检测目标物多个表位的生物感应器的制作方法

专利名称：检测目标物多个表位的生物感应器的制作方法
检测目标物多个表位的生物感应器管辖权此项发明获国家卫生研究院(NationalInstitutes of Health)依 R41GM079891 提供政府资助。政府对此项发明持有特定权利。
背景技术：
致病菌可引发五十种以上的感染性疾病。检测临床、食物、水和环境样本中所含致原菌的方法，对感染性疾病的诊断、治疗和预防至关重要。现有的病原体检测法包括以细胞培养和菌落计数为基础的传统检测法、抗原检测法、聚合酵素链锁反应(PCR)法，及各种生物感应器。每种方法各有优缺点。传统检测法虽然健全而灵敏，但速度非常缓慢；抗原检测法和PCR法尽管速度较快，但需具备技术，而且PCR法很容易出现伪阳性；生物感应器很有希望大幅缩短检测时间，但还需更多发展才能实际派上用场。目前显然需要能克服现有技术限制的新检测法。发明摘述此项发明其中一部分，包含一种检测至少含一个重复性表位(i^peating epitope)之目标物的方法。此种方法需以分子生物感应器接触含目标物的样本。此生物感应器包含R1-R2-R3-R4 ；与R5-R6-R7-R8 ；其中Rl和R5为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；R2为连接Rl及R3的弹性连结元(flexible linker)R3 和 R7 是一对互补核甘酸序列(complementary nucleotide sequences)，在温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至IOOmM的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole 左右白勺连结自由能(free energy for association)；R4和R8共同组成一种检测工具，当R3和R7连结时就会产生可检测到的信号；R6为连接R5及R7的弹性连结元。下文将更详细说明此项发明的其它层面和迭代法。彩色图片说明申请档案内含至少一张彩色图片。只需要求并支付必要费用，本营业处就会提供含彩色图片的专利权申请书副本。图示简述图I(A)所示为分子生物感应器的设计。ANTIl和ANTI2是以信号寡核甘酸 (signaling oligonucleotides)标注的抗体；T是目标物蛋白质。

图1 (B)所示为分子生物感应器的原理验证。黑线以荧光素(fluorescein)标注的20nM ANTIl发射光谱。红线 以Cy5标注的20nM ANTIl与25nM ANT12混合物发射光谱。蓝线当与20nM的人类I型心肌肌钙蛋白(cardiac troponin I)同时出现时，20nM ANTIl与25nM ANTI2混合物发射光谱。激发点为490nM。插页各样本的荧光共振能量转移(fluorescent resonance energytransfer, FRET)信号(发射点为670nm，激发点为490nm)。图1 (C)为低蛋白质浓度时的心肌肌钙蛋白感应器反 应。图2所示为检测病原体的抗体感应器设计。图3(A)所示为抗体优先结合(preferential binding)机制，以互补信号寡核甘酸(complementary signaling oligonucleotide)标注相邻抗体。图 3(B)为原理验证， 证明图2所示的感应器设计确实可行。呈现含等摩尔标注抗体(与指定数量的目标细胞
或阴性对照细胞[K12] —起培养)混合物的96孔微量分析盘中，伪色荧光影像的盘孔。上图是发射点为520nm(激发点为488歷)的影像，下图是发射点为670nm(激发点为488nm)的影像。图4所示为20nM/25nM抗体(在指定数量的细胞[20ml分析液，384孔微量分析盘]上，以荧光素和Cy5修饰互补信号寡核甘酸标注)混合物所产生的FRET信号。图中呈现3次独立测量结果的平均值和标准差。黑色符号为0157:H7型大肠杆菌(E.coli)；蓝色符号为K12型大肠杆菌。图5所示为0157:H7型大肠杆菌细胞(与以荧光素修饰信号寡核甘酸标注的抗体 [只有予体]，或以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注[予体/受体]的抗体混合物一起培养)的荧光共焦显微影像。所拍摄的荧光素影像激发点为488nm，发射点为520nm。FRET 影像的激发点为488nm，发射点为670nm。图6所示为生物感应器反应的动力学。在20nM的抗体(以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注)混合物中，加入指定数量的0157 :H7型大肠杆菌细胞，并监测FRET信号 (发射点为670nm，激发点为488nm)的时间变化。图7所示为抗体浓度较低时，目标细胞的检测灵敏度增加。黑色符号10/12nMnM 抗体混合物；蓝色符号5/6. 2nM nM抗体混合物。图8所示为用来提高少量细菌检测率的样本浓缩步骤。红色长条图浓度为 3000cells/ml的样本；蓝色长条图浓度为300，000cells/ml的样本。图9所示为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)的生物感应器。利用在指定数量细胞(201分析液，384孔微量分析盘)中的20nM/25nM抗体(以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注)混合物，产生FRET信号。图中呈现3次独立测量结果的平均值和标准差。黑色符号鼠伤寒沙门氏菌；青绿色符号K12型大肠杆菌；蓝色符号0157:Η7型大肠杆菌。图10所示为鼠伤寒沙门氏菌生物感应器反应的动力学。在20ηΜ/25ηΜ的抗体(以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注)混合物中，加入指定数量的沙门氏菌细胞，并监测 FRET信号(发射点为670nm，激发点为488nm)的时间变化。图11所示为均质性限制酶(homogenous restriction-enzyme)信号放大法，可与分子生物感应器的均质性性质兼容。Sl与S2所示为可辨识目标物的抗体(以短寡核甘酸标注)，这些抗体上的短寡核甘酸会与S3的限制酶切割位点区互补。图12所示为细菌检测感应器的固相表面(solid-surface)转化。将含多个序列复本(与用来标注抗体的信号寡核甘酸具互补作用)的寡核甘酸，固定在固相表面。图13为原理验证，证明图12所示设计确实有效。将不同数量的0157:H7型大肠杆菌与20nM的抗体(在内含已固定之互补寡核甘酸的微量分析盘盘孔中，与荧光素修饰信号寡核甘酸结合)一起培养，在以缓冲液冲洗盘孔后，盘式仪(Plate reader)就会读取残留在盘孔中的荧光。K12型大肠杆菌并未检测到信号(红色符号)。图14所示为TIRF固相表面细菌生物感应器的原理验证。将含多个序列复本(与用来标注抗体的信号寡核甘酸具互补作用)的寡核甘酸，固定在石英载玻片表面。监测 TIRF所诱发的荧光(源自载玻片表面)。将只含标注抗体的样本注入后，只能观察到少量信号；但若有目标细菌存在，就能观察到大量信号。图15为2条铁蛋白分析(ferritin assay)的标准曲线。详述此项发明此项发明是以分子生物感应器的利用方法为导向。尤其特别的是，其中包含可检测含重复性表位之目标物的方法。此种方法通常涉及二个表位结合体(印itope-binding agent)的目标分子诱发性连结(target-molecule induced co-association),各个结合体均能辨识目标物上的同一个重复性表位。每个表位结合体均含互补信号寡核甘酸(以检测工具标注，并透过弹性连结元与表位结合体连接)。二个表位结合体和目标物的连结，会使二个信号寡核甘酸相互靠近，因而产生可检测到的信号。分子生物感应器的优点在于可提供快速的同构型工具，检测各种含重复性表位的目标物，包括但不限于蛋白质、醣类、脂质和微生物。II.分子生物感应器此项发明有一部分包含分子生物感应器。有项实施例使用单价生物感应器，只包含一个能与目标物上的表位结合的表位结合体，不过此项发明通常包含多价的分子生物感应器。熟习此技术的人士可能感到激赏，根据目标物，所采用的分子生物感应器可包含大约二至五个表位结合体。尽管此分子生物感应器通常含二个或三个表位结合体，但以包含二个表位结合体的情况最常见。实施例的另一种选择为双价分子生物感应器，其中包含与目标物上的重复性表位结合的第一表位结合体，和与目标物上同一个重复性表位结合的第二表位结合体。实施例的第三种选择为三价分子生物感应器，其中包含与目标物上的重复性表位结合的第一表位结合体、与目标物上同一个重复性表位结合的第二表位结合体，及与目标物上同一个重复性表位结合的第三表位结合体。(a)双价分子感应器此项发明的实施例可能采用双价分子生物感应器。在典型的实施例中，所使用的双价构造物包含与目标物上的重复性表位结合的第一表位结合体、第一连结元、第一信号寡核甘酸、第一检测工具、与目标物上同一个重复性表位结合的第二表位结合体、第二连结元、第二信号寡核甘酸和第二检测工具。在最佳实施例中，此分子生物感应器包含二个核酸构造物，共同形成分子式(I)R1-R2-R3-R4R5-R6-R7-R8 ； (I)其中R1为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；R2为连接R1及R3的弹性连结元；R3和R7是一对互补核甘酸序列，在温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至IOOmM 的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole左右的连结自由能；
