专利名称：微波腔中的荧光显微镜的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种光学成像系统，其提供化学反应时间的提高以及实时监测反应的
能力，并且具有足够的分辨率来观察用发光分子标记的细胞内组分的位置、以及多种生物
分子之间的相互作用和对活细胞和组织中的局部化环境变化的响应。 在一个方面中，本发明涉及微波/光学成像系统，其包括 a)被封闭的容器，其包括微波腔并且在其中具有至少一个开口 ； b)设置于微波腔中用于保持至少一个样品的样品板，其中样品包括检测剂分子或
进行能够被检测的反应的组分； c)通信连接于微波腔用于将微波能量递送进微波腔中并朝向样品引导的微波能
4量产生源； d)设置用于向样品递送能量的电磁能量产生源；禾口 e)通信连接于微波腔的光学成像装置，其设置为用于将来自电磁能量产生源的光 引导到样品并且捕获由样品发射的发光发射。 在另一个方面中，本发明涉及微波/显微镜系统，所述系统包括 a)被密封的容器，其包括微波腔并且在其中具有预定尺寸的开口，其中微波腔的
内部包括用于放置至少一个样品板的平台，所述样品板用于保持至少一个样品，其中所述
样品包括作为额外的标记分子而被包括在内的信号产生试剂或由于样品中的化学反应而
形成的试剂； b)通信连接于微波腔用于将微波能量递送进微波腔中的微波能量产生源；禾口
c)通信连接于微波腔的荧光显微镜系统，其设置为用于向样品递送激发能并且捕 获来自样品的发射，其中所述荧光显微镜系统包括
用于以一定频率产生能量来激发样品的电磁能量产生源； 设置为用于从所述电磁能量产生源接受电磁能量并将其聚焦在样品上的物镜；
设置在激光器和物镜之间的二向色镜，用于将来自能量源的电磁能量反射到物镜 以及用于引导来自样品的发射信号；禾口 设置在二向色镜后面的管透镜，用于收集来自样品的发射并将其引导到检测器装置。 所述样品板可以包括沉积在样品板表面上的至少一层金属材料，包括银、金、铜、 锌、铝或铂，其中所述金属材料形成为带图案的形状。优选地，所述带图案的形状包括具有 至少一个顶端的几何形状，几何形状为例如三角形、正方形、矩形、梯形、多边形、抛物线形、 椭圆形、圆的扇形、长椭圆形和/或其组合，其中所述多个顶端彼此相邻，从而在其中产生 反应性区域。所述其中的反应性区域可以另外准备用于放置被固定的与检测剂分子互补的 捕获分子、用于与其它化学品反应的化学品、或用于与其它生物分子反应的生物分子。所述 反应性区域可具有的直径或在相邻和/或相对顶端之间的距离为约0. Olmm到5mm、更优选 2mm到约3mm。另外，所述反应性区域可以被设置在具有多个孔的试验系统上，其中所述反 应性区域位于所述孔内并且暴露于微波能量下增强其中的反应。 样品板可以由聚合物材料、玻璃、纸、硝化纤维素、其组合或为设置金属材料提供 足够稳定性的任何材料制成。 所述顶端区域/反应性区域暴露于一定量的微波能量下，用于提高生物学相互作 用的反应速率，用于提高感测技术中的来自化学发光反应、荧光、磷光或荧光标记的发射强 度；用于通过将电磁场聚焦在反应性区域内而增强电场，和/或用于增强反应性区域内所 含分子的布朗运动。 本发明的另一个方面涉及制备样品板的方法，所述方法包括 a)向衬底表面施加至少一个金属结构，所述衬底表面包括但不限于玻璃、聚合物、 纸、硝化纤维素，其中所述金属结构由银、金、铝、锌、钼、铜或其组合物制成，其中所述金属 结构具有成形的图案，并且其中成形图案的区域包括设置为邻近另一个成形图案顶端的顶 端区域，从而提供处于至少两个顶端区域之间的反应性区域；禾口 b)引入包含至少一种生物分子的溶液，用于设置在所述相邻的顶端区域之间的反
5应性区域。 本发明的另一个方面涉及使由微波诱导的生物分子的反应或相互作用实时数据 成像的方法，所述方法包括 a)提供包括至少一种生物分子和检测剂分子的样品，其中将所述样品设置在样品 板上； b)将样品置于微波腔中，其中所述微波腔通信连接于微波产生源并且还通信连接 于光学成像系统，其中所述光学成像系统包括 i.用于以一定频率产生能量来激发样品的电磁能量产生源；
ii.设置用于接受激发电磁能量并将其聚焦在样品上的物镜； iii.设置在激光器和物镜之间的二向色镜，用于将来自能量源的电磁能量反射到 物镜以及用于引导来自样品的发射信号；禾口 iv.设置在二向色镜后面的管透镜，用于收集来自样品的发射并将其引导到检测 器装置； c)用一定量的低功率微波能量辐射样品以增加样品中的相互作用或反应；禾口
d)用步骤b)的光学成像系统将检测剂分子的发射信号成像。 使用被引导给置于由相邻的金属图案形成的反应性区域中的样品的低功率微波 能量提高在样品内发生的化学反应的速度。 本发明的其它特征和优点通过以下发明详述、附图和权利要求而变得显而易见。
图1表示本发明的微波/显微镜的实施方案。 图2表示用于制备在本文所述系统中使用的样品板的样品几何结构方案。 图3显示10 MRu(by)2Cl2在不同温度下的归一化强度谱。玻璃几何结构(插图，
