微粒相互连接，结果产生了微粒的凝集。另外，在图3中，从受体延伸的虚线简易地表示结合的标准样品。均图示了6个第1受体331和第2受体341,但不一定限于6个。另外，第1微粒33和第2微粒34是光学上能够相互区分的微粒，生成的凝集物是全部反映这些微粒的光学性质的凝集物。当标准样品为多种时，例如当标准样品中含有的2种以上的配体在这些每种标准样品中不同时，只要只混合含有与多种中的一种标准样品中含有的配体特异性结合的受体的微粒，即可选择性检测出该种标准样品。同样地，按各标准样品分别制备含有与标准样品中的2种以上的配体特异性结合的受体的微粒，将这些微粒用于混合，即可同时检测出多种标准样品。如上所述，只要适当选择用于混合的微粒，即可检测出一种标准样品或同时检测出多种标准样品。另外，本发明的标准样品或样品的检测是指对使标准样品或样品与微粒结合而生成的凝集物的光学性质进行检测。另外，标准样品中的2种以上的配体可以如上所述那样采用每种标准样品都完全不同的配体，也可以使2种以上的配体中的例如一种为多种标准样品间的共同配体。由此，能够简化检测工序。此外，微粒的凝集反应即使在混合2种以上的标准样品的条件下也具有特异性。因此，将2种以上的标准样品混合并用其将任意的微粒凝集时，成为凝集素的1种标准样品的反应不会被其他种类的标准样品阻碍。由此，通过混合2种以上的标准样品，可以提供能够检测、测定多种微粒的共同的标准样品。通过标准样品的共同化，能够减少样品数量和准备时间及人力。关于进行标准样品和微粒的混合时的温度、时间、使用的溶液，可考虑配体-受体的组合种类等，根据情况来适当选择。18当用生物体相关物质等水溶性物质作为标准样品时，优选使用缓冲液等水溶液。作为缓冲液，例如可列举出磷酸、Tris、HEPES、MOPS、MOPSO、CHAPS、乙酸钠、柠檬酸钠、Earle、Hanks等。并且，例如，当标准样品为核酸时，与微粒的混合优选在缓冲液中于44(TC下进行530分钟。温度范围更优选为1540°C，进一步优选为1828。C或3638。C。1828°C为室温，3638"C是生物体反应的一般性最适温度。当使用相同种类的标准样品和微粒多次进行标准样品的检测时，为了得到更高精度的检测值，标准样品与微粒的混合优选在相同条件下进行。另一方面，通过改变进行混合的时间来追踪标准样品检测值随时间的变化，还能够确认由标准样品与微粒的结合引起的凝集物生成的终点。标准样品与微粒的混合只要在溶液中进行即可，其混合方法不受特殊限制。例如，可以向溶液中添加标准样品溶液和微粒，也可以向溶液中添加标准样品溶液和微粒分散液。另外，也可以仅将标准样品溶液和微粒分散液混合。其中，优选制备标准样品溶液和微粒分散液，然后将它们用于混合。当向溶液中添加标准样品溶液和微粒分散液时，用于制备标准样品溶液和微粒分散液的溶液优选与添加它们时的溶液是同种类的。作为溶液，优选使用上述缓冲液。当将标准样品与微粒混合时，当在进行混合的溶液中的标准样品或微粒的浓度过高时，已知会发生阻碍标准样品与微粒结合的前带效应。因此，为了高精度地检测凝集物的光学性质，优选在标准样品和微粒的混合前，调节标准样品溶液和/或微粒分散液的浓度，使标准样品与微粒的结合恰当地进行。例如，具体而言，优选将标准样品与缓冲液混合并调节浓度后在该混合液中添加微粒的方法、或将微粒与缓冲液混合并调节浓度后在该混合液中添加标准样品的方法。更优选微粒以微粒分散液、标准样品以标准样品溶液的形式来使用。关于用于混合的标准样品与微粒之间的量关系，例如当微粒的浓度为0.0010.2质量％时，标准样品的浓度优选为lpMlpM。如上所述，通过将标准样品与微粒混合后检测生成的凝集物的光学性质，能够确认微粒的样品检测活性。而且，将此时的标准样品的检测值同与该标准样品为相同种类且相同浓度的标准样品的已知检测值进行比较，能够容易地确认微粒的样品检测活性。例如，针对微粒的每个制造批次，通过将使用各批次微粒时的标准样品的检测值同与该标准样品为相同种类且相同浓度的标准样品的已知检测值进行比较，能够确认制造批次间的微粒的样品检测活性有无不均。