用于成像和测序的扫描系统和方法

专利名称：用于成像和测序的扫描系统和方法
技术领域：
本发明涉及用于图像检测的扫描系统。
背景技术：
多种测序仪器，诸如来自Life Technologies Corporation的SOLiD 系统，可以 使用递进(tiling)方案来建立和/或产生成像数据。在这样的方案中，可以使用能够按照 X和Y维确定位置的台子(stage)来将含有测序珠子或其它物质的载玻片或基质的一部分 移动进照相机或其它成像装置的视野内。一旦就位，可以停止台子，并允许其沉降，然后开 始积分和/或成像。该过程可以重复许多不同的迭代或周期。对于不同的测序仪器已经观 察到，为了获得测序数据，使用近似相同量的时间来移动台子。这样的系统可能进一步需要 多次扫描，例如，一次扫描一种核苷酸、染料或颜色(共4次或更多次扫描)。这类系统是费 时的且昂贵的。存在对减少采集时间并降低成本同时产生精确的序列信息的需要。此外，如果大部分时间不是用于收集发射光子的照相机，而是用于从一个位置移 动到另一个位置，则提高激发能的益处是有限的。也存在解决该限制的需要。

发明内容
根据本发明的不同实施方案，提供了用于检测来自基质上的多个位置的发射的系 统。该系统可以包含一个或多个辐照源，所述辐照源构造成辐照基质。可以使第一个反应 诸如荧光发射发生在基质上的第一组位置。在有些实施方案中，可以使第二个不同的反应 发生在基质上的第二组位置。可以包括扫描检测器例如检测器阵列，其相对于一个或多个 辐照源放置，以便收集来自第一组位置的发射和/或收集来自第二组位置的发射。通过同时使用多个照相机或成像装置来获取数据，可以实现成像方案的改进。这 样的系统可以多个照相机(例如，2个或4个照相机)共用一个激发源。结果，通过对成像 系统进行修饰可以提高系统的处理量。这样的修饰可以根据需要进行，同时基本上保持系 统的剩余部分不变。另外，如果增加成像系统的激发能，可以减少积分时间，相应地提高系 统速度。根据本发明的不同实施方案，提供了成像方法，其可以包含对连接反应成像。该方 法可以在一个或多个扫描步骤后另外包含从多个多核苷酸中的一个或多个光切割保护基 的步骤。流动池可以包含多个在其中的珠子，多个多核苷酸可以固定化在所述多个珠子上。 要成像的多个位置可以是被所述多个珠子占据的位置。


在附图中例证了本发明的不同实施方案。本发明不限于所述实施方案，且包括在 下面的描述中阐明的和本领域普通技术人员已知的等效结构和方法。在附图中应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述仅仅是示例性的和解释性的，意在 提供本发明的不同实施方案的进一步解释。图1解释了根据本发明的不同实施方案的代表性的荧光计扫描系统。图2描述了根据不同实施方案的系统和方法，其使用进行的时间延迟积分，从而 跨固定位置扫描检测器阵列，并混合被不同像素先后测量的亮度以增强检测的信号。图3描述了可以根据本发明的不同实施方案使用的时间延迟积分单分子测序扫 描系统的一个实施方案。图4描述了在上面图3中描述的相同的流动池和扫描系统，在扫描操作过程中的
第一个早期位置。图5描述了在图3和4中所示的相同的扫描系统，但是与在图4中所述的位置相 比，在扫描操作过程中的稍后位置。图6-8描述了根据本发明的不同实施方案的2个相邻位置，物镜相对于基质中的 蚀刻沟槽。图9解释了概率相对于时间的图，为在3秒的时间内用于单个标记的核苷酸掺入 事件和光切割操作。图10是图9的图的进一步解释，为0. 10秒的时间内。图11显示了一组示例性的棱镜，其可以用作根据不同实施方案的扫描操作过程 中一个或多个辐照束和/或一个或多个发射束的镜子。图12A是根据本发明的不同实施方案的4种示例性标记的激发效率相对于波长的 图，它们可以一起使用，例如作为集合。图12B是图12A的示例性标记的荧光强度相对于波长的图。图13A是根据不同实施方案使用的一对辐照源的相对辐照强度相对于波长的图， 其中由2个源产生的辐照束具有2种不同的波长(颜色)，且可以用于同时辐照基质上的不 同的或相同的固定位置。图1 是显示调节滤光片的透射百分率相对于波长的图，所述调节滤光片用于调 节图13A所示的光束。图13C是显示带通滤光片的透射百分率相对于波长的图，所述带通滤光片用于过 滤由来自13A所示的辐照束的光激发的标记生成的光信号。图13D是显示经过带通滤光片过滤的光的相对发射强度相对于波长的图，所述带 通滤光片具有图13C所示的性质。图14是包含多个排列成有序阵列的位置的基质的图像，所述基质已经根据本发 明的不同实施方案进行扫描，其中所述图像代表基质的正方形部分。图15是包含多个排列成非有序阵列的位置的基质的图像，所述基质已经根据本 发明的不同实施方案进行扫描，其中所述图像代表基质的正方形部分。图16是包含多个排列成有序阵列的位置的基质的剖视图，其中所述基质要根据 本发明的不同实施方案成像，且其中用于激发在所述位置处的标记的激光激发束是以线的形式，其宽度仅是沿着该线的每个位置的宽度的约一半。图17是线性图像阵列的顶视图，所述阵列在图16所示的位置线上面对齐，所述位 置线已经用图16所示的激发束辐照，其中相对于位置线显示图像阵列的宽像素的中心。图18是包含多个排列成有序阵列的位置的基质的剖视图，其中所述基质要根据 本发明的不同实施方案成像，且其中用于激发在所述位置处的标记的激光激发束是以线的 形式，其宽度超过沿着该线的每个位置的宽度。图19是线性图像阵列的顶视图，所述阵列在图18所示的位置线上面对齐，所述位置 线已经用图18所示的激发束辐照，其中相对于位置线显示图像阵列的像素的中心，在线中的每 个位置上面显示了多个像素，图像阵列的每个像素的宽度小于被成像的各个位置的宽度。图20是包含多个排列成有序阵列的位置的基质的剖视图，其中所述基质要根据 本发明的不同实施方案成像，且其中用于激发在所述位置处的标记的激光激发束已经成形 为区域光束的形式，其宽度等于5条位置线的宽度，使得激发束可以同时辐照第一个位置 区域。图21是在图20所示的5行位置区域上面对齐的二维图像阵列的顶视图，所述位 置区域已经用图20所示的区域激发束辐照，其中在位置区域的上面显示二维图像阵列的 像素，在区域中的每个位置上面显示了多个像素，图像阵列的每个像素的宽度小于被成像 的各个位置的宽度，且二维图像阵列可以以时间延迟积分模式运行。
具体实施例方式根据本发明的不同实施方案，提供了用于检测来自基质上的多个位置的发射的系 统，例如，与基质上的固定化的多核苷酸的位置相对应的固定位置。该系统包含第一个辐照 源和第二个辐照源，所述第一个辐照源构造成辐照基质并设置成辐照第一组位置，所述第 二个辐照源构造成辐照第二组位置，其中所述第二个辐照源相对于第一个辐照源固定，使 得第二组位置分隔且排除基质上的第一组位置。这样，可以使第一个反应诸如荧光发射发 生在第一组位置，而可以使第二个不同的反应例如光切割反应发生在第二组位置。可以包 括扫描检测器，例如检测器阵列，其相对于第一个辐照源和第二个辐照源放置，以便收集来 自第一组位置的发射，而不收集来自第二组位置的发射。也可以提供平移台子，并构造成使 第一个辐照源、第二个辐照源和扫描检测器相对于彼此移动。在有些实施方案中，每个位置可以与多核苷酸位置相对应，且至少一些多核苷酸 可以用各自的标记进行标记，所述标记当暴露于激发光时发荧光。系统可以包含基质，其中 所述基质相对于第一个辐照源放置，以便受到第一个辐照源的辐照。基质可以包含流动池 和放置在流动池中的多个被标记的多核苷酸。流动池可以包含多个彼此隔开的通道。第一个辐照源可以包含至少一个激光源和全息摄影光束成形器。扫描检测器可以 包含二维电荷耦合器件。在有些实施方案中，所述系统可以包含调整光学器件。调整光学 器件可以设置在第一个辐照源和扫描检测器之间。扫描检测器可以包含点检测器、线检测 器或图像检测器。在有些实施方案中，提供了用于检测荧光标记的多核苷酸的系统，且包含基质，所 述基质包含第一个末端、第二个末端、在它们之间形成的一个或多个通道和在一个或多个 通道中固定化的多个被标记的多核苷酸珠子，每个被标记的多核苷酸珠子具有直径，且用各自的标记进行标记，所述标记对辐照做出响应，并发射出发射光，该发射光指示至少一种 核苷酸的存在。系统可以包含至少一个辐照源，该至少一个辐照源用于发射辐照并设置成 辐照多个被标记的多核苷酸珠子，从而激发对辐照起响应的标记，并引起标记发射出发射 光。可以提供调整光学器件，其包含柱面透镜、全息摄影光束成形器和一组棱镜中的至少一 个，所述棱镜包括至少一个长号棱镜。调整光学器件可以构造成使从至少一个辐照源发射 的辐照朝向一部分被标记的多核苷酸珠子，使得发射的辐照照射一个区域，该区域的尺寸 与被标记的多核苷酸珠子的直径相同或更小。系统可以包含扫描检测器阵列，其相对于多 个被标记的多核苷酸珠子放置，且构造成收集由标记生成的发射光，并生成与发射光相对 应的电荷。检测器阵列可以具有输出端，且可以提供时间延迟积分(TDI)系统，其在检测器 阵列内积累与发射光相对应的电荷，并在扫描检测器阵列的输出端上解读积累的电荷。在有些实施方案中，所述系统可以包含第二个调整光学器件，其设置在至少一个 辐照源和扫描检测器阵列之间。第二个调整光学器件可以包含柱面透镜。TDI系统可以构 造成通过以下过程积累电荷使至少一个辐照源和多个被标记的多核苷酸珠子相对于彼此 移动，而不使至少一个辐照源和扫描检测器阵列相对于彼此移动。在有些实施方案中，TDI 系统通过使扫描检测器阵列和调整光学器件相对于彼此移动而积累电荷。