R4和R8共同组成一种检测工具，当R3和R7连结时就会产生可检测到的信号；R5为为表位结合体，可与目标物上和R1结合的同一个重复性表位结合；R6为连接R5及R7的弹性连结元。由于受到熟习此技术之人士的激赏，可以选择含R1和R5表位结合体的分子式(I) 分子生物感应器，但仍应视具体的目标物而定。经由实例得知，当目标物为蛋白质时，R1和 R5可为适体(aptamer)或抗体。另有实例显示，当R1和R5为双链核酸时，目标物通常是与脱氧核糖核酸(DNA)结合的大分子或DNA结合蛋白。一般而言，R1和R5的适当选择，包括能各自辨识同一个目标物上某个重复性表位的二种结合体。不过在某些实施例中，R1和R5 或许也能辨识不同目标物上的重复性表位。表位结合体的选择实例无数，视目标物而定，可从组成适体、抗体、抗体片段、双链DNA序列、配体(Iigand)、配体片段、受器、受器片段、多肽、胜肽、辅酶、共同调控因子、异位分子(allosteric molecule)，和离子的基团，选择结合体。有示范实施例所采用的R1和R5均为抗体，选自组成多株抗体、腹水(ascites)、Fab片段、Fab’片段、单株抗体、嵌合抗体，和人源性抗体的基团。有项最佳实施例所采用的R1和 R5均为单株抗体，另有实施例所采用的R1和R5均为适体；更另有实施例所采用的R1和R5都是双链DNA。此外也有采用R1是双链核酸，R5是适体的实施例；采用R1是抗体，R5是适体的实施例；和采用R1是抗体，R5是双链DNA的实施例。在所采用的R1和R5包含同一个表位结合体的实施例中，可将此双价生物感应器视为单价生物感应器。有项分子式(I)分子生物感应器实施例，示范连结元R2和R6的作用是拉近R3和 R7的距离，如此当R1和R5均与目标物结合时，R3和R7的连结方式就能促使检测工具R4和R8 产生可检测到的信号，其中R2和R6可能是长度约10至100个核甘酸的核甘酸序列。有项实施例的R2和R6长约10至25个核甘酸；另有实施例的R2和R6长约25至50个核甘酸；此外也有R2和R6长约50至75个核甘酸的实施例，与R2和R6长约75至100个核甘酸的实施例。在各项实施例中，组成连结元的核甘酸可能是DNA或RNA的任一核甘酸碱基(DNA为腺嘌呤[A]、胞嘧啶[C]、胸腺嘧啶[T]、鸟粪嘌呤[G] ；RNA为A、C、尿嘧啶[U]、G)。有项实施例的R2和R6是由DNA碱基组成；有项实施例的R2和R6是由RNA碱基组成；另一项实施例的R2 和R6则是由修饰过的核酸碱基所组成，例如修饰DNA碱基或修饰RNA碱基。经适当修饰的 DNA 或 RNA 实例包括2，-氟核甘酸(2，-fluoro nucleotides)、2，-氨核甘酸(2，-amino nucleotides)、5，_ 氨基烯丙基 _2，_ 氟核甘酸(5‘-aminoalIy 1-2‘-fluoro nucleotides), 和硫代磷酸核甘酸(phosphorothioate nucleotides)。此外，R2和R6也可以是双功能化学连结元聚合物。有项实施例使用的是异质双功能(heterobifunctional)化学连结元， 适用的异质双功能化学连结元包括sulfo SMCC(Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidom ethyl)cyclohexane-l-carboxylate)禾口 lc_SPDP(N_Succinimidyl_6_(3， -(2-PyridylDi thio)-Propionamido)-hexanoate)。有工页实施例贝>Η吏用同质双功能(homobifunctional) 化学连结元，适用的同质双功能连结元包括二琥珀亚胺基辛二酸酯(disuccinimidyl suberate)、二琥珀亚胺基戊二酸酯(disuccinimidyl glutarate)与二琥珀亚胺基酒石酸酯(disuccinimidyl tartrate)。有些实例述及其它适用的连结元，例如源自Spacer 18(由聚乙二醇[polyethylene glycol]组成)的氨基磷酸酯(phosphoramidate)。有项实施例使用的R2和R6长约0至500埃；另一项实施例使用的R2和R6则长约20至400埃； 还有一项实施例则使用长约50至250埃的R2和R6。
在一项使用分子式(I)分子生物感应器的实施例中，属于互补核甘酸序列的R3和 R7,具有除非R1和R5与目标物上不同的重复性表位结合，否则就不会产生连结的长度。当R1 和R5与目标物上不同的重复性表位结合时，就会拉近R3和R7的距离，导致局部浓度升高， 促使R3和R7产生连结。R3和R7的长度可为约2至20个核甘酸。有项示范实施例的R3和 R7的长度可为约4至15个核甘酸。有项示范实施例的R3和R7的长度可为约5至7个核甘酸。有项实施例在选定的缓冲液条件下(定义如下文所述)，测得R3和R7具有约5. 5kcal/ mole至8. Okcal/mole的连结自由能；另一项实施例则于选定的缓冲液条件下(定义如下文所述)，测得R3和R7具有约6. Okcal/mole至8. Okcal/mole的连结自由能；此外还有项实施例于选定的缓冲液条件下，测得的R3和R7连结自由能，约为7. Okcal/mole至8. Okcal/ mole。有项最佳实施例于选定的缓冲液条件下(如下文所述)，测得R3和R7具有7. 5kcal/ mole的连结自由能。更可取的是，在各项实施例里，R3和R7与R1和R5并不具有互补关系。在一项分子式(I)分子生物感应器的典型实施例中，R4和R8共同组成数项适用的检测工具，当R3和R7连结时，就会产生可检测到的信号。分子生物反应器适用的示范检测工具包括FRET、焚光交叉相关光谱分析(fluorescence cross-correlation spectroscopy, FCCS)、焚光淬熄(fluorescence quenching)、焚光偏极化(fluorescence polarization)、 流式细胞仪(flow cytometry)、邻近闪烁分析(scintillation proximity)、冷光共振能量转移(luminescence resonance energy transfer)、直接淬熄(direct quenching )、基态复合物形成(ground-state complex formation)、化学冷光會邑量转移(chemiluminescence energy transfer)、生物冷光共振會邑量转移(bioluminescence resonance energy transfer)、准分子形成(excimer formation)、t匕色基质检SJ (colorimetric substrates detection)、憐光(phosphorescence)、电化学变化(electro-chemical changes)、氧化还原电位变化(redox potential changes)。有项实施例使用分子式(I)分子生物感应器，其中R1为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合，选自组成适体、抗体、与双链核酸的基团；R2为弹性连结元，可分别与R1及R3形成共价键，以连接R1和R3，其中R2包含一个双功能化学交叉连结元(bifunctional chemical cross linker)，长度为0至500埃；R3和R7是一对互补核甘酸序列，长度约为4至15个核甘酸，在温度约21 °C至40°C， 且盐浓度约ImM至IOOmM的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole左右的连结自由能；R4和R8共同组成一种检测工具，选自组成FRET、荧光交叉相关光谱分析、荧光淬熄、荧光偏极化、流式细胞仪、邻近闪烁分析、冷光共振能量转移、直接淬熄、基态复合物形成、化学冷光能量转移、生物冷光共振能量转移、准分子形成、比色基质检测、磷光、电化学变化，与氧化还原电位变化的基团；R5为表位结合体，可与目标物上和R1结合的同一个重复性表位结合，选自组成适体、抗体与双链核酸的基团；R6为弹性连结元，可分别与R5及R7形成共价键，以连接R5和R7，其中R6包含一个双功能化学交叉连结元，长度为0至500埃。另有一项含分子式(I)分子生物感应器的发明实施例，其中
R1为抗体，可与目标物上的重复性表位结合；R2为弹性连结元，可连接R1及R3 ；R3和R7是一对互补核甘酸序列，在温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至IOOmM 的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole左右的连结自由能；R4和R8共同组成一种检测工具，当R3和R7连结时，就会产生可检测到的信号；R5为抗体，可与目标物上和R1结合的同一个重复性表位结合，选自组成适体、抗体与双链核酸的基团；R6为弹性连结元，可连接R5和R7。还有一项含分子式(I)分子生物感应器的发明实施例，其中R1为抗体，可与目标物上的重复性表位结合；R2为弹性连结元，可分别与R1及R3形成共价键，以连接R1和R3，其中R2包含一个双功能化学交叉连结元，长度为0至500埃； R3和R7是一对互补核甘酸序列，长度约为4至15个核甘酸，在温度约21 °C至40°C， 且盐浓度约ImM至IOOmM的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole左右的连结自由能；R4和R8共同组成一种检测工具，选自组成FRET、荧光交叉相关光谱分析、荧光淬熄、荧光偏极化、流式细胞仪、邻近闪烁分析、冷光共振能量转移、直接淬熄、基态复合物形成、化学冷光能量转移、生物冷光共振能量转移、准分子形成、比色基质检测、磷光、电化学变化，与氧化还原电位变化的基团；R5为抗体，可与目标物上的同一个重复性表位结合；R6为弹性连结元，可分别与R5及R7形成共价键，以连接R5和R7，其中R6包含一个双功能化学交叉连结元，长度为0至500埃。(b)三价分子感应器采用其它选择的实施例，使用的是三价分子生物感应器。有项典型实施例采用的三价构造物，包含与目标物上的重复性表位结合的第一表位结合体、第一连结元、第一信号寡核甘酸、第一检测工具、与目标物上同一个重复性表位结合的第二表位结合体、第二连结元、第二信号寡核甘酸、第二检测工具、与目标物上同一个重复性表位结合的第三表位结合体、第三连结元、第三信号寡核甘酸，和第三检测工具。一项最佳实施例所采用的分子生物感应器，包含三个核酸构造物，共同形成分子式(II)R15-R14--R13--R9-R10-R11-R12