同样地，通过将使用在销售目的地保存中的微粒时的标准样品的检测值与微粒制造地所保留的标准样品的已知检测值进行比较，能够确认在销售目的地保存中的微粒的样品检测活性有无异常，从而能够预先避免使用不合格微粒。如此，本发明的样品检测活性的确认方法在微粒的品质管理上很有效。另外，通过使用浓度已知的标准样品每隔各任意的时间段进行微粒的样品检测活性的确认，能够定期地确认微粒的样品检测活性是否正常。这里，进行微粒的样品检测活性确认的时期可根据目的来任意设定。此时，如果例如在确认样品检测活性的同时，将该确认中使用的光学上能够区分的微粒分别单独地在样品检测中使用来确认检测值，当发现样品检测活性降低时，能够确定该活性降低是由哪种微粒引起的。本发明的样品检测试剂盒具备的如到目前为止所述的那样具备含有2种以上配体的标准样品和含有与各配体特异性结合的受体并光学上能够区分的2种以上的微粒。优选微粒为微粒分散液的形式，标准样品为标准样品溶液的形式。而且，优选还同时具有在标准样品与微粒的混合中使用的溶液。若使用这种样品检测试剂盒，则无需每次制备标准样品和微粒，能够简化微粒的样品检测活性的确认步骤、样品的定量步骤。另外，样品检测试剂盒优选以己知的不同的多个浓度具备标准样品和微粒。此时，对于标准样品，优选调制成使用频率较高的lpMl^M的浓度范围。标准样品浓度更优选为10pM500nM，进一步优选为100pM綱nM。若使用这种样品检测试剂盒，则不仅能够大幅简化微粒的样品检测活性的确认步骤、样品的定量步骤，还能够减少伴随着标准样品和微粒的浓度调节而产生的浓度不均等品质的不均。另外，由于标准样品或微粒按各20浓度分别配备，因此还能够减少杂质混入或分解等的危险性。另一方面，通过利用本发明的微粒的样品检测活性的确认方法，能够高精度地进行样品的定量。即，在进行微粒的样品检测活性的确认后，将含有与该微粒中的受体特异性结合的2种以上的配体的样品与该微粒混合，并检测生成的凝集物的光学性质，然后再次进行上述微粒的样品检测活性的确认。此时，若标准样品的检测值在样品检测前后均正常，则能够保证使用样品检测活性正常的微粒高精度地进行了样品的定量。另外，使用相同种类且己知的不同的多个浓度的标准样品来进行微粒的样品检测活性的确认，导出标准样品检测值与标准样品浓度之间的函数，从含有与该标准样品中的配体为相同种类的配体的样品和该微粒混合时的样品检测值和上述函数，也能够对样品进行定量。此时，样品中含有的各配体的数目优选与标准样品相同。另外，标准样品的分子长度优选与样品为同等程度。上述用于定量的样品可以与标准样品的种类不同，而与标准样品为相同种类时，凝集物的生成过程相同，检测精度更高，因而优选。另外，关于使用样品时的凝集物的光学性质的检测，可与使用标准样品时同样地进行，在此省略其说明。实施例以下，用具体实施例更详细地说明本发明。但本发明不受以下的实施例的任何限制。(实施例1)(1)分别采用序列号2表示的碱基序列的5'末端被生物素修饰得到的引物、序列号3表示的碱基序列的5'末端被FITC修饰得到的引物、作为模板的由序列号4表示的碱基序列形成的56bp的合成DNA，分别得到两5'末端被生物素修饰的PCR产物、两5，末端被FITC修饰的PCR产物、一个5'末端被生物素修饰而另一个5'末端被FITC修饰的PCR产物后，用Tris缓冲液将它们的浓度调节至100pM、lnM、10nM、100nM、1pM。另外，将两5'末端被生物素修饰的PCR产物、两5'末端被FITC修饰的PCR产物混合，将各PCR产物分别调节至上述浓度。将这些PCR产物作为被检测的样品使用。如图4A、图4B及图4C所示，作为样品的物质的两末端被2个配体修饰。图4A表示两5'末端被生物素修饰的PCR产物，图4B表示两5'末端被FITC修饰的PCR产物，图4C表示一个5'末端被生物素修饰而另一个5，末端被FITC分别修饰的PCR产物。图4A和图4B所示的两5'末端被相同配体修饰的物质也与图4C所示的物质同样，可作为标准样品使用。(2)将光的主要吸收波长为800nm的抗生物素抗体敏化珠粒(Pl)以及光的主要吸收波长为450nm的抗FITC抗体敏化珠粒(P2)分别用反应缓冲液(pH为7.2的PBS缓冲液)稀释至0.04质量％，按每孔10(^1分别注入96孔板。