一个或多个位置可以包含超过500个位置，例如，超过1000个位置，超过10，000 个位置，超过100，000个位置，超过1，000, 000个位置，超过10，000, 000个位置，或超过 1，000, 000, 000个位置。扫描检测器阵列可以构造成收集一个或多个通道中的标记先后生 成的发射光，例如，2至10个通道先后、约8个通道先后、至少100个通道先后等。一个或多 个通道中的每一个可以在基质的第一个末端处开始，并连续排列至基质的第二个末端。根据不同实施方案，提供了检测多核苷酸的核苷酸序列的方法。所述方法可以包 含用激发源产生第一束辐射，将该第一束指向流动池，所述流动池包含多个位置和在所述 多个位置处固定化的多个多核苷酸，然后在流动池中造成第一个反应，该第一个反应包含 多个多核苷酸中的至少一些，然后用扫描检测器阵列扫描流动池以检测从多个固定位置发 射的辐照。在有些实施方案中，扫描操作可以发生在第一个反应之前。所述方法可以进一 步包含在第一个反应之后用相同或不同激发源产生的第二束辐照照射流动池，例如，通过 不同波长的辐照。在第一个反应之前和之后，可以用扫描检测器阵列扫描流动池以检测从 多个位置发射的辐照。然后可以在流动池中造成第二个反应，其包含多核苷酸中的至少一 些。然后可以在第二个反应之后，用相同或不同激发源产生的第三束辐照照射流动池。在第 二个反应之后用扫描检测器阵列再次扫描流动池(为了检测从多个固定位置发射的辐照) 后，从扫描步骤查明的信息可以用于确定多个核苷酸中的一个或多个的核苷酸序列。所述方法可以包含连接反应，例如，在每个扫描步骤之前的连接反应。在一个或多 个扫描步骤之后，所述方法可以任选地包含从多个多核苷酸中的一个或多个光切除保护基 的步骤。流动池可以在其中包含多个珠子，多个多核苷酸可以固定化在所述多个珠子上，且 多个位置可以是被所述多个珠子占据的位置。在有些实施方案中，多个多核苷酸可以包含 多个单分子多核苷酸，它们各自固定化在各自的一个位置。在有些实施方案中，所述方法可以进一步包含用设置在激发源和流动池之间的调 整光学器件形成第一束、第二束和第三束。调整光学器件可以包含柱面透镜、全息摄影光束 成形器和一组棱镜中的至少一个，所述棱镜包括长号棱镜。流动池可以包含在其中形成的多个通道或沟槽，例如，多个沟槽可以包含仅几个沟槽，如1、2、3或4个，或多达至少10，000 个沟槽。多个多核苷酸可以固定化在多个珠子上，且所述珠子可以放置在多个沟槽中。在 有些实施方案中，流动池可以包含10，000至1，000, 000, 000个沟槽，用于容纳单条DNA链。 在有些实施方案中，多个多核苷酸可以包含至少一些携带保护基的多核苷酸，且所述方法 可以进一步包含用不同于激发源的光切割束源光切割保护基。在有些实施方案中，所述方法可以包含使用时间延迟积分系统，例如，以产生指示 在一个或多个固定位置处是否存在核苷酸的信号。根据不同实施方案，本发明涉及扫描系统和方法。所述系统可以构造成检测生物 聚合物，例如，包含可检测信号的生物聚合物。根据不同实施方案，提供了如图1所示的光 学系统100，其包含光源122、光学装置106 (通常显示为被虚线包围的部件)、要扫描的基质 126、检测器102、激发滤光片120和第二个光学元件114。光源122、基质1 和检测器102 可以是本文所述的那些中的任一种。根据不同实施方案，光学装置106可以包含具有与本 文所述的那些类似的结构的光学装置，诸如激发滤光片116、光束分离器112和发射滤光片 108。光学系统100也可以包含第一个光学元件116和第二个光学元件118，它们可以包含 或不包含在光学装置106中。根据不同实施方案，第一个光学元件116可以包含遮罩，诸如包括多个光圈的遮 罩。可以调节每个光圈，以减少从固定化在基质1 上的多核苷酸发射的光的不均勻性，所 述基质1 可以包括通道124。例如，可以调节光圈的排列，诸如光圈的大小和/或形状。 一般而言，可以调节光圈，使得来自使用类似模具并具有样品类似体积和类似浓度的位置 的光穿过具有类似光信号(诸如类似的相对响应)的遮罩。这样，到达检测器102的信号 将是反应的精确表现。例如，尽管基质的第一个位置和第二个位置可能含有多核苷酸的类似体积和浓 度，且也可能使用类似的染料，到达检测器的来自第一个和第二个位置中的每一个的光可 能不类似。在不同的实施方案中，遮罩的第一个光圈和第二个光圈可以分别设置在靠近基 质126的第一个通道和第二个通道。可以调节第一个和第二个光圈的排列，从而可以减少 到达检测器的来自第一个和第二个位置的光的不均勻性。根据不同实施方案，第一个光学元件116可以包含多个透镜，多个透镜中的每一 个具有独特的数值孔径(NA)。可以调节透镜的NA以及透镜的位置，以减少从基质1 的通 道中的标记发射的光的不均勻性。在有些实施方案中，可以将透镜模铸成具有独特的NA。 一般而言，可以调节NA，使得来自使用类似模具并具有标记的类似体积和类似浓度的通道 的光穿过具有类似光信号的遮罩。这样，到达检测器102的信号将是反应的精确表现。根据不同实施方案，光学系统可以进一步包含额外的光学元件114，其可以包含， 例如，额外的滤光片诸如中性密度滤光片，其可以改变从基质上的位置发射的光的传递。例 如，基于基质126中通道的位置，额外的光学元件114可以改变传递。根据不同实施方案，光学系统106可以进一步包含第二个光学元件114。第二个光 学元件114可以包含遮罩、中性密度滤光片或具有预定NA的透镜。第二个光学元件114辅 助减少来自光源106的光的不均勻性。第二个光学元件114可以放置成在光到达基质1 之前减少来自光源122的光的不均勻性。根据不同实施方案，单独地或组合地使用多种技术中的任一种，可以确定对光学元件114和116调节的类型。示例性的技术包括时序射线跟踪模型(sequential ray trace model)、非时序射线跟踪模型(non-sequential ray trace model)、放射性测量方法 (radiometric formulae)、到达样品空间的光的经验测量和到达检测器的光的经验测量。根据不同实施方案，光从光源122发射出并穿过激发滤光片124，并任选地穿过第 二个光学元件114，然后遇到光束分离器112。到达光束分离器112的一部分光被指向基质 1 上的位置，在这里其造成样品发光。从样品发射出的光穿过第一个光学元件116。光被 指向穿过滤光片104，并被检测器102检测到。根据不同实施方案，生物聚合物可以包含分析物，例如，一个或多个多核苷酸。系 统可以包含一个或多个含有内在可检测信号的生物聚合物，和/或已经用标记或标志物 衍生化的生物聚合物，所述标记或标志物赋予可检测性的希望的类型。用可检测部分(诸 如可激发的报告分子、放射性同位素、荧光染料、旋转标记、化学发光的化合物等)标记分 析物的不同方法是本领域熟知的，以刺激可检测的发射，后者指示分析物的性质。当分析 物是多核苷酸时，也可以采用通过与标记的探针杂交，进行标记。可以使用染料标记、发荧 光的染料、自由浮动的染料、报告分子染料、探针染料、插入染料、量子点、分子信标、线性探 针、量子点介质、量子点珠子、染料-标记的珠子、连接到结合珠子的分析物上的染料或它 们的组合来标记分析物。标记可以对辐照起响应，且可以构造成发射出发射光，后者指示至 少一种核苷酸的存在。示例性的分析物可以包括单链和双链核酸、蛋白、碳水化合物、病毒、细胞、完整细 胞、单个分子、聚合酶、细胞器、有机聚合物、其它生物样品、颗粒、标记的介质、标记的珠子 等。分析物可以包括生物分子，例如，细胞、蛋白、DNA、RNA、多核苷酸、多肽、多糖和小分子分 析物。在有些实施方案中，分析物可以包含聚合酶或适用于延伸反应的其它酶。根据不同 实施方案，分析物可以是选定序列多核苷酸，且用于检测多核苷酸的分析物-特异性的试 剂(包括序列选择性试剂)可以与多核苷酸结合。多核苷酸分析物可以通过任意合适的方 法进行检测，例如，聚合酶链式反应、连接酶链式反应、寡核苷酸连接测定法、杂交测定法、 抗体测定法、亲和测定法、链霉亲和素/生物素测定法、单碱基延伸反应或其组合。标记化合物的实例可以是染料标记。可以使用任意合适的标记，诸如，例如，荧光 团。根据不同实施方案有用的荧光团可以包括可以与有机分子(尤其是蛋白和核酸)偶联的那些，和可以响应于可利用的激发源的激发而发射 出可检测量的辐照或光信号的那些。合适的标记可以包括具有荧光的、发磷光的和/或其 它电磁辐照发射的物质。标记的辐照可以造成它们以不同的频率(取决于使用的标记的类 型)发射光。在有些实施方案中，可以将量子点掺入系统中，以促进多核苷酸或其反应产物的 检测。量子点可以是分子级的光学信标。通过用广范围的应用颜色“照亮”生物学结合事 件，量子点纳米晶体可以象分子LED (发光二极管)一样起作用。量子点可以提供比常规荧 光团多许多的颜色。量子点可以具有许多其它的非常需要的光学性质。在有些实施方案 中，量子点可以用作定位使用FRET的荧光团激发的工具。使用标准的缀合化学方法可以将 纳米晶体量子点共价连接至生物分子上。然后可以将量子点缀合物用于在广范围的测定中 检测结合配偶体。根据不同实施方案，可以将链霉亲和素连接至量子点上，以在许多测定中 检测生物素化的分子。量子点也可以连接至抗体和寡核苷酸上。利用量子点纳米晶体-标记的缀合物可以改善目前使用的任意测定，例如，荧光标记的分子、比色酶或胶体金。一 个示例性的量子点工具可在商标QDOT下从加利福尼亚海伍德(Haywood)的Quantum Dot Corporation得到。