专利名称：：制备方法
技术领域：
：本发明涉及保存和纯化来自全*本的细胞的方法。具体而言，本发明涉及4絲和纯化来自全*本的细胞的方法，以使得一群淋巴细#抗原呈递细月^皮有效稳定化和纯化，以供用于体外测量细胞介导免C^答的分析中。
背景技术：
：细胞介导免疫(CMI)应答通常用于确定个体的免疫状态。通常，在临床免疫学领域，术语CMI应答涵盖体内皮试、淋巴细自殖分析以#特异性抗原了用于，、^定化^^制备来自分离的全"本的细胞的改进的方法,以:用、于测量一类CMI应答的分析技术(下文称作"CMI分析")，所述CMI应答即针对特异性抗原的、基于细胞因子的体外CMI应答。免疫系统的细胞在受到抗原的刺激后能够产生免疫效应物分子，例如细胞因子。CMI分析包括将细M本与一种抗原""^温育，并测量免疫效应物^(例如细胞因子)是否存在或者存在的量，以提供个体针对所选抗原产生细胞介导免疫应答的能力的指征。在CMI分析中使用的细|^￡包括分离的淋巴细|^(特别是T细^)和抗原呈递细胞(APC)群。APC参与抗原的加工，以使得该抗原可以被每个T细J^4面的T细胞受体识另，J。抗原诱导的细胞因子可被員到分析介质中，并通过例如ELISA的方法直接测定，或者对分泌细胞因子的T细胞的频率佳月ELISP0T方法ii^f于定量。过滤免疫蚀斑分析也称酶联免疫斑点分析(ELISPOT)，在开发之初用于对个别的分泌抗体的B细Jf&i^ff^r测和定量。在该技7M皮开发出来时，它为常规的蚀斑形成细胞分析提供了快速的、多用途的替代方案。最近的改进已经提高了ELISP0T的灵M，以致可以^"测到每秒产生低至100个特异性蛋白质分子的细胞。这些分析利用了在紧邻分泌蛋白质的细胞的环境中的较高深度的给定的蛋白质性细胞产物(例如细胞因子)。这些细胞产物利用高亲和性抗体进行捕捉和检测。ELISPOT分析的综述可参考CurrentProtocolsinImmunology,Unit6.19pages6.19.1-8。ELISP0T分析通常包括六个步骤(1)在膜支持的微滴定;tUi包被纯化的细胞因子特异性抗体；(2)封闭该板，以防止非特异性吸附^^T其他的蛋白质；(3)将分泌细胞因子的细胞与适当的试剂-^温育；(4)除去细#试剂；(5)加入标记的第二抗细胞因子抗体；以及(6)枱r测膜上的抗体-细胞因子复合物。从全血样本制备用于CMI分析的细胞的目前的方法包括使用聚糖体(Ficoll)梯度来分离外周血单核细胞(PBMC)。梠^据这些方法，为了有效进行CMI分析，淋巴细胞和APC必须从全械本中尽快纯化，糾地ill在从个体采集血液样本后的8小时内。
发明内容本发明人已经发明了保存和纯化来自全jfc^本的细胞，以供在细胞介导免疫分析(CMI分析)，如ELISP0T分析中使用的方法。*明了在^之前处理全j6l^羊本的方法。这些方法可使全jfe^本在CMI分析，例如ELISP0T分析中使用之前^皮保存例如至少6小时，如多至48小时。本发明提供了一种M和纯化来自全血样本的细胞的方法，包括在纯化细胞之前和/或^絲该样本至少6小时，以及纯化一群淋巴细胞和APC以供在细胞介导免疫分析(CMI分析)中^J^！,所述纯^if过一种引AiL向或负向亲和it择步骤的方法^Mi^f亍。本发明在另一方面提[种处理和M全j6^本的方法，包括使用生长培养基稀释所述全i^羊本；并且将处理过的全j&^羊本絲至少6小时，其中，在4錄之后，可获得一群淋巴细胞和APC以供在CMI分析中使用。在M之后，可从稀释的全*本中分离PBMC或者淋巴细胞和APC的适当的制剂以供在CMI分析，如ELISP0T分析中^Jl。本发明在另一方面^^"种在ELISP0T分析中員来自全血的、分离的T细胞的肽特异性细胞因子应答的方法，包括^f捐正向或负向亲和选择>^^斤述全jM羊本中分离一群包括T细#APC的细胞。本发明在另一方面"R供一种制备适用于ELISP0T分析的淋巴细胞和APC的方法，其中，所述方法包^it过iiy虑除去红细胞。具体实施例方式本发明提供了一种保存和纯化来自全*本的细胞以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用的方法。本发明还提供了一种通过^J^)细胞生长培养基稀释来处理全jk^羊本、##存该处理的全*本的方法。该方法^f吏得来自所#液样本的分离的淋巴细#APC的肽特异性细胞因子应答足以在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，优逸地用在i貪断方法中。根据本发明，细^^h导免疫^^斤(CMI分析)是指用于测量4十对特异性抗原的、基于细胞因子的细胞介导免疫应答的体外分析。此类分析^^)从个体中获得的样本，其中所述样本包括免疫系统的细胞。该免疫系统的细胞在受到抗原刺激后能够产生免疫效应物M，如细胞因子。该分析包括将该样本与一种抗原""^温育，并测量免疫效应物^(例如细胞因子)是否存在或者存在的量，以提供个体针对所选抗原产生细胞介导免疫应答的能力的指征。本发明中，CMI分析优选为ELISPOT分析。