专利名称：一种辣(甜)椒根腐型疫病的快速检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及辣(甜)椒生产上一种重要土传真菌病害的快速
检测方法。
背景技术：
近年来，随着我国设施蔬菜栽培面积的增加，轮作倒茬困难，土传病害越来越严 重。2004年以来，在山东、辽宁、北京、河北等我国北方设施辣椒主产区，普遍发生辣椒 根腐型疫病(Capsicum Phytopathora Root Rot)，这是一禾中由辣椒疫毒(Phytophthora c即sici)引起的毁灭性病害，当地菜农在不清楚病原的情况下，按传统的镰刀菌引起的根 腐病进行防治，收效甚微，该病已经成为当地辣椒生产的"癌症"。辣椒根腐型疫病的防治 重在发病早期快速、准确的诊断，进而制定有效地防治措施。辣椒一旦发病严重后再进行防 治为时已晚，再加上许多根部病害症状相似，生产上难以区分，给病害防治带来了困难，造 成难以对症下药，容易造成误诊误治，防治效果不显著。因此生产上迫切需要明确辣椒根腐 病的病原并建立起一种快速、准确的检测辣椒根腐病的方法，为病害的早期诊断与防治、病 害的监测和预测预报提供支持和服务。基于此，本发明从解决我国设施栽培生产实际问题 出发，运用现代免疫学技术，研究开发了适用于辣椒疫霉检测的特异性强、灵敏度高的间接 ELISA快速诊断试剂盒，为辣椒的安全生产提供服务。 我国植物病原生物的检测、鉴定体系还不完善，检测技术薄弱，现有的技术与国际 上相比有相当的差距。随着科学技术的快速发展，生物技术为植物病原微生物的检测和鉴 定提供了新途径，分子生物学检测技术由于其灵敏、快速以及灵活多样而受到生命科学各 个研究领域的广泛重视，但由于其所需试剂价格昂贵、对实验人员的要求较高以及实验药 品对操作人员和环境有毒害作用等原因，从而限制了它在农业上的广泛应用。而免疫学技 术，已在医学上对有害病原微生物和农业上对植物病毒的检测得到了广泛的应用，检测的 方法和技术体系日渐成熟。辣椒根腐型疫病的检测方法在国内外研究较少，我国尚未建立 起对这种病害快速、有效的检测方法，从而给我国辣椒生产留下了重大的隐患，因此建立快 速、准确的检测技术方法迫在眉睫、意义重大。 1982年Hawkes等仿照分子生物学中点杂交(Dot Hybridzation)的方法发展起 来了点免疫结合测试技术(Dot immunobinding assay,DIBA)，该方法同酶联免疫吸附测定 (ELISA)反应原理相似，故也将这种方法称为Dot-ELISA。这种方法与ELISA相比具有所需 试剂少，不需特别的仪器，省时，适合于现场检测，具有与ELISA相同的灵敏度等优点，应用 范围越来越广。为适应辣(甜)椒根腐型疫病快速、准确检测的要求，本发明建立了该种病 害的快速检测方法程序。
发明内容
本发明旨在建立辣(甜)椒根腐型疫病的快速检测方法，通过制备高效价特异性 抗血清和优化斑点-酶联免疫吸附(dot-ELISA)方法实现对目标蛋白的检测，具体方法和步骤为 1.兔抗辣(甜)椒根腐型疫病菌抗血清制备先将保存在斜面上的辣椒疫霉NSGP 菌株转移至胡萝卜培养基上培养一周，然后挑取菌块移入装有lOOmL马铃薯葡萄糖液体培 养基的三角瓶中，25t: 120r/min振荡培养14天，将其中的菌丝滤出，用0. Olmol/L的磷酸 盐缓冲液(PBS， pH7.0 7.4)反复冲洗多次后，-20°〇冰箱内冰冻，冻后取出加入少许金 刚砂，采用反复冻融的方法将菌丝中的可溶性蛋白充分释放出来，考马斯亮蓝G-250法测 定蛋白质浓度后用于家兔免疫。以辣椒疫霉菌丝体可溶性蛋白作免疫原免疫家兔，首次免 疫剂量为lmg免疫原加等体积福氏完全佐剂充分乳化，背部皮下多点注射两只健康雄性兔 子；免疫前耳缘静脉采血lmL，做为阴性血清；此后每隔7d以免疫剂量1. 5mg与福氏不完全 佐剂充分乳化作为加强免疫，共免疫四次，最后一次免疫10d后耳缘静脉注射菌液lmL。测 定效价达到1 : 10000后采用饱和硫酸铵沉淀法和DEAE纤维素离子交换层析法进行纯化， 纯化后的抗体经考马斯亮蓝G-250法测定浓度后置于-2(TC贮存备用。