(3)然后测定450nm、800nm处的溶液的吸光度。(4)在分别注入的珠粒溶液中，分别向含有P1的溶液中添加两5'末端被生物素修饰的PCR(图4A)，向含有P2的溶液中添加两5'末端被FITC修饰的PCR产物(图4B)，每孔5—然后，通过吸液操作进行搅拌。同样地，将5^1由两5'末端被生物素修饰的PCR产物(图4A)以及两5，末端被FITC修饰的PCR产物(图4B)混合得到的溶液加入Pl或P2的珠粒溶液中，通过吸液操作进行搅拌。(5)测定加入PCR产物5分钟后的450nm、800nm处的溶液的吸光度。(6)算出上述(3)和(5)的吸光度的差值，求得吸光度变化量。结果如表1所示。(7)将Pl和P2的混合物用反应缓冲液(pH为7.2的PBS缓冲液)稀释至0.04质量％，按每孔100^1分别注入96孔板。(8)然后测定650nm处的溶液的吸光度。(9)在分别注入的含有Pl和P2的珠粒溶液中加入5^1作为标准样品的一个5，末端被生物素修饰而另一个5，末端被FITC修饰的PCR产物(图4C)，通过吸液操作进行搅拌。(10)测定加入标准样品5分钟后的650nm处的溶液的吸光度。(11)算出上述(8)禾n(10)的吸光度的差值，求得吸光度变化量。结果如表1所示。(12)在测定了吸光度的珠粒溶液中，对于使用的PCR产物的浓度为100nM的珠粒溶液，进一步测定在37'C下保存1个月后的吸光度，与(6)和(11)同样地求出吸光度变化量。结果如表2所示。(13)另外，将上述(1)中得到的一个5'末端被生物素修饰而另一个5'末端被FITC修饰的PCR产物(图4C)的浓度调节至10nM、5nM、2.5nM、1.25nM。(14)进而用与上述(1)同样的材料和方法，得到浓度未知的PCR产物。(15)用与上述(7)(11)相同的步骤求出在上述(13)和上述(14)中得到的PCR产物的吸光度变化量。另外，在测定后，再次测定10nM的PCR产物。结果如表3所示。表lPCR产物浓度吸光度变化量800nrn450nm650nmPlP2PlP2Pl+P2满pM0.05520細60.03980,00240.0513固0.10440扁70.06430.04540.133310nM0.43290細50.05560.18820,5527100nM0.76540.00040.05280.33280.9774lnM0.96000.00210.04860.41741.2259表2吸光度测定时期吸光度变化量800nm450nm650nmPlP2PlP2Pl+P2PCR产物刚制备后0.76540細40.05280.33280.9774保存l个月后0.53500.00110.04980.32760.683223表3<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>由表1的结果可知，使用作为标准样品的一个5'末端被生物素修饰而另一个5，末端被FITC修饰的PCR产物、抗生物素抗体敏化珠粒(Pl)以及抗FITC抗体敏化珠粒(P2)，利用本发明的方法，证实珠粒(Pl、P2)的样品检测活性正常。另外，从表2的结果中保存1个月后的Pl+P2的吸光度变化量减少的结果证实，珠粒试剂的样品检测活性降低。而且，将保存1个月后的吸光度变化量与PCR产物刚制备后的吸光度变化量进行比较，可知在P2的情况下两者的吸光度大致相同，而在P1的情况下，保存1个月后的吸光度大大减少。S卩，证实珠粒试剂的样品检测活性的降低是由P1引起的。如此，通过在将样品检测活性的确认中使用的光学上能够区分的微粒分别单独地用在样品检测中，并比较检测值，能够确认样品检测活性的降低是由哪种微粒引起的。另外，由表3的结果导出的PCR浓度与吸光度变化量的函数为Y=20.3X-1.23(Y-PCR产物浓度[nM]、X-吸光度变化量)，当在该导出的函数中代入浓度未知的PCR样品的测定值时，为7.95nM。如此，从导出的PCR浓度与吸光度变化量的函数，能够对浓度未知的样品进行定量。此外，在测定浓度未知的样品后，再次测定10nM的样品，结果与测定浓度未知的样品前的吸光度变化量为同等程度。由此可间接地证实在测定浓度未知的样品前后，珠粒的样品检测活性正常。