专利名称：分光光度测量生物样品中bnct药物里硼含量的方法
技术领域：
本发明属于核化学分析测试技术领域，具体涉及一种用分光光度法测量生物样品中BNCT药物里硼含量的方法。
背景技术：
棚中子俘获疗法(boron neutron capture ther即y， BNCT)是一禾中新型的放疗方法，它是将含1QB药物通过口服或注射方法引入体内，并使之选择性地聚集在癌细胞中，然后用中子照射病变部位，使、发生"B(n， a)7Li核反应，利用由此产生的a粒子和7Li离子在细胞范围内杀死癌细胞。该方法取得成功的一个前提条件是给药后生物体内硼浓度的准确测量。目前，生物样品中硼含量的测定方法主要有质谱法、原子光谱法、分光光度法、电化学分析法和核反应分析法。质谱法是硼及其同位素测定中最重要的一种分析方法，尤其是等离子体质谱法(如ICP-MS)的发展，不仅克服了大部分该方法的缺点，而且实现了生物样品中硼及其同位素比率的测定，正在发展为当前技术中应用最为广泛的方法。但缺陷是仪器设备价格昂贵，需专业人员操作及日常维护。原子光谱法如AES和AAS可同时测定包括硼在内的多种痕量元素，但是对硼、磷等主要以氧化离子形式存在的元素不够灵敏。电化学分析法使用的电极易受溶液中污染物的影响，稳定性和重现性差。核反应分析法在实际应用中有局限性。分光光度法所使用的仪器设备简单，易操作，是一种易于推广的硼元素测量方法。但目前使用比较普遍的姜黄素法需要无水状态；次甲基兰法试剂空白大，且减小空白难度大；蒽醌法需大量的浓硫酸，且反应速度很慢。
发明内容
( — )发明目的 本发明针对现有的分光光度法测量生物样品中BNCT药物里硼含量的方法所存在的不足，提供了一种可准确、简便、快速测定生物样品中BNCT药物里硼含量的分光光度法。
( 二 )技术方案 —种分光光度测量生物样品中BNCT药物里硼含量的方法，包括生物样品消解、标准曲线测定、生物样品测定流程，关键在于所用显色剂为3-甲氧基-甲亚氨H，所确定的最大检测波长为390 410nm ;最终测量液pH值为4-6. 5。 通常，分光光度测量生物样品中BNCT药物里硼含量时，所取的最终测量液体积为5mL。以此为例，具体测量方法如下。 所述的生物样品消解是取0. 1 0. 2mL血液样品，或0. 1 0. 2g其他组织并制成匀浆的样品，加0. 5 1. 0mL浓硝酸后放置12 24小时，备用。 所述的标准曲线测定是分别吸取0 1. 0mLBPA标准使用液，依次加入EDTA溶液
0. 5 0. 7mL，乙酸-乙酸胺缓冲液1 1. 5mL，显色剂3-甲氧基-甲亚胺H溶液0. 8
1. 6mL，加水定容至5. 0mL，pH值为4. 0 6. 5，混匀放置30 120min，在390 410nm处测吸光度，绘制标准曲线。
3
所述的生物样品测定流程是取上述准备好的消解液0. 1 0. 2mL，依次加入EDTA 溶液0. 5 0. 7mL，乙酸-乙酸胺缓冲液1 1. 5mL，显色剂3-甲氧基-甲亚胺H溶液0. 8 1. 6mL，加水定容至5. 0mL，pH值为4. 0 6. 5，混匀放置30 120min，在390 410nm处测 吸光度，根据标准曲线计算硼含量。
(三)实施效果 3-甲氧基-甲亚胺H是一种新型的硼显色剂，它避免了姜黄素等传统硼显色剂显 色时的苛刻条件，使操作变得简单，且反应时间短，专属性强，灵敏度高。同时，研究发现硼 与3-甲氧基-甲亚胺H显色剂在pH为4. 0 6. 5的溶液中显色稳定，而pH过低时将导致 最大吸收波长向短波长方向移动，且吸光度变小；而显色剂本身有颜色，且随体积的增大吸 光度也增大，因此，在显色稳定的范围内选择尽量小的体积。因此，本发明所提供的技术方 案具有快速，简便，特异，灵敏等优点，对生物体样品内硼含量测定的准确度和精密度满足 要求。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明所提供的技术方案作进一步阐述。
实施例1 本实施例为正常小鼠体内BPA生物分布实验。实验前准备如下实验试剂、实验仪
