专利名称：子宫癌遗传检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体子宫癌遗传易感性的试剂盒， 通过同时检测与子宫癌密切相关的雌激素受体a基因(ER-a)、细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)、 细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、细胞色素P450 1B1基因(CYP1B1)上的单核苷酸多态性位点基因型 来评估个体子宫癌遗传易感性。
背景技术：
子宫癌即子宫内膜癌，是起源于子宫内膜腺体的恶性肿瘤，由于原发于子宫体部，故又称子宫体癌。在 生育期的妇女，子宫内膜每个月都增厚，准备接受一个受精卵，如果卵子未受精，子宫内膜的外层组织和 血管就会剥脱，然后通过月经排出。如果子宫内膜增殖，就有可能发展为子宫癌。该病是妇女常见的恶性 肿瘤，而且基本上是一种老年妇女肿瘤，多发生于55-59岁妇女，40岁以下70岁以上发病均较少。
ER编码的雌激素受体是SHRS成员之一，该受体在乳腺、肝脏、骨骼、泌尿生殖道、动脉血管和中枢 神经系统中表达。ER(包括ER-a和ER-e)属于糖蛋白，特异性强、亲和力高、结合容量低、受热容易变 质，是核受体家族的成员。ER-a基因codonlOT/C位点是位于该基因第1号外显子TAF-1区上的一个T/C 多态位点，弓l起ER-a基因编码的蛋白第10个氨基酸发生Ser同义突变。该位点基因型有TT、 TC、 CC, 研究显示C等位基因起保护作用，可降低子宫癌的患病风险，TT/TC是子宫癌的风险基因型。研究显示， 当个体携带风险基因型时，改变了位于ER-a氨基末端TAF-l区对雌激素的应答水平，从而影响由雌激素 介导的生理及病理过程，促进子宫内膜增生及血管增殖，导致子宫癌的患病风险上升。
CYP17A1是细胞色素P450酶家族成员之一，定位于细胞内质网上，在全身各组织器官都有表达，其 中肝和肾表达量较多。CYP17A1同时具有17a-羟化酶、17，20-裂解酶的活性，在类固醇生成的途径中起 关键作用，能合成黄体酮、盐皮质激素、糖皮质激素、雄激素和雌激素。CYP17A1基因MspAl I酶切位 点是5' UTR端上的一个C/T多态位点(T27C)， A1(T)、 A2(C)是该位点的两个等位基因，前者可增加该基 因的转录效率，从而提高酶活性，产生更多的可转化为雌激素的雄激素前体物。该多态位点的基因型有 A1/A1、 Al/A2、 A2/A2三种，其中A1/A1和Al/A2是子宫癌的风险基因型。国内关联研究显示，CYP17A1 基因多态性与子宫癌的发生有关。携带野生型(A1)等位基因者该基因的转录效率提高，导致酶的总活性提 高，产生更多的可转化为雌激素的雄激素前体物，体内雌激素水平升高，从而增加了子宫内膜癌的患病风 险。
细胞色素P450 1A1是活化多环芳烃类致癌物的主要酶类。它作为一种微神经元体细胞酶与一些致癌物 质的生物激活有关，例如苯并芘[benzo(a)pyrene]。同时，CYP1A1易于被2,3，7^-四氯二苯-对-二恶英 (2，3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin， TCDD)禾卩3-甲基胆蒽等多环的芳香族化合物所诱导。CYP1A1 Msp I 位点是位于该基因3'-端非编码区多聚八下游26朴？处的17<:多态位点。共有三种基因型TT(ml/ml)、 TC(ml/m2)、 CC(m2/m2)。其中TC、 CC为风险基因型，携带C等位基因可被限制性核酸内切酶Msp I识 别。研究显示，当CYPlAlMspI酶切位点发生突变后，该酶的诱导活性增强，即容易受到环境致癌物的 影响，从而诱导产生更多的CYP1A1，使得致癌物质的活化加速，若其他解毒酶不能及时将该类物质代谢 排出，则会造成DNA损伤和细胞畸变，增加患癌症的风险。因此当携带风险基因型TC、 CC时，子宫癌 发病风险上升。 '
CYP1B1是目前CYP1B亚家族的唯一成员。CYP1B1参与环境中多种前致癌物及抗癌药的激活、代谢， 并介导17-雌二醇(E2)的C4羟化。CYP1B1的代谢产物4-羟基雌二醇在所有雌激素代谢产物中致癌性最强， 许多动物模型中都显示4-羟基雌二醇与子宫癌发病有关。4-羟基雌二醇可以通过其醌类代谢产物与DNA 结合，引起DNA氧化损伤；还可以与雌激素受体相结合对耙细胞发挥雌激素的作用。因此，CYP1B1基 因变异与由雌激素过多引起的多种癌症发病有关，比如子宫癌。CYP1B1基因Leu432Val位点是位于该基 因第432密码子处的C/G多态位点，导致Leu变为Val。该位点具有三种基因型CC(Leu/Leu)、 CG(Leu/Val)、 GG(Val/Val)，其中CG和GG是子宫癌的易感基因型。研究表明，CYP1B1基因6eu432变为Val432,使 CYP1B1基因编码产物的催化活性增加2-3倍，导致具有高致癌性的雌激素代谢产物4-羟基雌二醇水平升高，4-羟基雌二醇可直接诱导DNA单链断裂，还可通过一系列氧化还原反应生成苯醌类代谢物，该类物 质为亲电子化合物，能与DNA分子结合形成DNA加合物，引起DNA的损伤，导致子宫癌的患病风险增 加。
发明内容
基于雌激素受体a基因(ER-a )、细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)、细胞色素P450 1A1基因 (CYP1A1)、细胞色素P450 1B1基因(CYP1B1)上的4个SNP位点多态性可用来评估个体子宫癌遗传易感 性的基础上，本发明提供一种检测个体子宫癌遗传易感性的试剂盒。 该试剂盒包括