样品几何结构)的10iiM Ru(by)^l2溶液的归一化强度比用箭头标记，"蝶形领结"样品几
何结构(插图，样品几何结构)的10iiMRu(by)^^溶液的归一化强度比用虚线标记。归一
化强度比计算为暴露于短微波脉冲过程中的时间依赖性发射强度与暴露于短微波脉冲之
前的最大发射强度的比值。 图4表示'蝶形领结'(一 ---')和玻璃载片(--)样品几何结构在施加
低功率微波脉冲之前(大的破折号——)和过程中的Ru(by)2Cl2发射(没有二向色镜)的 归一化光谱。叠加了二向色透射曲线来显示二向色镜对Ru(by)^l2发射的过滤作用。
图5示出了得自CCD图像的在IOO像素2区域内的归一化的平均荧光强度(由 方框法估计的所选区域)的时间描图，所述描图是在施加5秒低功率微波脉冲(Mw脉 冲)过程中在不相交的'蝶形领结'接合点处以及在普通(plain)玻璃载片(对照)上的 10i!MRu(by)2Cl2溶液的描图。样品构造显示在CCD图像的右侧(插图)。
图6显示在A)普通玻璃衬底、B)用气相淀积的金'蝶形领结'结构75nm改性的玻 璃衬底上的在暴露于五秒微波脉冲过程中10i!MRU(by)2Cl2的荧光强度降低的实时电影记 录，显示了在微波腔中的荧光显微镜的功能性。 图7显示了在普通玻璃载片(对照)上以及在75nm厚的不相交的'蝶形领结'几 何结构的间隙中的得自化学发光溶液的最大像素强度时间描图。以10Hz的速率收集CCD图像大约10秒。样品暴露于五秒微波脉冲(Mw脉冲)，所述脉冲在数据收集之后大约2秒 开始。离散的时间间隔被标记为a)0秒或稳态发射、b)在初始暴露于微波脉冲时的发射、 c)在施加微波脉冲过程中和d)最大'触发'发射、e)最终的发射。 图8显示了在普通玻璃载片(对照)上的不相交处的化学发光溶液在离散的时间 间隔处的CCD图像。以10Hz的速率收集CCD图像大约10秒。样品暴露于五秒微波脉冲 (Mw脉冲)，所述脉冲在数据收集之后大约2秒开始。离散的时间间隔被标记为a) 0秒或稳 态发射、b)在初始暴露于微波脉冲时的发射、c)在施加微波脉冲过程中和d)最大'触发' 发射、e)最终的发射。 图9显示了在不相交的'蝶形领结'接合点上在不相交处的化学发光溶液在离散 的时间间隔的CCD图像。以10Hz的速率收集CCD图像大约10秒。样品暴露于五秒微波脉 冲(Mw脉冲)，所述脉冲在数据收集之后大约2秒开始。离散的时间间隔被标记为a)O秒 或稳态发射、b)在初始暴露于微波脉冲时的发射、c)在施加微波脉冲过程中和d)最大'触 发'发射、e)最终的发射。 图10显示了 6 的化学发光溶液的绿色CCD电影记录图像，A)在玻璃衬底上， B)在不相交的'蝶形领结'几何结构(破折号轮廓表示三角形的'蝶形领结'端部)的间隙中。 发明详述 本发明涉及通信连接于微波能量产生源的实时光学成像系统，从而提供用于在施
加微波场过程中记录生物分子相互作用的实时数据和生物系统中的反应的手段。 本发明的系统可以为微波或射频驱动的在表面处、溶液中、在包括原核生物和真
核生物在内的活生物体中的蛋白质-蛋白质、DNA-蛋白质、RNA-蛋白质、DNA-RNA、化学
品_蛋白质、化学品-DNA、和化学品-蛋白质之间的相互作用提供实时成像。此外，本发明
为由微波诱导的对生物系统的影响提供实时成像，为原核生物和真核生物体中、在界面处、
表面处和溶液中的由微波诱导的生物分子反应提供实时成像。另外，本发明为由微波诱导
的将小生物分子转染到活生物体、原核生物和真核生物中提供实时成像。 本文中使用的术语"生物分子"是指在自然界中存在的任何分子或这种分子的衍
生物。所述生物分子可以是活性的或无活性的形式。"活性形式"是指该生物分子处于可以
执行生物学功能的形式。"无活性形式"是指该生物分子必需在其执行生物学功能之前经过
天然或合成的处理。示例性的生物分子包括核酸、芳香碳环结构、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白
质、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黄素、DNA、RNA、寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌红蛋白、糖类
例如葡萄糖等、维生素、辅助因子、嘌呤、嘧啶、间型霉素、脂质、植物光敏色素、phytofluor、
