用于在薄膜流体样本中执行血清凝集和其他免疫测定的方法

专利名称：用于在薄膜流体样本中执行血清凝集和其他免疫测定的方法
技术领域：
本公开涉及用于在液体样本中执行血清凝集检验的方法和系统。该系统提供简单 的方法，用于在样本分析腔室内产生原位样本/试剂混合物而不使用任何精密流体处理部 件。可以在反应器的任意小的面积中确定反应物的相对和绝对浓度。
背景技术：
在大多数检验中，需要提供要被分析的样本的精确稀释，以使得可以使分析物的 浓度处于有效的检验范围，并且由于该稀释影响分析物的浓度，因此测试的精确性和准确 性很大程度上取决于稀释的精确性和准确性。这种稀释的一个原因是免疫测定受已知为前 带效应的现象的影响。本公开中使用的术语“前带”是指在基于沉淀或凝集的免疫测定反应 中通常要禁止或防止的抗体过量的情况，“后带”是指凝集或沉淀反应被禁止的免疫测定中 抗原过量的情况，以及“钩状效应”是指导致伪低(falsely low)结果的抗原过量的情况。 前带效应发生的情况可以导致对患者具有灾难性后果的假阴性(false negative)和伪低 的结果。每个检验组合都具有根据经验限定的工作范围，并且检验必须使用适当稀释的样 本和反应物来执行。传统上，已经通过精密流体处理部件的使用或者以较高的抗体稀释手 动重复检验实现了这种类型的稀释，以检查该阴性是否为真的阴性。尽管这些可以非常准 确，但这需要仔细的校准并且极大地增加了自动化仪器的复杂性。另外，存在于样本中的分 析物的范围可能会超过检验的动态范围，并且为了获得准确的结果可能会需要样本的进一 步稀释。另外，现有技术需要许多个腔室来容纳各种浓度的反应物。诸如针对传染病病原抗体，血清检验是重要的，这是因为血清检验会表明是由于 免疫作用还是由于先前或当前暴露于感染原而存在免疫性，这取决于免疫球蛋白存在的类 型。类似地，可以使用血清检验来检测自身免疫(auto-immunity)等。存在许多所进行的 检验类型，包括凝集、补体结合(complement-fixation)、沉淀等。这些测试的一个几乎普遍 的特征在于需要对样本进行多重稀释，以检测抗体不再对引起阳性测试有效的点。这被称 为“滴定度”，滴定度是与测试抗原产生可检测的凝集或者被测量的反应的患者血清或血浆 的最高稀释度。实际中，这需要在单独的腔室中执行许多单独的测试来达到该结果。使用 这种检验的另一个问题在于，有时难以确定结束点(end-point)，从而为滴定度的确定增加 了显著的误差。自动化可以增加测试效率和准确性，但是通过仪器来执行稀释是非常困难 且耗时的，包括需要首先限定期望的稀释度，这可以根据测试的不同而不同，并且多重稀释4步骤是非常复杂的。提供一种用于在不需要多重稀释并且消除了由于前带效应而引起假阴性的风险 的自动化系统中对抗体滴定度进行测量的方法和设备是所希望的。

发明内容
根据本发明的一个方面，使用可感测标记物以允许在被分析的反应区域中对添加 到试管内(in vitro)腔室的反应物的浓度进行测量。本公开中的可感测标记物是指不会 干扰被分析反应并且以接近该可感测标记物被加入其中的反应物的速率扩散的染料或可 检测的物质。可感测标记物可以是能够通过诸如吸收或荧光发射之类的光学方法进行测量 的一种或多种染料。可感测标记物均勻地存在于溶液或胶状悬浮体之中，该溶液或胶状悬 浮体具有随后要被添加到所使用的薄分析腔室的并且允许在所使用的薄分析腔室中混合 的两种或更多种液体中的至少一种液体。由于腔室的高度小于100微米(100 μ m)，优选地小于20微米QO μ m)，并且腔室 的横向尺寸优选地为几厘米，垂直尺寸和水平尺寸的差异大于1000倍将导致在垂直尺寸 方向上非常迅速地达到均衡而在横向尺寸方向上的均衡则需要花费几百到几千倍的更长 的时间。如果对成像或扫描的反应腔室的整个图像和成像或扫描的离散小区域进行分析， 其中离散分析区域的横向方面在腔室高度的1至3倍的范围内，则被分析的体积将近似均 衡。第一区域旁边的以毫米或更大的距离取得的区域将具有不同的均衡条件。在随后的与 附加反应物混合或扩散之前和之后，对来自混合的可感测标记物的信号进行测量，以允许 计算最终测量的可感测标记物的浓度，从而反映组分的相对稀释度。