3.反应中所用到的缓冲液 包被缓冲液0. 05mol/L， pH9. 6碳酸盐缓冲液(CBS) ， Na2C03， 1. 590g ;NaHC03， 2. 930g，加去离子水至1000mL，调pH值至9. 6，4。C贮藏。 磷酸盐缓冲溶液(抗原稀释液)(PBS) :0. Olmol/L， pH7. 4， NaCl，8. OOOg ;KH2P04， 0. 200g ;KC1 ， 0. 200g ;Na2HP04 12H20, 2. 900g溶于900mL去离子水后，调节pH至7. 4，定容 到1000mL，12rC下高压灭菌20min后，室温贮藏。 洗涤缓冲液0. Olmol/L， pH7. 4磷酸盐-吐温缓冲液(PBST) ， lOOOmL PBS中加入 Tween-200. 5mL、柳硫汞钠0. lg，室温贮藏。封闭缓冲液5% (m/V)的脱脂牛奶，用PBS配制，100mL 0. Olmol/L PBS中加入5g
脱脂奶粉和o. oig柳硫汞钠，4t:贮藏。 抗体稀释缓冲液(洗涤液)0. Olmol/L PBST (含2% PVP) ， 200mL PBST中加入PVP 4. Og，室温贮藏。 AP标记羊抗兔IgG稀释液10Mm HEPES、0. 15M NaCl、 pH7. 5、0. 1 %的Tween-20、 0. 1%的结晶牛血清白蛋白。
酶标二抗溶液用酶标二抗稀释液适当稀释碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。底物缓冲溶液(PNPP) :10mg的PNPP溶于10ml 0. 05M pH9. 8碳酸盐缓冲液中，并
含0.5mM Mgcl2。 终止液(2mol/LNaOH):取8g NaOH加蒸馏水lOOmL即为lOOmL 2M NaOH。
底物溶液取NBT83mg，BCIP43mg，分别溶于lmL的二甲基甲酰胺，混匀后各取20mL 加入5mL底物缓冲液中，冻存-2(TC保存20天左右。
4.抗体纯化所用溶液的配制 饱和硫酸铵溶液取去离子水500. OmL，加热至80。C，称取400. Og (NH4) S04，缓慢 加入水中并不断搅拌，直到(NH4)S04完全溶解且溶液变澄清透明后，置4t:过夜至结晶析 出，用前取上清，用氨水将pH调至7. 0。 DE-52纤维素称取5g DE-52溶于25ml蒸馏水，沸水反复煮开三次，去掉杂质后 装入层析柱。0. Olmol/L磷酸盐缓冲溶液(PB) :KH2P04，0. 200g ;Na2HP04 12H20，2. 900g，溶于900mL去离子水后，调节pH至7. 4，定容到lOOOmL，室温贮藏。 20%磺基水杨酸溶液称取2g磺基水杨酸溶于10mL蒸馏水中，室温保存。
氯化钡溶液(2% ):取0. 2g BaC12溶于10. OmL去离子水中。
5.透析袋的处理及使用 将透析袋剪裁成适当长度(10 15cm)的小段，在2 % (W/V)NaHC03和 EDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟，用蒸馏水彻底清洗透析袋，再于lmmol/L的 EDTA(pH8. 0)中煮沸10min，冷却后存放于4t:，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。用前在 透析袋内装满水，然后排出并清洗干净。 