检测ER-a基因上codon10 T/C SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测CYP17A1基因上MspAl I SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测CYPlAl基因上Msp I SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 检测CYP1B1基因上Leu432Val SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对； 荧光定量PCK反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离子水等)。 本试剂盒中所述的引物对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，并可用常规的合成技术进行合成。 本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是本领域技术人员能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对可用 常规的探针合成技术进行合成。
本发明试剂盒的组分和含量包括
10 X荧光定量PCR反应缓冲液化l，
25mM dNTP混合液0.4nl，
25mM MgC12溶液2. 4pl，
5units/nl Taq DNA聚合酶0. Olpl,
20MM特异性引物对每条引物各0.225nl，
10PM特异性荧光探针对每条探针各0.25nl，
去离子水21.3^1。 本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取
用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，分别进行4次独立的荧光定量PCR反应，每个反应的体系为 总体积lOpl,包含浓度为20ng/nl的DNA模板2pl、 lpl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液、0. lpl 25raM dNTP 混合液、0.6^1 25mM MgCh溶液、0.025^1 (5unitsAil) Taq DNA聚合酶、20-的有义引物和反义引物 各0.225nl、 1(HiM的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0.25nl，去离子水5.325pl。
在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、 2分钟，95。C、 IO分钟，进行60个循环的95°C、 30秒， 60'C、 l分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤4:基因型分析
根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。
熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量，根据不同序列探针VIC和FAM荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因型。
实施例2.应用检测试剂盒进行个体子宫癌遗传易感性检测的服务 步骤l: DNA提取
由医院检验科医师指导被检者使用口腔釆样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮 细胞的DM抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者基因组DNA的雌激素受体a基因(EK-a )上codon10 T/C SNP位 点、细胞色素P450 17Al基闲(CYP17A1)上MspAl I SNP位点、细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上Msp I SNP位点、细胞色素P450 1B1基因(CYP1B1)上Leu432Val SNP位点进行荧光定量PCK检测，确定这4 个SNP位点的基因型。
步骤3:个体子宫癌遗传易感性的分析
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具个体子宫癌遗传易感性的分析报告单。报告中详细说明了被 检测者子宫癌遗传风险的高低，并由医师向被检者详细说明和解读个体子宫癌遗传易感性分析报告单。
权利要求
1.一种检测个体子宫癌遗传易感性的试剂盒，其特征在于包括同时检测雌激素受体α基因(ER-α)上codon10T/C SNP位点、细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)上MspA1I SNP位点、细胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上Msp I SNP位点、细胞色素P4501B1基因(CYP1B1)上Leu432Val SNP位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括10 X荧光定量PCR反应 缓冲液糾,25mMdNTP混合液0. 4W， 25mMMgC12溶液2. 4ri， 5units/Ml Taq DNA聚合酶O.Olri， 20MM 特异性引物对每条引物各0.225W, IO幽特异性荧光探针对每条探针各0.25ri，去离子水21.3ri。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C 。
全文摘要
本发明公开了一种检测子宫癌遗传风险的试剂盒。该试剂盒包括检测雌激素受体α基因(ER-α)、细胞色素P450 17A1基因(CYP17A1)、细胞色素P450 1A1基因(CYPIA1)、细胞色素P450 1B1基因(CYP1B1)上的单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过同时检测与子宫癌遗传风险密切相关的基因上的多态性位点基因型来评估个体子宫癌遗传风险。
文档编号G01N21/64GK101608230SQ20081003927
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司