在腔室中存在多于两 种液体的情况下，可以采用能够与其他可感测标记物区分开的多于一种的可感测标记物， 将每种可感测标记物添加到被添加的多种组分中的一种组分，以能够计算每种组分的相对 比例。如果已经知道组分组成的初始浓度，则可以利用相对浓度来计算每单位体积被添加 组分整体的绝对浓度。从而，可以将任意小的被分析区域中的被添加的反应物的相对浓度 视为其被添加的试剂浓度可计算的虚拟离散反应器或腔室，并且结合的相对游离的或者凝 集或在被执行的免疫测定中采用的其他信号的结果可以被测量并绘制为按照计算出的样 本稀释度获得的信号或者按照被添加抗体或被添加抗原的浓度的标准体(standard)。因此，本发明的一个目的在于提供一种方法和设备，其中利用混合和扩散在腔室 内的薄膜样本中的两种或更多种可混合液体之间建立浓度梯度，以使得在检验时间期间该 腔室的薄尺寸方向上的均衡非常迅速而该腔室的长轴方向上的浓度差异没有达到均衡，并 且通过可感测标记物的相对浓度对最终相对相互稀释度(inter-dilution)进行测量，该 可感测标记物不参与任何期望的化学反应并且具有这样的属性其允许在反应腔室中的任 何小区域处对其进行准确测量。


图1为在执行本发明的方法中使用的腔室的示意平面图；图2为图1腔室的截面图；图3为图1腔室的放大截面图，其示出了通过腔室的顶面的偏斜在腔室中抽吸溶 液，以便于在遍及该腔室的横向方面建立不同的浓度；
图4为抽吸步骤已经完成后的图1腔室的平面图；图5示出了来自沿着图4的线a-a获得的图1腔室的荧光发射踪迹的读数，其中 可感测标记物为荧光染料；图6为图1腔室的平面图，其中该腔室具有内部挡板，当样本被首先引入到腔室中 时该挡板会引起样本混合，从而不需要对样本进行物理操作；图7为类似于图1的示意平面图，但在腔室中具有相对少的样本；图8为类似于图7的平面图，但其示出了混合之后的样本；图9为图1腔室的示意平面图，但其示出了向该腔室添加三种液体的结果；图10为根据本发明形成的测试腔室的示意截面图；图11为类似于图10的测试腔室的示图，其示出了向该腔室添加测试样本之后的 包含目标表位的粒子的凝集以及控制粒子的不凝集；图12为类似于图10的截面图，其示出了向该腔室添加测试样本之前在该测试腔 室中存在的抗体；图13为类似于图11的示图，其示出了向该腔室添加测试样本之后的包含目标表 位的粒子的凝集以及控制粒子的不凝集；图14A为测试腔室的混合物平面图，其示出了样本中存在凝集的包含目标表位的 粒子以及不存在控制粒子的凝集；以及图14B为从沿着线a-a的扫描获取的样本中的凝集粒子的示图，并且示出了样本 中没有粒子凝集的截止位置T。
具体实施例方式图1为腔室1的示意顶视图，在此示例中为正方形，其截面图在图2中示出。该腔 室包括相对较薄的顶板和底板，其中至少一个必须为透明的。在该腔室中引入两种或更多 种液体，其中一种液体为要被分析的样本3而其他液体为分析所需的试剂4。这些液体中的 至少一种具有溶解的标记物，其可以为荧光的染料(诸如荧光)或者为能吸收的染料(诸 如酚红)等。该标记物必须是这样的其不会对期望的分析信号产生化学干扰，并且该分析 的任何信号或反应产物都不会以不能补偿的方式影响该标记物信号。在示出的示例中，液体4为分析试剂，其包括荧光标记物，并且液体3为要被分析 的样本。如果在该腔室中引入的液体等量，则在所指示方向上，它们将在区域5附近相遇。 图3为该腔室的放大截面图，其显示了液体如何部分地混合。如果该腔室的一个表面被上 下地“抽吸”，则沿着线6附近将发生液体的混合，从而导致图4所示的稀释梯度，图4为该 腔室的顶视图。在适当的混合期之后，允许该腔室停滞一段时间以足够允许垂直扩散从而在给定 垂直段中完成液体的混合。此时，在区域7和8中的液体还未被完全稀释并且呈现混合前 液体的自然状态。然后，如果沿着线a-a获取来自标记物的荧光读数，则可以看到图5中的 结果，图5为沿着线a-a的该腔室的截面图，其具有示出了在每个相对位置处该腔室的荧光 的叠加曲线图以及示出了来自分析物的光吸收率的第二曲线图。由于信号级9表示来自未稀释的有标记试剂的信号，而信号级10表示样本的背景 值，则对应于信号级11的腔室区域包含被精确稀释了一半的样本。