器，并配置所需溶液、处理生物样品。 1.实验试剂L-BPA(—种BNCT药物，简称BPA)， SIGMA公司；3-甲氧基-甲亚胺H(98% )，上海 金圣化工试剂有限责任公司；冰乙酸、乙酸胺、EDTA、浓硝酸、氢氧化钠、抗坏血酸、盐酸均为 分析纯，北京化学试剂公司。
2.实验仪器UV2450型紫外-可见分光光度计，日本SHIMADZU公司；ICP-MS，英国Isoprobe GB Instrument公司；TGL-16L离心机，上海安亭科学仪器厂；BP211D电子天平，德国 Sartorius公司；211型pH计，Orion Research ; 100-1000 u L移液器，Socorex l-5mL移液 器，芬兰Fi皿pipette。
3.溶液配置 ①BPA标准使用液5. 22mgL-BPA加0. 5mL浓硝酸消解，加水稀释至10mL，则其中 硼元素浓度为25ii g/mL。 ②3-甲氧基-甲亚胺H溶液称取O. 450g试剂，用0. 5mol/LNaOH溶液完全溶解， 再加入1. 000g抗坏血酸(保护亚胺基)，用HC1调节pH为5. 7，定容至50mL聚丙烯容量瓶 中。 ③乙酸-乙酸胺缓冲溶液称取100g乙酸胺溶于400mL蒸馏水中，加28mL冰乙 酸，用pH计调节到pH为5. 7，定容至500mL。
EDTA溶液(2% ):称取1. 0g EDTA_Na2，加蒸馏水加热溶解，定容至50mL。
4.生物样品处理方法 取昆明小鼠28只，随机分为7组，每组4只，其中 一组为空白组，不注射BPA溶液， 其余6组每只小鼠经尾静脉注射BPA-F注射液100 ii L(相当于150mgBPA/kg体重)，分别
4于5、30min，l、2和3h断颈处死动物，取血及心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑和头皮等组织，匀桨后，称取各组织匀浆物0. 1 0. 2g的量于聚丙烯管中，血液量取0. 1 0. 2mL，分别加入0. 5 1. OmL浓硝酸消解，放置12 18小时，使组织完全消解，混匀备用。
5.分光光度法测量待测样品中的硼含量
测量按照以下两个步骤进行。 步骤l，测定标准曲线。分别吸取BPA标准使用液0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1.0mL于带刻度的聚丙烯容量瓶中，依次加入EDTA溶液0. 5mL，乙酸-乙酸胺缓冲液1. OmL，显色齐U3-甲氧基-甲亚胺H溶液1. OmL，加水定容至5. OmL， pH值为5. 7，则各溶液中硼元素浓度分别为0、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0和5. Oii g/mL，混匀放置40min，在400nm处用lcm石英比色皿测吸光度，并绘制标准曲线。 步骤2，测量待测样品中的硼含量，计算单位质量组织中摄取的BPA量。
取上述准备好的消解液0. 15mL于带刻度的聚丙烯容量瓶中，依次加入EDTA溶液0. 5mL，乙酸-乙酸胺缓冲液1. OmL，显色剂3-甲氧基-甲亚胺H溶液1. OmL，加水定容至5. OmL， pH值为5. 7，混匀放置，分别在5、30、60、 120、 180min时，在400nm处用lcm石英比色皿测吸光度，并根据步骤1绘制的标准曲线计算硼含量。所得结果进行统计学分析，得出BPA在小鼠体内的分布。结果如表l所示。 表1BPA在正常小鼠体内生物分布(ii gB/g， x±S. D. ， n = 4)
不同时相每克脏器摄取的BPA量(吗B/g) —器官 5min 30min 40min 120 min 180 min 实施例2 本实施例为荷人脑胶质瘤裸鼠体内BPA生物分布实验。实验前准备的实验试剂、实验仪器，并配置所需溶液、处理生物样品的操作同实施例1。
1.生物样品处理方法 取荷脑胶质瘤细胞U87MG裸鼠21只，随机分为7组，每组3只，其中一组为空白组，不注射BPA，其余6组小鼠尾静脉注射BPA-F注射液100 ii L (相当于150mg BPA/kg)，分别于5、15、30min，l、2、3和6h断颈处死动物，取血及肿瘤、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑和头皮等组织，匀浆后，称取各组织匀浆物O. 1 0. 2g的量于聚丙烯管中，血液量取0. 1 0. 2mL，分别加入0. 5 1. OmL浓硝酸消解，放置18 24小时，使组织完全消解，混匀备用。
