专利名称：双联法便潜血快速诊断层析试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及免疫胶体金法和化学法相结合，且两种方法通过一种防止液体相
互渗透的隔离带而互不影响的一步法便潜血快速诊断层析试纸及其制备方法。
背景技术：
粪便的潜血检查，是指消化道出血量很少，肉眼不见血色，而且少量红细胞又被消化分解以致显微镜下也无从发现的出血状况。隐血便消化道少量出血可不引起大便颜色改变，只有靠大便隐血试验才能确定。凡是消化道疾病引起少量出血的，均可有隐血便，因此潜血检查对于诊断多种消化道出血性疾病都有重要价值，是普查筛选消化道疾病的有效手
段，潜血实验已经成为人们不断深入研究的热点。
大便潜血的主要检测方法有化学法和免疫学方法 化学法种类繁多，常用的有邻甲苯胺法、还原酚酞法、联苯胺法、匹拉米洞法、愈创木脂法。其实验设计原理都是基于人血红蛋白中的含铁血黄素部分有催化过氧化物分解的作用，能催化试剂中的过氧化物，分解释放新生态的氧，氧化上述色原物质而呈色，呈色的深浅反映血红蛋白的多少。但是化学法缺乏准确性和特异性。外源性食物食品中如含有血红蛋白、肌红蛋白，其血红素的作用均可以使实验呈阳性，大量生食蔬菜中含有活性的植物过氧化物也可催化过氧化物分解，出现阳性反应。血液在肠道中停留过久，血红蛋白变性，则会出现与病情不符的阴性结果。此外，如果病人服用大量的维生素C或其他具有还原性的药物，在实验中可将过氧化物还原，从而不能氧化色原物质，也可使实验出现假阴性。[0006] 免疫学方法主要包括免疫单抗法、免疫斑点法、胶乳免疫化学凝聚法、放射免疫扩散法、反向间接血凝法、胶体金标记夹心免疫检验法等。此类试验所用抗体分为两大类，即抗人血红蛋白抗体和抗人红细胞基质抗体，目前一般都采用抗人血红蛋白抗体。近年来研发的胶体金免疫层析法，将单克隆技术与胶体金技术结合，利用抗人血红蛋白的单克隆抗体与人血红蛋白可以高度特异性结合的特点来检测粪便隐血。此法不受动物的血、肉、含过氧化物酶的新鲜蔬菜、铁剂、维生素C的影响，灵敏度高，反应快速，在临床各类疾病导致出血的诊断中起到了较好的效果。用单克隆双抗体夹心胶体金显色技术，以试纸条一步法检测便隐血，方法简单、快速，具有很好的灵敏度和特异性。胶体金免疫层析试纸条因具有体积小、携带方便、不需要仪器设备、操作简单、可现场检测、3 10min出结果及结果可由肉眼根据T线颜色深浅判断等诸多优点而被广泛应用。胶体金免疫层析法融合了免疫层析技术和胶体金显色的原理，为特异快速的检测粪便潜血建立了一种新的免疫学方法。该法是利用纤维膜的毛细作用，使待测物抗原沿表面向前运动，与待测区标记的捕获物特异结合而聚集显色。免疫层析一步法目前一般是用抗人血红蛋白抗体来特异性结合人血红蛋白抗原，此法简便、快速，只特异地针对人血红蛋白抗原表位，基本排除了饮食及药物等因素的干扰，被世界卫生组织胃肠镜检查协会推荐作为粪便潜血试验的一种较为确认的方法。免疫胶体金法隐血试验有一定的灵敏度，高于或低于此范围均可出现假阴性。单克隆抗体胶体金法在检测消化道出血有时候会漏诊，其原因主要有[0007] ①血红蛋白经过消化酶降解而变性，已不具有原来的免疫原性；
3[0008] ②过量的大出血而致使反应体系中抗原过剩，出现后带现象；[0009] ③病人的血红蛋白抗原与单克隆抗体不匹配。 到目前为止，单一的大便潜血FOB诊断方法的灵敏度和特异性都有待进一步提高。临床上往往需要两种或以上的方法联合检测。目前市场上已有相关的联全检测试剂出现。然而本专利涉及的采用胶体金免疫法和化学法结合检测粪便潜血方法和其它联测方法不同，能提高消化道出血的检出率，并且为一步法，操作简便。
发明内容本实用新型目的是提供一种简便、准确、快捷、灵敏度和特异性高、适合于临床诊