R16-R17--R18--R19；及
R20-R21--R22--R23(II)
其中R9为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；R10为连接R9及R11的弹性连结元；R11和R12是第一对互补核甘酸序列，在温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至 IOOmM的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole左右的连结自由能；R12和R23共同组成一种检测工具，当R11和R22连结时就会产生可检测到的信号；
R13为连接R9及R14的弹性连结元；Rw和俨是第二对互补核甘酸序列，在温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至 IOOmM的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole左右的连结自由能；R15和R19共同组成一种检测工具，当R14和R18连结时就会产生可检测到的信号；R16为为表位结合体，可与目标物上和R9结合的同一个重复性表位结合；R17为连接R16及R18的弹性连结元；R20为为表位结合体，可与目标物上和R9及R16结合的同一个重复性表位结合；R21为连接R2q及R22的弹性连结元。根据具体的目标物，分子式(II)分子生物感应器的表位结合体(R9、R16及R2°)可有多种选择。一般而言，R9、! "5及的适当选择包含三种结合体，每种结合体均能辨识相同目标物或不同目标物上的同一个重复性表位。适当表位结合体的选择实例无数，视目标物而定，包含选自组成适体、抗体、抗体片段、双链DNA序列、配体、配体片段、受器、受器片段、 多肽、胜肽、辅酶、共同调控因子、异位分子，和离子之基团的结合体。有项示范实施例所采用的R9I6及R2tl均为抗体。在其它分子式(II)分子生物感应器的实施例中，连结元Rltl和R21的作用是拉近R11 和R22的距离，如此当R9和R2°分别与目标物上的重复性表位结合时，R11和R22的连结方式就能促使检测工具R12和R23产生可检测到的信号。此外，示范连结元R13和R17的作用是拉近 R14和R18的距离，如此当R9和R16分别与目标物上的重复性表位结合时，R14和R18的连结方式就能促使检测工具R15和R19产生可检测到的信号。使用分子式(II)分子生物感应器的实施例，采用长约10至100个核甘酸的核甘酸序列作为连结元。有项实施例的连结元长约 10至25个核甘酸；另一项实施例的连结元则长约25至50个核甘酸；还有一项实施例采用长约50至75个核甘酸的连结元；此外也有实施例采用的连结元长约75至100个核甘酸。 在各项实施例中，组成连结元的核甘酸可能是DNA或RNA的任一核甘酸碱基(DNA为A、C、T、 G ；RNA为A、C、U、G)。有项实施例的连结元是由DNA碱基组成；但另一项实施例的连结元则是由RNA碱基组成。此外，也有实施例采用修饰核酸碱基作为连结元，例如修饰DNA碱基或修饰RNA碱基。经适当修饰的DNA或RNA实例包括2’ -氟核甘酸、2’ -氨核甘酸、5’ -氨基烯丙基-2’ -氟核甘酸，和硫代磷酸核甘酸。也可使用双功能化学连结元聚合物作为连结元。有项实施例使用的是异质双功能化学连结元，适用的异质双功能化学连结元包括s ulfoSMCC (Sulfosuccinimidy 1-4- (N-maleimidomethyl) eyelohexane-l-carboxylate)禾口 Ic-SPDP(N-Succinimidyl-6--(2-PyridylDithio)-Propionamido)-hexanoate)；另一项实施例则使用同质双功能化学连结元，适用的同质双功能连结元包括二琥珀亚胺基辛二酸酯、二琥珀亚胺基戊二酸酯，与二琥珀亚胺基酒石酸酯。有些实例述及其它适用的连结元，例如源自Spacer 18 (由聚乙二醇组成)的氨基磷酸酯。有项实施例的连结元长约0 至500埃；另一项实施例的连结元则长20至400埃左右；还有一项实施例是使用长约50至 250埃的连结元。在一项使用分子式(II)分子生物感应器的实施例中，属于互补核甘酸序列的R11 和R22，具有除非R9和与目标物上不同的重复性表位结合，否则就不会产生连结的长度。 此外，互补核甘酸序列R14和R18，也具有除非R9和R16与目标物上不同的重复性表位结合， 否则就不会产生连结的长度。R11和R22与R14和R18的长度，约介于2至20个核甘酸之间。有项实施例所采用的R11和R22与R14和R18，长约4至15个核甘酸；示范实施例所采用的R11 和R22与R14和R18，则长约5至7个核甘酸。在一项实施例中，于选定的缓冲液条件(如下文所述)下，测得R11和R22与R14和R18具有约5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole的连结自由能；另一项实施例于选定的缓冲液条件(如下文所述)下，所测得的R11和R22与R14和R18连结自由能约为6. Okcal/mole至8. Okcal/mole ；还有项实施例在选定的缓冲液条件下，所测得的R11和R22与R14和R18连结自由能约为7. Okcal/mole至8. Okcal/mole ；至于最佳实施例在选定的缓冲液条件下，所测得的R11和R22与R14和R18连结自由能则为7. 5kcal/mole0 更可取的是，在各项实施例里，Rn和R22及R14和R18与R9、R16或R2°并不具有互补关系。在一项分子式(II)分子生物感应器的典型实施例中，R12和妒3共同组成数项适用的检测工具，当R11和R22连结时，就会产生可检测到的信号。此外，R15和R19也共同组成数项适用的检测工具，当Rw和R18连结时，就会产生可检测到的信号。分子生物反应器适用的示范检测工具包括FRET、荧光交叉相关光谱分析、荧光淬熄、荧光偏极化、流式细胞仪、邻近闪烁分析、冷光共振能量转移、直接淬熄、基态复合物形成、化学冷光能量转移、生物冷光共振能量转移、准分子形成、比色基质检测、磷光、电化学变化，与氧化还原电位变化。(c)三组分分子生物感应器此项发明的另一个实施例，包含三组分分子生物感应器。这些感应器除了至少具有二个表位结合体构造物外，还额外包含一个寡核甘酸构造物，即下文所示的“0”。 某些实施例所采用的三组分分子生物感应器，含有限制性内切酶位点(endonuclease restriction site)；但也有些实施例所使用的三组分分子生物感应器，并不含限制性内切酶位点。 .不含限制性内切酶位點的生物感應器有项实施例的三组分生物感应器包含(1)与目标物上的重复性表位结合的第一表位结合体构造物、第一连结元、第一信号寡核甘酸、第一检测工具；( 与目标物上同一个重复性表位结合的第二表位结合体构造物、第二连结元、第二信号寡核甘酸和第二检测工具；及C3)寡核甘酸构造物，其中包含与第一寡核甘酸互补的第一区段，和与第二寡核甘酸互补的第二区段。第一信号寡核甘酸与第二信号寡核甘酸并未彼此互补，但与寡核甘酸构造物上的二个不同区段具有互补关系。二个表位结合体构造物与目标物连结的结果，会使各个信号寡核甘酸与寡核甘酸构造物产生杂合(hybridization)。两个信号寡核甘酸与寡核甘酸构造物结合，会拉近彼此的距离，于是产生可检测到的信号。在示范实施例中，此三组分分子生物感应器包含三个核酸构造物，共同形成分子式(III)R24-R25-R26-R27 ；R28-R29-R30-R31 ；0(III)其中R24为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；R25为连接R24及R26的弹性连结元；R26和R3°是一对核甘酸序列，彼此并未互补但与0上的二个不同区段具有互补关系；
R27和R31共同组成一种检测工具，当R26和R3q连结时就会产生可检测到的信号；R28为表位结合体，可与目标物上和R24结合的同一个重复性表位结合；R29为连接R28及R3q的弹性连结元；0为核甘酸序列，包含与R26互补的第一区段，和与R3°互补的第二区段。根据具体的目标物，分子式(III)分子生物感应器的表位结合体(R24及R28)可有多种选择。举例而言，当目标物为蛋白质时，R24和R28可为适体或抗体；当R24和R28为双链核酸时，目标物通常是与DNA结合的大分子或DNA结合蛋白。一般而言，R24及R28的适当选择包括二种结合体，每种结合体均能辨识相同目标物上的同一个重复性表位。不过在某些实施例中，R24和R28或许也能辨识不同目标物上的不同重复性表位。适当表位结合体的选择实例无数，视目标物而定，包含选自组成适体、抗体、抗体片段、双链DNA序列、修饰核酸、 核酸类似物(nucleic acid mimics)、配体、配体片段、受器、受器片段、多肽、胜肽、辅酶、共同调控因子、异位分子，和离子之基团的结合体。有项示范实施例所采用的R24及R28均为抗体，选自组成多株抗体、腹水(ascites)、Fab片段、Fab'片段、单株抗体、嵌合抗体，和人源性抗体的基团；另有项实施例采用的R24及R28均为配体；也有实施例以胜肽作为R24及R28。 此实施例的另一最佳选择为以单株抗体作为R24及R28 ；但有实施例采用双链DNA作为R24及 R28。有项实施例采用的R24为双链核酸，R28为适体；另有一项实施例的R24为抗体，R28为适体；也有实施例选择以抗体作为R24，双链DNA作为R28。