关于量子点和它们的应用的更多信息可以参见，例如，www. qdots. com, 和 Bawendi 等人的美国专利号 6，207，229,6, 251，303,6, 306，310,6, 319，426,6, 322，901、 6，326，144,6, 426，513 和 6，444，143，Weiss 等人的美国专利号 5，990，479,6, 207，392 和 6，423，551，Nie等人的美国专利号6，468，808，和Bruchez等人的美国专利号6，274，323， 它们描述了许多生物学应用、量子点制备方法和用于量子点纳米晶体和缀合物的仪器，它 们都通过参考以其整体并入本文。根据不同实施方案，本发明的检测系统和方法可以与已经用能量转移染料标记的 生物聚合物一起使用。能量转移染料可以包含大斯托克斯位移(即，染料具有最大吸收时 的波长和染料具有最大发射时的波长之间的差异)，使得荧光发射可以容易地与用于激发 染料的光源区分开。能量转移染料的实例描述在Lee的美国专利号US 7,012, 141 B2、US 7，157，572 B2和7，402，671 B2，和Lee等人的美国专利号US 7, 169,939 B2，它们都通过 参考以其整体并入本文。能量转移染料，如可以与本发明一起使用的那些，可以包含荧光 素-氰化物缀合物，例如BigDyes ，其可从加利福尼亚福斯特城(Foster City)的Applied Biosystems, LLC得到。在有些实施方案中，量子点可以用作供体。根据不同实施方案，所述系统可以包含基质。可以将一个或多个生物聚合物设置 在基质上或基质中。基质可以包含一个或多个反应区。本文提及的反应区可以包含通道、 流动池、沟槽、沟、孔、开口、槽或其任意组合。反应区可以部分地向周围环境开放，或被封闭 与周围环境隔开。在有些实施方案中，可以将生物聚合物设置在反应区的表面上。在有些 实施方案中，可以将生物聚合物设置在反应区中。包含一个或多个反应区的基质类型的一 个实例可以参见Nordman等人的国际公开号WO 2006/135782A2,它通过参考以其整体并入 本文。根据不同实施方案，一个或多个反应区可以包含设置在其中的反应表面。反应表 面可以是，例如，被标记的珠子的表面。珠子可以进一步固定化在反应区，或珠子可以适合 在反应区内来回移动。在有些实施方案中，反应区自身可以包含反应表面。反应区可以包 含一个或多个被标记的分析物，后者固定化在它的表面上或固定化在反应区内。在有些实 施方案中，分析物可以以非有序方式或以有序方式固定化。分析物在基质上的固定化和移 动的实例可以参见=Reel等人的美国专利申请公开号US2008/0M1892 Al，Reel等人的 美国专利申请号US 2008/0105831 Al，Foquet的美国专利申请公开号US 2008/0220537 Al，Rank等人的美国专利申请公开号US 2008/0176769 Al，和Nordman等人的国际公开号 W02006/135782 A2，它们都通过参考以其整体并入本文。在有些实施方案中，反应区表面(例如珠子表面)可以包含结合特征。表面可以包 含低密度反应基团，例如，在Roitman等人的美国专利申请公开号US 2007/0077564 Al (通 过参考以其整体并入本文)中所述的低密度基质。反应区表面可以包含在它上面的活性区 域,例如，在Rank等人的美国专利申请公开号US 2007/0238679 AUUS 2008/0032301 Al、 US2008/0153100 AUUS 20080176769 Al 和 McKernan 等人的 US2008/000;3571 Al (它们都 通过参考以其整体并入本文)中所述的酶结合和排除表面。根据不同实施方案，所述系统可以包含台子。台子可以构造成接收和容纳一个或多个基质。台子可以构造成沿X和Y旋转轴移动，从而造成一个或多个基质沿X和Y旋转 轴移动。台子可以构造成使基质的一部分移动进检测器或其它成像装置的视野内。一旦就 位，台子可以构造成停止，且台子可以沉降，然后开始成像。在有些实施方案中，台子是在连 续移动中，所以台子不会停止，直到检测器已经检测整个基质。在有些实施方案中，台子可 以使物镜相对于检测器和基质移动，或检测器和物镜可以相对于基质移动。根据不同实施方案，所述系统可以包含一个或多个检测器。本文提及的检测器可 以包含检测器阵列、物镜、物镜透镜、照相机、光检测器、电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧 化物半导体(CMOS)装置、点扫描器、线扫描器、图像扫描器、另一类型的光学检测器或其组 合。检测器也可以包含多个检测器，例如，2个检测器、4个检测器或需要的任意其它数量 的检测器。在有些实施方案中，检测器可以构造成检测来自单个源的多个光学信号，例如， 在Lundquist等人的美国专利申请公开号US 2007/0036511 Al (通过参考以其整体并入 本文)中所述的系统。在有些实施方案中，检测器可以构造成检测来自多个源的光学信号 的同时实时监测，例如，在Lundquist等人的美国专利申请公开号US 2007/0188750 Al和 US2008/0030628 Al和Nordman等人的美国专利号6，856，390 B2 (它们都通过参考以其整 体并入本文)中所述的系统。根据不同实施方案，检测器可以包含时间延迟积分(TDI)系统。在检测器中，在检 测器的光反应元件或像素中收集的光产生的电荷可以向串行寄存器转移，每次一行。使用 对应的检测器的单个芯片上(on-chip)放大器或读出寄存器可以读出串行中的电荷信息。 作为实例，对于256x256元件CCD，每次将单个成像区(一行)转移到串行寄存器，进行这样 转移的区域的η个读出(其中η对应着要扫描的区域的长度)，每个读出对应着行中的不同 光谱元件或像素。上面的过程持续到已经读出所有256行中的所有256个像素。图2显示了一个示例性的时间延迟积分过程，其可以根据本发明实现。如图2所 示，可以在定向箭头95所示的方向，在基质上的固定位置91扫描检测器阵列93。根据不同 实施方案，固定位置可以包含固定化多核苷酸且已经反应以发射辐照的位置。如图2所示， 从固定位置91发射的辐照在时间1被第一个阵列像素97检测，已经就显示在图下面的亮 度测量了发射的辐照，构型显示在时间1。根据图2所述的方法，检测器阵列93在方向95的扫描移动导致像素99的位置在 时间2超过固定位置91。然后将在时间2测得的亮度与像素97在时间1测得的亮度相混 合，混合的亮度显示在图下面，构型显示在时间2。根据所述的方法，扫描操作然后产生显示 在时间3的构型，由此检测器阵列已经在方向95移动到像素101所在的点，超过从固定位 置91发出的发射。然后将像素101在时间3测得的亮度与像素99在时间2测得的亮度以 及像素97在时间1测得的亮度相混合，形成混合的亮度，在图下面显示了在时间3的构型。 根据本发明的不同实施方案，可以使用这种和类似的时间延迟积分方法。根据不同实施方案，根据本发明的不同实施方案的另一种扫描系统如图3-5所 示。应当理解，图1所示的光学结构的特征和图2所示的时间延迟积分系统和方法可以整 体、部分地或根本没有与图3-5所示的系统结合地组合在一起。尽管图3将扫描系统标记为 时间延迟积分单分子测序(TDISMS)扫描系统，应当理解，系统不一定必须以时间延迟积分 模式运行。此外，应当理解，系统可以用于检测通常来自基质上的位置的任意发射，例如，检 测固定化在单个珠子上的多个多核苷酸拷贝，例如，当许多这样的珠子固定化在基质上时。提及珠子时的“固定化”，应当理解，珠子不需要物理地或化学地结合于基质，而是可以简单 地停留在基质上，但是在扫描操作过程中相对于基质的移动受到限制。如图3-5所示，系统可以用于检测基质上的反应，例如，所示的流动池200中的反 应。可以给流动池200提供第一个入口 212和出口 214，在它们之间可以运输试剂、反应物 或其它物质，以在流动池200中实现不同的反应。可以但是不一定给流动池200提供多个 在它内部或在它上面形成的沟槽或通道。在有些实施方案中，示例性的沟槽或通道可以包 含在Nordman等人的美国专利号6，856，390 B2中所述的那些。扫描系统可以包含检测器， 后者具有至少一个物镜透镜210，其可以构造成检测来自在流动池200上或邻近流动池200 的第一个区域206的发射。系统可以包含2个辐照源(未显示)，其中的第一个可以包含激 发源，后者构造成产生激发束并使激发束指向调整光学器件202，它在图3-5中显示为柱面 透镜202。另一个辐照源(未显示)可以构造成产生光切割辐照束，后者指向并穿过第二 个调整光学器件204，它显示为柱面透镜204。根据不同实施方案，调整光学器件202构造 成使激发束指向区域206，其指向方式使得激发束以区域206的形式投射在流动池200上。 类似地，由调整光学器件204调节的光切割束可以指向并投射在区域208上。可以看出，物 镜210构造成检测来自区域206的发射，而不检测来自区域208的发射。在图4和5中显 示了描述这种系统的应用的扫描操作。如图4所示，图3所示的系统是显示在扫描操作早期的第一个位置。在操作过程 中，整个系统(但是不包括流动池200)按照从左向右的方向移动，使得在一段时间后，系统 移动到图5所示的靠后位置。在图4和5中所示的连续步骤所述的这种扫描表明系统的运 行是，用激发束辐照在流动池200上的区域206，并使用物镜210检测从区域206发射的辐 照。