断或筛查用的双联法便潜血快速诊断层析试纸及其制备方法。 本实用新型免疫法运用双抗体夹心免疫层析技术实现对被检样品中人血红蛋白抗原的检测，提供一种双联法便潜血快速诊断层析试纸，其特征是在塑料支撑板9上一端设置上样垫l，上样垫1的一端上粘贴有化学法便潜血检测试纸2，在化学法便潜血检测试纸2的一端粘贴有疏水性物质的隔离带3，所述的疏水性物质是聚乙烯或聚丙烯或聚氯乙烯；在上样垫1的另一端紧密粘贴有包被标记人血红蛋白单抗的胶体金垫4，在胶体金垫4的另一端紧密粘贴有硝酸纤维素膜5，在硝酸纤维素膜5上包被有相互分离的检测T线7和质控C线8，在硝酸纤维素膜5上另一端紧密粘贴有吸样垫6 ;所述T线为包被在NC膜上的人血红蛋白单抗，所述C线为包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗体。 所述的双联法便潜血快速诊断层析试纸，其特征在于所述的上样垫1为无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。 所述的双联法便潜血快速诊断层析试纸，其特征在于所述的与上样垫粘贴在一块的化学法便潜血检测试纸2中含有6. 6% w/w过氧化羟基异丙苯，4. 0w/w四甲基联苯胺；89. 4w/w缓冲液和非反应物质。 本实用新型化学法设计原理都是基于人血红蛋白中的含铁血黄素部分有催化过氧化物分解的作用，能催化试剂中的过氧化物，分解释放新生态的氧，氧化上述色原物质而呈色，呈色的深浅反映血红蛋白的多少。为便于检测，化学法便潜血检测试纸于上样端与上样垫粘贴在一起，上样垫与便潜血检测试纸之间还粘有相互隔开的隔离带防止液体渗透以免两种方法相互影响。 抗体的包被方法为以0. 01M pH7. 2磷酸盐缓冲液PBS将人血红蛋白单抗配制成2mg/ml的溶液，用喷膜仪在NC膜下部以1. 0ul/cm的参数进行划线，包被T线，同时在NC膜上部包被羊抗鼠IgG作为C线。划线后将NC膜在干燥间温度20-25t:，湿度小于30%干燥8-10小时，备用。 人血红蛋白单抗标记胶体金颗粒的方法为以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为30-50nm的胶体金溶液，制备完成后取100ml胶体金液放在烧杯内，用0. 2M K2C03调至pH7. 6，按100ml胶体金溶液加入1. Omg人血红蛋白单抗，室温搅拌1小时，加入封闭剂，封闭20min， 10000r/m离心20分钟，弃上清，用胶体金工作液复溶至66. 7ml，按lml溶液铺22cm2的比例均匀地铺在玻璃纤维膜或无纺布上，再置干燥间温度20-25t:，湿度小于30%干燥2-4小时，制成胶体金垫，备用。 化学法便潜血检测试纸条中含有6. 6% w/w过氧化羟基异丙苯，4. Ow/w四甲基联苯胺；89. 4w/w缓冲液和非反应物质。 试纸条的装配方法为在干燥室内温度20-25t:，湿度小于30%，取塑料支撑板板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫搭胶体金垫的三分之一粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫搭上样垫的十分之一 ；在NC膜C线一侧搭接吸样垫搭吸样垫的十分之一 ；在距离上样垫底端10mm处粘贴一层隔离带，在距离上样垫底端3mm处粘帖化学法便潜血检测试纸，最上面贴一层标志膜，最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成便潜血诊断试剂卡。 