在其它分子式(III)分子生物感应器的实施例中，示范连结元R25及R29可能均是长约10至100个核甘酸的核甘酸序列。有项实施例的R25及R29长约10至25个核甘酸；另一项实施例的R25及R29长度约为25至50个核甘酸；还有一项实施例采用长约50至75个核甘酸的R25及R29 ；此外也有R25及R29长约75至100个核甘酸的实施例。在各项实施例中，组成连结元的核甘酸可能是DNA或RNA的任一核甘酸碱基(DNA为A、C、T、G ；RNA为A、 C、U、G)。有项实施例的R25及R29是由DNA碱基组成；但另一项实施例的R25及R29则是由 RNA碱基组成。此外，也有实施例的R25及R29是由修饰核酸碱基组成，例如修饰DNA碱基或修饰RNA碱基。修饰的位置可能(但不限于)为糖的2’位置、嘧啶的C-5位置，及嘌呤的位置8。经适当修饰的DNA或RNA实例包括2’ -氟核甘酸、2’ -氨核甘酸、5’ -氨基烯丙基-2’_氟核甘酸，和硫代磷酸核甘酸(一硫代磷酸盐[monothiophosphate]或二硫代磷酸盐[dithiophosphate])。有项实施例采用的R25及R29是核甘酸类似物，核甘酸类似物的实例包括锁核酸(locked nucleic acids, LNA)、肽核酸(ρ印tide nucleic acids, PNA)与磷醯二胺吗林代寡核甘酸(phosphorodiamidate morpholino oligomers, ΡΜ0)。此外，R25和R29也可以是双功能化学连结元。有项实施例使用的是异质双功能化学连结元，适用的异质双功能化学连结元包括sulfoSMCC(Sulfosuccinimidyl-4-(N-male imidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)禾口 lc_SPDP(N_Succinimidyl_6_(3，- (2-Pyri dylDithio)-Propionamido)-hexanoate)；另一项实施例则使用同质双功能化学连结元，适用的同质双功能连结元包括二琥珀亚胺基辛二酸酯、二琥珀亚胺基戊二酸酯，与二琥珀亚胺基酒石酸酯。有些实例述及其它适用的连结元，例如源自Spacerl8(由聚乙二醇组成) 的氨基磷酸酯。有项实施例的R25和R29长约0至500埃；另一项实施例的R25和R29则长20 至400埃左右；还有一项实施例是使用长约50至250埃的R25和R29。在一项使用分子式(III)分子生物感应器的实施例中，R26和R3tl为彼此并不互补的核甘酸序列，但与0的二个不同区段具有互补关系，其中R26和R3°长约2至20个核甘酸。 另一项实施例的R26和R3°长约4至15个核甘酸；示范实施例的R26和R3°长约5至7个核甘酸。更可取的是，在各项实施例里，R26和R3°与R24和R28并不具有互补关系。在一项分子式(III)分子生物感应器的典型实施例中，R27和沪共同组成数项适用的检测工具，当R26和R3°分别与0上具互补关系的不同区段连结时，就会产生可检测到的信号。分子生物反应器适用的示范检测工具包括荧光共振能量转移(FRET)、镧系元素(Ianthanide)冷光能量转移(LRET)、荧光交叉相关光谱分析、荧光淬熄、荧光偏极化、流式细胞仪、邻近闪烁分析、冷光共振能量转移、直接淬熄、基态复合物形成、化学冷光能量转移、生物冷光共振能量转移、准分子形成、比色基质检测、磷光、电化学变化，与氧化还原电位变化。在分子式(III)分子生物感应器中，0包含与R26互补的第一区段，及与R3tl互补的第二区段，0的长度约为8至100个核甘酸。在其它实施例中，0的长度约为10至15个核甘酸；或15至20个核甘酸；或20至25个核甘酸；或25至30个核甘酸；或30至35个核甘酸；或35至40个核甘酸；或40至45个核甘酸；或45至50个核甘酸；或50至55个核甘酸；或55至60个核甘酸；或60至65个核甘酸；或65至70个核甘酸；或70至75个核甘酸；或75至80个核甘酸；或80至85个核甘酸；或85至90个核甘酸；或90至95个核甘酸；或95个核甘酸以上。在示范实施例中，0形成分子式(IV)R32-R33-R34-R35-R36(IV)其中R32、R34和R36是核甘酸序列，与R26、R3°、R33或R35不具互补关系。R32、R34和R36分别长约2至20个核甘酸。在其它的实施例中，R32、R34和R36分别长约为2至4个核甘酸；或4至6个核甘酸；或6至8个核甘酸；或8至10个核甘酸；或10 至12个核甘酸；或12至14个核甘酸；或14至16个核甘酸；或16至18个核甘酸；或18 至20个核甘酸，或20个核甘酸以上；R33为与R26互补的核甘酸序列，R35则为与R3q互补的核甘酸序列。R33与R35所具有的长度，通常能使R33和R26与R35和R3tl之间在温度约21 °C至40°C， 且盐浓度约ImM至IOOmM的环境下，产生5至12kcal/mole左右的连结自由能。在其它实施例中，于温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至IOOmM的环境下，R33和R26与R35和R3q 之间的连结自由能约为 5kcal/mole、6kcal/mole、7kcal/mole、8kcal/mole、9kcal/mole、 lOkcal/moleUlkcal/mole或12kcal/mole以上。有些实施例的R33和R35长度范围约介于 4至20个核甘酸之间。至于其它实施例的R33和R35长度则约为4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19个核甘酸，或20个核甘酸以上。ii.含限制性内切酶位點的生物感應器另有一项实施例所采用的三组分生物感应器包含(1)与目标物上的重复性表位结合的第一表位结合体构造物、第一连结元、第一信号寡核甘酸；(2)与目标物上同一个重复性表位结合的第二表位结合体构造物、第二连结元、第二信号寡核甘酸；及(3)寡核甘酸构造物，其中包含与第一寡核甘酸互补的第一区段、与第二寡核甘酸互补的第二区段、二个弹性连结元、与和第一及第二寡核甘酸互补的第一及第二区段重迭的限制性内切酶位点， 及一对附有检测工具的互补核甘酸。第一信号寡核甘酸与第二信号寡核甘酸并未彼此互补，但与寡核甘酸构造物上的二个不同区段具有互补关系。当寡核甘酸构造物完整无损时， 互补的核甘酸就会退火(annealed)并产生可检测到的信号。二个表位结合体构造物与目标物连结，会使各个信号寡核甘酸与寡核甘酸构造物产生杂合杂合。信号寡核酸与寡核酸构造物上的二个不同部位杂合，产生含限制性内切酶位点的双链DNA分子，且信号寡核酸间的空隙(gap)，正好位于双链DNA受质某一链中的内切酶切割位点。因此，当限制性内切酶出现时，只有在目标物出现的情况下，才会切开寡核甘酸构造物(亦即当信号寡核甘酸与寡核甘酸构造物结合时)。切割之后，寡核甘酸上的检测工具就会脱离，因此不会产生可检测到的信号。当已切割的寡核甘酸构造物分解后，另一个寡核甘酸构造物，就会与二个表位结合体(已和目标物连结)的信号寡核甘酸产生杂合，于是重复发生切割反应。杂合和切割循环可能重复许多次，切开多个寡核甘酸构造物(藉由二个表位结合体与目标物所形成的复合物)。在此实施例的另一示范选择中，所使用的三组分分子生物感应器包含三个核酸构造物，共同形成分子式(V)R36-R37-R38 ；R39-R40-R41 ；0 (V)其中R36为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；R37为连接R36及R38的弹性连结元；R38和R41是一对核甘酸序列，彼此并未互补但与0上的二个不同区段具有互补关系；妒9为为表位结合体，可与目标物上的同一个重复性表位结合；R40为连接R39及R41的弹性连结元；0则包含R42-R43-R44-R45-R46R42为核甘酸构造物，包含限制性内切酶位点、与铲8互补的第一区段，及与R41互补的第二区段。R43为第一弹性连结元；R44为第一核甘酸序列，与连接于检测工具的R46互补；R45为第二弹性连结元；R46为第一核甘酸序列，与连接于第二检测工具的R44互补；R43 连接 R42 及 R44，而 R45 则连接 R42 及 R46。分子式(V)三组分分子生物感应器适用的连结元、表位结合体和检测工具，与分子式(III)三组分分子生物感应器相同。R42所含的限制性内切酶位点，包括切割双链核酸而非单链核酸的限制酶可辨识的位点。根据无数的实例，这些位点包括ACCI、AgeI、BamHI、 BgI、Bg/I、BsiffI、BestBI、ClaI、CviQI、DdeI、DpnI、DraI、EagI、EcoRI、EcoRV> FseI、FspI、HaeII、HaeIII、HhaI、Hinc II、HinDIII、HpaI、HpaII、KpnI、KspI、MboI、MfeI、NaeI、NarI、 NcoI, NdeI, NheI, NotI, PhoI, PstI, PvuI, PvuII, SacI, SacII、Sail、SbfI, SmaI, Spel、 SphI、StuI、TaqI、TfiI、TliI、XbaI、XhoI、XmaI、XmnI 与 ZraI0 R42 所包含的核甘酸间隔元 (spacer)，可能位于一个或多个限制性内切酶位点、与R38互补的第一区段，及/或与R41互补的第二区段之前或之后。举例而言，适用的核甘酸间隔元(spacers)细述于分子式(IV)。II.分子生物感应器的用法此项发明的另一部分，包含此发明之分子生物感应器的数种应用方法。有些实施例使用分子生物感应器检测一个或多个目标物，有些实施例以套组(kits)的方式使用分子生物感应器，并应用于治疗领域。通常可于1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10分钟左右，检测到此项发明的生物感应器所发出的信号。