肽、脂质、抗体和藻胆蛋白。 本文中使用的术语"受体-配体"是指其中各组分彼此具有亲合力的任何天然存 在的或非天然存在的结合对。例如，所述结合对可以包括抗体/抗原复合物、病毒包衣配体 /蛋白质细胞受体或探针和结合配对体的任何组合。术语"受体"是指对于样品中的特定的 化学基团、分子、病毒、探针或任何生物制剂靶标具有亲和力的天然存在的或合成的化学基 团、分子、生物试剂。用于本发明的受体-配体的选择可以由疾病、病况或要检测的感染来 决定。 本发明的系统包括检测剂分子或对电磁激发、化学激发、光源激发、或连续或脉冲激发的激光束有响应以产生荧光的可检测的化学反应，所述响应包括化学发光、荧光或磷 光发射。 检测剂分子包括在该物质被不同波长(激发波长)的辐射照射时发射电磁能量的 荧光团，所述电磁能量例如为某一波长(发射波长)的光，并且意在包括能够与样品中的所 关心的被分析物特异性地相互作用或反应以提供一种或多种光信号的化学或生物化学分 子或其片段。另外，荧光团包括非固有荧光团(extrinsic fluorophore)和固有荧光团。非 固有荧光团是指结合于另一种物质的荧光团。固有荧光团是指自身是荧光团的物质。示例 性的荧光团包括但不限于在Molecular Probes Catalogue中列举的那些，所述文献被并入 本文作为参考。 代表性的荧光团包括但不限于Alexa Fluor⑧350、 DansylChloride (DNS-C1)、 5-(碘代乙酰胺基)荧光素(5-IAF)凍光素5-异硫氰酸酯(FITC)、四甲基罗丹明5-(和 6_)异硫氰酸酯(TRITC)、6-丙烯酰基-2-二甲氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧 杂-1， 3- 二唑-4-基氯化物(NBD-C1)、溴化乙锭、萤光黄、5-羧基罗丹明6G盐酸盐、丽丝胺 罗丹明B磺酰氯、Texas RecTM、磺酰氯、B0DIPYTM、萘磺酸类(包括但不限于1_苯胺萘_8_磺 酸(ANS)和6-(对甲苯胺基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽基脂肪酸(Anthroyl fatty acid)、 DPH、十八碳四烯酸、TMA-Dra、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、德克萨斯红-磷脂酰 乙醇胺、芘基_磷脂酰胆碱、芴基_磷脂酰胆碱、部花青540、1-(3-硫酸根合(sulfonate) 丙基)-4-[-e-[2[(二正丁基氨基)-6萘基]乙烯基]吡啶鎗甜菜碱(N即htylStyryl)、 3，3' 二丙基硫杂二碳花青((115-03-(5))、4-(对-二戊基氨基苯乙烯基)-1-甲基妣啶 鎗(di-5-ASP) 、 Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy_7_异硫氰酸酯、罗丹明800、 IR-125、噻唑橙、Azure B、尼罗蓝、A1酞菁、0xaxine 1，4' ，6-二脒基-2-苯基n引哚(DAPI)、 Hoechst 33342、 T0T0、吖啶橙、乙菲啶同二聚体(Ethidium Homodimer) 、 N(乙氧羰基甲 基)-6_甲氧基喹啉(MQAE) 、Fura-2、钙绿(Calcium Green) 、 CarboxySNARF-6、 BAPTA、香豆 素、phytof luors、六苯并苯和金属-配体复合物。 代表性的固有荧光团包括但不限于具有芳族环结构的有机化合物，包括但不限于 NADH、 FAD、酪氨酸、色氨酸、嘌呤、嘧啶、脂质、脂肪酸、核酸、核苷酸、核苷、氨基酸、蛋白质、 肽、DNA、RNA、糖和维生素。另外的适合的荧光团包括酶-辅助因子；镧系元素、绿色荧光蛋 白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其突变体和衍生物。 可以将提供化学反应的任何化学发光物质用于本发明，所述化学反应产生可检测 的反应(被观察到的发射)，其中引起被观察到的发射的被激发的状态包括但不限于以下 激发机理 R +R' — R-R+hv (单键形成(自由基_自由基反应))
.R. + .R.' — R = R+hv(双键形成(自由基-自由基反应))
R02 — R +02 — R+hv
R++e— — R+hv (电子捕获)。 适合的化学发光检测剂分子的实例包括但不限于过氧化物酶、细菌荧光素 酶、荧光虫荧光素酶、官能化的铁卟啉衍生物、苯巴比妥、异氨基苯二酰一肼、吖啶鎗值 (acridinium esters)、磺酰胺以及其它。最近的化学发光标记物包括以次黄嘌呤作为底物 的黄嘌呤氧化酶。触发试剂包含过硼酸盐Fe-EDTA复合物和氨基苯二酰一肼。特定的化学
8发光标记物的选择取决于若干因素，包括制备被标记成员的成本、用于与检测剂分子共价 连接的方法、检测剂分子和/或化学发光标记物的大小。相应地，化学发光触发试剂的选择 取决于所用的特定的化学发光标记物。 化学发光反应已经得到充分研究，并且在文献中有充分记载。例如，过氧化物酶最 适合用于连接于用作化学发光的检测剂分子。在第一反应中有效诱导光发射的触发试剂包 括过氧化氢和氨基苯二酰一肼。也可以用于在过氧化物酶的存在下诱导光响应的其它触发 试剂包括异丁醛和氧气。用过氧化物酶标记检测剂分子(例如抗体或抗原)的方法为本领 域中已知的。例如，为了制备用过氧化物酶标记的抗体或抗原，分别使过氧化物酶和抗原或 抗体各自与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基硫)丙酸酯(以下称为SPDP)反应。