在CMI分析，如ELISPOT分析中使用的细胞包括分离的淋巴细#APC群，例如一群T细#APC。根据本发明方法制备的分离的淋巴细胞和APC制剂、特别是T细胞和APC制剂可用于CMI分析，如ELISPOT分析，以用于诊断。该制剂产生足以进4tit断的应答。该应答可被P艮定为高于本底的50%。或者，该应答可被限定为佳月刚刚分离的全jk4羊本所能获得的最;Ul答的至少50%。例如，在通常的分析中，在ELISP0T分析的每个孔中可使用2.5xl(f个存活的PBMC。在结核病的ELISPOT分析中，阴性对照通常少于5个斑点。在这种情况下，P曰性或M性样本应比阴性对照多6个或6个以上斑点。如果阴性对照有6个或6个以上斑点，则只有在斑点数量为阴性对照的两倍以上时才表明^JI性样本。在本发明方法的一个实施方案中，在*之前或之后，使用正向亲和选择步骤或负向亲和选择步骤来纯化来自全*本的细胞。正向亲和选择步骤用于将所需细胞结合至固体支持物上，从而使结合的细胞与^合的细胞分离。纯4匕的结合的细胞^t保留，未结合的细l&^:丢弃。另一方面，负向亲和选择步骤用于除去那些在用于CMI分析，如ELISP0T分析的细胞制剂中不需要或不想要的细胞。因而，结合至固体支持物的细胞被丢弃，纯化的未结合的细g回收并床留。该方法使淋巴细胞(如T细胞)和APC都得到纯化。该纯化可包拾淋巴细胞和APC两者的正向或负向亲和选择，在这种情况下，通常样本中这两种细胞类型都得到富集，即，作为实施本发明方法的结果，样本中T细J^细胞总数的比例和APC对细胞总数的比例都升高。根据本发明的一个方面，在通过包括正向或负向亲和选择步骤的方法对来自全jMf本的细胞进行纯^iL前和/或之后，将该全jM羊^i行保存。例如，该全jM羊本可在分离所选细lfe^ML前进行保存。在保存至少6小时、至少8小时、多达IO、12、18、24、36或48小时之后，处理(即进行亲和选择)该全jfa^羊本以分离所选细胞群，然后可用于CMI分析，如ELISPOT分析。或者，该全血样本在获得之后不久即进行处理(即进行亲和选择)，例如在获得之后1小时内、多达6小时或者多达8小时时进行处理以分离所选的细胞群。然后，在用于CMI分析，如ELISP0T分析^^前，将该细J!WM^。优选地，该全J&^羊4^cg在-5X:和40lC之间，通常在2"和8。C之前或者18。C和25。C之间。在特别优选的实施方案中，该全_16^羊4^皮*在室温下，例如约18。C或20。C或者从18"C至25'C或者从201C至25匸。在一个实施方案中，该样^本文提及的任何方法的任何阶段都不进行冷冻。在一个实施方案中，该样^^MS^^取的阶^g和纯化(通it^发明的方法)阶段之间不4皮冷冻；并且/或者该样本在保存和纯化阶段至在CMI分析中使用的阶段之间不被冷冻。在本发明的一个方面中，纯化方法包括负向亲和选择步骤以除去全*本中的粒细#^^的红细胞，以侵Jl得可在ELISPOT分析中使用的淋巴细#APC制剂。因此，根据本发明的一个方面，所提供的方法在一个步骤中从全*本中同时除去粒细胞和红细胞。才艮据该方法，全jfiM^本与含有抗CD66b和血型糖蛋白A抗体的抗体制剂相接触。这些抗体用于使红细J^粒细M集。凝集的红细胞和粒细胞可通过例如离心从样本中除去。该样;^ii可在离心前进行聚糖体梯度。在本发明的另一方面中，负向亲和选择包括使用结合有配体的固体支持物，所述配体结合存在于粒细J^面的细J!fe4面蛋白，而不结合在ELISPOT分析中^JI的淋巴细I^APC表面上存在的细g面蛋白。例如，提供的固体支持物可包括抗CD15配体以结冶^样本中的CD15+细胞，和/或包括抗CD66b以除去样本中的CD66b+细胞。根据本发明的这一方面，使全*本，或者经过处理已除去红细胞的血液样本在可结合粒细胞的条件下与含有抗CD15配体或抗CD66b配体的固体支持物相接触。已经除去粒细胞的淋巴细胞或APC制剂可直接获得，例如通过偉样本与该固体支持物接触，并收集^T未结合到该固体支持物的物质。或者，结合有粒细胞或者其他不想要的细胞的固体支持物可与样本的剩余物分开。例如，该固体支持物可包括#^例如*。一旦,已与样4^^触并置于可使粒细胞与固体支持物结合的条件下，微珠即可与该样本分离以使淋巴细胞和APC制剂中的粒细皿除去。在优选的实施方案中，固体支持物包括可与样本的剩余物分开的/^:，例如，可通过应用磁场与样本的剩余物分开。应该理解，可与粒细胞表面的细胞表面标记物结合的M配体，特别是抗体，都可用于负向亲和选择。例如，下述抗体也可用于通it^方法除去粒细胞抗CD16b和/或抗CD88抗体。优选地，根据本发明的这一方面，红细胞<^^^全*本中除去。这可以在除去表达CD15+的细J!^者粒细fe前、之后或者同时实现。可通过4沐适当的方法除去样本中的红细胞。例如，样本中的红细胞可通过4吏红细胞fj^来除去(Simonetal.,Immunol.Commun.1983，Vol.12，pp.301-314)。根据本发明的一个方面，红细胞可通过it^、除去。