在有些实施例中，可于3、4、5、6、7或8分钟左右，产生80%的最大信号；其它实施例则可于5、10、15、20、25、30、35、40或45分钟左右，产生最大信号。(a)检测方法有项实施例使用分子生物感应器检测一个目标物。检测方法通常包含让此项发明的分子生物感应器与目标物接触。为了检测目标物，所采用的方法通常涉及二个表位结合体(出现于此项发明的分子生物感应器)的目标分子诱发性连结，各个结合体均能辨识目标物上的同一个重复性表位。每个表位结合体均包含互补信号寡核甘酸(以检测工具标注，并透过弹性连结元与表位结合体连接)。二个表位结合体和目标物的连结，会使二个信号寡核甘酸相互靠近，因而产生可检测到的信号。通常是由任何此技术领域已知或本文所述的检测工具，产生可检测到的信号。有项特殊实施例提供检测蛋白质或多肽目标物的方法。蛋白质或多肽含有一个重复性表位。用来检测内含蛋白质或多肽样本的方法，通常包含让样本与此项发明的分子生物感应器接触的步骤。另有一项实施例使用分子生物感应器，检测样本中的大分子复合物目标物。在这项实施例中，重复性表位最好位于大分子复合物的各个组分，如此在形成复合物时，就能拉近可辨识重复性表位之表位结合体的距离，促使第一信号寡核甘酸和第二信号寡核甘酸产生稳定的交互作用，进而如上文所述般，产生可检测到的信号。(b)固相表面此项发明也包含一个固相表面，上面连接一个或多个此项发明的分子构造物。适用表面的实例无数，包括微量滴定盘、试管、(微球)、树脂和其它聚合物，以及其它此技术领域已知或本文所述的表面。如实例所述，有项实施例使用的固相表面，包含一个核酸序列，可与一个或多个分子构造物的信号寡核甘酸互补。因此，当表位结合体辨识出含重复性表位的目标物时，分子构造物的信号寡核甘酸就会与固定不动的核酸序列结合。可利用任何上文曾经细述或实例曾提及的工具，检测此种结合反应。另有一项实施例的固相表面，则使用三组分生物感应器。在此项实施例中，寡核甘酸构造物被固定在固相表面。第一表位结合体和第二表位结合体，会与上有已固定之0的表面和可能含有目标物的样本接触。当目标物出现时，第一表位结合体、第二表位结合体和目标物会结合，并与已固定之0形成复合物。有数种方法可检测含目标物的复合物，包括 先洗去未结合的组分后，检测连接于表位结合体的探针(probe)。此外，还有数种实时检测法适用的专门表面，包括但不限于表面等离子共振(surface Plasmon resonance, SPR)或全内反身寸焚光(total internal reflection fluorescence, TIRF) 寡核甘酸构造物(0)可被固定在数种类型的适用表面。所使用的表面可以是一种已经修饰含有彼此分离的个别位点，适于连接或连结三组分生物感应器的材料，且至少适合一种检测法。表面材料的实例无数，包括玻璃、改良式或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸脂、聚苯乙烯和苯乙烯及其它材料的异量分子聚合物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、 TeflonJ等)、尼龙或硝化棉、多醣类、尼龙、树脂、二氧化硅或二氧化硅类材料，包括硅和改良式硅、碳、金属、无机玻璃和塑料。各种尺寸和形状的表面，不致超出此项发明的范围。所使用的表面可以是平面、孔形(即364孔盘)，或者也可以是微球或载玻片。此技术领域的人士可依喜好利用各种方式连接寡核甘酸(0)与表面。举例而言，可先合成0，然后再将0与表面连接；或者也可以在表面上直接合成0 ；也可利用化学官能基来衍生表面和0，然后再连接两者。举例而言，可利用包含但不限于氨基、羧基、 氧基或硫醇基等化学官能基来衍生表面。藉由这些官能基，就能以直接或间接运用连结元的官能基来连接0。此外，也可以非共价的方式连接0与表面。举例而言，可以制备生物素H标定(biotinylated)的0，并与具非共价式链霉卵白素(str印tavidin)涂层的表面结合，产生连接反应。另外也可利用诸如光聚合(photopolymerization)与光微影(photolithography)等技术，在表面上合成0。其它将0连接于表面及在表面上合成 0的方法，在此技术领域中早已为人熟知，即Affymetrix的VLSIPS技术(例如请参阅 ^H^^JtX 6, 566, 495, Rockett and Dix,"DNA arrays technology, options and toxicological applications，，，Xenobiotica 30(2) : 155-177，特此将全文纳入参考)。(c)无检测工具之生物感应器的用途有些实施例思考的是不含检测工具的分子生物感应器。举例而言，当分子生物感应器为双价抗体构造物时，此双价抗体构造物可能不具可供检测的标记。可以想见，这些另类双价构造物的用途或许更类似抗体，可检测分子、结合分子、纯化分子(如同在管柱内或下拉式程序[pull-down type of procedure])、阻断分子交互作用、促进或稳定分子交互作用，或传递对抗微生物的免疫力。进一步思考认为，可将此双价抗体构造物应用于治疗领域。此项发明使技术熟练的人士，能以数种方式将可辨识来自任何分子的任何重复性表位的抗体，并入双价、三价或其它多价适体构造物，将这些彼此分离的分子拉拢，以测试产生适当疗效的效果。(d)套组另有一项实施例将此项发明导向一组套组，包含一个连接第一标记的第一表位结合体，及一个连接第二标记的第二表位结合体。当(a)第一表位结合体与第二表位结合体和多肽上的一个重复性表位结合时，(b)第一标记与第二标记就会发生交互作用，产生可检测到的信号。有项最佳实施例所采用的表位结合体为抗体构造物，内含一个抗体、一个标记与一个信号寡核甘酸。不过表位结合体可以是抗体片段、适体或胜肽。在检测包含一个重复性表位的目标物时，套组极有用处，因此可应用于研究或医学/兽医诊断领域。尤其特别的是，此套组可用来检测微生物，例如细菌、病毒和霉菌。(e)诊断有项将此项发明导向疾病诊断法的实施例，包含下列步骤(a)取得患者样本，(b)让样本接触第一表位结合体构造物及第二表位结合体构造物，与(C)利用检测方法， 检测样本中是否含有多肽、微生物或大分子复合物，样本若出现多肽、微生物或大分子复合物，就可据此判断患者是否罹患某种疾病。有项实施例所选择的(a)第一表位结合体构造物为第一抗体(连接第一标记和第一信号寡核甘酸)，(b)第二表位结合体构造物为第二抗体(连接第二标记和第二信号寡核甘酸)，并(C)采用荧光检测法，因此(d)当第一抗体与多肽结合，且第二抗体也与多肽结合时，(e)第一信号寡核甘酸和第二信号寡核甘酸将彼此连结，于是(f)拉近第一标记与第二标记的距离，进而促使荧光产生变化。在另一项实施例中所选择的(a)第一表位结合体构造物为第一胜肽(连接第一标记和第一信号寡核甘酸)，(b)第二表位结合体构造物为第二胜肽(连接第二标记和与第一信号寡核甘酸互补的第二信号寡核甘酸)，并(c)采用荧光检测法，因此(d)当第一胜肽与多肽结合，且第二胜肽也与多肽结合时，(e)第一信号寡核甘酸和第二信号寡核甘酸将彼此连结，于是(f)拉近第一标记与第二标记的距离，进而促使荧光产生变化。另有实施例选用不同类型的表位结合体(即抗体和胜肽，或适体和抗体等等)，作为第一表位结合体和第二表位结合体。比较适当的样本包括血液、尿液、腹水、细胞和组织样本/切片。比较适当的患者包括人类、农场动物和同伴动物。另一项实施项将此项发明运用于筛检样本的目标物，包含下列步骤(a)让样本接触第一表位结合体构造物及第二表位结合体构造物，然后(b)利用检测方法检测样本是否含有目标物。比较适当的目标物包括内含一个重复性表位的多肽与微生物。有项实施例所选择的(a)第一表位结合体为第一抗体(连接第一标记和第一信号寡核甘酸)，(b)第二表位结合体为第二抗体(连接第二标记和与第一信号寡核甘酸互补的第二信号寡核甘酸)，并(c)采用荧光检测法，因此(d)当第一抗体与多肽结合，且第二抗体也与多肽结合时，(e)第一信号寡核甘酸和第二信号寡核甘酸将彼此连结，于是(f)拉近第一标记与第二标记的距离，进而促使荧光产生变化。另一项实施例所选择的(a)第一表位结合体为第一胜肽(连接第一标记和第一信号寡核甘酸)，(b)第二表位结合体为第二胜肽(连接第二标记和与第一信号寡核甘酸互补的第二信号寡核甘酸)，并(c)采用荧光检测法，因此(d)当第一胜肽与多肽结合，且第二胜肽也与多肽结合时，(e)第一信号寡核甘酸和第二信号寡核甘酸将彼此连结，于是(f)拉近第一标记与第二标记的距离，进而促使荧光产生变化。另有实施例选用不同类型的表位结合体(即抗体和胜肽，或适体和抗体等等)，作为第一表位结合体和第二表位结合体。定义“抗体”一词通常是指能辨识并与抗原表位结合的多肽或蛋白质。本文所指的抗体，可为此技术领域所理解的完整抗体，即由二条重链和二条轻链组成的抗体，或者是选自组成多株抗体、腹水(ascites)、Fab片段、Fab’片段、单株抗体、人源性抗体的基团，或组成抗体高变异区的胜肽。“适体” 一词指的是聚核甘酸(polynucleotide)，通常是从生化学活性、分子辨识或结合功能(binding attributes)的角度来看，具备有用生物活性的RNA或DNA。适体通常具有分子活性，例如在某个特定表位(区段)与目标物结合。一般公认可利用活体外的方法，合成及/或识别与任何多肽具特异性结合能力的适体。