在物镜210是包含检测器阵列(例如像素阵列)的检测系统的一部分的情况下，应当 理解，像素可以单个地指定给流动池200中的不同位置，它们落入区域206。还应当理解，可 以对在区域208内的流动池200的位置进行光切割束分离，并远离指向区域206的激发束。 因而，系统可以提供在区域206中的位置的激发，同时提供在区域208中的位置的光切割反 应。从图4所示的位置向图5所示的位置所示的移动可以看出，在区域206内的流动 池中的位置处的激发和检测操作后不久，然后对相同位置进行光切割束和光切割操作。根 据不同的方法，在多核苷酸进行光切割操作之后，可以将额外的核苷酸掺入已经进行光切 割操作的多核苷酸中。在图6-8中显示了根据本发明的不同实施方案的扫描检测系统的另一个实施方 案。图6-8描绘了物镜300向包含通道308的流动池306移动并与之靠近的次序。在显示 的实施方案中，由调整光学器件302确定形状的激发束指向流动池306的第一个侧面310。 另外，由调整光学器件304确定形状的光切割束也指向流动池306的第一个侧面310。从 图8可以看出，物镜300检测来自通道308内的位置、来自流动池306的底侧312的发射， 所述底侧312与顶侧310相对，在所述顶侧310上，激发束和光切割束将它们的方向指向通 道308。在显示的示例性实施方案中，反应位置可以是在具有顶表面310的流动池壁309的 下面。在这样的一个实施方案中，物镜具有工作距离，其包括穿过流动池306的底基质311 和穿过通道308中的任意试剂进行检测。 在有些实施方案中，通过使基质和检测器相对于彼此移动可以实现TDI。在正常的读出方案下，图像在检测器上的移动产生模糊。在TDI中，可以省略快门。在有些实施方 案中，可以使检测器的行的移位与基质/台子的移动同步化。该时间段后，检测器上的电荷 可以转移到更接近串行寄存器的一行，使得来自分析物的荧光与检测器上的相同电荷信息 相对应。因此，不同于检测器的物理行，在根据不同实施方案的TDI中存在积累光产生的 电荷的行的连续移动行的集合。示例性的TDI系统可以参见Oldham等人的美国专利号US 7, 280, 207 B2和US 7, 265,833 B2中的图1、10和11，它们二者通过参考以其整体并入本 文。根据不同实施方案，所述系统可以包含一个或多个滤光片。本文提及的滤光片可 以包含发射滤光片、激发滤光片、多凹槽滤光片、Rugate滤光片、二色滤光片、带通滤光片或 其组合。在有些实施方案中，滤光片可以是单个带通滤光片或多个带通滤光片。本文使用 的带通滤光片和通带滤光片可以互换使用。多个通带滤光片可以是，例如，多凹槽滤光片、 多-Rugate滤光片或单个Rugate滤光片。多个通带滤光片可以与非相干光源一起使用，例 如，卤素灯、白光源和/或一个或多个发光二极管(LED)或发射不同波长光的有机LED。多 个通带滤光片可以与多个基于激光的发射不同波长光的光源一起使用。生产Rugate滤光 片和Rugate光束分离器的实例可以参见美国专利号US 7，498，164 B2的图1，它通过参考 以其整体并入本文。根据不同实施方案，所述系统可以包含不同的调整光学器件。调整光学器件可以 包括光束成形器、光束分离器、棱镜、长号棱镜、棱镜组、二色镜、透镜、柱面透镜、菲涅耳透 镜、聚焦透镜、准直透镜或其任意组合。调整光学器件可以设置在系统中，在辐照源和基质 之间的通道上。调整光学器件可以设置在基质和检测器之间的通道上。在有些实施方案中， 调整光学器件可以包含一个或多个全息摄影元件，例如全息摄影光束成形器。一个或多个 全息摄影光学元件可以用于在不同的角度衍射光。全息摄影光束成形器可以产生“顶帽”图 案，并可以进一步分散光，使得它补偿光学系统的其它部分，诸如使边缘更亮以补偿渐晕。 全息摄影光学元件的实例描述在Hoff等人的美国专利号US 6，744，502和US 7，006，215 中，它们二者通过参考以其整体并入本文。在有些实施方案中，可以使用激发增强来增强能 量水平，例如，在Oldham等人的美国专利申请公开号2008/0066M9A1 (通过参考以其整体 并入本文)中所述的电浆子。通过相对于辐照移动调整光学器件、通过相对于基质移动辐 照和/或通过移动光学器件和基质，可以进行TDI检测。在有些实施方案中，调整光学器件可以构造成与来自空间上隔开的光源的多谱光 相组合。在Boege的美国专利号US 7，M8，359 (它通过参考以其整体并入本文)的图1A-7B 中，例证了不同的光学元件与2种不同光源相组合的应用。在有些实施方案中，所述系统可 以是构造成以零模式波导(ZMW)运行的系统。在Limdquist等人的美国专利申请公开号 US2008/0226307 Al的图3中和Levene等人的美国专利号US 6，917，726 B2的图1-2中， 例证了零模式波导系统，它们二者通过参考以其整体并入本文。根据不同实施方案，基质自身可以构造成导向激发和发射光，例如，在Carrillo 的美国专利号US 6，809，810 B2，和US 6, 888, 628 B2中所述的检测池，它们二者通过参考 以其整体并入本文。根据不同实施方案，所述系统可以包含一个或多个辐照源。辐照源可以是多种光 源中的任一种。辐照源可以是，例如，LED、有机LED、本领域技术人员的非相干光源、固态激
13光、微线激光(microwire laser)、白光源或其组合。本文使用的术语“辐照源”、“光源”、“激 发源”等可以包括单个或多个辐照源。本文使用的"LED"可以指LED、OLED或其多重态。 此外，根据不同实施方案，“LED"可以包括相干辐照源，例如，固态激光源或微线激光源。 每个辐照源可以构造成辐照基质。每个辐照源可以构造成辐照基质上的一个固定位置或一 组固定位置。在有些实施方案中，所述系统可以包含2个或更多个辐照源。第一个辐照源可以 构造成辐照基质，且设置成辐照多个固定位置中的第一组固定位置。第二个辐照源可以构 造成辐照多个固定位置中的第二组固定位置。第二个辐照源可以相对于第一个辐照源而被 固定，使得第二组固定位置与基质上的第一组固定位置隔开并排除后者。在有些实施方案 中，第一组固定位置和第二组固定位置在X和/或Y方向部分地彼此重叠。在有些实施方 案中，第一组固定位置和第二组固定位置是相同的。一个或多个检测器，例如扫描检测器 阵列，可以相对于第一个辐照源和第二个辐照源放置，以便收集来自第一组固定位置的发 射，而不收集来自第二组固定位置的发射。在有些实施方案中，扫描检测器阵列可以相对于 第一个辐照源和第二个辐照源放置，以便收集来自第一组固定位置和第二组固定位置的发 射。在基质上或基质中固定化的由标记发射的光可以穿过带通滤光片。带通滤光片可 以基本上排它地允许来自基质的预定波长的光穿过，其中所述预定波长的光与所结合的标 记集合发射的光信号的一部分波长相对应。穿过带通滤光片的光可以是滤过的光。带通滤 光片可以基本上阻断来自辐照源的辐照光，如果这样的光从基质反射的话。可以穿过带通 滤光片的光信号的一部分波长可以包括所有光信号或在每个单独标记的光信号的峰强度 附近一定范围的波长。例如，在光信号的峰强度附近的波长范围可以是在给定标记的峰波 长的每侧上的波长的约5%至约20%，或它可以包括在半数最大值的全宽。预定波长的收 集可以通过例如色散或通过例如使用额外的带通滤光片来实现。根据不同实施方案，可以在辐照源(光源)和基质之间使用调节滤光片。光源发 射的光束也称作激发束(如果用于激发标记)，且可以被在激发波长范围的激发滤光片滤 过。相对比地，可以在放置基质的检测区和检测器之间使用调节滤光片。基质经激发发射 的荧光或亮度也称作发射束，其可以被在发射波长范围的发射滤光片滤过。根据不同实施方案，光源可以用于提供激发束，以辐照具有一个或多个在它上面 或其中固定化的标记的基质。在有些实施方案中，可以使用2个或更多个具有相同或不同 波长发射的激发束，使得每个激发束激发在基质上固定化的不同的各自的染料。激发束可 以从光源直接瞄向基质，穿过基质壁，或可以被不同的光学系统转到基质上，如本文所述。根据不同实施方案，一个或多个滤光片，例如带通滤光片，可以与光源一起使用， 以控制辐照束的波长。一个或多个滤光片可以用于控制从激发的标记或其它发光标记发射 的发射束的波长。一个或多个辐照滤光片可以与光源相结合以形成辐照束。一个或多个滤 光片可以设置在一个或多个光源和基质之间。一个或多个发射滤光片可以与来自激发的染 料的发射束相结合。一个或多个滤光片可以设置在基质和一个或多个发射束检测器之间。根据不同实施方案，可以使用的滤光片是单个带通滤光片或多个带通滤光片。本 文使用的带通滤光片和通带滤光片可互换使用。多个通带滤光片可以是，例如，多凹槽滤光 片或多-Rugate滤光片。多个通带滤光片可以与非相干光源一起使用，例如，卤素灯、白光源和/或一个或多个LED或发射不同波长光的0LED。多个通带滤光片可以与多个基于激光 的发射不同波长光的光源一起使用。生产和使用Rugate滤光片和Rugate光束分离器的实 例可以参见例如feisworth的美国专利号6，256，148，它通过参考以其整体并入本文。根据不同实施方案，多个通带滤光片可以与二色光束分离器、50/50光束分离器、 具有几个“通带”的二色光束分离器或无光束分离器一起使用。多个光束分离器可以在一 个角涂有涂层，造成跨滤光片基质的厚度差异，以用角补偿波长迁移。光束分离器可以沿着 光或光束途径设置在低角，以使滤过的光的边缘清晰，且可以便于制作。