根据本发明的这一方面，提供了一种制^^淋巴细胞和APC以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用的方法，包括过滤除去红细胞。该方法可单独使用，或者与本发明的一种或多种其他方法结^f^)，例如，与^^J抗CD15+配体的负向亲和选^^^f^以除去粒细胞。本申请的过滤方法包括将全jMf本应用至过滤器。选择过滤器以使红细胞穿过过滤器而淋巴细胞和APC留在过滤器上。才艮据该方法，带有淋巴细胞和APC的过滤器可直接在CMI分析，如ELISPOT分析中使用。或者，淋巴细胞和APC可通过例如下述方法收集冲洗过滤器或者反向冲洗过滤器，并收集回收的、淋巴细胞和APC。根据本发明的另一方面，从全*本中纯^*巴细#APC制剂是通过包括正向亲和步骤的方法实现的，其中优i^屯，该亲和选择步^i^择所有类型的T细胞(例如，不管是CD4还是CD8，或者不管识别什么表位)。在一个方面，使全iMf本与附着有配体的固体支持物相接触，所述B己体结合在淋巴细胞和APC表面存在的细胞表面蛋白。该配体可以是抗体。在本发明的一个优选的方面，该配体选自抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD45、抗CD45RC和抗CD14配体。例如，所提供的固体支持物可结合全jfa^羊本中的CD4+、CD8+CD14+和CD19+细胞，或者其子集，如CD4+、CD8+和CD19+细胞。这些细胞的分离可使淋巴细胞和APC制剂适于在ELISP0T分析中使用。该制剂可包括004+和008+T淋巴细胞、B细胞和单核细胞的混合物。在一个实施方案中，抗CD4和/或抗CD8配体不用于纯化步骤中，优选地，抗CD4抗体和/或抗CD8抗不用于纯化步骤中。在一个优选的实施方案中，选择固体支持物上的配体，以使在最终制剂中不想要的细胞(如粒细胞)不保留在固体支持物上。例如，选择g己体，以使它们对淋巴细胞和APC具有特异性，并且不结合粒细胞。固体支持物上可以大约相同的比率提供抗CD4、抗CD8和抗CD19配体或者其他适当的配体。或者，选择每种S己体的比率，以例如反映出存在于全血中的每种细胞的比例。或者，可以选择配体的比率，例如CD4:CD8:CD19S己体，以便以期望的比率(例如特别适合在ELISP0T分析中使用的比率)结^^和分离淋巴细胞和APC。使用结合有配体的固体支持物结合所选蛋白质的亲和选择方法为本领域所7^p。通常，使全j^羊本与含有所需配体的固体支持物相接触，所述接触发生在可使细l&iti^目关的细胞表面蛋白与该配体相结合的条件下。该固体支持物可与样本的剩余物分开以便将结合的细胞与未结合的物质分离。可包括冲洗步骤，例如，从固体支持物上洗去未结合的物质。在本发明的一个优选的方面中，固体支持物包括#。该^Mr容易地，例如通it应用磁场，与样本分离。若固体支持物以^Ml^^类型賴沐的形式提供，则每个#^上可具有一个酉己体，例如抗CD4S&体。每个只带一个St体(如抗CD4、抗CD8、抗CD14或抗CD19)的微珠可结合在一^使用，以佳_形成的固体支持物可结合所需的细胞，如CD4+、CD8+、CD14+和CD19+细胞。或者，每个^K上可提供多于一个配体，如抗CD4和抗CD8两种配体，或者抗CD4和CD19两种配体，或者所有g己体的结合。在一个特别优选的实施方案中，选择配体的比率，如抗CD4:抗CD8:抗CD19，使其相关于在ELISP0T分析中^J]的最终制剂中所需的淋巴细J!^APC的比率。也可选择一定数量的#,以便分离选定数量的细胞，以便有助于进一步处理该制剂以供在ELISP0T分析中使用。结合在固体支持物上的所选细胞的制剂，特别是淋巴细胞和APC制剂可直接在分析中使用。特别是，结合有相关细胞的磁珠可直接在CMI分析，如ELISP0T分析中使用。优选地，结合有细胞的微^被用于分析中之前被洗涤。或者，一旦所选细胞与全*本的剩余物分离，结合在固体支持物上的细胞可以从该固体支持物上解离以在分析中使用。根据本发明的另一方面，全械本^JI细胞生长培养基稀释处理，并在用于CMI分析，如ELISPOT分析之前进^f亍^M^。稀释的全jfi^羊本在采集^可保存至少6小时，例如在从个体采集^##至少8小时，>^在采集^*长达IO、12、18、24、36或48小时。才艮据本发明的这一方面，全iM^^M^之前被稳定化或处理。例如，该方法包括^J^细胞生长培养基稀释全械本，以使当^^斤述*的全械本获得的全jM羊本或者分萬的t细胞和apc制剂在样本采集后长达48小时时在ELISP0T分析中^J^1时，仍保持活性应答。根据本发明，全j^羊本可^^细胞生长培养基以^^t适当的比率稀释。在一个优选的实施方案中，全jfa^羊本与细胞生长培养基的比率为1:1。另夕卜，全械本与细胞生缺养基的比率可以是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、高达10:1、20:1或30:1。