检测方法为将混匀后的样本平衡至室温，将试纸条或试剂卡平放，在上样垫上加入50-80ul被检样品，对于化学法的检测结果，一分钟内根据便潜血诊断试纸的颜色变化判读结果；对于免疫胶体金法，在5分钟内用肉眼直接观察C、 T线的出现情况，并判定检测结果。最后结合两种检测方法的结果判定最终检测结果。 本实用新型的有益效果是采用免疫胶体金法和化学法结合制备便潜血快速诊断层析试纸，隔离带使得两种方法互不影响，且采用一步加样，方便、快捷。采用双联法使试纸的性能比单纯的胶体金法或化学法提高一个等级，使快速诊断试剂的灵敏度和准确度达到一个新的水平；该试纸用于消化道类疾病的筛查或临床诊断，具有敏感性高、特异性强、操作简便、反应快速、适合现场检测和经济实用等优点。
图1双联法便潜血快速诊断层析试纸结构示意图。[0023] 附图符号说明 1 :上样垫；2 :化学法便潜血检测试纸；3 :隔离带；4 :胶体金垫；5 :硝酸纤维素膜；6 :吸样垫；7 :检测线；8 :质控线；9 :塑料支撑板
具体实施方式
实施例双联法便潜血快速诊断层析试纸的制备[0026] 1主要材料 1. 1人血红蛋白单抗为上海至亨生物科技有限公司提供，用于标记胶体金颗粒；另一人血红蛋白单抗上海至亨生物科技有限公司提供，用于NC膜包被；氯金酸Sigma公司产品，用于空白金制备；柠檬酸三钠sigma公司出品，用于空白金制备；硝酸纤维素NC膜Millipore公司产品；牛血清白蛋白BSA，聚乙二醇PEG20000， Sigma公司产品，用于胶体金封闭；其它常用试剂均为分析纯试剂。 1. 2氰化高铁血红蛋白标准液中国药品生物制品检定所检产品。[0029] 2方法 2. 1人血红蛋白单抗的胶体金标记氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备直径为40nm的胶体金溶液，制备完成后取三份胶体金，分别用0. 2M K2C03将溶液调到p朋.0、 pH7. 6和pH9. 0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液O. 5mg、1. Omg、1. 5mg人血红蛋白单抗缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌1小时，再加入2%体积20% m/V牛血清白蛋白BSA， 1%体积20% m/V聚乙二醇PEG2 0000进行封闭20min。标记结束后10000r/m离心20min，弃上清，沉淀按原体积复溶至不同配比的胶体金稀释液tris-HCl缓冲液，pH7. 3，含酪蛋白，蔗糖和表面活性剂中。然后将标记胶体金溶液按lml溶液铺22cm2的比例加样于无纺布上，在温度20-25°C ，相对湿度在< 30%的干燥间干燥2-4小时，制成胶体金垫，干燥备用。 2. 2人血红蛋白单抗的包被用0. 01M pH7. 2 PBS将人血红蛋白单抗分别稀释成1. 5mg/ml、2. 0mg/ml、2. 5mg/ml，然后用喷膜仪将人血红蛋白单抗在NC膜上按1. Oul/cm进行划线包被，同时在NC膜上包被抗羊抗鼠IgG抗体，用于产品的质控，包被完成后将NC膜在干燥间干燥8-10小时，备用。 2. 3化学法便潜血检测试纸中含有6. 6Xw/w过氧化羟基异丙苯，4. Ow/w四甲基联苯胺；89. 4w/w缓冲液和非反应物质，制备完成后切成5mm宽试纸条备用。[0033] 2. 4便潜血快速诊断试纸条的组装在干燥室内温度20-25 °C ，相对湿度< 30%取塑料支撑板，将已包被的NC膜放置在塑料支撑板的中部粘贴，在NC膜T线一侧搭接胶体金垫搭胶体金垫的三分之一粘贴，在胶体金垫另一侧搭接粘贴上样垫搭上样垫的十分之一 ；在NC膜C线一侧搭接吸样垫搭吸样垫的十分之一 ；在距离上样垫底端10mm处粘贴一层隔离带，在距离上样垫底端3mm处粘帖化学法便潜血检测试纸，最上面贴一层标志膜，最后用裁剪机将贴好塑料板切成3mm或4mm宽的试纸条。