专利名称：一种黄瓜枯萎病的快速检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及黄瓜生产上各一种重要土传真菌病害的快速检测 方法。
背景技术：
黄瓜是我国的一种重要蔬菜，对于满足人民群众的日常生活需求具有重要意义。 黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum)是黄瓜上的一种重要病害，能够给 黄瓜生产带来严重损失，阻碍了黄瓜生产的发展。在全国主要黄瓜种植区均有不同程度的 发生，通过嫁接是防治黄瓜枯萎病的重要方法，但在辽宁、北京、山东等地先后出现嫁接黄 瓜发生枯萎病的案例。黄瓜枯萎病一旦发病严重后再进行防治为时已晚，再加上许多根部 病害症状相似，生产上难以区分，给病害防治带来了困难，造成难以对症下药，容易造成误 诊误治，早期的快速、准确的诊断至关重要。我国植物病原生物的检测、鉴定体系还不完善，检测技术薄弱，现有的技术与国际 上相比有相当的差距。随着科学技术的快速发展，生物技术为植物病原微生物的检测和鉴 定提供了新途径，分子生物学检测技术由于其灵敏、快速以及灵活多样而受到生命科学各 个研究领域的广泛重视，但由于其所需试剂价格昂贵、对实验人员的要求较高以及实验药 品对操作人员和环境有毒害作用等原因，从而限制了它在农业上的广泛应用。而免疫学技 术，已在医学上对有害病原微生物和农业上对植物病毒的检测得到了广泛的应用，检测的 方法和技术体系日渐成熟。辣椒根腐型疫病和黄瓜枯萎病的检测方法在国内外研究较少， 我国尚未建立起对这种病害快速、有效的检测方法，从而给我国辣椒生产留下了重大的隐 患，因此建立快速、准确的检测技术方法迫在眉睫、意义重大。1982年Hawkes等仿照分子生物学中点杂交(Dot Hybridzation)的方法发展起 来了点免疫结合测试技术(Dot immunobinding assay，DIBA)，该方法同酶联免疫吸附测定 (ELISA)反应原理相似，故也将这种方法称为Dot-ELISA。这种方法与ELISA相比具有所需 试剂少，不需特别的仪器，省时，适合于现场检测，具有与ELISA相同的灵敏度等优点，应用 范围越来越广。为适应黄瓜枯萎病快速、准确检测的要求，本发明建立了上述两种病害的快 速检测方法程序。
发明内容
本发明旨在建立黄瓜枯萎病的快速检测方法，通过制备高效价特异性抗血清和优 化斑点-酶联免疫吸附(dot-ELISA)方法实现对目标蛋白的检测，具体方法和步骤为1.兔抗黄瓜枯萎病菌抗血清制备先将保存在斜面上的黄瓜枯萎病菌株转移至 PDA平板上培养一周，然后挑取菌块移入装有IOOmL PD液体培养基的三角瓶中，25°C 120r/ min振荡培养15d，将培养物用两层Whatman —号滤纸过滤，收集含体外抗原的滤液，冷冻 干燥，于_20°C下保存，取冻干样品室温融化后，离心(10，OOOrpm 30min,4°C )去杂质，所 得上清液装入透析袋中，用蔗糖将体积浓缩至20ml左右。对浓缩液进行离心(10，OOOrpm30min,4°C)去杂质，上清液作为体外抗原样品液。取少量上清液测定蛋白含量。用PBS调 整蛋白浓度为l_2mg/ml，Iml每管分装，_20°C保存备用，用于动物免疫(免疫原)和ELISA 检测(抗原)。本实验选用4 6月龄、体重2. 5kg左右的健康雄性白兔共4只，用于免疫。以枯萎病菌菌丝体外蛋白作免疫原免疫家兔，首次免疫剂量为Iml免疫原加等体 积福氏完全佐剂充分乳化，方法是用橡皮管连接2个5mL注射器(4 6号针头)对抽，直 到药品与佐剂成油包水状态，滴于水中不扩散为止，注射时，首兔每只兔子注射乳化后抗原 lml，背部皮下多点注射两只兔子(曹澎泽，1992 ；沈关心，1998)，注射前先将耳边缘附近的 毛用刀片剃去，70%酒精消毒，二甲苯揉擦耳翼，使静脉充血。用刀片轻微割破耳静脉，取免 疫前耳缘静脉采血lmL，做为阴性血清；此后每隔7d以免疫剂量1. 