另外，全械本与细胞生长培养基的比率可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10、低至1:15、1:20或1:30。在一个实施方案中，将稀#^养#入全_1&#本中，但不进行振荡或^搅拌。全j6Mf本优选^"在标准的^:化试管中。优iti也，全*^^^在暗处。本发明中使用的细胞生长培养基可为^f可适当的细胞生长培养基。例如，该培养基可以是市场上购得的培养基，如AIM-V(InvitrogenPaisleyUK)或者RPMI1640(SigmaAldrichCorp,St.Louis,M0，USA)。在一个优选的实施方案中，细胞生长培养基为无血清的培养基，如AIM-V。根据本发明的一个方面，所i^t理的全j6M^本用于CMI分析或者准^^在保存后用于CMI分析。通常，在*后，^y^斤述处理的全jfa^本中纯化PBMC制剂或者T淋巴细胞和APC制剂，以供用于CMI分析。任何适当的方法均可用于获得分离的细胞制剂，以供用于CMI分析，如ELISP0T分析。通常，可使用聚糖,度来分离PBMC。更M地，通过包括亲和选择步骤的方法，从处理过的全jMf本中除去红细^粒细胞，以例如分离'淋巴细胞和APC制剂。稀释处理还可用于本发明的另一方面，用以在CMI分析中佳月之前的M该制剂之前处理分离的淋巴细胞和APC制剂。在本发明的另一方面中，将稀释或未稀释的全血^M^几个小时，优选*至少6小时，或者长达12小时，或者12-48小时。可以在2-8。C或者室温j呆存。保存后，可以通过上述的亲和选择来制备淋巴细胞和APC制剂，并JWii^地，该制剂中T细胞的肽特异性应答可通过CMI分析测定。用这样的方式，引入CMI分析的T细胞的体外活性被稳定化和储。因此，该过程减少或者絲了体外T细胞活性的显著降低，而当血液样本在分离步骤前保存几小时，再使用例如标准的聚糖*度从全*本中分离而得的淋巴细胞和APC制剂中，会观察到体外T细胞活性的显著I^f氐。本发明还提供了一种^4MfiM^本的试剂盒，包括标准的g化试管和细胞生长培养基。本发明还提供了一种在由本文所述的方g萍和纯化的细l&Ji实施ELISPOT分析的试剂盒，其中所述试剂盒包括(i)一种细胞因子特异性抗体，任选地附着于微滴定板，和(ii)本文所述的可用于亲和选择中的一种或多种配体，^fiit地结合于一个固体支持物，和(iii)任选地，进行ELISP0T分析和/或实施*和纯化细胞的方法的说明书。另外，本发明还提供了一种用于根据本发明来纯化一群淋巴细胞和APC的试剂盒，其中所述试剂盒包括一种或多种本文提及的配体，所述配体<链地结合于固体支持物上。该试剂盒还包括用于实施本发明的方法的说明书。在本发明的另一个实施方案中，全jM羊本使用正向或负向亲和选择步骤处理，分离一群T细胞和APC以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，而无需保存该样本。在另一个实施方案中，正向或负向亲和选择方法可用于分离细胞制剂以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，所述细胞来自于已经过稀释处理和^#的4^Jfe■#本。任何上述实施方案均可在来自于人的样本上实施，例如被怀疑患有可由ELISP0T诊断的疾病的人。下文中，参照以下实施例，对本发明进行更加详细的说明。实施例1使用培养^^^#释处理对总共78个供体中的^个皿进行静脉穿刺，之后立即采集一管10mlLithiumHeparinVacutainer管(BDBiosciences,Oxford,UK)的全血，并<吏用T一SPOT.7^分才斤试剂盒(OxfordI咖unotec，Abingdon,UK)i^f亍6个月时间的处理。根据该试剂盒随附的厂商说明书来实施该方法。该方法包括a)用于制备夕卜周血单核细胞(PBMC)的标准的Ficol1方法-参见SampleCollectionandPreparation,Procedure2"alternativebloodcollectionmethods"andNote2.;b)^JI台盼蓝染色排除法(TrypanBlueDyeExclusionmethod,Freshney,R.(1987)CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,p.117，AlanR.Liss,Inc.,NewYork)对存活细JJ&it^i十数；c)将细胞使用GIBC0AIM-V(Invitrogen，Paisley,UK)^^释至250，000细胞/100pi;d)将250，000(100pi)Ficol1提取的细#入每个微滴定板中，所述滴定板已经用抗y干扰素以及下述之一物质很好地包被植物血细皿集素(pha)阳性对照；或者来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的特异性测试抗原(A板；B板)；或者来自巨细胞病毒/EB病毒/流感病毒(CEF;Mabtech，Sweden),该抗原不在T-SP0T.M试剂盒中提供；e)将该板温育16至20小时(37X:，5%C02)，使用磷酸盐緩冲液(PBS)冲洗四次，然后加A^性磷酸酶缀合的第二抗体，并在2-8。