然后使被 SPDP标记的过氧化物酶、或被SPDP标记的抗原或抗体与二硫苏糖醇反应，以产生被硫醇标 记的过氧化物酶、或被硫醇标记的抗原或抗体。然后使硫醇衍生物与被SPDP标记的抗原或 抗体、或被SPDP标记的过氧化物酶偶联。 通常，可以将光学成像系统和基于微波的技术的任何组合用于本发明中。如图1 中所示，所述系统包括用于放置样品的微波腔和用于产生电磁能量的源，所述电磁能量的 波长和频率处于微波范围或射频范围内，更优选处于微波范围内。 施加低水平的微波能量来加热样品可用于加速系统内的任何生物学/生物化学 动力学。值得注意的是，低水平的微波不使蛋白质、DNA、或RNA破坏或变性，而是将样品加 热到足以加速动力学，例如结合、杂交或化学相互作用。 微波(约0. 3到约300GHz)位于红外线和射频电磁辐射之间。普遍认为微波通过 加热作用加速化学和生物化学反应，其中所述加热基本上遵循微波介电损耗的原理。极性 分子通过偶极旋转吸收微波辐射，并由此被加热，而非极性分子由于介电常数较低而不吸 收微波辐射，并因此不被加热。极性分子在外部施加的场的作用下自身对准。在本项工作 中所使用的常规的微波炉腔中，辐射频率(2450MHz)每秒改变符号2.45X10"欠。随着极 性分子来回旋转、随着变化的场连续地重新排列的扭转作用(tortional effect)而发生加 热，其中分子旋转慢于电场变化。作为分子被电场极化的能力的介电常数是指介质被微波 加热的能力。因此，诸如水、甲醇和二甲基甲酰胺的溶剂容易被加热，而微波实际上可穿透 己烷、甲苯和二乙醚。 在本发明中，微波辐射可以由频率介于0. 3-10GHz、更优选约lGHz-5GHz、更优选 2GZ-3GZ，功率大小为约10毫瓦特-700瓦特、优选30毫瓦特-约500瓦特、更优选约50瓦 特-300瓦特的电磁源来提供。可以使用本领域技术人员已知的任何源，例如到能够发射在 微波范围内的能量的激光器。根据需要，微波辐射可以连续或间歇(脉冲)发射。
在可供选择的方案中，微波能量可以通过用于输送来自适当的磁控管的微波能量 的空腔波导管来提供。优选微波能量经过调节，以引起金属材料内的热增加，而不对试验系 统中的任何生物材料造成损害。 在一个实施方案中，样品板通过附着金属表面而进行改性，所述金属表面被制造 为用于形成诸如三角形、正方形、长椭圆形、椭圆形、矩形、或提供至少一个金属表面顶端区 域的任何形状的几何形状。另外的多种金属几何形状可以附着于所述图案形式的表面，来 提供处于顶端区域之间的至少一个反应性区域。可以预见，所述顶端区域不仅包括尖顶区 域，而且包括具有圆边的区域，例如在长椭圆形或椭圆形中所见的。优选顶端区域设置为使
9得一个顶端区域与另一个顶端区域相对或对准，以便使反应性区域被设置于其间。顶端区 域之间的距离可以为0. 01mm-5mm，更优选为2mm-约3mm，取决于所需的反应性区域的大小。 金属几何形状的厚度为25nm-约1000nm，更优选为约45nm_约250nm。
所述几何形状可以通过本领域技术人员已知的任何手段形成在表面衬底上，包括 掩蔽表面衬底并随后沉积金属材料、将预先形成的金属几何形状直接固定在衬底表面上、 或用金属材料灌注表面衬底中的几何形状凹陷并在衬底上形成连续的平坦表面。另外，所 述几何形状可以包括多种材料，包括介电材料。例如，可以将一层金属材料淀积在衬底表面 上，在其上面淀积一层SiOp 在另一个实施方案中，本发明使用金属化的椭圆形、球形、三角形或杆形式的岛来 提供增强的发射。另外，金属材料可以是多孔性三维基质的形式。所述三维基质可以是纳 米孔性的三维基质。所述金属材料可以包括金属胶体粒子和/或被嵌入到大分子聚合物基 质的玻璃表面中的成形粒子。 如图1中进一步所示，所述系统包括电磁能量源，其通信连接于微波腔，用于向样 品和检测剂材料传递辐射能量，从而诱导化学激发、电激发、或单光子或多光子激发，以便 在检测剂材料中产生特征性荧光。值得注意的是，用于施加电磁能量的所述源可以包括施 加必需的频率或波长的任何装置，例如弧光灯，包括水银或氙；能够以连续或脉冲模式产生 单光子或多光子的激光二极管和LED光源，其中所述电磁能量的强度与所述检测剂分子或 可检测反应的吸收和随后的荧光相对应。通常使用的激光器是高强度单色光源，然而，需要 指出的是，还考虑了多点激光器。 在另一个实施方案中，使用在700-1000nm的2-光子激发以及使用短脉冲宽度 (< 50pi)、高重复率(l-80MHz)、激光二极管和LED(lns， l-10MHz)源提供与1-光子激发相 比被加强的敏感性。如果荧光团同时吸收两个光子，其会吸收足够的能量来提升到激发态。 然后所述荧光团会发射具有一定波长的单光子，所述波长取决于所用的荧光团并且典型地 处于可见光谱内。 本发明的光学成像/微波系统不仅包括本文中上述讨论的光源，而且包括用于观 察所发射的激发信号(例如荧光)的光学器件。