光束分离器可以沿 着光束途径以45°入射角放置。低角可以包括小于45°、小于30°或小于15°的入射角。 通过将不同光干涉材料涂布于在多个通带滤光片生产中使用的基质的各个区域可以形成 多个通带滤光片。Rugate滤光片是基于折射率的干涉涂层的实例，其在一个方向连续变化，所述方 向例如垂直于胶片平面或与胶片平面成45°。当折射率在2个极端值内周期地变化时，可 以制备在排斥带的任一侧上具有高透光率的负滤光片。可以生产周期性的Rugate滤光片。 Rugate凹槽滤光片可以使用耐火金属氧化物以实现涂布，并具有特殊的热和环境稳定性。 这些滤光片可以用于替换其它类型的凹槽滤光片，特别是需要耐久性和可靠性时。Rugate 凹槽滤光片可从Barr Associates (Westford，Mass.)得到。Rugate凹槽滤光片可以用作 边缘滤光片和光束分离器。对于Rugate凹槽滤光片，滤光片大小或形状没有限制。Rugate 凹槽滤光片可以提供环境和热稳定性、宽广的操作温度范围、狭窄的排斥带、多种形状和大 小、高处理量、低波动和/或宽光谱范围。更多信息可以从例如www. barr-associates-uk. com 禾口 www. barrassociates. com/opticalfliters, php 得至lj。可以制备多四槽滤光片，例 如，使用测量的0. D. 6或更好的阻断。具有这类在光波长的深阻断水平的凹槽滤光片也可 以提供接近光辉带的高传递。根据不同实施方案，当在不同固定位置的光谱上隔开的多个染料被激发束辐照 时，可以增加激发水平。这可以导致更少的光谱串扰。可以提高染料基质、条件数和/或 系统中的解卷积(deconvoluting)。增加的激发水平可以提供更高的信号水平。在使用在 “红”光谱中发射的染料的过程中，可以看到更高的信号水平。可以提高系统的动态范围。 系统可以减少对不同染料的发射束强度中的差异的补偿。根据不同实施方案，检测器可以包含检测集合部件。示例性的检测集合部件可以 用于样品中靶多核苷酸的荧光检测，其中使用根据本发明的装置。检测集合部件包含平移 台子，其用于定位试验装置。试验装置可以包含可寻址的检测室的阵列，所述检测室含有荧 光检测试剂。集合部件中的检测器可以包含钨灯泡(或石英卤素灯泡，75W)照明源、CCD照 相机和适当的聚焦/收集光学器件。照明源可以放置成从上面对角地照射装置(例如，相 对于照射的表面以45度倾斜角)。光学器件可以包含2个被发射滤光片隔开的透镜。第一 个透镜校准发射滤光片的入射图像，第二个透镜将滤过的光束重新成像在CXD上。试验装 置放置在第一个透镜的焦点处。在有些实施方案中，CXD可以是热电冷却的仪器级前照明的CXD (Princeton Instruments TEA/CCD-512TK/1)。CCD 的检测板可以包含 512X512 阵列的 27mu. m 正方 形像素，其可以覆盖试验装置的整个头上横断面。照相机头可以由控制器(Princeton Instruments ST-135)控制，所述控制器可以与计算机(Quadra 650，Apple Computers)
15通讯，以收集和处理信号数据。检测系统可以能够实现像素的芯片上框并(on-chip binning)。对于具有Immxlmm的头上横断面的检测室，具有2X2像素大小的框是合适的。更 一般地，可以基于需要的总处理时间、检测室的大小和数目、灵敏度和信号噪音来选择框大根据不同实施方案，检测集合部件可以包含计算机。集合部件中的计算机可以包 含信号处理软件，用于选择从其中测量信号的每个检测室中的适当子区域。可以选择这样 的子区域的入射光的均一性，以确保边缘区域被排除。根据测定的要求，可以以选定的间隔 记录和储存装置的信号图像。优选地，将每个检测室的信号记录为每个室中的选定子区域 的每个框的平均信号，这是因为每个室中的选定子区域的大小通常随室不同而异。可寻址 的阵列的实例描述在Woudenberg等人的美国专利号6，126，899中，它通过参考以其整体并 入本文。其中可以掺入本发明的检测系统和方法的示例性系统包括但不限于下述的在 Reel等人的美国专利申请公开号US 2008/0105831A1的图ΙΑ、1B、3A和中例证的单分子 测序检测系统，在Howard的美国专利申请公开号US 2007/0295917 Al的图1中例证的单个 激发波长检测系统，在Reel的美国专利号US 7，139，074 B2的图14和28中例证的用于光 学地分析来自样品的光的光学系统和方法，在Reel等人的美国专利号US7，177，023 B2的 图9-11B和13中例证的荧光检测系统，在Oldham等人的美国专利号US 7，265, 833 B2的 图1中例证的具有多凹槽滤光片和激光激发源的电泳系统，和在i^erenczi的美国专利申请 号US 2009/0015912 Al的图2中例证的全内部反射荧光显微镜或检测系统，它们都通过参 考以其整体并入本文。示例性的系统仅仅是可能的系统结构的实例，无意限制本发明的教 导。根据不同实施方案，所述系统可以包含线扫描器方案来成像。构造成执行线扫描 器方案来成像的系统可以包含在扫描方向是单个像素宽度的检测器。该方案消除了从一个 位置移动到另一个位置所耗费的大部分时间，允许大部分时间用于收集发射光子。对于其 中荧光团的周转速率通常缓慢的单分子系统，这可以解决下述问题在希望的扫描速度得 到足够的信噪比，以更充分地利用照相机。对于基于珠子的测序系统，光学结构可以构造成 实现有效的线扫描系统，例如，在Oldham等人的美国专利号US7，265, 833B2的图1中例证 的系统，该专利通过参考以其整体并入本文。在有些实施方案中，使用点扫描器，且可以以许多方式来构建，例如，用于点扫描 器的检测器可以包含用于单通道检测的单个检测器。在有些实施方案中，可以使用一个光 束-分离器或一组光束-分离器，允许同时检测2个或更多个通道。激发束可以类似地具 有单个带通，或可以具有同时或先后使用的多个带通。关于下一代测序应用，其中使用的珠子通常是在1微米直径的量级，实现仅500nm 的光学分辨率是合理的。如果使用与1微米相对应的扫描轴像素宽度，光学分辨率受到像 素宽度的影响(convolve)，导致1. 5微米的有效宽度。因而，如果1微米珠子彼此过于接 近，它们可能不会被分辨开。那么这可以影响扫描轴的宽度，其可以使用线扫描系统成像， 但是这些问题可以通过使用激发束在扫描轴中的紧密聚焦和高通量密度来解决。根据不同实施方案，所述成像系统可以是，例如，在图1中显示的成像系统。成像 系统可以包含光源(诸如白光源)和转换激发滤光片、发射滤光片和光束分离器。可以考虑将多-照相机/成像系统(诸如双照相机系统)与这样的照明系统一起使用。在有些实 施方案中，所述系统可以包含4个照相机。4照相机系统可以包含白光照明系统。在这样的 系统中，Rugate滤光片集合可以用于实现4个同时的带通。Rugate滤光片或二色滤光片可 以用于实现2个激发带通。激发源可以包含白光源、一个或多个激光器或其它可能的照明 组合。系统可以包含例如2种标准染料和2种大染料(具有更大的斯托克斯位移)、4种标 准染料、大染料集合、2种标准染料和3种大染料或其它染料组合。在有些实施方案中，所述系统可以包含色散元件，诸如光栅棱镜或棱镜，其具有与 扫描方向垂直的色散，以建立光谱。珠子、单个分子或其它靶物可以放置在固定的网格上， 与扫描方向垂直的间隔可以提供足够的距离以调节光栅的色散。根据不同实施方案，可以与现有的成像系统类似地构造所述系统。或者，可以为该 目的构造和使用扫描系统，包括点扫描器、线扫描器和图像扫描器(例如在图2中所示的作 为下面的实例的TDI扫描器)。在有些实施方案中，所述系统可以包含点扫描器。可以以 多种方式构造点扫描器，例如，用于点扫描器的检测器可以包含用于单通道检测的单个检 测器。可以使用一个光束-分离器或一组光束-分离器，允许同时检测2个或更多个通道。 激发可以具有单个带通，或可以同时或先后具有多个带通。在不同的实施方案中，可以优化系统的处理量，例如，通过优化获取率或像素读出 率(每秒的像素数)。这可以使用检测器来实现，例如，多头(multi-tap)(XD、CM0S装置或 其它检测器。检测器可以构造成以TDI模式运行。当系统是在TDI模式时，激发源可以构 造成提供激发光束，后者是珠子的宽度或比珠子更宽。在有些实施方案中，激发源可以构造 成提供激发光束，后者是珠子宽度的一半或更小。根据不同实施方案，珠子可以是1微米直径的量级。检测器可以实现500nm的光学 分辨率，这接近使用NA透镜的理论衍射限度。当用运行在TDI模式的检测器构造系统时， TDI装置提供可以实现比像素宽许多的光束的机理，这是因为它在扫描方向具有许多像素。 另外，更大的成像区域可以允许整个激光线的成像，即使它是几个微米的宽度。在该结构 中，系统可以在扫描轴中照射并光学地组合多个珠子。在有些实施方案中，如果使用与1微 米相对应的扫描轴像素宽度，光学分辨率可以受到像素宽度的影响(convolve)，导致1.5 微米的有效宽度。因而，如果1微米珠子彼此接近，它们可能不会被分辨开。那么这会限制 可以使用线扫描系统成像的扫描轴的宽度，进一步需要激发在扫描轴中的紧密聚焦，并需 要高通量密度。TDI检测装置可以构造成提供可以实现比像素宽许多的光束的机理，这是因 为它在扫描方向具有许多像素。另外，更大的成像区域可以允许整个激发线在扫描轴中的 成像，即使它是几个微米的宽度，因而潜在地在扫描轴中同时照射并光学地收集多个珠子。