5mg与福氏不完全佐剂 充分乳化作为加强免疫，共免疫四次，最后一次免疫IOd后耳缘静脉注射菌液ImL (表2-1)， 隔两周后耳静脉采少量血，4°C放置过夜后析出血清，5000rpm离心15min，取上层抗血清采 用间接ELISA法测其效价达到10000以上即可大量放血，析出血清(过夜)，将析出血清 5000rpm离心15min，分装，_20°C下冻存备用。2.反应中所用到的缓冲液包被缓冲液0.05mol/L, ρΗ9· 6 碳酸盐缓冲液(CBS)，Na2C03,1. 590g ；NaHC03, 2. 930g，加去离子水至lOOOmL，调pH值至9. 6，4°C贮藏。磷酸盐缓冲溶液(抗原稀释液)(PBS)0. 01mol/L, ρΗ7· 4，NaCl，8· 000g ；ΚΗ2Ρ04, 0. 200g ；KCl，0. 200g ；Na2HP04 · 12H20，2. 900g 溶于 900mL 去离子水后，调节 pH 至 7. 4，定容 到lOOOmL，121°C下高压灭菌20min后，室温贮藏。洗涤缓冲液0. 01mol/L, ρΗ7· 4磷酸盐-吐温缓冲液(PBST)，IOOOmL PBS中加入 Tween-200. 5mL、柳硫汞钠0. lg，室温贮藏。封闭缓冲液5% (m/V)的脱脂牛奶，用PBS配制，IOOmL 0. 01mol/L PBS中加入5g 脱脂奶粉和0. Olg柳硫汞钠，4°C贮藏。抗体稀释缓冲液(洗涤液)0.01mol/L PBST (含2 % PVP)，200mL PBST中加入PVP
4. 0g，室温贮藏。AP 标记羊抗兔 IgG 稀释液IOMm HEPES、0. 15M NaCl、ρΗ7· 5、0. 1 % 的 Tween-20、
0. 的结晶牛血清白蛋白。酶标二抗溶液用酶标二抗稀释液适当稀释碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。底物缓冲溶液(PNPP) IOmg的PNPP溶于IOml 0. 05M ρΗ9· 8碳酸盐缓冲液中，并 含 0.5mM Mgcl2。终止液(2mol/LNa0H)取8g NaOH 加蒸馏水 IOOmL 即为 IOOmL 2M NaOH。底物溶液取NBT83mg，BCIP43mg，分别溶于ImL的二甲基甲酰胺，混勻后各取20mL 加入5mL底物缓冲液中，冻存-20°C保存20天左右。3.抗体纯化所用溶液的配制饱和硫酸铵溶液取去离子水500. OmL，加热至80°C，称取400. Og (NH4) S04，缓慢 加入水中并不断搅拌，直到(NH4)S04完全溶解且溶液变澄清透明后，置4°C过夜至结晶析 出，用前取上清，用氨水将PH调至7. 0。DE-52纤维素称取5g DE-52溶于25ml蒸馏水，沸水反复煮开三次，去掉杂质后装入层析柱。0. 01mol/L 磷酸盐缓冲溶液(PB) :KH2P04，0. 200g ；Na2HP04 · 12H20, 2. 900g,溶于 900mL去离子水后，调节pH至7. 4，定容到IOOOmL,室温贮藏。20%磺基水杨酸溶液称取2g磺基水杨酸溶于IOmL蒸馏水中，室温保存。氯化钡溶液(2% )取0. 2g BaC12溶于10. OmL去离子水中。4.透析袋的处理及使用将透析袋剪裁成适当长度(10 15cm)的小段，在2 % (W/V)NaHC03和 EDTA(pH8. 0)中将透析袋煮沸10分钟，用蒸馏水彻底清洗透析袋，再于lmmol/L的 EDTA (pH8. 0)中煮沸lOmin，冷却后存放于4°C，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。用前在 透析袋内装满水，然后排出并清洗干净。将透析袋一端打好结，装入生理盐水，稍用压力试一下是否漏水，若不漏，则倒出 生理盐水，挤出气泡，将待透析的样品装入袋中，充分挤压使透析袋与溶液接触，成一条水 柱，然后将另一端打好结，放入透析液中，加入小转子，置于4°C冰箱中慢慢搅拌，透析72小 时，期间更换透析液数次。透析完毕后，将透析袋内的液体小心注入已湿热灭菌的离心管 中。5.粗提抗体IgG的纯化与浓度测定将粗提的抗体通过DE-52纤维素柱层析，用0. OlM pH7. 2PB洗脱除盐，具体方法如 下1)取出1支层析柱，垂直固定于支架上。