将透析袋一端打好结，装入生理盐水，稍用压力试一下是否漏水，若不漏，则倒出 生理盐水，挤出气泡，将待透析的样品装入袋中，充分挤压使透析袋与溶液接触，成一条水 柱，然后将另一端打好结，放入透析液中，加入小转子，置于4t:冰箱中慢慢搅拌，透析72小 时，期间更换透析液数次。透析完毕后，将透析袋内的液体小心注入已湿热灭菌的离心管 中。 6.粗提抗体IgG的纯化与浓度测定 将粗提的抗体通过DE-52纤维素柱层析，用0. OIM pH7. 2PB洗脱除盐，具体方法如 下 1)取出l支层析柱，垂直固定于支架上。将已经溶胀好的DE-52(放入蒸馏水浸 泡)中的水倾倒出去，加入2体积的0. 01M pH7. 4的PB缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌装 入柱，打开柱的下端出口 ，继续加入搅拌的DE-52，使凝胶自然沉降到柱子高度的4/5左右， 关闭出口 。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入PB缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲液流过 凝胶柱，以平衡凝胶。 2)凝胶平衡后，除去凝胶表面的溶液，将盐析所得全部样品加到凝胶柱表而，打开 柱下口 ，控制流速让样品溶液慢慢进入凝胶内。凝胶柱面上加一层PB缓冲液，并用此缓冲 液洗脱，控制流速0. 5mL/min左右，用试管收集洗脱液。 3)在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已经开始流出。由每支收集管中取出 1滴溶液于黑色比色盘中，加1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀，则证明有蛋白质， 直到检查不出白色沉淀时，停止收集。将收集到的抗体按考马斯亮蓝G-250法(Bradford, 1976)测定其浓度，少量分装后置-2(TC保存备用。
具体检测方法为 1.取健康植株和待测植株组织，把待检测组织剪成小块，放入提取管中 2.向提取管中加1号试剂，以浸没组织块为宜 3.用玻璃研磨器把待检测组织块研碎 4.用取液针取待检测组织液，点于固相膜上 5.待膜干后，反复用取液针进行点样5-7次，待最后一次膜干 6.将膜浸于2号试剂中1小时； 7.用3号试剂摇荡洗三次，每次5min ; 8.将膜浸于疫霉病菌免疫抗血清中，室温放置2小时； 9.用3号试剂摇荡洗三次，每次5min ; 10.将膜浸于4号试剂中，于室温放置2小时；
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11.用3号试剂摇荡洗三次，每次5min ; 12.将膜浸于6号试剂中，于室温避光反应10min ; 13.流水冲洗终止反应，目视法判断结果凡显示黑紫色斑点的表明检测样品为 疫霉病，无色或斑点颜色极浅者表明检测样品非该两种病害。
图1间接Dot-ELISA的特异性检测 特异性检测结果表明，本实验所建立的间接Dot-ELISA方法与辣椒疫霉能够形成 明显的斑点反应(见说明书附图，图l)，除与致病疫霉能够形成颜色较弱的斑点外，与其它 侵染茄果类根部的病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、大丽轮枝菌、瓜果腐霉菌 均不形成斑点，呈阴性反应，表明本实验所建立的间接ELISA检测方法对辣椒疫霉不同菌 株间无特异性，而对不同种病原菌则具有较高的特异性。
图2间接Dot-ELISA对纯培养菌体蛋白的灵敏度检测 采用以上建立起的间接Dot-ELISA工作条件，将纯培养的辣椒疫霉抗原作10X、 100 X 、200 X 、400 X 、600 X 、800 X 、 1000 X 、 1200 X 、 1500 X稀释，以考察所建立检测方法的 灵敏度。结果表明，随着抗原稀释度的增加，Dot-ELISA所形成的斑点颜色越来越浅，当抗 原稀释1000倍时仍然能够呈现出明显的斑点(见说明书附图，图2)，因此本实验检测纯培 养辣椒疫霉的灵敏度为1000倍，即1 ii g/mL。