在不同的实施方案中，系统可以包含反馈系统。使用反馈系统可以使台子的扫描 速度与TDI照相机或成像仪器的计时速度同步化。系统可以包含线性编码器，其分辨率比 珠子大小或图像空间中的像素大小更细。在有些实施方案中，检测器的像素大小是几个微 米宽。当使用20x系统放大率时，每个像素可以对应着珠子阵列的约1/3微米。因而，线性 编码器的分辨率可以显著小于1/3微米。可以调整线性编码器以匹配珠子大小的变化，或 匹配单个分子的结合点的间隔或要成像的其它目标区域。在有些实施方案中，反馈系统可以产生信息，所述信息可以输出以通知TDI检测 器或成像系统在水平方向(扫描轴)计时。利用该信息，系统可以在检测器图像和台子的移动之间进行比对。为了进一步优化该系统，TDI检测装置的每个输出头(output tap)可 以包含电子扩大(EM)寄存器。当通过相同的检测器同时成像多个颜色时，该方案可以提供 不同颜色图像之间的比对。 在有些实施方案中，系统的基质可以包含一个或多个基准，例如，基质上的可区别 的标识，其可以用于辅助维持每个珠子或斑点的位置地图。基准可以有规律地隔开，例如， 掩蔽的金属基准或随机的，诸如结合的颗粒，它们是反射的、荧光的或着色的，它们已经随 机地散布在载玻片上。基准可以校正位置的意外改变。例如，载玻片的热膨胀或相对于光 学标尺的意外移动可能造成误差。关于基准的信息可以与每个珠子或斑点在一起且可以储 存在系统中。这可以急剧减少任何后续数据处理负荷。此外，可以储存单个图像地图，且可 以在扫描该区域的同时调用地图的该部分。那么当前的局部区域可以是处理的唯一区域， 使与处理的图像和地图有关的阵列的大小最小化，例如，系统点扩展函数(PSF)的解卷积。
在有些实施方案中，可以解决跨检测器的色差和传递差别。系统可以包含多个检 测器，例如，发射荧光的每种单独颜色的检测器。每个检测器可以包含焦点调整器，其可以 调节每个检测器以克服物镜的色差。检测器可以包含校正因子以确保颜色通道之间的适当 对齐。如前面提及的，系统可以包含光束成形器。使用光束成形器可以补偿由不同因素(包 括渐晕)引起的强度变化。光束成形器可以提供强度的变化，其可以增加在图像中具有更 少信号的那些目标区域中的通量。光束成形器可以在整个图像上提供均勻的信号。在有些实施方案中，所述系统可以用于单分子检测系统中。处理单个分子的系统 的一个问题是荧光团的周转时间。一般而言，为了获得足够的信噪比，期望最小观察时间以 允许发射足够的光子。更高的激发能可能简单地使荧光团饱和，会产生非常少的额外光子。 因此，为了充分利用构造成在TDI模式运行的扫描检测器，检测器可以保持其在延长的时 间段使用，以防止像素的饱和。例如，如果扫描距离相对较短，那么大部分时间可能用于在 扫描结束时掉头，而不是实际扫描。另一个问题是，如果希望快速地连续扫描，一次读出荧 光团，一次证实它已经被光切割，那么在阵列上的不同点处扫描之间的时间可能是相等的。根据不同实施方案，多个激发波长可以用于检测多个样品组分。根据不同实施方 案，所述仪器和方法可以适合用于任何合适的荧光检测系统。例如，仪器和方法的不同实施 方案可以用于单个或多个样品的测序系统中，例如，核酸序列扩增反应、测序检测系统。根据不同实施方案，所述系统可以包含扫描检测器，其在一个方向扫描，扫描第一 行，然后在与扫描过的行垂直的轴中步进一个扫描宽度，并回扫其它方向，扫描第二行。或 者，系统可以包含扫描检测器，其使用倒转扫描，其中所述检测器扫描一行，然后返回到它 的起始位置，然后在与扫描过的行垂直的轴中步进一个扫描宽度，并重复。如果需要光切割 步骤，可以通过检测器透射出2个激光线，一个用于执行光切割，例如，在约355nm，而一个 用于激发染料，例如，在约488nm。系统也可以包含3个激光器，即2个激发激光器和1个光 切割激光器。或者，可能需要具有在物镜外部的一个或多个激光线。这会减少荧光和来自 物镜的光学元件的散射的问题。激光器可以构造成跟踪物镜，所以激发光停留在图像的相 同部分。在不同的实施方案中，当使用所述系统检测单分子测序时，如果整个激发束被包 含在扫描检测器的图像区域内，激发激光器之间的间隔通常不是至关重要的。在有些实施 方案中，激发束可以充满检测器的成像区域。在有些实施方案中，激发束可以亚充满检测器的成像区域。当要进行光切割时，计时可能是重要的，这是因为光切割和激发之间(和期 间)的时间可以允许第一个和/或第二个dNTP掺入，导致缺失误差的可能性。因而，在不同 的实施方案中，可以优化光切割激光线的宽度以防止通量密度升高到荧光团聚合酶或dNTP 的光破坏可能发生的点。另外，所述系统可以构造成可以控制光切割激光线、激发激光线之 间的间隔和激发激光线的宽度。在不同的实施方案中，可以使用旋转的台子，避免台子停止或方向反转。这可以与 R台子相组合。孔或分子位置可以进一步覆盖整个表面，或可以是在轨道中，所述轨道可能 作为放射带或螺旋出现。如果使用放射带，所述带可以包含在它们之中的短间隙，允许检测 器在放射轴中平移，不需要浪费样品珠子或分子，或每次扫描将所述带的一部分暴露于激 发和/或切割光超过一次。在有些实施方案中，所述系统可以用于检测放射珠子或珠子的 直线阵列。如果检测放射带，所述带可以包含在它们之中的间隙以防止浪费样品珠子或分 子。如果检测珠子的直线阵列，检测器可以扫描一条路，如图3-5所示。在有些实施方案中，可能希望关闭激光器或遮盖它们，同时检测器返回到另一侧， 或执行倒转。如果使用多个带(对应着多次扫描)，无论是直线扫描器还是旋转扫描器，可 以分隔多个带，使得与扫描轴垂直的照射的区域可以比垂直于扫描器的图像距离略大。这 可以确保，整个成像的区域都被照射到，也不需要照射下一个带/扫描的部分。这种间隔应 当考虑对齐图像区域和照明区域的耐受性，和图像和/或照明区域的大小(由于不同光程 或照明束成形变化导致的不同放大水平所造成)的任何耐受性。如图3-5所示，系统可以包含具有倒转的流动池，或可以存在多个具有倒转的流 动池和流动池之间的平移。系统可以包含在单个流动池中的多个带，在带之间具有倒转和 平移。或者，可以反转激发和切割的方向，允许换向扫描，不需要倒转。在一个示例性的实施 方案中，流动池的总区域可以接近相同大小。在一个实施方案中，如果紫外和激发光不穿过 物镜可能是希望的，二者都消除背景并允许全内反射荧光(TIRF)，无需使用浸入物镜。在有 些实施方案中，优选地，照明区域不是高斯(Gaussian)，但是在有些实施方案中，可以是“高 顶帽”形状或补偿由渐晕造成的收集效率差别的形状。激发照明宽度的大小可以接近检测 的成像区域的大小；例如1 像素线/3线/微米=约43微米。紫外光切割照明宽度的大 小可以是光切割所需的时间除以每个像素线/线/微米的时间；例如25毫秒/(1/50，000 线/秒)/3线/微米=417微米。光切割区域的大小可以部分地由最大通量密度决定，以 便使光损害最小化。在不同的实施方案中，系统可以构造成检测同步单分子测序(sSMS)的系统。sSMS 可以使用在内部猝灭的dNTP作为固定化的加工聚合酶的底物。应当指出，dNTP不一定需 要完全猝灭，且其它标记的dNTP构建体可以用作底物。在一个示例性的应用中，受体染 料可以经由光可切割的连接物(PCL)连接到每个碱基上，且黑暗猝灭剂可以连接至聚磷 酸酯末端。在聚合酶掺入脱氧核糖核苷酸(dNTP)后，可以切割和解离含有黑暗猝灭剂的 聚磷酸酯。结果，碱基上的染料未被猝灭，且可以用于发信号或检测掺入事件的指征。在 不同的实施方案中，当已经鉴别出新掺入的碱基或登记了掺入事件时，然后染料可以通过 光切割释放出或被灭活，以允许额外的碱基掺入事件发生。在Mir的美国专利申请公开 号 US 2005/0244863 Al、McKernan 等人的 US 2008/0003571 Al 和 Rabini 的国际公开号 W096/27025中，例证了构造以执行sSMS检测的示例性系统，它们都通过参考以其整体并入
19本文。在有些实施方案中，光切割和检测步骤可以以基本上同步的方式进行，以提供进 行测序单个分子的方便方法。在不同的实施方案中，在已经发生碱基的荧光标记的光切割 之前，没有预见到后续的核苷酸掺入。因而，SSMS会提供有价值的方式，该方式可以用于从 结合事件中分离和辨别掺入事件。在有些实施方案中，可以固定检测的时间段，检测时间段可以设定得足够长以提 供足够的信号，防止由于光子的不充分收集或由于碱基误用(base miscall)导致的缺失误 差，所述碱基误用源自具有不充分的信号来检测碱基，或具有不充分的信号来精确测定何 种颜色并从而测定掺入了何种碱基。同时，时间段也可以设定得足够短以限制过度照明，这 可能造成染料、酶或DNA的光激活的降解。进行上述过程的一种示例性的方法包括下述步骤(1)执行希望的模板的dNTP延伸以掺入单个标记的核苷酸，由此从每个标记的核 苷酸释放猝灭剂从而允许检测核苷酸；(2)进行成像操作以检测新掺入的核苷酸；(3)执行光切割操作，其中与新掺入的核苷酸结合的染料被释放或被灭活以允许 检测后续的掺入事件；和(4)重复步骤⑴至(3)进行后续的碱基延伸。在考虑掺入和光切割的推测性质时，可以考虑选定的聚合酶对dNTP的掺入速率。 一般而言，可以将值归因于聚合酶的周转速率，其经常表示为通常在平均值附近的分配的 平均值。应当理解，有些聚合酶具有比其它聚合酶更快的周转速率。周期时间可以类似于 掺入速率，或根据需要而更长。更长的周期时间可以允许为更大的测序处理量发生大部分 掺入，但是会增加总运行时间和装置大小。