切好的试纸条可以再装入塑料卡内，形成便潜血诊断试剂卡。 2. 5检测原理和方法将混匀后的样本平衡至室温，将制备好的试纸条或试剂卡平放，检测时，在上样垫上加入50-80ul被检样品，若样品中中含人血红蛋白，则和胶体金垫上标记人血红蛋白单抗的胶体金结合，形成复合物，并扩散到NC膜上进一步层析，当遇到包被在NC膜上T线处的另一人血红蛋白单抗时，复合物则又和包被人血红蛋白单抗结合，被捕获在包被处，当被捕获的胶体金复合物达到一定数量时，则形成一条肉眼可见的T线；若样本中不含人血红蛋白，则不能形成免疫复合物，亦不能形成T线，C线作为试剂的质控标准，阳性和阴性样品检测时均会出现。用肉眼直接观察在1、5、10和15分钟内C、 T线的出现情况，并判定检测结果。 对于化学法，若样品中中含有一定量的人血红蛋白，人血红蛋白中的含铁血黄素部分可以催化过氧化物分解释放新生态的氧，氧化四甲基联苯胺而呈色，呈色的深浅反映人血红蛋白的多少，用肉眼直接观察在30秒、1分钟和5分钟内试纸的颜色变化情况，并判定检测结果。 最后结合两种检测方法的结果判定最终检测结果。 2. 6反应体系工艺评价方法研制产品制备小样后，以氰化高铁血红蛋白标准液为质控品，进行检测，确定最佳的产品反应体系和工艺路线。[0038] 3结果 3. l根据小样的检测结果，确定了试纸的最佳标记pH值为7.6 ;人血红蛋白单抗的最佳标记量为lmg每100ml胶体金溶液；最佳的胶体金稀释液为Tris-HCl缓冲液，pH7. 3，含O. 5X的酪蛋白，5^蔗糖，l^Tween 20 ;最佳的人血红蛋白单抗包被浓度为2mg/ml。检测结果的最佳判定时间免疫法为在5分钟内判定，化学法为在1分钟内判定。[0040] 3. 2临床样本检测，以已商品化的试剂为对照，50份FOB阳性样本中，本试剂检测出阳性49份，灵敏度为98% ， 50份FOB阴性样本中，本试剂检测均为阴性，特异性为100% 。
权利要求一种双联法便潜血快速诊断层析试纸，其特征是在塑料支撑板9上一端设置上样垫1，上样垫1的一端上粘贴有化学法便潜血检测试纸2，在化学法便潜血检测试纸2的一端粘贴有疏水性物质的隔离带3，所述的疏水性物质是聚乙烯或聚丙烯或聚氯乙烯；在上样垫1的另一端紧密粘贴有包被标记人血红蛋白单抗的胶体金垫4，在胶体金垫4的另一端紧密粘贴有硝酸纤维素膜5，在硝酸纤维素膜5上包被有相互分离的检测T线7和质控C线8，在硝酸纤维素膜5上另一端紧密粘贴有吸样垫6；所述T线为包被在NC膜上的人血红蛋白单抗，所述C线为包被在NC膜上的羊抗鼠IgG抗体。
2. 根据权利要求1所述的双联法便潜血快速诊断层析试纸，其特征在于所述的上样垫1为无纺布，吸样垫由吸水滤纸构成。
专利摘要本实用新型公开了一种双联法便潜血快速诊断层析试纸及其制备方法，其是采用免疫胶体金法和化学法相结合，且两种方法通过一种防止液体相互渗透的隔离带而互不影响的一步法快速诊断层析试纸，该层析试纸包括上样垫、与上样垫粘贴在一块的化学法便潜血检测试纸、上样垫与化学法便潜血检测试纸相互隔开的隔离带、紧密连接于上样垫一端的含有标记人血红蛋白单抗的胶体金垫、与胶体金垫的另一端紧密连接的硝酸纤维素膜和紧密连接于NC膜另一端的吸样垫，NC膜包被有相互分离的检测(T)线(7)和质控(C)线，粘贴到塑料支撑板上形成试纸，用于消化道类疾病的筛查或临床诊断，具有敏感性高、特异性强、准确度高、操作简便、反应快速等优点。
文档编号G01N33/551GK201522494SQ200920096169
公开日2010年7月7日 申请日期2009年4月3日 优先权日2009年4月3日
发明者刘围, 李洲, 杨发青 申请人:天津中新科炬生物制药有限公司