2.分光光度法测量待测样品中的硼含量
5
176.20±0.0531.05±0.1316.37±0.1147.15±0,0981.26±0.21152.35±0.2118.97±0.11101.79±0.4169.39±0,20164.89±0.41
115.49±0.08
43.42±0.22
29.86±0.06
89.96±0.33
134.3±0.15
179.67±0.31
20.63±0.10
129.，6±0.33
70.03±0.15
175.85±0.28
85.76±0.1028.34±0.1126.16±0.1079.96±0.4476.4±0.1798.61±0.5512.31±0.06114.54±0.8159.31±0,10160.91±0.37
61.78±0.0518.31±0.22
/
72.54±0.3372.47±0.2283.28±0,5110.07±0.1468.88±1.7249.03±0.15161.52±0.36
52.11±0.0812.1±0.1418.23±0.1421.34±0.3462.99±0.1473.24±0.329.41±0.1640.99±0.3132.15±0.21146.27±0.51
血心肝脾肺肾胃肠脑
皮
测量按照以下两个步骤进行。 步骤l，测定标准曲线。分别吸取BPA标准使用液0、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1.0mL于 带刻度的聚丙烯容量瓶中，依次加入EDTA溶液0. 7mL，乙酸-乙酸胺缓冲液1. 5mL，显色剂 3-甲氧基-甲亚胺H溶液0. 8mL，加水定容至5. OmL， pH值为4，则各溶液中硼元素浓度分 别为0、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0和5. Oil g/mL，混匀放置30min，在390nm处用lcm石英比色皿测 吸光度，并绘制标准曲线。 步骤2，测量待测样品中的硼含量，计算单位质量组织中摄取的BPA量。 取消解液0. 2mL于带刻度的聚丙烯容量瓶中，依次加入EDTA溶液0. 7mL，乙酸_乙
酸胺缓冲液1. 5mL，显色剂3-甲氧基-甲亚胺H溶液0. 8mL，加水定容至5. OmL，pH值为4，
则各溶液中硼元素浓度分别为0、0. 5、1. 0、2. 0、4. 0和5. Oii g/mL，混匀放置30min，在390nm
处用lcm石英比色皿测吸光度，并根据步骤l绘制的标准曲线计算硼含量。所得结果进行
统计学分析，得出BPA在小鼠体内的分布结果。结果如表2。 表2BPA在荷胶质瘤裸鼠体内生物分布(y gB/g， x±S. D. ， n = 3)
不同时相每克脏器摄取的BPA量(貼B/g) 器官 5min15tnim 30 min lh 2h 3h 6h 实施例3 本实施例为正常小鼠体内BPA生物分布实验。实验前准备工作及分光光度法测 量待测样品中的硼含量的步骤同实施例1。不同之处是溶液PH值为6. 5，显色剂加入量为 1. 6mL，反应时间为120min，最大检测波长为410nm。 研究发现，硼浓度0 5. Oii g/mL时线性良好。本发明的具体技术方案是以通常 情况下，最终测量液体积为5mL为例推荐的技术方案。实际应用时，可以根据实际情况调整 最终测量液体积，其它试剂用量也应相应调整。 显然本领域的技术人员可以对本发明进行各种修改和变型而不脱离本发明的精 神和范围。这样，假若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求其等同技术的范围内， 则本发明也意图包含这些修改和变型。
33.69±0.03 8.96±0.05 6.48±0.04 23.74±0.02 16.11±0.04 26.43±0.07 5.91±0.04 6.02±0.06 2.87±0.02 37.46±0.02 22.75士0.07
