一种检测真菌多糖的方法

文档序号:6153799阅读:955来源:国知局
专利名称:一种检测真菌多糖的方法
技术领域
本发明涉及一种检测真菌多糖的方法。
背景技术
多糖是自然界含量最丰富的高分子化合物,其在自然界分布极其广泛,高 等植物、藻类、菌类及动物体内均有存在,多糖类物质所具有的多种生物学及 药理功能已引起人们的高度重视。多糖科学作为后基因组时代异军突起的学科 已纳入国际前沿研究领域。在国际上,食、药用真菌多糖被称为"生物反应调
节剂"(Biological Response Modifier,简称BRM),由于它是一类能够增强人体 免疫功能的生物活性物质,具有广泛的生理和药理功能,近年来,食、药用真 菌多糖已成为生物化学、分子生物学、医学、药学、食品科学等领域的研究热 点之一。虽然人们已对真菌多糖的结构、生物活性、药理功能等方面进行了较 为广泛和深入的研究,但如何高效检测真菌多糖还并未见合适的方法报道。目 前,所使用的多糖检测方法主要有苯酚-硫酸法、凝胶电泳法、HPLC法等。苯 酚-硫酸法既是一种检测多糖的经典方法,又被称之为是定量检测多糖的标准 方法,但该法是一种无法严格定量的化学分析法,不仅操作技术难以掌握,而 且误差较大。凝胶电泳法和HPLC法可以说是分析检测多糖的现代方法,凝胶 电泳法的使用前提是样品要带电,而多数多糖都是不带电荷的中性化合物,这 就使得凝胶电泳法的使用范围受到极大的限制。HPLC法对于多数大分子化合物 分析检测确是一种不错的方法,但由于多糖的分子量较大,粘度大,多糖与固 定相的吸附始终是一个难以克服的问题。另外,上述的这些方法都还必需要有 标准物作参照才能使用。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作程序简便、迅速,条件温和,不破坏样品,样品吸附极少,无需标样,灵敏度高,可同时检测真菌多糖的多 种物理化学特性参数的检测方法。 本发明采用的技术方案是
该检测真菌多糖的方法是以具有宽广的动态量程、不存在剪切力、快速分 离的单相色谱技术为核心,并与多角度激光光散射法,高灵敏示差法及动态光 散射法进行有机组合构成的一种既可在线、又可离线,既可直接定量检测真菌 多糖,又可对多糖的绝对分子量;分子尺寸和第二维里系数;分散度;均方根 旋转半径;分子构象;溶解性和稳定性等特性进行表征以及分析的方法。
该检测真菌多糖的方法,具体包括以下工艺步骤
(l淛样
称取10-100mg的真菌多糖样品置于干净的试管或小量杯中,加入5-60ml 蒸馏水或0.85%氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(7.0 mmol/L KH2P04, 7.0 mmol/L Na2HP04,pH-6.8)搅拌使其溶解后,于4。C低温冰箱中保存备用。样品液的浓 度为0.1-0.98mg/ml;
(2) 流动相的制备
将上述用于溶解多糖的溶剂用脱气机进行脱气处理后作为流动相;
(3) 进样、缓冲、聚焦平衡
将单相色谱(非对称场流分离)仪(The Eclipse AF4)、多角度静态光散 射仪(MALS, DAWNHELEOSII)、动态光散射仪(DLS, DynaPro Titan)、示 差折光检测器(RI, OPTILABrEX)、脱气机(1100 Series vacuum degasser)和进 样泵等进行有效连接整合成一个完整的系统;以该系统为基础来实施本检测真 菌多糖的方法;