光源发光，所述光可能在紫外范围内，并且 击中反射一定范围的波长并允许另一范围透过的二向色镜。所述二向色镜将光反射到样品 用于激发样品和/或检测剂分子中的分子内荧光。物镜收集所产生的荧光波长的光。这个 荧光透过二向色镜，并且优选透过消除波长与荧光不同的波长，并使荧光通往成像设备。优 选地，荧光显微镜使用落射荧光设置，其中物镜即用于将辐射光聚焦在样品/检测剂分子 上，又用于收集从样品/检测剂分子发射的荧光。 包括微波腔的结构构建为用于与光学成像系统连通，其中在微波腔中制作一个开 口，用于将聚焦的光引导到样品上，以及用于所发射的荧光波长的光离开。光源产生光束， 所述光束被引导到物镜中，优选所述光束通过光束扩束镜而使光束充分扩展以提供经过扩 展的激发光的光束，其进入微波腔用于聚焦在样品上。 可以使用光检测器检测离开微波腔并通过物镜的激发发射。可以使用多种光检测 器，例如光电二极管、电荷耦合器件(CCD)、光电倍增管(PMT)、或光子计数检测器，其中各 自具有不同的灵敏度。PMT和光子计数检测器可以实现高达10e-108的电子放大因子。常 规的PMT需要 lkV电源，但是新的小型化检测器仅需要5V。大部分化学发光发射波长处于可见区内。可以使用窄带滤光器来确保检测荧光波长。所述系统可以另外包括微驱动器(microactuator)、检测器、微处理器、电子设备、显示器、和转化平台。检测器的输出可以连接于模_数转换器和微处理器，以便计算被分析物浓度。 另外，本发明的系统可以包括在xy和z方向上可以移动的样品平台。另外，考虑了使用多点激光器来产生点激发阵列，其被引导到物镜以便聚焦在样品上，从而产生多个聚焦斑点的阵列。另外，所述系统可以包括用于调节系统中的透镜的设备，以选择样品内不同深度的聚焦点，以便入射在物体平面处的检测剂分子或可检测反应上。值得注意的是，所述系统可以包括用于递送同时或顺序的、空间上和/或暂时受控的电磁辐射的多组件的组合，用于控制生物学或化学反应的活性，所述生物学或化学反应与任何小生物分子、化学分子、由任何介电材料(包括任何纳米粒子或碳纳米管)组成的粒子的任何大小或粒子集合、原核生物体、真核生物体和/或其组合直接或间接有关。 另外，本发明的组合的光学成像和微波系统可以包括如下的光学成像系统，包括但不限于荧光、发光、宽场、共聚焦反射的、共聚焦的、双光子、多光子、宽场、旋转圆盘、Nipkow旋转圆盘、4-pi共聚焦的、用于将分子间相互作用成像的荧光共振能量转移(FRET)、用于将分子与表面的相互作用成像的全内反射荧光显微术(TIRFM)、多聚焦、多聚焦多光子、近场、单分子、光谱成像、寿命成像(lifetime imaging)、荧光成像、荧光相关光谱学、光栅成像相关光谱学(RICS)、和图像相关光谱学(ICS)。
实施例 方法和材料优质的APS-涂层玻璃载片(75X25mm)得自Sigma-Aldrich。具有粘合剂的CoverWell成像室垫圈(2. 5mm直径，2mm深和5mm直径，2mm深，用于温度测量)得自Molecular Probes (Eugene, OR) 。 Ru (by) 2C12盐得自Sigma-Aldrich。市售的化学发光材料购自Unique Industries, Inc。
在微波腔中的宽场显微镜的光学设置 在微波腔(0. 7立方英尺，GE Compact Microwave型号JES735BF，最大功率700W)的底部钻1英寸的孔，并将随后暴露的金属表面用白色瓷漆覆盖，以防止产生火花和电弧。使用扩束器，将473nm激光源的斑点尺寸扩展到约l英寸并且使用在物镜的后光圈处的175mm透镜聚焦成斑点。用二向色镜(z479/532rpc， Chroma, Brattleboro， VT)将入射的激发光束反射到无限远校正的明视野物镜(LWD Plan Achromat物镜-LPL10 x物镜/NA =0.25)中。通过以落射荧光模式工作的宽场激发所产生的荧光发射强度通过无限远校正的光学器件收集并且成像到CCD摄像机上，使用488nm的峰口 (razor edge)和570LP滤波器来阻挡激发光的任何渗透，如图l所示。化学发光强度图像通过无限远校正的光学器件成像并在没有任何光学过滤器的存在下成像在CCD摄像机上。用基于4X4面元划分的Retiga-SRV CCD Camera (Qlmaging， Burnaby， B.C.)以10fps拍取CCD图像。使用连接于NA为0. 22的Ocean OpticslOOO ii m直径纤维(Dunedin， FL)的Ocean Optics光谱仪SD2000型(Dunedin，FL)收集发射光谱。准直仪连接于纤维的末端并定位为使荧光发射进入光谱仪的偶联最大化。以100毫秒的积分时间收集Ru(by)2Cl2时间依赖性发射光谱。物镜和适配的光学器件的所有暴露的金属表面都用白色反射性涂漆覆盖，以防止在施加微波脉冲过程中产生火花和电弧。 在APS覆层的玻璃衬底上形成连续的金属薄膜 由'蝶形领结'结构改性的玻璃载片的制备以前已有描述[23]。简而言之，由粘合剂掩模制成不相交的'蝶形领结'等边2. 5mm三角形模板(stencil)。由两个5mm倒三角形形成不相交的'蝶形领结'结构，使得顶端之间的距离或间隙尺寸为约2-3mm，如图2中所示。将三角形胶带掩模附着于普通玻璃载片并通过使用EMF Corp. (Ithaca， NY)汽相淀积仪器气相淀积75nm的Au薄膜产生用Ag三角形结构改性的玻璃载片。在淀积工艺过程中使用Edwards FTM6膜厚监测仪监测薄膜厚度。