本文所称的“检测方法”，意指任何此技术领域中已知可用来检测分子交互作用的方法。“可检测到的信号”一词，基本上等同于“检测方法”。检测方法包括检测的质量变化 (例如等离子共振)、荧光的变化(例如FRET、荧光交叉相关光谱分析、荧光淬熄或渐增式荧光、荧光偏极化、流式细胞仪)、酶活性(例如耗尽受质或形成产物，诸如可检测到的染剂，碱性磷酸酶的NBT-BCIP系统就是其中一例)、化学冷光或闪烁分析(例如邻近闪烁分析、冷光共振能量转移、生物冷光共振能量转移等)，以及基态复合物形成、准分子形成、 比色基质检测、磷光、电化学变化、氧化还原电位变化。“表位” 一词通常是指目标物的特定区段。“表位”可以是抗原、半抗原(hapten)、 分子、聚合物、普利昂蛋白(prion)、微生物、细胞、胜肽、多肽、蛋白质、配体、受器或大分子复合物。表位可由衍生自大型多肽的小胜肽组成。表位可能具有二维或三维表面，或具有组成数个不连续胜肽伸展(peptide stretches)或氨基酸基团的多肽、蛋白质或大分子复合物的表面特征。“表位结合体”一词是指有能力与抗原、多肽、蛋白质或大分子复合物上的特定表位结合的物质。表位结合体的实例无数，包括适体、双链DNA序列、配体和配体片段、受器和受器片段、抗体和抗体片段、聚核甘酸、辅酶、共同调控因子、异位分子和离子。“表位结合体构造物”一词是指包含表位结合体，且可在某个“分子生物感应器”和另一个分子生物感应器中发挥作用的构造物。表位结合体构造物最好也能含有“连结元” 和“信号寡核甘酸”。可使用表位结合体构造物，启动此项发明的适体选择法。可利用“连结元”连结第一表位结合体构造物与第二表位结合体构造物，形成“双价表位结合体构造物”。 表位结合体构造物也可称为分子辨识构造物。适体构造物是表位结合体构造物的特例，其中的表位结合体构造物为适体。本文所述“标记”一词，是指任何可连接于聚核酸、多肽、适体、核酸组分或其它受质材料的物质，且可利用检测方法检测到此物质。此项发明适用的标记实例无数，包括但不限于冷光分子、化学冷光分子、荧光染剂(fluorochromes)、荧光淬熄剂、染色分子、放射性同位素、闪烁物质、质量标记(透过质量变化进行检测)、生物素、卵白素、链霉卵白素、蛋白质A、蛋白质G、抗体或抗体片段、第二型生长因子受器结合蛋白(GA2)、聚组胺酸、Ni2+、 Flag标示、myc标示、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化酶、冷光酶、电子予体/电子受体、吖啶酯(acridinium esters)与比色基质。可聘雇此技术领域中技术熟练的人士，负责操作此项发明。本文所述“大分子复合物”一词，是指由含大分子的素材组成的合成物。有一个或多个大分子(例如多肽、脂质、醣类、核酸，天然或合成聚合物等等)彼此连结的复合物更佳，其中的连结可能涉及大分子复合物组分间的共价性或非共价性交互作用。大分子复合物可能相当简单(例如与配体结合的多肽)、相当复杂(例如脂筏[lipid raft])，也可能非常复杂(例如细胞表面、病毒、细菌、孢子等等)。大分子复合物的性质可能属于生物性， 也可能属于非生物性。本文会交替使用“分子生物感应器”和“分子信标”(molecular beacon)这二个名词，来指称至少由二个表位结合体构造物组成的构造物。分子生物感应器可用来检测或量化目标物，所利用的化学系统是以测量读取系统为检测方法，检测或量化分析物、普利昂蛋白、蛋白质、核酸、脂质、醣类、生物分子、大分子复合物、霉菌、微生物，或由生物分子组成的大分子复合物。“信号寡核甘酸”一词是指短的(长度通常为2至15个核甘酸，以5至7个核甘酸为佳)单链聚核甘酸。信号寡核甘酸通常成对使用，组成第一信号寡核甘酸和第二信号寡核甘酸。更可取的是，第一信号寡核甘酸序列可与第二信号寡核甘酸互补，除非经由第三方结合体的媒介，拉近第一和第二信号寡核甘酸的距离，否则第一信号寡核甘酸和第二信号寡核甘酸不会透过氢键，彼此形成稳定的连结。

实例下列实例说明此项发明的各种迭代法。实例1 一般生物感应器设计图1所示为分子生物感应器的整体设计。此项概念是衍生自检测DNA结合蛋白的分子信标，及先前发展用来检测蛋白质的适体分子信标[12-15]。利用长弹性PEG交叉连结元(crosslinker)，分别以一对互补的短信号寡核甘酸，标注一对能辨识蛋白质上非重迭性表位的抗体。使用一对可在荧光共振能量转移(FRET)中作为予体和受体的荧光分子 (fluorophores)修饰寡核甘酸[16]。当目标蛋白质出现时，二个抗体均会与目标物结合， 促使信号寡核甘酸的局部浓度大幅升高，进而导致寡核甘酸退火，拉近荧光分子的距离，形成有效的FRET，成为检测目标蛋白质的信号。近期所进行的长弹性连结元配体结合属性定量分析结果指出，长约数十奈米的连结元，应可与图IA所示设计兼容。此种长度的连结元， 应有充分的空间和弹性，足以有效形成含二个抗体，甚至极大型蛋白质的复合物。以I型心肌肌钙蛋白为目标蛋白质，证实图IA所示感应器的可行性。在不含心肌肌钙蛋白的条件下将标注抗体混合后，比较有受体标注抗体和无受体标注抗体的情况下， 予体标注抗体的荧光光谱，结果发现不会观察到显着的FRET信号(图1B)。但在添加肌钙蛋白后，即可观察到于670nm时(激发点为490歷)的FRET信号发射量增高数倍，且于520nm 时发射予体淬熄。此信号对蛋白质的检测极为灵敏(低至40pM的肌钙蛋白)(图1C)。我们曾测试心肌肌钙蛋白感应器的特异性。当在感应器中加入非特异性关联对照蛋白(猪的肌肉肌钙蛋白)时，可观察到强烈的心肌肌钙蛋白反应。在分子生物感应器分析中，未标注心肌肌钙蛋白抗体的作用如同竞争者，显示在含有肌钙蛋白时，分子生物感应器所产生的信号，是源自于标注抗体与蛋白质间的特异性交互作用。由于三起分子事件(二个抗体各自辨识目标蛋白质，及互补信号寡核甘酸的连结)必须同时发生，才能在出现目标物时产生信号，因此预料分子生物感应器应具有高度特异性，只要缺少其中一起事件，感应器就不会产生信号。利用与成功制备其它目标物(C反应蛋白、胰岛素、C胜肽)感应器所采用的相同肌钙蛋白蓝图，已证实此感应器设计的一般性。实例2 检测细菌用的抗体生物感应器藉由类推至信号寡核甘酸的目标蛋白质诱发性退火(图1)，假设信号寡核甘酸标注抗体与细菌细胞表面的重复性表位结合，将能产生类似效果(图2)。虑及细菌细胞的大小( 500- 3000nm)与连接寡核甘酸和抗体的弹性连结元长度(10-50nm)，预料即使细胞表面表位(由抗体辨识)的密度中等，也应足以拉近抗体的距离，促使信号寡核甘酸退火。在目标细胞出现时，可进而拉近予体与受体荧光染剂的距离，产生FRET信号。此法似乎和蛋白质目标物的分子生物感应器(图1)类似，必须有二个抗体(分别以互补信号寡核甘酸标注)和二个分析用的不同细胞表面表位结合(如图2所示)，才能发挥作用。无论如何，我们假设，利用分别以二个互补信号寡核甘酸标注的相同抗体混合物，就足以发挥作用。理由如图3A所示。当以互补寡核甘酸标注的抗体彼此结合时，互补寡核甘酸可提供额外的适当能量。当二个相邻抗体以相同的信号寡核甘酸标注(不会产生FRET信号的配置方式)时，就不会产生这些能量。因此，当使用以二个互补信号寡核甘酸标注的相同抗体混合物时，有能力产生PRET信号的抗体，可藉由此项设计的嵌装历程优先结合。下文所述的初步数据，已清楚证明图2所示设计确实有效。实例3 大肠杆菌生物感应器为了取得原理验证的证据，证实图2及图3A所示设计确实有效，我们以0157:H7 型大肠杆菌作为检测目标物，进行一系列的实验。自KPL取得0157:H7型大肠杆菌的特异性亲和力纯化山羊多株抗体。针对上述各个抗体，制备二个信号寡核甘酸标注抗体的样本。 其中一个以5’-荧光素-GCTCAT修饰(藉由长弹性连结元)，另一个则以Cy5-修饰互补信号寡核甘酸(5，-Cy5-ATGAGC)修饰。利用分析物AD荧光盘式仪(Analyst AD microplate reader) (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)，进行所有的荧光测量。将0157:H7型大肠杆菌标注抗体混合物，与逐渐增加数量的0157:H7型大肠杆菌细胞一起培养，就会观察到大量的剂量依存性FRET信号(发射点为670nm，激发点为 488nm)(图。相较之下，使用相同数量的K12型大肠杆菌，则未记录到FRET信号，证实此感应器具有特异性。图4所示为在各种目标细胞数量下，重复进行三次独立分析的结果。 使用上述分析条件，很容易就能检测到数千个目标细胞，再现性(r印roducibility)高(平均变异系数[CV]为1. 7%;范围0. 7-3. 9% )。阴性对照组(K12型大肠杆菌)所测试的任何细胞量，均未检测到信号。在出现极大量的目标细胞时，FRET信号之所以开始减弱的原因，最可能导因于反应混合物中的游离抗体耗尽，所以与各细胞结合的抗体平均数量减少。 图3A与图4所示数据，证实图2所示的分析设计确实可行。图2所示的分析设计假定，连接于共同结合于相同细胞之抗体的互补寡核甘酸退火，会产生FRET信号。另一种可能性为连接于与不同细胞(即导致细胞出现抗体诱发性凝集)结合之抗体的信号寡核甘酸退火，会产生FRET信号。为了探究目标细胞出现时所产生的FRET信号性质，我们已取得与荧光素和Cy5-修饰互补寡核甘酸标注抗体混合物一起培养的0157:H7型大肠杆菌(图5;予体/受体)，及只与荧光素修饰寡核甘酸(缺乏透过互补寡核甘酸退火的交叉连结能力)标注抗体一起培养之相同细胞(图5 ；只有予体)的共焦显微影像。在两种条件下，均能发现个别细胞和细胞凝集。相较于只有予体样本，予体/ 受体样本的细胞凝集并未增加，显示不同细胞间的信号寡核甘酸退火，即为产生FRET信号的机制。此外，在个别细胞内可发现大量的FRET信号(图5，最下方的FRET盘)。上述观察结果显示，在出现目标细胞的情况下，产生FRET信号的主要路径为图2所描绘的历程。实例4 生物反应器反应时间图2所示感应器设计的重要优点之一，分析方法简单快速，因此，下一个实验要测定感应器的反应时间。将各种数量的目标细胞加入抗体(以荧光素和Cy5修饰互补寡核甘酸标注)混合物中，并监测FRET信号(作为培养时间的函数)(图6)。经过30分钟的培养后，可测得最大FRET信号。经过5分钟的培养后，即可产生80%的最大FRET信号(因此， 必要时只需培养5分钟即可进行分析)。上述数据证实此生物感应器的反应时间迅速。实例5:灵敏度