工艺操作条件用微量移液器吸取上述己制备好的多糖样品5-120pL及适 量的流动相进行进样、缓冲与聚焦平衡。进样、缓冲、聚焦平衡时间为5-10 min, 进样速度0.05-0.95 mL/min,聚焦平衡时间为1-5 min;流道流速0.2-2 mL/min,交叉流流速起始以2-9 mL/min运行1-5分钟,然后降至1-4 mL/min运行3-8 分钟后逐渐降低至0 ml/min,总运行时间为10-60分钟;操作方式为先调节流 道流和交叉流的流动相的流速,待平衡稳定后再开始进样。糖样的流速为 0.05-0.95 mL/min;
进样既包括自动进样方式也包括手动进样方式,缓冲和聚焦平衡是既包括 流道流和交叉流的流动相的、也包括多糖样品的缓冲和聚焦平衡。
(4) 洗脱分离
用上述制备的流动相溶液做洗脱剂,在上述样品进样、缓冲与聚焦平衡完 成后开始洗脱5-49分钟;
(5) 检测
检测手段采用在线或离线两种检测,在线检测是指自洗脱开始至洗脱结束 的全程检测;而离线检测则是指洗脱完毕后的全部检测。检测多糖的种类既可 是水溶性又可是水不溶性多糖。
本发明所述的真菌多糖样品系指香菇多糖、猴头多糖、灵芝多糖、黑木耳 多糖、灰树花多糖等食、药用真菌多糖中的任何一种或数种。其制样方法是一 种不改变样品理化性质的方法。
本发明所公开的检测真菌多糖方法的有益效果是
该方法是以具有宽广的动态量程、不存在剪切力、快速分离的单相色谱技 术为基础,并与多角度激光光散射法,动态光散射法及高灵敏示差法进行有机 组合构成的一种既可直接定量检测多糖,又可对多糖的绝对分子量;分子尺寸 和第二维里系数;分散度;均方根旋转半径;分子构象;溶解性和稳定性等特 性进行表征以及分析的方法。与现有的多糖检测方法如苯酚-硫酸法、凝胶电 泳法、HPLC等法相比,本发明具有以下几个特点①既可定量又可定性检测多 糖,它是一种集定量与定性于一体的检测方法。②不破坏样品,全物理检测。 ③样品吸附极少。④操作程序简便、迅速,条件温和。⑤无需标样即可获得多糖的绝对分子量及其分布,且所测多糖的分子量大小范围广泛。(D灵敏度高, 可达10—9。⑦可同时检测多糖的多种物理化学特性。本发明可广泛用于多糖及 其它相关化合物的分析检测、质量控制及研发。
具体实施例方式
以下介绍本发明的实施例。
实施例l:该检测真菌多糖的方法,具体包括以下工艺步骤 (l淛样
分别称取一定量(20mg)的多糖样品(香菇多糖,猴头多糖,灰树花多 糖,金针菇多糖,苦瓜多糖)置于5个干净的试管或小量杯中,加入5ml蒸馏 水搅拌使其溶解后,于低温(4'C)冰箱中保存备用。样品液的浓度为0.1mg/ml;
(2) 流动相的制备
将上述用于溶解多糖的溶剂用脱气机进行脱气处理后作为流动相;
(3) 进样、缓冲、聚焦平衡
将单相色谱(非对称场流分离)仪(The Eclipse AF4)、多角度静态光散 射仪(MALS, DAWNHELEOSII)、动态光散射仪(DLS, DynaPro Titan)、示 差折光检测器(OPTILABrEX)、脱气机(1100 Series vacuum degasser)和进样泵 等进行有效连接整合成一个完整的系统;以该系统为基础来实施本实施例及下 述各实施例;
工艺操作条件用微量移液器吸取上述已制备好的多糖样品l(HlL及适量 的流动相进行进样、缓冲与聚焦平衡。进样、缓冲、聚焦平衡时间为5 min, 进样速度0.1mL/min;聚焦平衡时间为1 min,流道流速0.2mL/min,交叉 流流速起始以2mL/min运行5分钟,然后降至1 mL/min运行8分钟后逐渐 降低至Oml/min,总运行时间为55分钟。糖样的流速为0.1 mL/min;
(4) 洗脱分离
用上述制备的流动相溶液做洗脱剂,在上述样品进样、缓冲与聚焦平衡完成后开始洗脱48分钟; (5)检测
检测手段为在线检测。
实施例2:与实施例l的步骤相同,所不同的是