将已经溶胀好的DE_52(放入蒸馏水浸 泡)中的水倾倒出去，加入2体积的0. OlM pH7. 4的PB缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌装 入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅拌的DE-52，使凝胶自然沉降到柱子高度的4/5左右， 关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入PB缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲液流过 凝胶柱，以平衡凝胶。2)凝胶平衡后，除去凝胶表面的溶液，将盐析所得全部样品加到凝胶柱表而，打开 柱下口，控制流速让样品溶液慢慢进入凝胶内。凝胶柱面上加一层PB缓冲液，并用此缓冲 液洗脱，控制流速0. 5mL/min左右，用试管收集洗脱液。3)在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已经开始流出。由每支收集管中取出 1滴溶液于黑色比色盘中，加1滴20%磺基水杨酸，若呈现白色絮状沉淀，则证明有蛋白质， 直到检查不出白色沉淀时，停止收集。将收集到的抗体按考马斯亮蓝G-250法(Bradford， 1976)测定其浓度，少量分装后置-20°C保存备用。具体检测方法为
1.取健康植株和待测植株组织，把待检测组织剪成小块，放入提取管中
2.向提取管中加1号试剂，以浸没组织块为宜
3.用玻璃研磨器把待检测组织块研碎
4.用取液针取待检测组织液，点于固相膜上
5.待膜干后，反复用取液针进行点样5-7次，待最后一次膜干
6.将膜浸于2号试剂中1. 5小时(检测镰刀菌枯萎病)；
7.用3号试剂摇荡洗三次，每次5min ；
8.将膜浸于镰刀菌免疫抗血清中，室温放置2小时；
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9.用3号试剂摇荡洗三次，每次5min ；10.将膜浸于5号试剂中，于室温放置2小时；11.用3号试剂摇荡洗三次，每次5min ；12.将膜浸于7号试剂中，于室温避光反应IOmin ；13.流水冲洗终止反应，目视法判断结果凡显示黑紫色斑点的表明检测样品为 疫霉病或枯萎病，无色或斑点颜色极浅者表明检测样品非该两种病害。
图1间接Dot-ELISA法的特异性检测结果图1中A1-A8分别为尖孢镰刀菌504281体内抗原、Bl体内抗原、06021601体内抗 原、茄病镰刀菌体内抗原、尖孢镰刀菌504281体外抗原、Bl体外抗原、06021601体外抗原、 茄病镰刀菌体外抗原。B1-B8分别为灰葡萄孢体内抗原、黑刺盘孢体内抗原、大丽轮枝菌体内抗原、瓜果 腐霉菌体内抗原、立枯丝核菌体内抗原、辣椒疫霉C2体内抗原、NJDP体内抗原、NSGP体内抗原。C1-C8分别为灰葡萄孢体外抗原、黑刺盘孢体外抗原、大丽轮枝菌体外抗原、瓜果 腐霉菌体外抗原、立枯丝核菌体外抗原、辣椒疫霉C2体外抗原、NJDP体外抗原、NSGP体外抗原。特异性检测结果表明，本实验所建立的间接Dot-ELISA方法与尖孢镰刀菌能够形 成明显的斑点反应(见说明书附图，图1)，除与茄病镰刀菌能够形成颜色较弱的斑点外，与 其它侵染黄瓜根部的病原菌如灰葡萄孢、黑刺盘孢、霜霉、大丽轮枝菌、瓜果腐霉菌、立枯丝 核菌、白粉、辣椒疫霉都呈阴性反应或形成的斑点颜色很浅。以上表明本实验所建立的间接ELISA检测方法对尖孢镰刀菌不同菌株间无特异 性，而对不同种病原菌则具有较高的特异性。图2间接Dot-ELISA法的灵敏度检测结果图2中1-3为三次重复，图2中上图为菌丝体可溶性蛋白产生的抗体；下图为体外 抗原产生的抗体。上图和下图中从左至右的每列斑点分别为抗原稀释倍数为10倍、100倍、 200 倍、400 倍、600 倍、800 倍、1000 倍、1200 倍、1500 倍、2000 倍、2500 倍、3000 倍液。采用以上建立起的间接Dot-ELISA工作条件，考察所建立检测方法的灵敏度。