图3间接Dot-ELISA的田间模拟检测效果评价 共采集病样12株检验，结果表明，采用本实验所建立的间接Dot-ELISA方法对发 病辣椒植株进行检测，12株发病植株在NC膜上均能够形成明显的斑点(见说明书附图，图 3)，表现为阳性反应，健康植株则表现为阴性反应，此结果与间接ELISA检测结果相一致。
具体实施例方式
通过对辣椒根腐型疫病、黄瓜枯萎病的Dot-ELISA快速检测条件的优化，制定了 田间用于该两种病害快速诊断的试剂盒，田间预测病害的准确率达到95%，灵敏性达到 95%。 1.辣椒根腐型疫病田间快速检测技术
间接Dot-ELISA最佳工作条件的确定 按照间接Dot-ELISA方法，确定抗体的工作浓度为160倍(8. 69 y g/mL)。抗原抗 体最佳孵育时间为1.5h 2.0h。酶标二抗最佳工作浓度为600X。按照以上建立的间接 Dot-ELISA优化反应程序，测得酶标二抗的最佳孵育时间为1. 5h。
2.小结 以硝酸纤维素膜为固相载体，以辣椒疫霉为抗原，通过优化Dot-ELISA反应条件， 建立了辣椒疫霉的间接Dot-ELISA检测体系。硝酸纤维素膜不仅比酶联板便宜，而可以根 据试验需要裁减成不同大小，在进行病害田间诊断和调查时，硝酸纤维素膜体积小，便于携 带，在很小的体积上可以进行大量样品检测，使用十分方便。用样量少，只需要3 5ii L即 可。反应的底物以非容性的固体形式沉淀在硝酸纤维素膜上，结果可以长期保存。试验表 明，本实验所建立的Dot-ELISA检测方法特异性强(与致病疫霉有轻微交叉反应)，灵敏度高，该方法简化了 ELISA的反应时间和步骤，在辣椒根腐病的病害诊断中将具有广阔的前
旦 豕。 3.结论 经过对茄果类蔬菜疫霉根腐病(Phytophthora c即sici)的D0T-ELISA检测条件 的优化和特异性鉴定，获得了田间快速检测该两类病害的诊断程序，检测准确率达到95% 。 可以在发病初期预测病害的流行趋势，以采取相应的预防措施，达到减少农药的使用量，提 高生态效益，减少农民损失的目的。
权利要求
一种辣(甜)椒根腐型疫病的快速检测方法，其特征主要包括常温条件下，利用间接Dot-ELISA方法，对辣(甜)椒根腐型疫病具体检测程序为(1)分别以辣(甜)椒根腐型疫病菌菌丝体的可溶性蛋白抗原免疫家兔获得抗血清；(2)采用饱和硫酸铵沉淀法和DEAE纤维素离子交换层析法对抗血清进行纯化；(3)对纯化抗体进行间接Dot-ELISA方法最佳工作条件筛选。(4)现场检测取健康植株和待测植株组织，把待检测组织用眼科剪刀剪成小块，放入50mL离心管中；(5)向离心管中加1号试剂，以浸没组织块为宜；(6)用玻璃研磨器把待检测组织块研碎；(7)用取液针取待检测组织液，点于固相膜上；(8)待膜干后，反复用取液针进行点样5-7次，待最后一次膜干(9)将膜浸于2号试剂中1小时；(10)用3号试剂摇荡洗三次，每次5min；(11)将膜浸于疫霉病菌免疫抗血清中，室温放置2小时；(12)用3号试剂摇荡洗三次，每次5min；(13)将膜浸于4号试剂中，于室温放置2小时；(14)用3号试剂摇荡洗三次，每次5min；(15)将膜浸于6号试剂中，于室温避光反应10min；流水冲洗终止反应，目视法判断结果凡显示黑紫色斑点的表明检测样品为疫霉病，无色或斑点颜色极浅者表明检测样品非该该种病害。
2. 根据权利要求书1所述，间接Dot-ELISA方法最佳工作条件为菌丝体体外抗原最适 封闭时间为1. 5h，菌丝体体外抗原抗体的工作浓度均为1. 56 ii g/mL，选择菌体体外抗原抗 体工作最适时间为2. 0h ;菌丝体体外抗原的酶标二抗最佳孵育2. 5h时；检测纯培养辣椒疫 霉菌的灵敏度为2000倍，即0. 5 ii g/mL。