从而，可以将从期望反应的信号推断出的分析物浓度乘以二来获得准确的浓度。在此示例中，如果已经知道由于 在该区域的混合物中存在过多的分析物而使得分析物信号太高，则只需要找到一个具有与 区域12的标记物信号相当的标记物信号的区域，该区域被更多地稀释，并且然后乘以相应 的分析物吸收率结果。类似地，在存在前带效应的情况下，仪器报告在考虑到全部稀释之后获得的最高 分析物结果并且还报告该计算已被执行。还可以通过“抽吸”腔室之外的其他方式来混合样本。例如，图6是具有挡板13的 腔室的示意顶视图，如图所示，当引入液体时挡板13用来引起样本混合。不需要使样本或试剂的某一部分保持未被稀释。例如，在图7中(其为具有相对 较少样本14的腔室的另一示意顶视图)，在此情况中，样本为包含标记物的液体，而较大的 试剂区域15不包含标记物。在混合之前，在区域16和17上获取基准读数，并且在混合之 后(图8)，不存在剩余的未被稀释的样本，但是可以将原始的基准值用于如上所述的相同 的计算。标记物与样本均勻地混合的该特定示例特别适合于需要相对较高稀释率的情况。全部所示示例都示出了稀释梯度的形成，但这并不总是必需的。在单一的近似稀 释就足够的情况下，可以均勻混合样本和有标记试剂(或者有标记样本)并且从任何适当 的区域获得读数，再利用标记物浓度来计算最终的实际稀释度。在上述各示例中，假设腔室的厚度是均勻的，但这不是绝对必需的。在测量点处， 腔室具有已知的或者可以从其他方式确定的厚度是可接受的；例如，在限定几何形状的腔 室的情况下的绝对读数位置，或者可以通过诸如干涉测量法之类的不依赖标记物的方式或 通过在美国专利No. 6，127，184、No. 6，723，290和No. 6，929，953中所描述的系统测量的厚 度，在此以参考的方式将这些专利的全文并入。腔室厚度必须足够小使得不会产生对流单元，并且还足够小使得在合理的时间段 内通过扩散能够产生完全垂直混合。在优选实施例中，腔室厚度小于1毫米，优选地小于 200微米。腔室的面积在很大程度上不相关，但对于大多数应用来说大约4平方厘米的面积 是足够的。在为了进行反应而必须在混合后对腔室进行延长时间的培养的示例中，梯度可能 由于扩散超过了所期望的界限而有降低的趋势。在这些情况下，可以使用增粘剂(诸如葡 聚糖(dextran)、聚氧乙烯(polyoxyethylene)等)或者通过可以形成至少局部凝胶体的试 剂(诸如凝胶或琼脂)来延迟进一步的扩散。本发明的另外特别重要的应用是可以被用于提供同步的标准曲线和分析稀释的 方式。标准曲线经常用于对给定分析进行校准，其中分析不同浓度的已知标准体来产生分 析信号相对于样本浓度的响应曲线。当对包含未知浓度的分析物的样本进行测量时，分析 信号与标准曲线进行比较以给出样本中分析物的浓度。这使得在多个单独反应器中的多重 分析成为必需，并且如果反应在时间上是不可重复的，则这会需要重复此过程的每个分析 运行。类似的情况还存在于控制材料的使用，控制材料实际上是已知浓度的标准体，连同样 本一起对其进行批量分析，以保证分析适当地进行。这两种情况都可以通过所描述的本发 明的具体使用而避免。图9示出了引入三种液体的样本单元18，这三种液体包括包含有未知浓度的分析 物的样本、包含有标记物的试剂、以及适当浓度的标准体。可以使用挡板19来防止这些成分的完全混合。当腔室如前述那样平衡时，利用前述方法，使用沿着线21的读数来产生标 准曲线，并且使用沿着线20的读数来得到用于分析的适当的样本稀释度。从而，可以在同 一反应腔室中执行同步的标准曲线和样本分析，这保证了样本和标准体的反应条件是相同 的。通过改变几何形状，可以在单一腔室中滴多于一种的样本，只要发生适当的混合。所测 量的是扫描区域的每像素光亮。如所述那样在测试腔室中进行凝集检验，具有下列添加的特征以影响血清检验。 优选地，在化学成分上类似于表达目标表位的粒子但缺少目标表位的控制粒子将与目标粒 子一起存在于样本中。可以通过其颜色或其他特征来将控制粒子与包含目标表位的粒子区 分开，以使得控制粒子的配体诱导凝集不会正常地产生。如果控制粒子的显著凝集发生，则 表示非特异凝集，并且可以使用该条件来确定测试的有效性。