32.67±0.04 17.卯±0.04 16.96±0.04 28.69±0.02 19.26±0.17 34.47±0.10 15.20±0.07 13.13±0.11 6.26±0.04 42.41±0.05 27.24±0.14
22.02±0.01 29.97±0.07 23.91±0.01 43.54±0.12 37.33±0.16 46.68±0.12 47.38±0.03 23.22±0.03 17.60±0.13 81.36±0.19 40.76±0.07
10.05±0.02 25.29±0.08 18.45±0.05 41.14±0.03 33.22±0.02 33.47±0.01 40.53±0.06 13.25±0.04 12.68±0.05 57.30±0.06 30.60±0.06
9.65±0.05
23.46±0.12
14.28±0.02
27.14±0.08
17.38±0.17
19.25±0.09
32.42±0.13
9.88±0.03
U.51士0.05
39.18±0.02
22.88±0.17
6.99±0.04
15.36±0.03
11.0U0.12
26.56±0.05
18.35±0.12
19.75±0.04
23.09±0.04
11.65±0.02
2.09±0.01
36.33±0.08
22.52±0.11
5.35±0.04 4.96±0.01
/
16.48±0.08
2.34±0.03
14.82±0.13
7.79±0.05
5.30±0.05
1.50±0.02
19.42±0.48
18.84±0.06
血心肝脾肺肾胃肠脑瘤M
权利要求
一种分光光度测量生物样品中BNCT药物里硼含量的方法，包括生物样品消解、标准曲线测定、生物样品测定流程，其特征在于所用显色剂为3-甲氧基-甲亚氨H，所确定的最大检测波长为390～410nm；最终测量液pH值为4-6.5。
2. 根据权利要求1所述的分光光度测量生物样品中BNCT药物里硼含量的方法，其特征在于所述的生物样品消解是取O. 1 0. 2mL血液样品，或0. 1 0. 2g其他组织并制成匀浆的样品，加0. 5 1. OmL浓硝酸后放置12 24小时，备用。
3. 根据权利要求1所述的分光光度测量生物样品中BNCT药物里硼含量的方法，其特征在于所述的生物样品消解是取0. 1 0. 2mL血液样品，或0. 1 0. 2g其他组织并制成匀浆的样品，加0. 5 1. OmL浓硝酸后放置12 24小时，备用。所述的标准曲线测定是分别吸取0 1. OmLBPA标准使用液，依次加入EDTA溶液O. 5 0. 7mL，乙酸-乙酸胺缓冲液1 1. 5mL，显色剂3-甲氧基-甲亚胺H溶液0. 8 1. 6mL，加水定容至5. OmL， pH值为4. 0 6. 5，混匀放置30 120min，在390 410nm处测吸光度，绘制标准曲线。所述的生物样品测定流程是取上述准备好的消解液0. 1 0. 2mL，依次加入EDTA溶液0. 5 0. 7mL，乙酸_乙酸胺缓冲液1 1. 5mL，显色剂3-甲氧基-甲亚胺H溶液O. 8 1. 6mL，加水定容至5. OmL，pH值为4. 0 6. 5，混匀放置30 120min，在390 410nm处测吸光度，根据标准曲线计算硼含量。
全文摘要
本发明属于核化学分析测试技术领域，具体公开了一种用分光光度法测量生物样品中BNCT药物里硼含量的方法。该方法包括生物样品消解、标准曲线测定、生物样品测定等流程，其中所用显色剂为3-甲氧基-甲亚氨H，所确定的最大检测波长为390～410nm；最终测量液pH值为4-6.5。这种分析方法具有快速，简便，特异，灵敏等优点，对生物体样品内硼含量测量的准确度和精密度满足要求。
文档编号G01N21/78GK101713740SQ200910215729
公开日2010年5月26日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘子华, 李凤林, 樊彩云, 罗志福, 邓新荣 申请人:中国原子能科学研究院