样品制备 将经过改性或者未经改性的'蝶形领结'金属结构的玻璃衬底切成lOXlOmm样品大小。将成像孔置于两个淀积的75nm厚的Au三角形之间或'蝶形领结'间隙处和未改性的普通玻璃衬底上。随后为样品填充20 ill的10 M Ru(by)2Cl2溶液或6 y 1的化学发光材料(图2)。 化学发光试剂(化学反应试验) 市售的辉光条(glow stick)包含苯基草酸酯、荧光探针和包含活性剂(过氧化氢)的玻璃包膜。通过将被密封的包含过氧化物的玻璃包膜破坏、随后将化学品混合以开始化学发光反应来实现化学品的活化。过氧化氢将苯基草酸酯氧化为过氧酸酯和苯酚[24]。不稳定的过氧酸酯分解为过氧化合物和苯酚，这是一个化学上诱导电子受激发状态的过程[24]。 Ru(by)2Cl2温度测量 预先地，已经使用氯化钌水溶液来校准具有CCD传感器的温度成像系统[25]。已知的是，这种溶液的发射强度随温度而降低。氯化钌水溶液的光物理学和光化学性质的温度依赖性已经在其它地方有所详述[26，27]。随后，使用带有温度控制器的Cary Eclipse荧光分光计记录10 ii M的Ru (by)2Cl2水溶液的预先校准的强度_温度曲线。校准温度为10、20、30、40、50、60和70°C ，所述温度处于相对荧光与温度之间的线性关系范围内，如图3中所示[25]。 对于微波成像实验，在有和没有薄的连续金属膜三角形几何结构(75nm厚)的存在下测量在玻璃衬底上的10 ii M的Ru(by)2Cl2水溶液的荧光发射强度。Ru(by)2Cl2水溶液用473nm激光源激发。在施加5秒的低功率2. 45GHz微波脉冲(10%功率)之前和过程中，使用图1的纤维检测和光谱仪光学构型以100毫秒时间间隔记录Ru(by)^l2水溶液的光谱发射历时20秒。将在施加微波脉冲之前和施加过程中在玻璃衬底和'蝶形领结'改性衬底上记录的Ru(by)2Cl2水溶液的荧光光谱强度归一化，如图3中所示。 将经过归一化的光谱叠加，以确定微波场是否诱导Ru(by)2Cl2发射的任何光谱变化，如图4中所示。将CCD时间依赖性强度相对于最大发射强度(时间=0)归一化。归一化强度比计算为在暴露于短微波脉冲过程中的时间依赖性发射强度与暴露于短微波脉冲之前的最大发射强度的比值。随后，将这些比值乘以0.9的系数(图3，RT)，以反映在室温下的lOyM Ru(by)^l2水溶液的经过归一化的强度比值(图4)。随后，可以从相同浓度的Ru(by)2Cl2样品的经过预先校准的强度-温度曲线估算在玻璃衬底和在具有蝶形领结几何结构的衬底上的经过微波加热的溶液的相应温度值(图3，箭头和虚线)。
12
使用CCD摄像机以10Hz的帧频捕获Ru(by)2Cl2水溶液和化学发光样品的总发射强度图像(图6-10)。为了获得对于所有测量是相同的初始化学发光发射，将大约6iU的化学发光溶液置于成像室内。数据收集在施加五秒微波脉冲之前io秒开始并且持续到微波暴露之后的20秒。
结果和讨论 因为公认的是Ru(by)^l2溶液的发射强度与温度成反比，所以在一定的温度范围内记录Ru(by)2Cl2的发射光谱[28]。从这些光谱，对于10°C _701:之间的10 y M的Ru(by)2Cl2溶液，观察到在发射强度和温度之间存在线性关系，这与以前发表的结果一致[23]。使用光学方案的纤维检测构造(图1)，以100毫秒的时间间隔记录Ru(by)2Cl2水溶液的荧光强度，持续大约60秒。在60秒记录过程中，施加了五秒的2. 45GHz脉冲微波脉冲。将相同浓度的Ru(by)^l2样品的经过归一化的强度-温度曲线拟合到线性函数(数据未示出)。分别用箭头和虚线标记近似的由微波诱导的对玻璃和'蝶形领结'样品几何结构上的溶液产生的最大温度升高，如图3中所示。 尽管在二向色镜的存在下仅一部分Ru(by)2Cl2光谱被透射，但是在施加微波脉冲之前的叠加的经过归一化的Ru(by)2Cl2强度谱表示在图4中。典型地，发色团发射的光谱移动归因于电子跃迁能量的电子分布变化[29]。因为在施加微波脉冲(图4，黑线)之前的Ru(by)2Cl2溶液的经过归一化的强度谱在施加低功率微波脉冲过程中(图4，点划线)没有改变，推断微波加热没有引起Ru(by)2Cl2溶液的光物理学性质产生任何值得注意的变化[29]。 使用CCD成像构造，在有和没有'蝶形领结'结构的情况下以10Hz的帧频记录在微波腔中的玻璃衬底上的Ru(by)2Cl2水溶液的荧光强度图像，持续10秒(图5)。