检测灵敏度是定义生物感应器实用性的重要参数之一。可利用将分析灵敏度最佳化的方法，确认最佳抗体浓度。降低抗体浓度可能会增加分析灵敏度，因为在既定的目标细胞密度下，总抗体浓度中有较多抗体可与细胞结合(前提为抗体浓度不得低于抗体抗原复合物的Kd值)。图7所示为在二种(较低)浓度下，生物感应器的反应。一如预期，降低抗体浓度可检测较少量的目标细胞。据估计，使用5/6. 2nM抗体混合物的检测灵敏度为 150cells/20ml assay。细菌检测法通常会采用某种型式的样本浓缩步骤，以提高低细胞数量的检测率。我们已进行样本测试，以判定此分析是否可加入此类步骤。先制备二份0157:H7型大肠杆菌的稀释样本。使用20/25nM标注抗体混合物，其中一份样本(3000CellS/ml ； 60cells/20ml assay)低于感应器的检测限值(图8)。另一份样本(300, 000cells/ml ； 6000cells/20ml assay)则出现相当低的信号(图8)。然后快速旋转外覆半透膜的离心层析管柱，将二份样本浓缩 10倍后，再进行一次测量。经过离心层析管柱处理后，先前无法检测到信号的样本，已可轻易检测到信号，而浓度较高的样本(先前测得的信号相当低)所出现的信号大幅提升(图8)。实例6 沙门氏菌的生物感应器为了证明图2所示感应器设计的一般性，我们使用与0157:H7型大肠杆菌感应器相同的程序，制备另一种细菌(鼠伤寒沙门氏菌)的感应器。图9显示如同0157:H7型大肠杆菌的情况，当出现沙门氏菌细胞时，可观察到大量的剂量依存性FRET信号。相较之下， 出现0157:H7型大肠杆菌或K12型大肠杆菌时，只能看见极少量的FRET信号，证实此感应器对目标细胞具有特异性。在0157:H7型大肠杆菌的情况下，再现性极佳(平均变异系数为1.0%;范围0. 3-2.2%)。沙门氏菌的FRET信号少于0157:H7型大肠杆菌，反映的非常可能是对应抗体(corresponding antibodies)属性的差异(例如抗体辨识表位的表面密度不同)。然而，可将相同的功能性感应器设计蓝图，应用于不同细菌细胞的事实，强烈显示图2所示设计的确具有一般性。沙门氏菌感应器反应的动力学(图10)，与0157:H7型大肠杆菌感应器类似。实例7 制备附有连结元的抗体制备利用长弹性连结元进行短寡核甘酸修饰的抗体，是制作细菌生物感应器的重要步骤。目前已发展出标注并纯化抗体的可靠程序。简单地说，是利用以陀氏试剂(Traut’s reagent)诱发游离硫氢基(SH group)的程序，来处理抗体。5’ -氨基标注寡核甘酸会与 N-羧基丁二醯亚胺-马来醯亚胺(NHS-maleimide)双功能交叉连结元发生反应，产生含马来醯亚胺的寡核甘酸，并与含硫氢基的抗体发生反应。可在标准寡核甘酸合成[12]作用中引进长弹性连结元，或以长弹性连结元作为双功能交叉连结元的一部分。利用快速蛋白质液相层析(FPLC)尺寸排阻色层分析法，纯化标注抗体。若要评估赞成和反对各种感应器设计变形的理由，则需针对一系列含各种稀释细菌目标物的样本进行分析。测定讯号/背景值比(signal-to-backgroimd ratios)、检测的灵敏度和特异性，可评估感应器的性能。灵敏度的定义为所产生的信号高于背景值(无目标物存在时的测量值)三个标准差时的最低数量目标物。比较在出现既定目标物与同数量的不相关细菌时所测得的信号，即可评估特异性。含长弹性连结元的配体属性分析结果显示，当用来连接寡核甘酸与抗体时，可使用长达50nm的连结元来制造功能性感应器。不过上述结论是以使用简单型系统所进行的实验为依据，尚不清楚将上述结论应用于我们的细菌感应器设计(图2)上的结果，在使用我们的细菌感应器时，抗体需与微米大小的细胞结合。因此我们使用以10、20、30、40与 50nm长的连结元标注的抗体，来比较分析的性能。在标准寡核甘酸合成过程里，加入弹性连结元的构造物，即可操控连结元的长度[12]。由于最佳连结元长度可能取决于抗体辨识抗原的表面密度，因此使用所有四种细菌目标物，来测试各种长度的连结元。举例而言，在初步的实验中，我们曾观察到在沙门氏菌实验中所得到的FRET信号，显着低于0157:H7型大肠杆菌。或许利用不同长度的连结元，可以提高沙门氏菌实验的FRET信号。实例8 抗体寡核甘酸结合物的最佳寡核甘酸/蛋白质比图2为按照蛋白质分子概略描绘以一个寡核甘酸标注的抗体。事实上情况未必如此，我们不需制备此类标注抗体的均质制剂。改变试剂的浓度及/或耦合反应的时间，即可调整抗体的标注程度。可利用寡核甘酸标注程度不同的抗体(每个抗体 1至 5个寡核甘酸)，比较感应器的性能，以找出最理想的比例。实例9 信号寡核甘酸的最佳长度要使感应器发挥最佳功能，用来标注抗体的寡核甘酸长度极为重要。说得更明确一点，我们关注的参数并非寡核甘酸的长度，而是寡核甘酸与互补链杂合时的自由能变化。 若用来标注抗体的二个互补寡核甘酸之间的结合亲和力太强，就会出现过强的目标物非依存性连结，产生强大的背景信号。若亲和力太弱，背景结合作用虽小，但寡核甘酸的目标物诱发性退火就会降低，导致无法在目标细胞出现时产生最理想的FRET信号。初步实验所使用的寡核甘酸，于0. IM NaCl中的杂合Δ G值为 7. 5kcal/mole0尽管这些寡核甘酸能适当发挥功能，但我们并不清楚它们是否发挥最佳功能，因此测试使用的寡核甘酸杂合AG 值范围介于6至Qkcal/mole的感应器性能，测定目标细胞出现时的高信号，与无目标物出现时的低背景值之间的最佳AG值。实例10 干式化学法须将寡核甘酸标注抗体冷冻储存在-80°的环境下，才能确保长期的稳定性。当储存在4°的环境下时，它们的功能性仍能继续保持至少2周。上述观察结果显示，感应器主要组分的稳定性与任何其它免疫分析法类似，因此可与感应器的实际应用兼容。应用干式化学法(dry-chemistry approach)可大幅简化微量分析盘中的均质性分析(homogenous assays) [17，18]。利用此种方法，需将试样混合液(assay mixture solution)在微量分析盘的盘孔内干燥。若试样试剂与此程序兼容，就可简化分析，因为只需将样本溶液加入含干燥试样组分的微量分析盘盘孔即可。采用干式化学法不但可延长试样的保存期限，也可简化储存要求。因此我们使用干式化学法来测试感应器的性能。放置在硅胶凝体上经过一夜的干燥后，感应器混合物(置于5%山梨糖醇(sorbitol)缓冲液[已证实有助于保留干燥后试样试剂的功能性属性]中的5ml标注抗体溶液)会在384孔微量分析盘的盘孔中挥发[17， 18]。针对四种细菌目标物，比较干式化学分析法与利用“正常”湿式化学法所进行之分析法的灵敏度。若试样组分的干燥和溶解，不会显着降低分析法的灵敏度，就进一步测试干式化学法的试样稳定性。以分析盘封膜密封放有干燥试样组分的分析盘，并存放在室温或4° 的环境下一段长时间( 周)。每周均针对所储存的干式化学试样进行性能评估，以测定储存时间和储存温度对试样性能的影响。实例11 改善灵敏度目标细胞的检测灵敏度，可界定感应器的最终用途和用法。目前于初步实验中所测得的感应器细菌检测灵敏度，等同或优于酵素连结免疫吸附分析法(ELISA) [2]。因此，即使感应器尚未进行最佳化，仍是标准ELISA之外另一个优秀的选择，因为此种感应器不但具有与ELISA相同的灵敏度、结果出炉的时间较ELISA短，而且使用相当容易。为了检测低于目前灵敏度限值的细胞数量，可能必须利用半透膜浓缩步骤(如图8所示的初步数据) 或细胞增殖培养步骤，提高样本浓度。无论如何，感应器的灵敏度愈高，应用的用途范围就愈广，因此已针对下列改善分析灵敏度的观点进行测试⑴另类FRET探针。有个相当直接的方法可以改善感应器的灵敏度，亦即使用较优良的荧光探针(提高亮度的探针)。我们已测试过以一对更亮、更耐光的探针(Alexa488/ Alexa647或AleXa546/AleXa647)，取代所有初步实验中所使用的荧光素_Cy5予体一受体对，确实可提高灵敏度。OD时间解析FRET (LRET)。另一种可提高FRET分析灵敏度的方法，是增加FRET 信号的讯号/背景值比。在FRET分析中，大部分的背景值来自予体发射至受体检测频道的溢出讯号，及受体对予体激发波长的直接激发。使用以镧系元素螯合物作为予体标记的冷光能量转移(LRET)，可有效去除上述二种导致背景值(以及导因于光散射的背景值)升高的来源[19-23]。这些标记的萤光寿命很长(数百微秒)，足以运用脉冲激发并延长闸门发射测量值，已证实可大幅降低FRET均质性分析的背景信号[19，22]。LRET对去除导因于样本中的光散射或荧光杂质的背景值，效果极佳，有助于分析混浊或会自发荧光的样本。至于四种细菌目标物，应制备以铕螯化物和Cy5修饰的互补寡核甘酸标注抗体。我们也比较利用LRET检测法与标准FRET检测法的感应器性能。(iii)限制酶信号放大法。在使用分子生物感应器分析法检测溶液中的蛋白质目标物时(图1)，最近已发展出一种限制酶吸收信号放大法(图11)，信号强度较均质性分析结果高100倍。此种信号放大法是以荧光DNA构造物的目标物依存性限制酶吸收率为基础 (图11，S3)，荧光DNA构造物被切开后，荧光会大幅增高。单一目标物一抗体复合物可催化多次切割，进而放大信号强度。S3组分包含由限制酶负责辨识的序列。虽然可使用Hinc II 序列，不过任何可切割ds DNA但对ss DNA无活性(如同Hinc II)的限制酶均可使用。S3 也包含先连接于二个互补寡核甘酸，接着再利用弹性连结元连接于S3的探针。当S3寡核甘酸是完整的，连接于S3的互补寡核甘酸局部浓度会升高，于是发生退火(产生近接程度依存性信号，例如FRET)。Sl和S2使用的寡核甘酸很短，因此无法以任何有意义的方式自行退火为S3。当目标物出现时，由于含目标物的复合物会变成有效的S3双价结合元(binder)， 与S3的结合亲和力远高于游离的Sl和S2，所以其中所含的Sl和S2就会与S3结合。Sl和 S2的寡核甘酸会退火为S3，如此一来，二个与S3杂合的寡核甘酸间的空隙，正好位于Hinc II切割双链DNA下链的位置。因此，当样本含Hinc II时，只有在已退火成Sl和S2 (即出现目标物时)时，才会切割S3。S3被切割后，复合物将会分离(切割S3将大幅降低复合物的稳定性，导致二个信号寡核甘酸分离，进而消除近接程度依存性信号)。如此一来，含Sl 和S2的复合物即可与S3的另一个分子结合，且此类切割和分离的循环可一再重复许多次， 导致信号放大。