C温育l小时；f)将孔沖洗四次，然后加入5-溴-4-氯-3，吲咮基磷酸酉旨/硝基蓝四唑(NitroBlueTetrazoli咖，BCIP/NBT),温育7^#。出现斑点后，使用蒸馏水终止反应；g)在37X:干燥4小时之后，记录每个孔中的斑点形成细胞(SFC)it量，并i^f亍^^冲斤。将剩余的M体的血液使用AIM-V以1:1的比例稀释，在室温(18-25t:)、暗处it^^M^24小时。在第2天，对保存的血液进行T-SPOT.7S分析，包括制备PBMC的标准的Ficol1方法。然后使用阳性对照(PHA)和空白对照(无抗原)，进行T-SP0T.分析以确定SFC计数。从测"^原孔的SFC计数中减去空白对照。如果任何一个抗原孔含有6个或者更多斑点而空白对照含有零个斑点，则该样树于该测试抗原来iJW皮认为是"反应性的，，。下J^示新鲜的和稀释的和保存的血液之间的关系。显示了对于每个^H^血液样本，在室温(RT)下过夜^M^血液(在用AIM-V以1:1稀释之后)，使用A板、B板和CEF孔的反应性和非反应性结果。同时显示了供沐总数的百分比。CEF抗原溶解于AIMV，以5畔/ml的水平存在于该分析中。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果显示86.1%的临床一致性(败比空白对照多6个斑点表示^性)。因此，^Ejk液样本中加入培养基使得在保存24小时后在PBMC中可测得阳性SFC应答，该应答与在采M直接处理的血液中所测得的应答类似。采集并保存24小时而不添加培养基的血液在可测得的CMI应答中显示显著性减小(数据未示出)。实施例2正向亲和选择在第1天，并JL^静脉穿刺的2小时之内，对于九个皿中的每个皿，取两管10mlLithiumH印arinVacutainer管的全j6a文置^^，一管在室温(18-25°0下暗处，另一管在冰箱(2-8n)中。在每个时间点，在每个^^静脉穿刺后的0-2小时(新鲜的)或者24小时(保存的)，取3ml全血使用沖洗緩沖液(PBS/0.1。/4BSA/2mMEDTA)以1:1稀释，与80pl特异性Dynabead^l的濕/^混合，所M^的"^物即111.45(CD4);111.47(CD8);111.49(CD14);和111.43(CD19)以同等比例混合(Invitrogen)。这些"齡"基于是否存在特异性分化(CD)标记物对细J!feii行正向选择，所述特异性分化标记物为CD4和CD8为T细胞亚群；CD14(单核细胞)和CD19(B细胞和APC)。将该样^室温下混合12min，通过将样本试管置于磁性颗粒聚焦器(magneticparticleconcentrator,MPC:Invitrogen,Paisley,UK)2分钟来将^分离。弃去上清液，将:用PBS沖洗两次，然后再次在MPC中分离。然后将孩沐重新悬浮于lmlAIM-V，使用台盼蓝染色排除法对细胞进^S十数。将细胞佳月AIM-V稀释至250，000细胞/100jil。作为平行，，在每个时间点，在每个^^静脉穿刺后0-2小时(新鲜的)或者24小时WW的)，取5ml全血用实施例1中所述的标准的Ficoll方法直接处理。然后将所有处理的样本^J^T.SPOT.7S分析试剂盒(见实施例l)进行分析，在分析孔中使用抗原CEF(5蹄/ml)，或者PPD(1pg/ml)，或者PPD/CEF(分别为1蹄/ml和5蹄/ml),它们均不在T-SPOT.TB试剂盒中提供；PPD(产品^R^马RT23)从StatensSerumInstitut(Copenhagen,Denmark)|yf;对于CEF,参见实施例1。PPD和CEF分别用于识别CD4+和CD8+T细胞。下表#了所有供本的结果的平均值，显示了由ELISPOT测得的选自新鲜的或者M的血液的细胞的SFC计数，该分析佳月CD4、CD8、CD14和CD19缀合的*，并与仅使用Ficoll的分析相对照。在室温*24小时并用M选择的血液的结果与"新鲜M"样本的结^目当，并且比"只^吏用Ficoll"的样本以及"只佳月Ficoll"和在4X:保存的结果^"好。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>假定只用Ficoll处理的"新鲜"样本在ELISPOT分析中产生100%的SFC计数，对结果进行标准化。上面三4于显示平均SFC计数，下面三行显示标准差。实施例3负向亲和选捧从4个供体中的每一个，在静脉穿刺后立即采集两个10mlLithiumHeparinVacutainer管全血，时间跨度1个月。对于每个供体的一个样本，使用MACSi抗CD15/^(MiltenyiBiotech,BergischGladbach，Germany)进行负向选择步骤。^MM^)前完全重新悬浮，以确保均匀地*。