根据不同实施方案，掺入单个标记的核苷酸所需的时间(掺入时间)可以包括扩 散、结合和/或掺入，其可以在宽时间范围内变化。在不同的实施方案中，掺入时间包含指 数式衰减。掺入时间的分布可以遵循指数式衰减。在掺入时间中，可以决定在成像之前应 当经过哪个时间段。在一个方面，系统可以等到足够久，以允许接近95%或更多的固定化在 纳米芯片或基质上的聚合酶DNA复合物(可以固定化的聚合酶或DNA)具有足够的时间来 掺入一个碱基。这可以解读为系统处理量和反应区域大小之间的折衷。扫描之间的时间可 以取决于平均掺入时间和在给定的某种百分比水平的分布宽度。例如，如果估计平均掺入 时间接近200ms (5/s)(也称作时间常数)，则预见到在1000ms中，接近99%的聚合酶已经 结束掺入。对于光切割，测得的时间常数可以接近5ms。因而，在一个实施例中，如果掺入 碱基同样暴露于光切割(例如紫外光切割)，接近99%的染料分子可以在约25ms中被切割 掉。对于光切割，对于特定的通量水平，测量的时间常数可以是接近5ms。因而，在一个 实施例中，如果掺入碱基在相同的通量水平暴露于光切割(例如紫外光切割)，接近99 %的 染料分子可以在约25ms中被切割掉。未切割的染料可以在第二个检测期间被检测出。结 果可以用于计算插入误差。根据有些实施方案，单个修饰的碱基检测的周期时间可以如下确定(平均掺入 时间)x5+(暴露时间+读出时间)+ (平均光切割时间)x5 = 1.025+图像时间。考虑到2次分布的重叠，一部分快速掺入的修饰的碱基会被光切割掉，不会被检出。由此，在1个光 切割周期中，可以存在光切割和掺入。2个时间常数(掺入/光切割)之间的更大比例可以 导致来自该来源的更小的误差。在同步SMS(aSMS)中，更慢的照相机可以导致更高的错过 快速掺入事件的风险。aSMS是指实时SMS，其中掺入可以发生在任何时间，这取决于酶动力 学。如果4个碱基之间的掺入速率和/或结合和掺入时间具有不同分布，那么在aSMS的测 序中可能存在系统误差。sSMS的系统误差会更少，这是因为该系统可以控制dNTP浓度以标 准化每个碱基的掺入速率，且结合和掺入时间的变化不是周期时间的主要部分。在考虑单分子测序的推测性质(其在有些方面反映了掺入时间和光切割时间的 分布)时，可以将分布估计为如图9和10所示的简单指数式衰减。平均值可以用作一个时 间常数，其中对于掺入平均掺入速率是接近5个碱基/s ；时间常数是接近0. 2s ；且5个时间 常数是接近Is (接近99%的特征将具有掺入的dNTP)。对于光切割时间常数是接近5ms ；5个时间常数是接近25ms (接近99%的染料将 被切割掉，参见图9和10)。根据不同实施方案，为了避免在同一个光切割事件中再次切割-掺入-切割，2个 时间常数可以明显不同(在该情况下，比例接近0. 2/0. 005 = 40)。一个示例性的过程可以 包含下述步骤触发延伸，等待接近Is使接近99%的反应结束，成像接近ls(优选地，对于 给定的照相机或成像仪器，尽可能多的像素用于实践)，进行光切割接近25ms，然后返回起 始位置以再次开始成像。一个示例性的处理量计算可以包含lsx50, 000 像素/s = 50，000 像素，长度中的特征数目=50,000/3 = 16,666，宽度中的特征数目=2048/3 = 682,总特征=11.4M，1000碱基/反应，1 个反应时间=1x1000 = 1000s,反应数/ 天=86400/1000 = 86. 4，处理量/天=特征数目χ反应数目/天XlOOO碱基/反应，=985GB/天。在有些实施方案中，流动池、通道或基质内的通道可以包含接近11. 3mm2的宽度， 具有IuM的螺距。图11显示了根据本发明的不同实施方案的一个示例性的棱镜集合500，其可以用 作调整光学器件，以在扫描操作期间调整一个或多个激发束和/或一个或多个发射束。在 图11中，显示的棱镜集合500构造成调整激发束，例如，激光束。棱镜集合500可以包含第 一个棱镜502，其位置邻近检测器(未显示)的物镜透镜(未显示)，且构造成随着物镜透 镜扫描基质以检测发射和物镜一起移动。棱镜集合500也包含第二个棱镜504，其构造成 固定在与激发源(未显示)相对的位置。棱镜集合500也包含长号棱镜506。第一个棱镜 502和第二个棱镜504构造成与长号棱镜506 —起工作，使得激发束从它的激发源到基质上 的任意点的距离可以是相同的，由此使激发束的强度一致，无论扫描基质的哪个部分。根据 不同实施方案，这样的系统可以防止在基质的边缘或角落位置的激发束强度损失的变化。
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如图11所示，棱镜集合500可以构造在平移台子上，使得第一个棱镜502可以与 检测器的物镜一起以第一个移动速度移动。长号棱镜506可以构造在同一个平移台子或不 同的平移台子上，但是使得长号棱镜506可以以不同于第一个移动速度的第二个移动速度 移动。在所示的实施方案中，第一个移动速度是第二个移动速度的2倍，使得随着物镜从基 质的第一个边缘移动到基质的对面边缘，第一个棱镜502和长号棱镜506以不同速率移动。 经过相同的时间长度，第一个棱镜502移动2倍距离单位，具体地，200. 000距离单位，同时 长号棱镜506移动的距离单位数目具体地是100. 000距离单位。将在图11中指出的第一 个位置的棱镜集合500的棱镜位置与在图11中指出的第二个位置的棱镜位置相对比。应 当指出，在图11中显示的含有小数点的数字不是参照数字，而是相对距离单位。与图11所示棱镜相同或类似的一组棱镜可以根据不同实施方案用于调整发射 束ο图12A和12B分别显示了代表性的激发效率曲线和荧光强度曲线，相对于4种不 同的染料标记的波长进行绘制，所述染料标记根据不同实施方案可以用于检测测序反应 中，即染料标记5-FAM、JOE、TAMRA和R0X。这些染料标记是可以用于不同实施方案(其中 要使用多个染料标记)中的那些标记的示例。在图12A中，χ-轴对应激发源发射的波长，按纳米(nm)表示。y_轴对应激发效率 的百分比。如图12A所示，5-FAM具有最大吸光度，对应它在约490nm处的峰激发效率百分 比。当染料标记的最大吸光度发生在给定的波长时，它指示当它受到该给定波长辐照时，该 染料标记在它的峰荧光强度发荧光。如在图12A中进一步显示的，JOE在约具有最 大吸光度，TAMRA在约560nm具有最大吸光度，且ROX在约588nm具有最大吸光度。图12A 也表明，当诸如5-FAM等染料标记在它的最大吸光度波长受到辐照时，其它染料标记，诸如 例如JOE、TAMRA和R0X，实际上表现出一些吸收，尽管其程度比5-FAM更低。任何激发源， 例如多个激光激发源，可以用于发射在χ-轴上指出的波长。根据不同实施方案，可以在用多色辐照源(例如，多色激光器或多色LEDS)辐照的 同时，扫描基质上(例如，在含有通道的基质上或内)的固定位置。在有些实施方案中，一 个辐照源可以产生第一个波长范围的光，其可以用作激发束来激发可检测的标记，而与第 一个辐照源一起使用的另一个辐照源可以产生第二个波长范围的光，其可以、但是不一定 不同于第一个波长范围。第二个波长范围可以设计为从受保护的多核苷酸光切割保护基， 例如，使得后续的核苷酸掺入步骤可以发生。根据不同实施方案，可以调节辐照源，以仅仅提供狭窄的波长范围的光。带通滤光 片可以用于基本上阻断来自辐照源的所有不想要的辐照。本文使用的“辐照源”可以包括 一个或多个辐照源。在图13A至13D中解释了结果的一个实例，以图的形式证实了与带通 滤光片相组合的受调节的辐照源的作用。根据不同实施方案，如图13A至13D所示，基质上的位置可以同时被2个辐照源辐 照，尽管根据不同实施方案可以同时使用任意数目的辐照源。根据使用的辐照源的数目可 以改变有关的光学器件。根据不同实施方案，可以为每个辐照源或辐照源集合使用调节滤光片。调节滤光 片可以基本上阻断从辐照源集合发射的预定波长范围的光，如前所述。辐照的每个预定范 围可以对应各自的激发波长，如例如在图13A中证实的，或一个可以对应激发波长范围，而另一个对应光切割波长范围。图13A显示了一组辐照源的2个辐照源各自的相对辐照强度 相对于按纳米表示的波长的图。图13A的图描述了 2个辐照源作为产生光束，分别在光谱 的紫色和橙色部分。应当理解，不同的实施方案不限于上述类型的辐照源，而是包括任意数 目的辐照源，它们根据用途需要发射任意频率范围的光。如图13B所示，穿过调节滤光片的 每个预定的波长范围对应在图13A的图中所示的各自辐照源发射的波长的子集。穿过调节 滤光片的波长可以能够激发对各自的辐照源起响应的标记。图1 是穿过调节滤光片的光的透射百分率相对于波长的图。如图1 所示，调节 滤光片可以基本上阻断除了在各自激发范围最大值附近的波长以外的所有辐照光。例如， 受调节的光范围可以对应从约450nm至约490nm的波长范围，和从约580nm至约605nm的 第二个波长范围，它们分别对应第一个和第二个辐照源。调节滤光片和能穿过它们的预定 范围可以随使用的辐照集合而变化。根据不同实施方案，调节滤光片可以包括单个调节滤光片或一组调节滤光片，其 能过滤来自一组辐照源的光，如上面更详细地描述的。受调节的光可以聚焦在要扫描的基 质上，如在上面以前所述的。图13C描述了相对于波长绘制的光透射百分比。根据不同实施方案，带通滤光片 可以允许与“蓝色，，、“绿色，，、“黄色，，、“红色，，和，，橙色，，标记相对应的光穿过。