结 果表明，随着抗原稀释度的增加，Dot-ELISA所形成的斑点颜色越来越浅(见说明书附图， 图2)，当抗原稀释1500倍时仍然能够呈现出明显的斑点，因此本实验检测纯培养尖孢镰刀 菌的灵敏度为1500倍，即0. 667 μ g/mL。图3间接Dot-ELISA法的田间检测效果评价结果图3中A1-A4为1_4号病样，B1-B4为5_8号病样，C1-C4为健康植株的阴性对照； 图3中左图为菌丝体可溶性蛋白产生的抗体，右图为体外抗原产生的抗体。共采集病样16株，按间接Dot-ELISA程序进行操作，以评价该方法的田间检测效 果。结果表明，采用本实验所建立的间接Dot-ELISA方法对发病黄瓜植株进行检测，16株发 病植株在NC膜上均能够形成明显的斑点(见说明书附图，图3)，表现为阳性反应，健康植株 则表现为阴性反应，此结果与间接ELISA检测结果相一致。
具体实施例方式通过对黄瓜枯萎病的Dot-ELISA快速检测条件的优化，制定了田间用于该种病害 快速诊断的试剂盒，田间预测病害的准确率达到95%，灵敏性达到95%。1.黄瓜枯萎病田间快速检测技术1. 1间接Dot-ELISA最佳工作条件的确定按照间接Dot-ELISA方法，确定菌丝体可溶性蛋白及体外抗原最佳封闭时间分 别为l.Oh及1.5h ；菌丝体可溶性蛋白及体外抗原抗体的工作浓度分别为320X ；160X, 即3. 125 μ g/mL ；6. 25 μ g/mL ；一抗最佳孵育时间为2. Oh和2. O 2. 5h ；菌丝体可溶性蛋 白及体外抗原酶标二抗的最佳工作浓度分别为800X，600X ；酶标二抗的最佳孵育时间为 2. Oh01. 2黄瓜枯萎病病原的现场检测效果评价健康植株，发病初期植株，发病中期植株，发病末期植株在NC膜上的颜色逐渐加 深。而一株外表健康的植株实际上已经染病，由此我们可以得出Dot-ELISA法可以对黄瓜 枯萎病进行早期诊断。2 小结以硝酸纤维素膜为固相载体，以尖孢镰刀菌为抗原，通过优化Dot-ELISA反应条 件，建立了尖孢镰刀菌的间接Dot-ELISA检测体系。硝酸纤维素膜不仅比酶标板便宜，而 且可以根据试验需要裁剪成不同大小。在进行病害田间诊断和调查时，硝酸纤维素膜体积 小，便于携带，在很小的体积上可以进行大量样品检测，使用十分方便；样品用量少，只需要 3 5μ L即可。反应的底物以非容性的固体形式沉淀在硝酸纤维素膜上，结果可以长期 保存。试验表明，本研究所建立的Dot-ELISA检测方法特异性强，灵敏度高，该方法简化了 ELISA的反应时间和步骤，在黄瓜枯萎病的病害诊断中将具有广阔的前景。3.结论经过对镰刀菌枯萎病(Fusarium solani)的D0T-ELISA检测条件的优化和特异性 鉴定，获得了田间快速检测该病害的诊断程序，检测准确率达到95%。可以在发病初期预测 病害的流行趋势，以采取相应的预防措施，达到减少农药的使用量，提高生态效益，减少农 民损失的目的。
权利要求
一种黄瓜枯萎病的快速检测方法，其特征主要包括常温条件下，利用间接Dot ELISA方法，对黄瓜枯萎病的具体检测程序为(1)分别以黄瓜枯萎病菌菌丝体的可溶性蛋白抗原免疫家兔获得抗血清；(2)采用饱和硫酸铵沉淀法和DEAE纤维素离子交换层析法对抗血清进行纯化；(3)对纯化抗体进行间接Dot ELISA方法最佳工作条件筛选。(4)现场检测取健康植株和待测植株组织，把待检测组织用眼科剪刀剪成小块，放入提取管中；(5)向提取管中加1号试剂，以浸没组织块为宜；(6)用玻璃研磨器把待检测组织块研碎；(7)用取液针取待检测组织液，点于固相膜上；(8)待膜干后，反复用取液针进行点样5 7次，待最后一次膜干(9)将膜浸于2号试剂中1.5小时；(10)用3号试剂摇荡洗三次，每次5min；(11)将膜浸于用抗体稀释液稀释后浓度为1.56μg/mL的镰刀菌免疫抗血清中，室温放置2小时；(12)用3号试剂摇荡洗三次，每次5min；(13)将膜浸于5号试剂中，于室温放置2小时；(14)用3号试剂摇荡洗三次，每次5min；(15)将膜浸于6号试剂中，于室温避光反应10min；流水冲洗终止反应，目视法判断结果凡显示黑紫色斑点的表明检测样品为枯萎病，无色或斑点颜色极浅者表明检测样品非该种病害。