3. 根据权利要求书1所述，1号试剂为磷酸盐缓冲溶液(PBS) :0. 01mol/L，pH7. 4，具体 配制由NaCl，8. 000g ;KH2P04，0. 200g ;KC1，0. 200g ;Na2HP04 12H20，2. 900g溶于900mL去离 子水后，调节pH至7.4，定容到1000mL，12rC下高压灭菌20min后，室温贮藏；
4. 根据权利要求书l所述，固相膜为硝酸纤维素膜(NC膜)；取液针为lmL—次性注射器；
5. 根据权利要求书1所述，2号试剂为5X脱脂奶粉封闭液，用PBS配制5X (m/V)的脱 脂牛奶、0. 5% BSA、 1 % BSA， 4。C贮藏;3号试剂为洗涤缓冲液0. 01mol/L， pH7. 4磷酸盐-吐 温缓冲液(PBST)，即1000mL PBS中加入Tween-200. 5mL、柳硫汞钠0. lg，室温贮藏；抗体稀 释缓冲液为PBST(含2% PVP);
6. 根据权利要求书l所述，4号试剂为碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG溶液，该溶液 为酶标二抗溶液，使用时用AP标记羊抗兔IgG稀释液，即10Mm HEPES、0. 15M NaCl、pH7. 5、 0. 1%的Tween-20、0. 1%的结晶牛血清白蛋白配制而成的溶液稀释成浓度600倍液；
7. 根据权利要求书1所述，6号试剂为底物溶液(PNPP)，即10mg的PNPP溶于10ml 0. 05MpH9. 8碳酸盐缓冲液中，并含0. 5mM Mgcl2。
8. 根据权利要求书1所述，抗血清纯化所用溶液的配制饱和硫酸铵溶液取去离子水500. 0mL，加热至80°C ，称取400. 0g (NH4) S04，缓慢加入水 中并不断搅拌，直到(NH》S04完全溶解且溶液变澄清透明后，置4t:过夜至结晶析出，用前 取上清，用氨水将pH调至7.0。DE-52纤维素称取5g DE-52溶于25ml蒸馏水，沸水反复煮开三次，去掉杂质后装入 层析柱。`0. Olmol/L磷酸盐缓冲溶液(PB) :KH2P04， 0. 200g ;Na2HP04 12H20， 2. 900g，溶于900mL 去离子水后，调节pH至7. 4，定容到lOOOmL，室温贮藏。20%磺基水杨酸溶液称取2g磺基水杨酸溶于10mL蒸馏水中，室温保存。 氯化钡溶液(2% ):取0. 2g BaCl2溶于10. OmL去离子水中。
9. 一种辣(甜)椒根腐型疫病的快速检测方法，其主要特征包括，所有检测过程均在常 温下进行，适宜田间现场检测。
10. —种辣(甜)椒根腐型疫病的快速检测方法，其主要特征包括，辣(甜)椒根腐型 疫病病原菌为Phytophthora c即sici。
全文摘要
本发明为“一种辣(甜)椒根腐型疫病的快速检测方法”，属于生物技术领域。本发明涉及的辣(甜)椒根腐型疫病的快速检测方法，其特征是该方法应用ELISA的改进新技术斑点ELISA(Dot-ELISA)技术，其试剂用量少；操作简便快速，不需要特殊设备条件，适合基层单位使用；抗原膜保存期长，20％可保存半年，不影响其活性；并可邮寄供现场流行病学调查使用；检测结果可长期保存，便于复查，适宜现场检测和该病害流行性发生的快速预测。本发明还涉及到检测程序、工作条件、可检测量，检测用到的药品、器具。
文档编号G01N33/531GK101762695SQ20091024149
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者朱辉, 李宝聚, 石延霞, 谢学文 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所