1. 称取60mg的多糖样品(香菇多糖,猴头多糖,灰树花多糖,金针菇 多糖,苦瓜多糖)置于干净的试管或小量杯中,加入30ml 0.85%氯化钠溶液搅 拌使其溶解后,于低温(4'C)冰箱中保存备用。样品液的浓度为0.5mg/ml;
2. 操作工艺条件为用微量移液器吸取上述己制备好的多糖样品60]iL 及适量的流动相进行进样、缓冲与聚焦平衡。进样、缓冲、聚焦平衡时间为8 min,进样速度0.5mL/min;聚焦平衡时间为3 min,流道流速1.2mL/min, 交叉流流速起始以5mL/min运行3分钟,然后降至2.5 mL/min运行5.5分 钟后逐渐降低至Oml/min,总运行时间为35分钟。糖样的流速为0.5 mL/min;
3. 洗脱分离用上述制备的流动相溶液(0.85%氯化钠)做洗脱剂,在上 述样品进样、缓冲与聚焦平衡完成后开始洗脱23分钟;
4. 本实施例的检测手段为离线检测。 实施例3:与实施例l的步骤相同,所不同的是
1. 称取100mg的多糖样品置于干净的试管或小量杯中,加入60ml磷酸 盐缓冲液(7.0 mmol/L KH2P04, 7.0 mmol/L Na2HP04, pH = 6.8)搅拌使其溶解 后,于低温(4'C)冰箱中保存备用。样品液的浓度为0.95mg/ml;
2. 操作工艺条件为用微量移液器吸取上述已制备好的多糖样品120pL 及适量的流动相进行进样、缓冲与聚焦平衡。进样、缓冲、聚焦平蘅时间为 10min,进样速度0.95 mL/min;聚焦平衡时间为5 min,流道流速2.0 mL/min, 交叉流流速起始以9mL/min运行l分钟,然后降至4 mL/min运行3分钟后 逐渐降低至0 ml/min,总运行时间为25分钟。糖样的流速为0.95 mL/min;
3. 洗脱分离用上述制备的流动相溶液(磷酸盐缓冲液)做洗脱剂,在上述样品进样、缓冲与聚焦平衡完成后开始洗脱15分钟; 4.本实施例的检测手段为在线检测。
根据上述3个实施例,均可获得以下结果(见表l、表2): 表l:几种不同多糖样品的浓度及分子量(Mw)
样品 含糖量g/1 分子量(kDa)
香薛多糖 18.96 312.95
猴头多糖 15.80 113.62
灰树花多糖 17.85 625.64
金针菇多糖 13.27 91.39
苦瓜多糖 11.28 23.56
表2:几种不同多糖样品的浓度及分子量分布特性(Mw)
样品
含糖量g/1
分子量分布(kDa)
香菇多糖
猴头多糖
灰树花多糖
金针菇多糖
苦瓜多糖
18. 96 15. 80 17. 85 13. 27 11.28
162.87-432. 72 73. 66-212. 24 425.68-962.15 62.25-152.19 10. 50—32. 98
权利要求
1. 一种检测真菌多糖的方法,包括以下工艺步骤(1)制样称取10-100mg的真菌多糖样品置于干净的试管或小量杯中,加入5-60ml蒸馏水或0.85%氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(7.0mmol/L KH2PO4,7.0mmol/LNa2HPO4,pH=6.8)搅拌使其溶解后,于4℃低温冰箱中保存备用,样品液的浓度为0.1-0.98mg/ml;(2)流动相的制备将上述用于溶解多糖的溶剂用脱气机进行脱气处理后作为流动相;(3)进样、缓冲、聚焦平衡将单相色谱(非对称场流分离)仪(The Eclipse AF4)、多角度静态光散射仪(MALS,DAWN HELEOS II)、动态光散射仪(DLS,DynaPro Titan)、示差折光检测器(RI,OPTILAB rEX)、脱气机(1100Series vacuum