我们认为连结于细菌细胞表面的抗体，可产生与图11所示(针对溶液中的蛋白质目标物)相同的事件(如图2所示)。我们制备细菌特异性抗体(以与S3互补的寡核甘酸标注)，以测试图11所示信号放大法对细菌检测的适用性。将此类抗体混合物与各种数量的目标物和阴性对照细胞，放在含HincII的环境下一起培养，然后进行荧光强度测量。比较应用此种放大法与标准FRET检测法的分析之间的性能。实例12 生物感应器的固相表面变形本实例的目的是发展另一种感应器设计，如图12所示。尽管使用此种感应器设计需要更精密的仪器，但潜在的益处包括提高灵敏度及利用多条路径同时检测数种目标物。 此种设计使用的是藉助弹性连结元以信号短核甘酸修饰的抗体(图12)。具有与此寡核甘酸互补区段的第二寡核甘酸，将被固定于固相表面。用来标注抗体的寡核甘酸经设计具有些许亲和力，可与已固定的互补寡核甘酸结合，但所设定的亲和力(以寡核甘酸的长度和序列为变量，可随意设定二个寡核甘酸间交互作用的亲和力大小)很低，因此在奈摩尔的抗体浓度下，游离抗体极少与已固定的寡核甘酸产生连结(举例而言，nM范围的KD就能满足此种设计的要求)。我们假设，当加入目标细胞时，与细胞表面结合的抗体可有效产生一个多价粒子，能与已固定的寡核甘酸产生多价交互作用(图12)。由于这些交互作用具有多价特性，目标细胞可以极高的亲和力与固相表面结合。我们主张可利用此种目标细胞与固相表面的结合(因标注抗体与细胞表面抗原的连结而诱发)，有效检测目标细胞。图13所示为可行的实验，证明可根据图12所示的设计，利用固相表面分析法检测目标细菌。既然是以荧光探针标注抗体，任何专门针对表面结合型荧光探针的荧光检测法， 应有潜力读取信号。我们将针对此种另类分析设计的二种变形，进行性能研究。在研究第一种变形时，先将寡核甘酸(与已和抗体结合的寡核甘酸互补)固定在96孔微量分析盘的盘孔内，再将样本和寡核甘酸标注抗体放在一起培养，然后用缓冲液冲洗盘孔，并读取残留在盘孔中的荧光强度。在研究第二种变形时，则是利用全内反射荧光(TIRF)实时读取目标细胞一抗体复合物与固相表面的连结反应。此种信号读取模式需利用更具技术性的复杂仪器，但可能比较灵敏也比较快速。此外，还可将具独特序列的寡核甘酸固定在TIRF载玻片的不同区域(位置)，如此就能藉由对各个目标细胞(以具独特序列的寡核甘酸[和固定于载玻片上特殊位置的寡核甘酸互补]标注)具特异性的抗体，利用多条路径同时检测数种目标细胞。上文测定的最佳均质性分析参数，大部分也适用于固相表面分析。不过在图12所示的分析状况中，连接于抗体的寡核甘酸最佳长度，可能与均质性分析(图幻不同。在固相表面分析中，可能必须使用亲和力较低的寡核甘酸，才能发挥最佳性能。因此，我们利用杂合AG值范围介于5至池％1/!11016的寡核甘酸，测试固相表面分析变形(图12)的性能。在这些实验中，须将寡核甘酸(与已和抗体结合的寡核甘酸互补)固定在96孔微量分析盘的盘孔内。至于固相表面分析的建立和执行则相当容易，而且此种分析变形所确认的互补寡核甘酸最佳长度，应该也适用于实时TIRF分析。使用链霉卵白素涂层分析盘和生物素H标定寡核甘酸，将寡核甘酸固定于微量分析盘的盘孔表面。将所欲测试的各种长度寡核甘酸、各种数量的目标细胞和阴性对照细胞，同时放入外覆对应互补寡核甘酸涂层的微量分析盘的盘孔中培养。以缓冲液冲洗盘孔三次，并使用分析物AD荧光盘式仪(Molecular DeViCeS，SUrmyVale，CA)，测量残留在各个盘孔中的荧光强度。利用已经测试的各种寡核甘酸长度的检测灵敏度和讯号/背景值比，测定最佳的寡核甘酸长度。
也针对已固定的寡核甘酸(包含多个与标注抗体的寡核甘酸互补的重复序列)进行测试(相对于此类序列的单一复本，如图12所示)。大幅提高外覆寡核甘酸标注抗体涂层的目标细胞，与含寡核甘酸(具有多个重复互补序列)的固相表面之间的结合亲和力，对固相表面分析的性能颇有助益。实例13:TIRF检测法

TIRF(全内反射荧光)[31-34]利用玻璃载玻片附近产生的渐逝波(evanescent wave)(从载玻片反射而来的光束)，限制激发分子与载玻片表面间的结合。因为本体溶液中的荧光分子并未被激发，且对信号并无影响，所以限制激发分子与载玻片表面结合，可实时监测标注分子与载玻片表面的交互作用。同样的，限制极薄(通常只有几百奈米)的样本层激发，可降低背景值，提高检测的灵敏度，如此一来甚至可以检测到来自单个分子的荧光[31，34]。因此可采用TIRF，实时检测抗体涂层细胞与寡核甘酸(与标注抗体的寡核甘酸互补)涂层表面间的目标分子诱发性连结。实时检测的能力可加速读取时间，TIRF优异的信号检测灵敏度可产生显着的灵敏度增益。图14所示实验的可行性，展现采用TIRF检测，以固相表面分析检测目标细菌的情形。此外，TIRF检测法具有发展多条路径分析的独特潜力，可同时检测多种目标细胞。 在测试此法时，将四个具独特序列的寡核甘酸固定于TIRF载玻片的四个不同区域(位置)。 四种目标物标注抗体，均含一个具独特序列的寡核甘酸，可与固定于某个位置上的寡核甘酸互补。当含目标细胞的样本与四种目标物的寡核甘酸标注抗体混合时，会被引入TIRF载玻片，于是就能藉由出现在位置(所含序列和目标物抗体标注寡核甘酸互补的已固定寡核甘酸)上的荧光信号，检测特定的目标细胞。在测试此项多条路径的TIRF分析时，每次只测试含一种目标物的样本，以确认可在正确位置检测到荧光信号。然后加入含各种比例目标细胞的混合物样本，以测试此多条路径分析正确描述复合物样本所含成分的能力。实例14 检测病毒的生物感应器设计如同致病菌般，迅速检测并确认病毒，是诊断、治疗和预防感染性疾病的要素。举例而言，迅速检测家禽的禽流感感染，是控制疾病爆发的关键。虽然远小于细菌细胞(举例而言，流行性感冒病毒的直径为80-120nm)，但病毒粒子的大小仍足以产生FRET信号(根据图2所示，为很多标注抗体和病毒表面的表位结合所造成的结果)。使用A型流行性感冒病毒和B型流行性感冒病毒作为模范目标物，探究四种感应器对病毒检测的适用性。我们向 BiosPacific (Emeryville, CA)公司购买伽玛射线钝化病毒和病毒特异性抗体。若上述的实验结果证实，采用图2所示感应器设计检测病毒的作法普遍可行，接着就会测试固相表面分析法的病毒检测性能。评估微量分析盘分析和TIRF分析这二种分析法，并利用这些数据测定最佳化分析的灵敏度、特异性和再现性(CV)，并利用这些参数， 评估以固相表面分析检测病毒的可行性。实例15 检测含一个重复性表位的蛋白质将抗人类铁蛋白抗体转换为一个分子生物感应器对(抗人类铁蛋白-A2-AA2-FAM 和抗人类铁蛋白-A2-AM-0yster)。将上述二个分子钳混入含0. lmg/ml牛血清白蛋白(BSA) 的缓冲液(TBS)，形成2倍分析混合液(根据寡核甘酸浓度计算，各分子螯为40nM)。将纯化的人类铁蛋白蛋白质标准液加入10 μ 1含0. lmg/ml BSA的TBS，稀释为浓度范围介于200nM 至OnM之间的溶液。在各样本(10μ1)中加入10μ1的2倍分析液。将分析盘放在室温(RT)下培养 40 分钟，并在 TECAN 盘式仪上记录 FRET 085nm/665nm)与 FAM085nm/535nm) 值。利用下列公式，根据原始荧光值计算荧光的相对倍数变化(RF)。其中RF=荧光相对倍数变化；FRETs =样本的FRET信号；FRETtl =样本中无目标物时的FRET信号；FRETb =背景 FRET信号(只有缓冲液)；FAMs =样本的FAM信号；FAMtl =样本中无目标物时的FAM信号； FAMb =背景FAM信号(只有缓冲液)。 FR = (FRETs-FRETb) (FAM0-FAMb) / (FRET0-FRETb) (FAMs-FAMb)。
权利要求
1.检测含至少一个重复性表位之目标物的方法，此法包含将含目标物的样本与分子生物感应器接触，此生物感应器包含R1-R2-R3-R4 ；与R5-R6-R7-R8 ；其中R1和R5为表位结合体，可与目标物上的重复性表位结合；R2为连接R1及R3的弹性连结元；R3和R7是一对互补核甘酸序列，在温度约21°C至40°C，且盐浓度约ImM至IOOmM的环境下，具有5. 5kcal/mole至8. Okcal/mole左右的连结自由能；R4和R8共同组成一种检测工具，当R3和R7连结时就会产生可检测到的信号；R6为连接R5及R7的弹性连结元；检测R3和R7连结所产生的信号。
2.第1项主张所述方法，其中目标物选自组成蛋白质、多肽、核酸、脂质、醣类和微生物的基团。
3.第1项主张所述方法，其中目标物为微生物，选自组成细菌、病毒或霉菌的基团。
4.第1项主张所述方法，其中R2和R6组成长约10至100个核甘酸的核甘酸序列。
5.第1项主张所述方法，R2分别与R1和R3形成键结，R6分别与R5和R7形成键结，其中所形成键结的自由能范围介于12. Okcal/mole与16. 5kcal/mole之间。
6.第5项主张所述方法，其中的键结为共价键。
7.第1项主张所述方法，其中R2和R6组成双功能化学交叉连结元。
8.第1项主张所述方法，其中R2和R6长约0至500埃。
9.第1项主张所述方法，其中R3和R7长约4至15个核甘酸。
10.第1项主张所述方法，其中R4和R8形成一组能量转移分子对，从而产生可检测到的信号。
11.第1项主张所述方法，其中检测工具选自组成FRET、荧光交叉相关光谱分析、荧光淬熄、荧光偏极化、流式细胞仪、邻近闪烁分析、冷光共振能量转移、直接淬熄、基态复合物形成、化学冷光能量转移、生物冷光共振能量转移、准分子形成、比色基质检测、磷光、电化学变化，和氧化还原电位变化的基团。
12.第1项主张所述方法，其中可于5分钟左右检测到约80%的最大信号。
全文摘要
此项发明包含检测含一个重复性表位之目标物的方法。
文档编号G01N33/542GK102317779SQ200980146720
公开日2012年1月11日 申请日期2009年11月19日 优先权日2008年11月21日
发明者T·海杜克, 田玲 申请人:圣路易大学, 百捷有限公司