另外，2种标准样品混合后的测定结果如表4所示。即使将两5'末端被生物素修饰的标准样品和两5'末端被FITC修饰的标准样品这2种标准样品混合，由特异性反应引起的微粒的吸光度变化量也显示出与单独使用1种标准样品时同样的趋势。由此可知，即使将配体不同的2种以上的标准样品混合，也能够得到与单独使用1种标准样品时同样的结果。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>本发明适用于使临床检査简便化、迅速化等，可在医疗相关领域中得到应用。权利要求1、一种微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将含有2种以上配体的标准样品和含有与各配体特异性结合的受体且光学上能够区分的2种以上的微粒进行混合，并检测生成的凝集物的光学性质。2、如权利要求1所述的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，在缓冲液中进行所述标准样品与所述微粒的混合。3、如权利要求2所述的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将所述标准样品与所述缓冲液混合后，向该混合液中添加所述微粒。4、如权利要求2所述的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将所述微粒与所述缓冲液混合后，向该混合液中添加所述标准样品。5、如权利要求14中任一项所述的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，所述微粒为磁性微粒，并对生成的凝集物施加磁力。6、如权利要求15中任一项所述的微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将所述标准样品和所述微粒在44(TC下混合。7、一种微粒的样品检测活性的确认方法，其中，将通过权利要求16中任一项所述的微粒的样品检测活性的确认方法检测的标准样品的检测值同与该标准样品为相同种类且相同浓度的标准样品的已知检测值进行比较。8、一种微粒的样品检测活性的确认方法，其中，使用浓度已知的标准样品每隔任意的时间段进行权利要求16中任一项所述的微粒的样品检测活性的确认方法。9、一种样品的定量方法，其中，在通过权利要求16中任一项所述的方法确认微粒的样品检测活性后，将含有2种以上与该微粒中的受体特异性结合的配体的样品和该微粒进行混合，并检测生成的凝集物的光学性质，然后再次进行所述微粒的样品检测活性的确认。10、一种样品的定量方法，其中，通过权利要求16中任一项所述的方法，使用相同种类且已知的不同的多个浓度的标准样品来进行微粒的样品检测活性的确认，导出标准样品检测值与标准样品浓度之间的函数，利用将含有与该标准样品中的配体为相同种类且相同数目的配体的样品与该微粒混合时的样品检测值和所述函数，来对样品进行定量。11、一种样品检测试剂盒，其具备含有2种以上配体的标准样品和含有与各配体特异性结合的受体且光学上能够区分的2种以上的微粒。12、一种样品检测试剂盒，其具备含有2个以上配体的2种以上的混合而成的标准样品和含有与各配体特异性结合的受体且光学上能够区分的2种以上的微粒。13、如权利要求11或12所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品中的配体是半抗原。14、如权利要求1113所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品中的配体的种类与样品中的配体的种类相同。15、如权利要求1113所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品中配体的数目和种类与样品中配体的数目和种类相同。16、如权利要求1115中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品的种类与样品相同。