将400nl^M^入15ml锥管中的4ml全血中。将该试管在室温下佳月MACSimix(MiltenyiBiotech)试管旋转器以中等ii^(8rpm)温育15分钟。将试管置于MACSiMag分离器(MiltenyiBiotech)中2分钟，以使M粘附于试管壁。将试管留M场中，用移液管移去上清液，置于新试管中。含有上清液的试管重新置于MACSiMag分离器中2分钟，以使所有残留的微珠粘附于试管壁上。将试管留在磁场中，将上清液转移至50ml锥管中。加入16ml新制备的1X红细胞(RBC)自緩沖液(由10X自緩冲液稀释而制备1.55MNH4C1，lOOmMKHC03，lOmMEDTA),将试管在室温温育5分钟。将样本在300xg离心10分钟。将沉淀的细胞用^J^緩冲液(5ml)冲洗两次，每次在300xg下离心5分钟。将细胞用RPMI沖洗一次，在lmlAIM-V中稀释，以供用于ELISP0T分析。作为本方法的平行#，^^I每个餘沐的第二个样本，将5ml全血通过实施例1中所述的标准的Ficol1方法处理。然后将纯化的PBMC样本在如实施例1中所述的T.SPOT.7S分析中进行分析，分析中将CEF(5叫/ml)用于供体l、2和4样本作为抗原；A板和B板抗原(33畔/ml)用于*体3样本。^J1负向选择方^^J)MACSi抗CD15^i^制备的PBMC所获得的SFC计数(如下表所示)显示了与^^1聚糖>^#度制备的PBMC的高度的等价性。该基于抗体的PBMC分离方法被证实在技术上是可行的，在T-SPOT.M分析中产生高度可重现的结果。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(N.B,为胁3和4，(-)孑L^示没有^^;(+)孑A示存在PHA(5貼/ml)实施例4负向亲和选择ii-f亍两项分开的实验，每项实验^^I从一组15或11个儉本汇集的全血。对于每项实验a)在第l天，在静脉穿刺之后立即将一个10mlLithiumH印arinVacutainer管的从每个供沐汇集的全jM艮据标准的Ficoll方法(见实施例l)进行处理。^^l台盼蓝染色排除法对存活的PBMC进^i十数。将细胞佳月细I^养基(AIM-V)稀释至250，000细胞/100b)将剩余的血液以未稀释的状态、在暗处、在2-8。C的水箱中或者在室温(18-25。C)保存24小时；c)在第2天，根据标准的Ficoll方法对保存的血液样4^ii行处理以制备PBMC，如上所述(见本实施例的第一勵对存活的细胞进^i十数^l释。在每项实验中处理的平行样本中，对于每个餘沐，在第l天(新鲜的)和第2天(^#的)，将4.5ml全jkip入到15ml离心管中，然后将225jilRosetteSep(StemCell，Vancouver,BC，Canada)加入^争个管中，以4吏用含有抗CD66b和血型糖蛋白A的四聚体复絲使RBC和粒细胞结合。将样錄轻^^，置于室温下温育20M。然后将样本^j^RPMI以1:1稀释，标准的Ficoll方法(见实施例1)将PBMC从除去粒细胞的细胞中分离，从而将RBC和粒细胞与淋巴细胞和APC分离。然后根据试剂盒随附的厂商说明书，对淋巴细#APC进行冲^fe^处理-见实施例1。结果在下面显示。在进行的两项分开的实验中，在分析中一项使用CEF(5蹄/ml)作为抗原，另一项使用PPD(l畔/ml)。Ji^:在4t:和室温以Ficoll和RosetteS印处理的CEF诱导的SFC计数(15个儉f^的平均值)。下表在4。C和室温以Ficoll和RosetteS印处理的PPDi秀导的SFC计数(ll个儉沐的平均值)。结a明，在4匸保存、然后以抗粒细胞抗体处理、接着用Ficoll纯化PBMC获得的样本与标准的"新鲜"样本是等价的，同时其SFC计数高于在室温下保存然后以抗粒细胞抗体处理的样本。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>n=ll个供体，32个重复实施例5-过滤在静脉穿刺后T0和T24小时研究佳JI反向冲洗白细胞滤膜(PALLMedical)的可行性以絲该膜上捕获的细胞的稳定性。将捕获的细絲该膜上絲，一个糾的併存在冰箱(2-81C)中，另一个儉沐的絲在室温(18-251C)。在每个时间点和温度,在进行标准的Ficol1PBMC分离方法的同时进^S亥膜分离方法。该膜需要按照步骤1-3(见下幻进行*,然后对其^适当的^MNH^和期限。然后将膜^#装置从保存区域移除，并^M目关时间点进行4-7(见下文)。将Ficoll对照##样本在室温、暗处存放，用AIMV细l&^养基以1:1稀释，直到需要通过标准的Ficoll分离方法进行处理。膜处理过程如下所述步骤1-3包括佳冗转移注射器将10ml冲洗緩沖液1通过该膜过滤至废物瓶中。将10ml全*本与50ml冲洗緩冲液1先混合，然后使用转移注射器通过LK4膜过滤至废物瓶中。使用#^多注射器，将50ml冷却的沖洗緩沖液1通过LK4膜过滤至废物瓶中。