在图像收集过程中，样品暴露于五秒的微波脉冲。在100像素2区域上求取微波处理前的荧光强度的平均值，所述区域选自图像中心(图5，插图，方框轮廓)。将在不相交的'蝶形领结'接合点处和在普通玻璃载片(对照)上的10iiM Ru(by)^l2溶液的CCD图像的平均强度_时间数据相对于微波处理前的最大荧光强度归一化(图5)并且按比例縮放为预经过先校准的室温下的归一化强度(图3和9，室温)。在暴露于微波脉冲过程中，观察到玻璃衬底上的10y M Ru(by)2Cl2的荧光强度略有降低，对应于约5-8t:的温度升高(图5-右上插图)。另一方面，在暴露于微波脉冲过程中观察到在'蝶形领结'几何结构的间隙中10iiMRu(by)2Cl2溶液的荧光强度有显著降低(图5-右下插图)，使人想到发射与温度成反比。 相对于10iiM Ru(by)^l2溶液强度-温度的校准曲线，玻璃衬底上的溶液温度升高，略高于室温(图3，玻璃)，而在'蝶形领结'几何结构的间隙中的10iiM Ru(by)^^溶液的强度变化符合温度-强度曲线的线性范围以外的显著的温度下降(图3，虚线)。本文中显示了这些溶液在暴露于低功率微波脉冲过程中的荧光强度降低的实时电影记录，以证明微波腔中的荧光显微镜的功能性，如图6A， B中所示。 除了温度依赖性的Ru(by)2Cl2溶液的实时成像之外，化学发光溶液的局部'触发'也被成像，以便进一步验证显微镜在微波原理中的有效性。将6iU的蓝色化学发光溶液置于被附着到普通玻璃衬底的成像孔中以及位于连续的金薄膜'蝶形领结'几何结构的2mm间隙中[23,30]。以10Hz的帧频记录化学发光发射历时10秒(图7)。在10秒的时间间隔期间，样品暴露于五秒的微波脉冲下，这诱导'被触发的'发射或最大光子通量的显著增 加，如图7中所示。 在图7中标记离散的时间点，对应于a)稳态发射、b)在初始暴露于微波脉冲时的 发射、c)在微波脉冲开始过程中和d)在脉冲过程中的最大'触发'发射、e)最终的微波发 射。在记录不相交的'蝶形领结'几何结构强度图像过程中，以约4. 5的系数降低CCD摄像 机增益，以防止饱和。随后，相应地将得到的'蝶形领结'几何结构的CCD像素强度等级，以 得到与从玻璃衬底记录的化学发光强度的绝对对比。示出了在这些离散的时间点的对于普 通玻璃衬底(图8)以及在不相交的'蝶形领结'接合点处(图9)的化学发光发射的CCD图 像。 玻璃和'蝶形领结'图像二者的像素强度等级是相等的，以便精确地反映得自化学 发光反应的'按需'光子通量的显著增加。此外，本文中显示了在暴露于低功率微波脉冲过 程中由化学发光溶液产生的'光子通量'增加的实时电影记录，以便证明荧光显微镜在微波 中的功能性，如图IOA， B中所示。 本文中已经证明了在微波腔中构建荧光显微镜的可行性。使用这种光学构造，在 普通玻璃衬底上以及在接近离散的平坦构造几何结构附近观察到10 ii M Ru(by、Cl2溶液的 由微波诱导的实时温度降低。化学发光发射结果显示'蝶形领结'几何结构的化学发光发射 有大约100倍的增加。关于化学发光反应的'触发'，所述'触发'的发射从由磁控管产生的 入射微波场最近的一侧开始。化学发光溶液的CCD图像描述了化学发光反应由于化学发光 溶液的微波加热或介电损耗而得以促进。因为图像(图9B)的右侧定向为最靠近磁控管， 可以看到'触发'的发射从最靠近微波源的一侧开始。在随后的图像(图9C)中，观察到由 微波腔的远侧壁反射的波引起的触发发射(注释在微波腔中产生驻波)。重要的是，'蝶 形领结'端部略加偏移，以便于观察微波腔中的由反射波引起的'触发'发射。
使用本文中所述的微波聚焦和触发技术，证明了捕获由微波诱导的溶液加热和被 加速的化学发光反应的实时图像的可行性。
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权利要求
微波/光学成像系统，包括a)被封闭的容器，其包括微波腔并且在其中具有至少一个开口；b)设置于微波腔中用于保持至少一个样品的样品板，其中样品包括检测剂分子或进行能够被检测的反应的组分；c)通信连接于微波腔用于将微波能量递送进微波腔中并朝向样品引导的微波能量产生源；和d)通信连接于微波腔的光学成像装置，其设置为用于将来自电磁能量产生源的激发光引导到样品并且捕获由样品发射的发光发射。
2. 权利要求l的系统，其中所述微波腔包括用于保持样品板的平台。
3. 权利要求l的系统，其中所述检测剂分子是荧光团。
4. 权利要求1的系统，其中被递送的微波能量具有2GZ-3GZ的频率和约10毫瓦特-700 瓦特的功率水平。
5. 权利要求1的系统，其中样品包括至少一种生物分子，其中所述生物分子选自核酸、 芳香碳环结构、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白质、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黄素、DNA、 RNA、 寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌红蛋白、糖类例如葡萄糖等、维生素、辅助因子、嘌呤、嘧啶、间型 霉素、脂质、植物光敏色素、phytofluor、肽、脂质、抗体和藻胆蛋白。