17、如权利要求1116中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品中的配体由分子量为18060000的分子形成。18、如权利要求1117中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品中的配体具有在至少0100°C的温度范围内与所述微粒中的受体特异性结合的能力。19、如权利要求1118中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品中的配体是选自荧光物质、地高辛配基、氨基酸残基数为6以上的多肽、2个以上单糖结合而成的糖链、生物素、蛋白质、聚组氨酸、透明质酸(HA)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、序列号l表示的肽以及它们的衍生物中的l种以上。20、如权利要求1119中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，在所述标准样品中含有具有链状结构的高分子物质。21、如权利要求20所述的样品检测试剂盒，其中，所述高分子物质为水溶性的。22、如权利要求20或21所述的样品检测试剂盒，其中，所述高分子物质在其主链或侧链的末端具有所述配体。23、如权利要求2022中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述高分子物质是选自多糖、聚乙二醇、多核苷酸、多肽、聚丙烯酸衍生物、聚丙烯酰胺、聚酯、聚醚、聚酰胺以及它们的衍生物中的l种以上。24、如权利要求2023中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述高分子物质主链的长度为15200nm。25、如权利要求2024中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，在所述标准样品与所述微粒的混合中使用的溶液中，所述高分子物质为直链状。26、如权利要求1125中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述标准样品的分子长度为样品的分子长度的80120%。27、如权利要求1126中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，以已知的不同的多个浓度具备所述标准样品。28、如权利要求27所述的样品检测试剂盒，其中，所述多个标准样品的浓度为lpMl^M的范围。29、如权利要求1128中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述微粒的粒径为0.11(Him。30、如权利要求1128中任一项所述的样品检测试剂盒，其中，所述微粒是磁性微粒。31、如权利要求30所述的样品检测试剂盒，其中，所述磁性微粒的粒径为0.120,32、如权利要求1131中任一项所述的样品检测试剂盒，其具备在所述标准样品与所述微粒的混合中使用的溶液。全文摘要本发明提供微粒的样品检测活性的确认方法、样品检测试剂盒以及样品的定量方法。微粒的样品检测活性的确认方法的特征在于将含有2种以上配体的标准样品和含有与各配体特异性结合的受体且光学上能够区分的2种以上的微粒混合，并检测生成的凝集物的光学性质；样品检测试剂盒的特征在于其具备上述标准样品和上述微粒；样品的定量方法的特征在于通过上述确认方法确认微粒的样品检测活性后，将含有2种以上与该微粒中的受体特异性结合的配体的样品和该微粒混合，并检测生成的凝集物的光学性质，然后再次进行上述微粒的样品检测活性的确认；因此本发明提供试剂的样品检测活性的确认方法、利用该确认方法的样品的定量方法以及含有该试剂的样品检测试剂盒，所述试剂的样品检测活性的确认方法适用于以核酸等为代表的生物体相关物质的样品检测。文档编号G01N33/543GK101467044SQ20078002206公开日2009年6月24日申请日期2007年7月13日优先权日2006年7月13日发明者西川和孝申请人:奥林巴斯株式会社