例如，如果50%的包含目标表 位的粒子凝集，并且小于10%的控制粒子凝集，则表示检测为阳性。如果控制粒子与包含目 标表位的粒子等量显著凝集，则测试无效。当包含目标表位的粒子的显著凝集与控制粒子 的显著凝集都不存在时，则意味着被测试样本中不存在特定于目标表位的目标抗原。这种 结果还被看作是测试结果为阴性的有效测试。图10为测试腔室的示意截面图，该腔室具有上述一般结构的至少一个透明表面 101。该腔室的一个表面附着有粒子102，粒子102的表面表达或包含有目标抗体所针对的 抗原103。粒子可以是人造的，诸如胶乳、苯乙烯胶乳、苯乙烯、聚碳酸酯等，其具有通过本领 域已知的多种措施中的任何措施结合到表面的抗原；或者粒子可以是天然的，诸如花粉、细 菌、酵母菌、霉菌或真菌。粒子必须为这样的大小其能够确定粒子凝集的发生，并且最优选 地在0. 2微米至20微米的大小范围内。粒子附着至可溶涂层104，优选地粒子被可溶涂层 104覆盖，可溶涂层104可以包括诸如海藻糖之类的糖，其保持抗原103的活性。测试腔室 中还存在控制粒子115，其具有目标抗体不针对的表面抗原114。控制粒子115与第一粒子 102具有相同的尺寸范围，并且优选地由与第一粒子102相同的材料形成。当包含要被检测的抗体106的液体样本105被添加到腔室时，可溶涂层104溶解， 从而释放第一粒子102和控制粒子115，并使附着的抗原103暴露于抗体106(如果样本中 存在)。如图11所示，其示出了在已经添加样本之后的某时刻的图10的腔室，如果样本中 存在足够量的抗体106，则样本中的抗体106将导致第一粒子102凝集以至少形成粒子对 107 ；或者如果样本中存在较高浓度的抗体106，则样本中的抗体106将导致第一粒子102 形成较大的凝块(clump) 108。显而易见地，通过自动化仪器检查该腔室可以通过本领域已 知的任意数量的图像处理算法对粒子凝块的存在进行检测。在图11所示的示例中，控制粒 子115没有凝集或结块在一起。在给定示例中，假定抗体106为多价的(诸如Ig-M)，其为在针对感染的反应的早 期阶段中形成的抗体。然而，如果免疫反应持续较长时间，则将会存在Ig-G抗体，该抗体不 是多价的并且对于产生凝块不起作用。为了在该情况中实现更好的凝块，可溶涂层104应 当包含多价的anti-Fc抗体，主动连接要被检测的非多价抗体110的Fc段。从而，当层104 溶解时，释放anti-Fc抗体109并且结合抗体110，实质上，建立能够使粒子102凝块的多价 抗体110的形式，如图12和图13所示。图14A和图14B为结合了以上所引公开和直接公开的特征的腔室的示意顶视图和 描述凝集粒子相对于沿着线a-a的位置的存在的示图。混合有如前所述标记物的样本112和稀释液113以允许形成梯度稀释的方式被引入到腔室。在适当的培养期之后(该培养期 取决于被检测抗原和抗体的种类)，沿着线a-a扫描该腔室并且定位区域T，如图14B所示， 区域T表示不再发生凝集或凝块的位置。在此位置处的样本的稀释度的倒数(如通过在此 区域中的标记物的相对浓度所确定的那样)等于抗体的滴定度。例如，如果相对于原始样 本区域112的标记物浓度为0. 2，则滴定度为5。图14A中还示出了未凝集的控制粒子115。应当注意到，可以检测除凝集或凝块之外的诸如沉淀之类的其他免疫反应，其中 抗原和抗体形成可见的络合物而非凝块粒子。还应当注意到，在本发明中描述的措施还可 以在其他类型的免疫测定中应用，包括那些包含有从游离的虚拟减去结合的分析方法、在 2008年4月2日提交的同时待审的美国临时专利申请No. 61/041，784和因此最近提交的记 录摘要No. 7564-0035-1的主题。在后面的情况中，本发明不需要消除前带效应，但是本发 明可以用于对检验的工作范围进行优化并且可以在不脱离本公开中包含的规范的情况下 执行。尽管已经关于本发明的特定详细实施例示出并描述了本发明，但是本领域技术人 员应当理解，在不脱离本发明的思想和范围的情况下可以对本发明的形式和细节进行各种 改变。
权利要求