6. 权利要求1的系统，其中所述光学成像装置包括 用于以一定频率产生能量来激发样品的电磁能量产生源； 设置用于将电磁能量聚焦在样品上的物镜；设置在激光器和物镜之间的二向色镜，用于将来自能量源的电磁能量反射到物镜以及 用于引导来自受激发的样品的发射信号；设置在二向色镜后面的管透镜，用于收集来自样品的发射并将其引导到检测器装置。
7. 权利要求6的系统，其中所述物镜捕获由受激发的样品发射的信号。
8. 权利要求l的系统，其中所述样品板包括沉积在样品板表面上的至少一层金属材 料，其中所述金属材料包括银、金、铜、锌、铝或铂。
9. 权利要求8的系统，其中所述金属材料形成为带图案的形状。
10. 权利要求9的系统，其中所述带图案的形状包括具有至少一个顶端的几何形状并 且其中多个顶端彼此相邻或相对从而在其之间产生反应性区域。
11. 权利要求10的系统，其中所述几何形状选自三角形、正方形、矩形、梯形、多边形、 抛物线形、椭圆形、圆的扇形，及其组合。
12. 权利要求10的系统，其中将至少一个样品置于反应性区域中并接触微波能量且受 激发能量辐射。
13. 权利要求12的系统，其中所述样品板包括多个孔，其中所述反应性区域位于所述 孔内并且暴露于微波能量下增强其中的反应。
14. 权利要求12的系统，其中所述反应性区域具有的在相邻和相对顶端之间的距离为 2mm到约3mm。
15. 权利要求1的系统，其中所述样品板由玻璃或聚合材料制成。
16. 使由微波诱导的生物分子的反应或相互作用实时数据成像的方法，所述方法包括a) 提供包括至少一种生物分子和检测剂分子的样品，其中将所述样品设置在样品板上；b) 将样品置于微波腔中，其中所述微波腔通信连接于微波产生源并且还通信连接于光学成像系统，其中所述光学成像系统包括用于以一定频率产生能量来激发样品的电磁能量产生源；设置用于从所述电磁能量产生源接受激发电磁能量并将其聚焦在样品上的物镜；设置在激光器和物镜之间的二向色镜，用于将来自能量源的电磁能量反射到物镜以及用于引导来自样品的发射信号；设置在二向色镜后面的管透镜，用于收集来自样品的发射并将其引导到检测器装置；c) 用一定量的低功率微波能量辐射样品以增加样品中的相互作用或反应；禾口d) 用步骤b)的光学成像系统将检测剂分子的发射信号成像。
17. 权利要求16的方法，其中生物分子的相互作用包括在表面处、在溶液中以及在活生物体中的蛋白质_蛋白质、DNA-蛋白质、RNA-蛋白质、DNA-RNA、化学品_蛋白质、化学品-DNA相互作用。
18. 权利要求16的方法，其中所述反应包括产生化学发光信号的化学反应。
19. 权利要求16的方法，其中所述微波腔包括用于保持样品板的平台。
20. 权利要求16的方法，其中所述低功率微波能量具有2GZ-3GZ的频率和约10毫瓦特-700瓦特的功率水平。
21. 权利要求16的方法，其中所述样品包括至少一种生物分子，其中所述生物分子选自核酸、芳香碳环结构、NADH、 FAD、氨基酸、蛋白质、肽、碳水化合物、甾族化合物、核黄素、DNA、 RNA、寡核苷酸、核酸、脂肪酸、肌红蛋白、糖类例如葡萄糖等、维生素、辅助因子、嘌呤、嘧啶、间型霉素、脂质、植物光敏色素、phytofluor、肽、脂质、抗体和藻胆蛋白。
22. 权利要求16的方法，其中所述样品板包括沉积在样品板表面上的至少一层金属材料，其中所述金属材料包括银、金、铜、锌、铝或铂。
23. 权利要求22的方法，其中所述金属材料形成为带图案的形状。
24. 权利要求23的方法，其中所述带图案的形状包括具有至少一个顶端的几何形状并且其中多个顶端彼此相邻或相对从而在其之间产生反应性区域。
25. 权利要求24的方法，其中所述几何形状选自三角形、正方形、矩形、梯形、多边形、抛物线形、椭圆形、圆的扇形及其组合。
26. 权利要求24的方法，其中将至少一个样品置于反应性区域中并接触微波能量且受激发能量辐射。
27. 权利要求26的方法，其中所述样品板包括多个孔，其中所述反应性区域位于所述孔内并且暴露于微波能量下增强其中的反应。
28. 权利要求26的方法，其中所述反应性区域具有的在相邻和相对顶端之间的距离为2mm到约3mm。
29. 权利要求16的方法，其中所述样品板由玻璃或聚合材料制成。
全文摘要
本发明涉及通信连接于微波能量产生源的光学成像系统，其中该组合提供化学反应时间的提高以及实时监测反应的能力，并且具有足够的分辨率以便在施加微波场的过程中观察活细胞和组织中的用荧光分子标记的细胞内组分的位置以及与其它生物分子之间的相互作用和对局部化环境变化的响应。
文档编号G01N21/64GK101743467SQ200880024921
公开日2010年6月16日 申请日期2008年6月4日 优先权日2007年6月4日
发明者克里斯·D·格迪斯, 迈克尔·J·R·普雷维特 申请人:马里兰大学生物技术研究所