步骤4-7包括立即或者在24小时后(根据时间点)将滤膜倒置。使用反向冲洗注射器，将50ml冷却的移除緩沖液l反向通过该膜过滤到50mlFalcon管中。将细胞悬液以2000rpm在室温下离心5min，然后重悬于10mlAIMV中。将细胞悬液再次以2000rpm在室温下离心5min,然后重悬于lmlAIMV培养基中，并根据标准的Ficoll分离方法计数。(冲洗緩冲液l:500mlAIMV培养基，以20mMHEPES和1%[w/v]DextranT40緩沖)(移除缓冲液1:500mlAIMV培养基，以20mMHEPES和0.1%[w/v]DextranT40緩冲)。然后，如实施例l所述，同时根据每个试剂盒附随的厂商指导说明，进行T-SPOT.7S分析。下表记载了该研究中进行的T-SPOT.7S，结果的总结。显示了与膜实验的时间和温^L有关的CEF斑点计数的对比。这是针对膜性能与在同一天进行的相关Ficoll对照的关系以及它们在TO的关系进行的。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>^MJi^中可以看出，用于新鲜全血、在T0和T24^#在2-8匸和18-25。C(室温)的膜所提供的PBMC在用于ELISPOT分析时可产生足够的CEF信号。在ii^已经证实了^^反向冲洗滤膜條的PBMC能够在ELISPOT分析中诱导应答。实施例6-负向亲和选~^前的##时间使用来自15个儉体的^r—个的全i^羊本，进行两项M的实验。对于每项实验a)在第1天，在静脉穿刺后立即将一个10mlLithiumH印arinVacutainer瓶的来自每个供体的全i^艮据标准的Ficoll方法进行处理("新鲜，，样本)，以制备PBMC;b)将来自每个儉休的剩余血液以未稀释的状态保存在暗处，在2-8t:的水箱中(保存的样本)保存不同时间(16到72小时)；c)在第2天，#^存的样本如实施例4所述用RosetteS印(StemCell，Vancouver,BC，Canada)温育，然后才艮据标准的Ficoll方法进行处理，以制备PBMC。然后对PBMC进^i十数和稀释，将样拟艮据实施例4进行处理，除了在进行的两项分开的实验中，一项使用CEF(5pg/ml)作为抗原，另一项在分析中使用CEF/PPD(分别为5jig/ml和1蹄/ml)。下面给出的结果^^了，对于所有个体##:#本，在4捐CEF抗原(n=10)或者使用CEF和PPD两种抗原(n-5)经过不同的处理M后，所记录的累积SFC计数，该计^bl^于^—处理样本的三次单独ELISP0T分析结果的平均值的总和。这些数据表明，在2-8"C保存了16至24小时之间的样本可随后在用Ficoll处理之前用抗4立细胞抗体"稳定化"，而斜目同的纯化^Ht^^^更长的时间会导致ELISP0T分析中的SFC计it逐渐减少。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>当样本在室温下保存了长达48小时，然后被"稳定化"并用Ficoll处理时，获得了类似的结果。权利要求1.一种保存和纯化来自全血样本的细胞的方法，包括在纯化细胞之前和/或之后保存该样本至少6小时，以及纯化一群淋巴细胞和抗原呈递细胞以供在细胞介导免疫分析(CMI分析)中使用，所述纯化通过一种引入正向或负向亲和选择步骤的方法来进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述样^M^保存至少IO小时。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述样^^皮M至少12小时。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述样^^皮保存12至36小时之间、12至48小时或者24至48小时。5.根据上i^K利要求中任一项所述的方法，其中，所述样4^皮*在2-8。C。6.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述样4^皮*在18-25"C。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述纯化方法包括负向亲和选择步骤以除去粒细胞。8.根据权利要求7所述的方法,其中，所述方法包括使该样本与包括抗CD66b和血型糖蛋白A抗体的抗体制剂相接触，以使红细^粒细胞疑集，并且通过离心>^^斤述制剂中除去所述红细#粒细胞。9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述粒细胞的除去是通过使所述样本与包括抗CD15配体的固体支持物相接触以从该样本中除去CD15+细胞来实现的。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述固体支持物包括#,并且其中，该方法包括使该样本与该^M目接触以使CD15+细胞与该^K结合，以及从该样本中分离结合有CD15+细胞的^K。