degasser)和进样泵等进行有效连接整合成一个完整的系统,以该系统为基础来实施本检测真菌多糖的方法;工艺操作条件用微量移液器吸取上述已制备好的多糖样品5-120μL及适量的流动相进行进样、缓冲与聚焦平衡,进样、缓冲、聚焦平衡时间为5-10min,进样速度0.05-0.95mL/min,聚焦平衡时间为1-5min;流道流速0.2-2mL/min,交叉流流速起始以2-9mL/min运行1-5分钟,然后降至1-4mL/min运行3-8分钟后逐渐降低至0ml/min,总运行时间为10-60分钟;操作方式为先调节流道流和交叉流的流动相的流速,待平衡稳定后再开始进样,糖样的流速为0.05-0.95mL/min;(4)洗脱分离用上述制备的流动相溶液做洗脱剂,在上述样品进样、缓冲与聚焦平衡完成后开始洗脱5-49分钟;(5)检测检测手段采用在线或离线两种检测,在线检测是指自洗脱开始至洗脱结束的全程检测;而离线检测则是指洗脱完毕后的全部检测。
2. 根据权利要求1所述的检测真菌多糖的方法,其特征在于所述(l)制样中的真菌多糖样品系指香菇多糖、猴头多糖、灵芝多糖、黑木耳多糖、灰树 花多糖等食、药用真菌多糖中的任何一种或数种。
3. 根据权利要求1或2所述的检测真菌多糖的方法,其特征在于所述 的步骤(l)制样方法是一种不改变样品理化性质的方法。
4. 根据权利要求1或2所述的检测真菌多糖的方法,其特征在于所述(2) 步骤中的流动相是指所有能溶解多糖的溶剂,包括水相及有机相。
5. 根据权利要求1或2所述的检测真菌多糖的方法,其特征在于所述(3) 步骤中的进样既包括自动进样方式也包括手动进样方式,缓冲和聚焦平衡是 既包括流道流和交叉流的流动相的缓冲和聚焦平衡、也包括多糖样品的缓冲和 聚焦平衡。
6. 根据权利要求1或2所述的检测真菌多糖的方法,其特征在于所述 (5)步骤检测多糖的种类既可以是水溶性多糖又可以是水不溶性多糖。
7. 根据权利要求1或2所述的检测真菌多糖的方法,其特征在于所述 (3)、 (4)和(5)步骤是以单相色谱作为样品的分离系统,并以多角度激光光散射法(MALS),动态光散射(DLS)法及高灵敏示差(OPTILABrEX)法进行动态在线 或离线检测来获得多糖的各种理化参数;它是将单相色谱法,多角度激光光散 射法(MALS),动态光散射(DLS)法及高灵敏示差(OPTILABrEX)法进行有机组合构成的一种既可直接定量检测多糖,又可对多糖的绝对分子量;分子尺寸 和第二维里系数;分散度;均方根旋转半径;分子构象;溶解性和稳定性等特 性进行表征以及分析的方法。
全文摘要
本发明公开了一种检测真菌多糖的方法,该方法是单相色谱技术为核心,并与MALS,高灵敏示差法及DLS进行有机组合构成的一种既可在线、又可离线,既可定量检测,又可对多糖的绝对分子量;分散度;分子构象;溶解性和稳定性等特性进行表征及分析。该方法包括制样、流动相的制备、进样、缓冲、聚焦平衡、洗脱分离和检测等步骤。与现有的苯酚-硫酸、凝胶电泳、HPLC等法相比,本发明具有以下特点集定量与定性于一体;不破坏样品,全物理检测;样品吸附极少;操作程序简便、迅速,条件温和;无需标样即可获得多糖的绝对分子量及其分布;灵敏度高,可达10<sup>-9</sup>;可同时检测多糖的多种物理化学特性。可广泛用于多糖及其它相关化合物的分析检测、质量控制及研发。
文档编号G01N30/02GK101441202SQ200810231539
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者王卫国, 赵永亮 申请人:河南工业大学
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