可以阻断与 辐照源的辐照光相对应的区域或范围。根据不同实施方案，带通滤光片可以包括单个带通 滤光片或一组带通滤光片(其能过滤来自辐照源的光)、多凹槽滤光片或Rugate滤光片。图13D描述了相对发射强度相对于滤过的光的波长的图，所述波长按nm表示。图 13D实际上提供了透射过示例性的带通滤光片的光按照波长的分解。如图13D所示，在图 13A至13D的实施例中使用的辐照源的激发源激发的标记发射在“蓝色”、“绿色”、“黄色”、 “红色”和”橙色”波长范围的光。在使这样滤过的光信号聚焦到CCD的检测器阵列上之前， 可以使用色散元件，诸如光栅。在使用上述系统实施方案进行数据收集期间，可以执行TDI。图14-21描述了不同的底物、要成像的基质位置、与它们一起使用的图像阵列和 可以用于根据本发明的不同实施方案的时间延迟积分模式中的激发束形状。图14是包含 排列成有序阵列704的多个位置702的基质700的图像。根据本发明的不同实施方案已经 扫描了基质700。图像代表基质700的正方形部分。图15是包含排列成非有序阵列714的多个位置712的基质710的图像。根据本 发明的不同实施方案已经扫描了基质710。图像代表基质710的正方形部分。图16是包含排列成有序阵列724的多个位置的基质720的剖视图。所述基质要 根据本发明的不同实施方案成像。用于激发在位置7 处的标记的激光激发束是线728的 形式，其宽度仅是沿着该线的每个位置726的宽度的约一半。图17是在图16所示的位置线7 上面对齐的线性图像阵列730的顶视图，所述位 置线已经用图16所示的激发束线7 辐照。相对于位置线7 显示线性图像阵列730的像 素732的中心。在线中的每个位置7 上面显示了多个像素732。激光线728的狭窄宽度 会防止扫描过程中模糊化，但是可能难以形成，这是因为它可能导致限于扫描轴中的衍射。图18是包含排列成有序阵列744的多个位置742的基质740的剖视图。基质740 要根据本发明的不同实施方案成像。使用激光激发束746激发在位置748的线处的标记。 激光激发束746是线形式，其宽度超过沿着位置线的每个位置748的宽度。
图19是在图18所示的位置线748上面对齐的线性图像阵列750的顶视图。位置 线748已经用图18所示的激发束746辐照。相对于位置线748显示线性图像阵列750的像 素752的中心。在位置线中的每个位置748上面显示了多个像素752。线性图像阵列750 的每个像素752的宽度小于要成像的各个位置748的宽度。像素752的狭窄宽度会防止扫 描过程中模糊化，但是可能导致发射的光子的损失，这是因为激光线746可能照射不成像 的区域。图20是包含排列成有序阵列764的多个位置762的基质760的剖视图，其中基质 760要根据本发明的不同实施方案成像。如图20所示，激光激发束766已经成形为区域光 束的形式，其辐照区域768，后者的宽度等于5条位置线的宽度。如显示的，区域768可以包 括多个位置，它们可以被激发束766同时辐照。图21是在图20所示的5行位置区域768上面对齐的二维图像阵列770的顶视图。 位置区域768(图20)已经用图20所示的区域激发束766辐照。二维图像阵列770的像素 772显示在位置区域768的上面，可以看到，在位置区域768中的每个位置762上面显示了 多个像素772。二维图像阵列770的每个像素772的宽度小于要成像的各个位置762的宽 度。二维图像阵列770可以以时间延迟积分模式运行。二维图像阵列770不具有以前描述 的线性扫描器表现出的潜在限制。其可以对整个激光线成像，激光线可以相对容易地产生。 此外，激光线和图像阵列之间的完美比对不是必需的。本文所述的本发明的实施方案的不同替代方案也在本发明的范围内。本发明不限 于所述的具体实施方案，而是包括本领域普通技术人员会知晓的等效特征和方法。在考虑 本说明书和本文公开的发明实践后，本领域技术人员会明白其它实施方案。本说明书和实 施例意在视作仅仅是示例性的。
权利要求
1.用于检测来自基质上的多个固定位置的发射的系统，该系统包含第一个辐照源，所述辐照源构造成辐照所述基质并设置成辐照多个固定位置中的第一 组固定位置；第二个辐照源，所述辐照源构造成辐照多个固定位置中的第二组固定位置，所述第二 个辐照源相对于所述第一个辐照源固定，使得第二组固定位置与所述基质上的第一组固定 位置隔开并且排除所述第一组固定位置；扫描检测器阵列，其相对于第一个辐照源和第二个辐照源放置，以便收集来自第一组 固定位置的发射，而不收集来自第二组固定位置的发射；和平移台子，其构造成使所述第一个辐照源、第二个辐照源和扫描检测器阵列一起移动。
2.权利要求1的系统，其中在每个位置设置多核苷酸，且至少一些多核苷酸用各自的 标记进行标记，所述标记当暴露于激发光时发荧光。
3.权利要求1的系统，其进一步包含基质，其中所述基质相对于第一个辐照源放置，以 便受到第一个辐照源的辐照。
4.权利要求3的系统，其中所述基质包含流动池和放置在所述流动池中的多个被标记 的多核苷酸。
5.权利要求1的系统，其中所述第一个辐照源包含至少一个激光源、全息摄影光束成 形器和长号棱镜。
6.权利要求1的系统，其中所述扫描检测器阵列包含二维电荷耦合器件。
7.权利要求1的系统，其中所述扫描检测器阵列包含点检测器。
8.权利要求1的系统，其中所述扫描检测器阵列包含时间延迟积分图像检测器。
9.用于检测荧光标记的多核苷酸的系统，其包含基质，所述基质包含第一个末端、第二个末端、在其中形成的一个或多个通道和在所述 一个或多个通道中固定化的多个被标记的多核苷酸珠子，每个被标记的多核苷酸珠子具有 直径，且用各自的标记进行标记，所述标记对辐照做出响应并发射出发射光，该发射光指示 至少一种核苷酸的存在；至少一个辐照源，其用于发射辐照并设置成辐照所述多个被标记的多核苷酸珠子，从 而激发对辐照起响应的标记并造成标记发射出发射光；调整光学器件，其包含柱面透镜和全息摄影光束成形器中的至少一个，所述调整光学 器件构造成使从所述至少一个辐照源发射的辐照朝向一部分被标记的多核苷酸珠子；扫描检测器阵列，其相对于多个被标记的多核苷酸珠子放置，所述扫描检测器阵列构 造成收集由标记生成的发射光并生成与所述发射光相对应的电荷，所述检测器阵列具有输 出端；和时间延迟积分(TDI)系统，其在检测器阵列内积累与发射光相对应的电荷，并在扫描 检测器阵列的输出端上解读积累的电荷。
10.权利要求9的系统，其进一步包含第二个调整光学器件，该第二个调整光学器件 设置在所述至少一个辐照源和扫描检测器阵列之间，所述第二个调整光学器件包含柱面透 镜、长号棱镜和全息摄影光束成形器中的至少一个。
11.权利要求9的系统，其中所述TDI系统构造成通过以下积累电荷使所述至少一个 辐照源和多个被标记的多核苷酸珠子相对于彼此移动，而不使所述至少一个辐照源和扫描检测器阵列相对于彼此移动。
12.权利要求9的系统，其中所述一个或多个通道包含2至10个通道，且所述扫描检测 器阵列构造成收集由至少2个通道先后生成的发射光。
13.用于检测多核苷酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括在流动池中造成第一个反应，所述流动池包含多个固定位置和在所述多个固定位置处 固定化的多个多核苷酸，所述第一个反应包含所述多个多核苷酸中的至少一些；用激发源产生第一束辐照；将所述第一束指向流动池；用扫描检测器阵列扫描流动池，以检测从多个固定位置发射的辐照；在流动池中造成第二个反应，所述第二个反应包含多核苷酸中的至少一些；在第二个反应之后用第二束辐照照射流动池；在第二个反应之后用扫描检测器阵列扫描流动池，以检测从多个固定位置发射的辐 照；和使用从所述扫描步骤查明的信息确定多个核苷酸中的一个或多个的核苷酸序列。
14.权利要求13的方法，其中所述第一个反应包含连接反应。
15.权利要求13的方法，其进一步包括在一个或多个扫描步骤之后从多个多核苷酸中 的一个或多个光切除保护基的步骤。
16.权利要求13的方法，其中所述流动池包含在其中的多个珠子，所述多个多核苷酸 固定化在所述多个珠子上，且多个固定位置是被所述多个珠子占据的位置。
17.权利要求13的方法，其中所述多个多核苷酸包含多个单分子多核苷酸，该多个单 分子多核苷酸各自固定化在各自的一个固定位置。
18.权利要求13的方法，其进一步包括用设置在所述激发源和流动池之间的调整光学 器件形成第一束、第二束和第三束，其中所述调整光学器件包含柱面透镜、全息摄影光束成 形器和长号棱镜中的至少一个。
19.权利要求13的方法，其中所述多个多核苷酸固定化在多个珠子上，所述流动池包 含多个沟槽，且所述珠子放置在所述多个沟槽中。
20.权利要求13的方法，其中所述多个多核苷酸包含至少一些携带保护基的多核苷 酸，且所述方法进一步包括用不同于激发源的光切割束源光切割保护基。
全文摘要
提供了扫描检测系统，其中检测来自流动池中的位置的发射。在有些实施方案中，所述系统可以包含激发源、光切割源和调整光学器件，它们构造成使由激发源产生的激发束辐照第一组固定位置，并使由光切割源产生的光切割束辐照第二组固定位置，后者与第一组固定位置分离且隔开。也提供了使用这样的系统检测测序反应的方法。
文档编号G01N33/53GK102084003SQ200980120289
公开日2011年6月1日 申请日期2009年4月6日 优先权日2008年4月4日
发明者E·S·诺尔德曼, H·孙, M·F·奥尔德罕, S·J·伯格 申请人:生命科技公司