2.根据权利要求书1所述，间接Dot-ELISA方法最佳工作条件为菌丝体体外抗原最佳 封闭时间分别为1. 5h，菌丝体体外抗原抗体的工作浓度分别为3. 125 μ g/mL和6. 25 μ g/ mL，选择菌体体外抗原抗体工作最适时间为2. Oh，体外抗原酶标二抗的最佳工作浓度 600X ,酶标二抗的最佳孵育时间为2. Oh ；检测纯培养尖孢镰刀菌的灵敏度为1500倍，即 0.667 μ g/mLο
3.根据权利要求书1所述，1号试剂为磷酸盐缓冲溶液(PBS)0. 01mol/L,pH7. 4，具体 配制由 NaCl，8. OOOg ；KH2PO4,0. 200g ；KC1，0. 200g ；Na2HPO4 · 12Η20，2· 900g 溶于 900mL 去离 子水后，调节pH至7. 4，定容到1000mL，12rC下高压灭菌20min后，室温贮藏；
4.根据权利要求书1所述，固相膜为硝酸纤维素膜(NC膜)；取液针为ImL—次性注射器；
5.根据权利要求书1所述，2号试剂为5%脱脂奶粉封闭液，用PBS配制5%(m/V)的脱 脂牛奶、0. 5% BSA, 1 % BSA，4°C贮藏；3号试剂为洗涤缓冲液0. 01mol/L, ρΗ7· 4磷酸盐-吐 温缓冲液(PBST)，即IOOOmL PBS中加入Tween-20 0. 5mL、柳硫汞钠0. lg，室温贮藏；抗体 稀释缓冲液为PBST(含2% PVP)；
6.根据权利要求书1所述，5号试剂为碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG溶液，该溶 液为酶标二抗溶液，使用时用AP标记羊抗兔IgG稀释液，即IOMm HEPES、0. 15MNaCl、pH7. 5、 0. 的Tween-20、0. 的结晶牛血清白蛋白配制而成的溶液稀释成浓度1000倍液；
7.根据权利要求书1所述，6号试剂为底物溶液(PNPP)，即IOmg的PNPP溶于IOml；0.05ΜρΗ9· 8碳酸盐缓冲液中，并含0. 5mM Mgcl2。
8.根据权利要求书1所述，抗血清纯化所用溶液的配制饱和硫酸铵溶液取去离子水500. OmL,加热至80°C，称取400. Og (NH4) SO4,缓慢加入水 中并不断搅拌，直到(NH4) SO4完全溶解且溶液变澄清透明后，置4°C过夜至结晶析出，用前 取上清，用氨水将PH调至7.0。DE-52纤维素称取5g DE-52溶于25ml蒸馏水，沸水反复煮开三次，去掉杂质后装入 层析柱。；0.01mol/L 磷酸盐缓冲溶液(PB) =KH2PO4,0. 200g ；Na2HPO4 · 12H20, 2. 900g,溶于 900mL 去离子水后，调节pH至7. 4，定容到IOOOmL,室温贮藏。20%磺基水杨酸溶液称取2g磺基水杨酸溶于IOmL蒸馏水中，室温保存。氯化钡溶液(2% )取0. 2g BaCl2溶于10. OmL去离子水中。
9.一种黄瓜枯萎病的快速检测方法，其主要特征包括，所有检测过程均在常温下进行， 适宜田间现场检测。
10.一种黄瓜枯萎病的快速检测方法，其主要特征包括，黄瓜枯萎病的病原菌为 Fusariumoxysporium0
全文摘要
本发明为“一种黄瓜枯萎病的快速检测方法”，属于生物技术领域。本发明涉及的黄瓜枯萎病的快速检测方法，其特征是该方法应用ELISA的改进新技术斑点ELISA(Dot-ELISA)技术，其试剂用量少；操作简便快速，不需要特殊设备条件，适合基层单位使用；抗原膜保存期长，-20％可保存半年，不影响其活性；并可邮寄供现场流行病学调查使用；检测结果可长期保存，便于复查，适宜现场检测和该病害流行性发生的快速预测。本发明还涉及到检测程序、工作条件、可检测量，检测用到的药品、器具。
文档编号G01N33/531GK101900730SQ20091024149
公开日2010年12月1日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者李宝聚, 王艺凯, 石延霞, 谢学文 申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所