11.根据权利要求9至10中任一项所述的方法，其中，该样本中的红细Jf&it过裂解或过滤除去。12.根据上it^L利要求中任一项所述的方法，其中，所述纯化导致该样本中T细胞对总细胞的比例和抗原呈递细胞对总细胞的比例均升高；和/或其中，该样^4保存或者纯化或者在CMI分析中佳月之前的任何时间都不被冷冻。13.权利要求1至6中任一项所述的方法，它包括对所述细胞的正向亲和选择步骤，其中任选地，该亲和选择步^it择所有类型的T细胞。14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述方法包括将所述样本与附着有配体的固体支持物接触，从而分离淋巴细^抗原呈递细胞制剂，其中所述配体可结合存在于所逸林巴细胞和抗原呈递细胞的表面的细J!fe^面蛋白。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述固体支持物包括抗CD4、抗CD8、抗CD19和抗CD14配体中的一种或多种，以便将CD4+、CD8+、CD19+和/或CD14+细JJ&^全j6M^本中分离。16.根据权利要求14或15所述的方法，其中，在用于分析之前，将所述淋巴细胞和抗原呈递细胞制剂从该固体支持物上分离。17.根据权利要求14或15所述的方法，其中，所逸林巴细胞和抗原呈递细胞制剂被保留在所述固体支持物Ji^分析中^fM。18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中，所述固体支持物包括19.才艮据权利要求18所述的方法,其中，每个所述的^Ui结合有一个抗CD4、抗CD8和抗CD19g己体。20.根据权利要求18所述的方法，其中，每个>#^上结合有抗CD4、抗CD8或抗CD19中的一种或多种，并JL^斤ii^Ma^在"^，以4吏该固体支持物能够结合CD4+、CD8+和CD19+细胞。21.—种处理和絲全械本的方法，包括使用生长培养基稀释所述全jM羊本；并且将处理过的全jfi^羊本保存至少6小时，其中，在*之后，可获得一群淋巴细胞和抗原呈递细胞以供在细胞介导免疫分析(CMI分析)中賴。22.才艮据权利要求21所述的方法，进一步包括在#之后，A^斤述全jk4f23.根据权利要求21或22;斤述的方法，其中，)斤述全JM^本使用细胞生长培养基以l:l的比例辨f释。24.根据权利要求21、22或23所述的方法，其中，所述的细胞生长培养基为AIM-V。25.—种进行ELISP0T分析的方法，包括##权利要求1至20或22中任一项所述的方法来^#4^62##纯化一群淋巴细#抗原呈递细胞，以;S^ELISP0T分析中^^1该淋巴细#抗原呈递细胞制剂。26.—种在ELISP0T分析中,来自全血的、分离的T细胞的肽特异性细胞因子应答的方法，包括^^正向或负向亲和选择A^斤述全J6^本中分离一群包括T细胞和抗原呈递细胞的细胞。27.根据权利要求26所述的方法，其中-T细胞和抗原呈递细胞群通it^利要求7至26中4壬一项限定的方法从全血中分离；和/或-其中，在进行亲和选择之前，所述样本保存至少10小时、至少12小时，或者在12至36小时之间、12至48小时之间或者24至48小时之间；和/或-其中，在进行亲和选择之前，所述样本M在2-8t:之间或者18-25'C之间。28.—种制备适用于ELISPOT分析的淋巴细胞和抗原呈递细胞的方法，其中，所述方法包^it过过滤除去红细胞,其中所述方'^fii^包括使所述全血样^it过一个过滤器，允许红细胞穿过该过滤器，151^从该过滤器收集淋巴细胞和抗原呈递细胞。29.根据权利要求28所述的方法，其中反向冲J5^斤述it^虑器以回Jl^斤ii^巴细胞和抗原呈递细胞。30.根据上a利要求中任一项所述的方法，该方法在来自人体的样本上进行，任选地该样本在CMI分析中使用以诊断疾病。31.—种用于实;^K利要求25的方法的试剂盒，包括(i)一种细胞因子特异性抗体，^i^附着于微滴定板，和(ii)权利要求9和15中^—项限定的配体/抗体中的一种或多种，<链地结合于一个固体支持物，和(iii)任选地，实施M和纯化细胞的方法和/或进行ELISP0T分析的说明书。32.—种用于根据权利要求1至20、26和27中^~~项来纯化一群淋巴细齡抗原呈递细胞的试剂盒，其中，该试剂盒包括(i)权利要求9和15中P艮定的配体/M中的一种或多种，^i^结合于一个固体支持物，和(iiMii^地，用于实施该纯化的说明书。全文摘要一种保存和纯化来自全血样本的细胞的方法，包括在纯化细胞之前和/或之后保存该样本至少6小时，以及纯化一群淋巴细胞和抗原呈递细胞以供在细胞介导免疫分析(CMI分析)中使用，所述纯化通过一种引入正向或负向亲和选择步骤的方法来进行。文档编号G01N1/34GK101529221SQ200780037140公开日2009年9月9日申请日期2007年10月5日优先权日2006年10月6日发明者A·奥基夫,I·杜兰特,M·班普顿,T·戴申请人:牛津免疫科技有限公司