1.一种用于针对液体样本中的一种或多种目标分析物抗体执行血清凝集检验的方法， 所述方法包括以下步骤a)提供具有相对的平板表面的薄平板腔室，其中至少一个平板表面为透明的；b)将有效量的可检测的第一粒子放置在所述平板腔室中，所述第一粒子在其表面上包 含有目标分析物抗体所针对的抗原；c)将大小和形状类似于所述第一粒子的第二控制粒子放置在所述腔室中，所述控制 粒子的颜色或荧光或其他可辨别特征与所述第一粒子不同，并且所述控制粒子没有所述抗 原；d)允许或引起所述可检测粒子与所述样本彼此混合，从而当存在所述目标分析物抗体 时，所述目标分析物抗体将引起所述第一粒子的凝集；e)对所述混合物进行电子成像或扫描，以通过分析由于被检测粒子的凝集而产生的像 素强度图案来检测各粒子聚集体；以及f)通过对任意凝集的第一粒子的信号与任意凝集的控制粒子的信号进行比较来确定 是否存在显著的粒子凝集。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过测量包含凝集的第一粒子的像素面积和包含 任意凝集的控制粒子的像素面积来执行对粒子凝集存在的检测。
3.根据权利要求1所述的方法，其中通过确定任意给定类型的粒子凝集或凝块的百分 比来执行对粒子凝集的检测。
4.根据权利要求1所述的方法，其中存在多于一种类型的单独可辨别可检测的第一粒 子，每种类型包含不同的抗原，以使得可以在同一样本腔室中同时执行多种检验。
5.根据权利要求1所述的方法，其中对所述第一粒子和所述控制粒子区别地标记，以 使其可以相互区分开。
6.一种用于针对液体样本中的一种或多种目标分析物抗体执行血清凝集检验的方法， 所述方法包括以下步骤a)提供具有相对的平板表面的薄平板腔室，其中至少一个平板表面为透明的；b)将有效量的可检测的第一粒子放置在所述平板腔室中，所述第一粒子在其表面上包 含有针对样本中可能存在的目标抗原的配体；c)将大小和形状类似于所述第一粒子的第二控制粒子放置在所述腔室中，所述控制 粒子的颜色或荧光或其他可辨别特征与所述第一粒子不同，并且所述控制粒子没有所述配 体；d)允许或引起所述可检测粒子与所述样本彼此混合，从而当存在所述目标抗原时，所 述目标抗原将引起所述第一粒子的凝集；e)对所述混合物进行电子成像或扫描，以通过分析由于被检测粒子的凝集而产生的像 素强度图案来检测各粒子聚集体；以及f)通过对任意凝集的第一粒子的信号与任意凝集的控制粒子的信号进行比较来确定 是否存在显著的粒子凝集。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过测量包含凝集的第一粒子的像素面积和包含 任意凝集的控制粒子的像素面积来执行对粒子凝集存在的检测。
8.根据权利要求6所述的方法，其中通过确定任意给定类型的粒子凝集或凝块的百分比来执行对粒子凝集的检测。
9.根据权利要求6所述的方法，其中存在多于一种类型的单独可辨别可检测的第一粒 子，每种类型包含不同的抗原，以使得可以在同一样本腔室中同时执行多种检验。
10.根据权利要求6所述的方法，其中对所述第一粒子和所述控制粒子区别地标记，以 使其可以相互区分开。
11.一种用于针对液体样本中的一种或多种目标分析物抗体执行血清凝集检验的方 法，所述方法包括以下步骤a)提供具有相对的平板表面的薄平板腔室，其中至少一个平板表面为透明的；b)将有效量的可检测的第一粒子放置在所述平板腔室中，所述粒子在其表面上包含有 目标分析物抗体或抗原所针对的配体；c)允许或引起所述可检测粒子与所述样本彼此混合，从而当存在所述目标分析物抗体 或抗原时，所述目标分析物抗体或抗原将引起所述第一粒子的凝集；以及d)对所述混合物进行电子成像或扫描，以通过分析由于被检测粒子的凝集而产生的像 素强度图案来检测各粒子聚集体。
全文摘要
一种用于在液体样本中执行血清凝集检验的方法和系统。该系统提供了一种简单的方法，用于在样本分析腔室内创建原位样本/试剂混合物而不使用任何精密流体处理部件。
文档编号G01N33/58GK102047118SQ200980120262
公开日2011年5月4日 申请日期2009年4月2日 优先权日2008年4月2日
发明者斯蒂芬·C·沃德洛, 罗伯特·A·莱文 申请人:艾博特健康公司