专利名称：使用pigf-2和pigf-3标志物确定先兆子痫风险的方法
使用PIGF-2和PIGF-3标志物确定先兆子痫风险的方法
背景技术：
全世界每年至少有1亿2千6百万妇女生孩子。她们中超过2千万会遭受妊娠相关的并发症或疾病。例如，高血压症，比如先兆子痫(PE)影响了所有孕妇的10%以上，是母亲死亡的主要原因。充分的产前保健降低了这样的并发症和疾病未被发现的机会。虽然如此，但目前对于使用母体样品早期检测先兆子痫尚没有采用例行筛查。如果能够较早检测到PE、特别是早发型PE的发生的话，有可能在很多病例中得到较好的结果，包括降低严重度和甚至复原。妊娠早期或后期期间，对于PE发生风险评估或评估PE存在的可靠方法，将降低孕妇、婴儿或两者的负面健康结果的可能。存在于母体样品中的许多生物标志目前被认为与先兆子痫有关。目前建议将胎盘生长因子(PlGF)用于评估孕妇发生PE的风险(Akolekar等Q008)maternal serum placental growth factor at 11+0 to 13+6 weeks of gestation in the prediction of pre-eclampsia.(妊娠11+0至13+6周的母体血清胎盘生长因子对于先兆子痫的预测) Ultrasound Obstet Gynecol 32 :732-739)。虽然PlGF作为先兆子痫的可靠标志已经得到了一些认可，但希望有以更高的特异性和预测功效为特征的备选方案和其他的标志。
发明内容
本文描述的发明在一个方面提供了用于确定孕妇发生先兆子痫风险的方法。方法包括测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。在一个实施方案中，测定P1GF-2的水平。在这种情况下，样品中P1GF-2的水平相对于对照样品的增加指示发生先兆子痫的风险增加。在一个实施方案中，测定P1GF-3的水平。在这种情况下，对象样品中P1GF-3的水平相对于对照样品的降低指示发生先兆子痫的风险增加。在不同的实施方案中，使用PlGF同工型的组合。例如，在确定孕妇发生先兆子痫的风险时，可以使用P1GF-2和P1GF-3。其它示例性的PlGF同工型组合包括P1GF-2和 PlGF-I ；P1GF-3 和 P1GF-1 ；P1GF-1、P1GF-2 和 P1GF3。在其它实施方案中，当确定孕妇发生先兆子痫的风险时，使用生化标志物的比。在一个具体的实施方案中，确定P1GF-2/P1GF-3的比。在另一个实施方案中，确定P1GF-2/ PlGF-I的比。在这两个例子中，对象样品中相对于对照样品的比的差异指示发生先兆子痫的风险增加。在另外的实施方案中，P1GF-2和/或P1GF-3可以与先兆子痫、高血压、胎盘紊乱等等的一种或多种生化标志物组合使用。在具体的实施方案中，使用选自PAPP-A、PAI-1、 PAI-2、PlGF-U P1GF-4、PP13、VEGF165b和ADAM-12的一种或多种生化标志物。可用于检测先兆子痫的其它生化标志物也可与P1GF-2、P1GF-3和P1GF-2与P1GF-3两者组合使用。作为具体的例子，当在这样的组合中使用PlGF-I时，对象样品中的PlGF-I相对于对照样品的水平指示发生先兆子痫的风险增加。在另一个实施方案中，确定孕妇发生先兆子痫的风险的方法包括使用孕妇的一种或多种生物物理标志。将测得的生物物理标志与对照对象的相同生物物理标志相比较，其中孕妇每种生物物理标志的测量值相对于对照增加或降低，指示发生先兆子痫的风险增加。在一个实施方案中，生物物理标志是血压。在另一个实施方案中，生物物理标志是子宫动脉的搏动指数。本文描述的确定孕妇发生先兆子痫风险的方法，可以使用从妇女的妊娠前三个月或中三个月期间获得的样品来实施。在具体的实施方案中，样品在前三个月期间获得。在另一个实施方案中，在第二个三个月期间获得样品。在一个实施方案中，可以从妇女的一个或多个妊娠阶段获得一个或多个样品。还通过本文描述的发明提供了确定孕妇是否患有先兆子痫的方法。方法包括测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自 P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中对象样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫。在本方法的一个实施方案中，得到至少一种以下观察结果从对象获得的样品中 P1GF-2水平相对于对照样品中P1GF-2的水平增加；和/或从对象获得的样品中P1GF-3的水平相对于对照样品中P1GF-3的水平降低。在一个实施方案中，从对象获得的样品中P1GF-2/P1GF-1的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。在另一个实施方案中，从对象获得的样品中P1GF-2/ P1GF-3的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。在一个实施方案中，一个或多个样品可以从妊娠前三个月和/或第二个三个月的孕妇获得，比如在妊娠20-40周之间。本文描述的发明进一步提供了计算机程序，其在电脑上运行时，引起计算机执行确定孕妇中先兆子痫的风险或存在的过程。所述过程可以包括输入通过下述方式获得的至少一种生物标志i)分析从孕妇获得的样品的一种或多种生化标志物，其中至少一种生化标志物选自P1GF-2和P1GF-3 ；ii)将样品中所述一种或多种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫；和iii)根据比较结果确定先兆子痫风险的定量评价。在一个实施方案中，计算机程序可以进一步包括使用至少一种另外的生化标志物。在具体的实施方案中，所述一种或多种生化标志物可以选自PAPP-A、PAI-U PAI-2、 PlGF-I、VEGF165b、P1GF-4 和 ADAM-12。在又一个实施方案中，计算机程序可以包括输入通过测定对象的一种或多种生物物理标志获得的至少一种生物标志的测量值；将对象的一种或多种生物物理标志与对照对象的相同生物物理标志相比较，其中对象中一种或多种生物物理标志的测量值相对于对照增加或降低，指示发生先兆子痫的风险增加；和根据所比较的一种或多种生化标志物和所比较的一种或多种生物物理标志的结果，确定先兆子痫风险的定量评价。在具体实施方案中，生物物理标志可以选自血压和子宫动脉搏动指数。
在一个计算机程序的实施方案中，过程还可以包括确定先兆子痫风险的定量评价，其包括使用多变量分析确定先兆子痫的似然性，其中多变量分析包括使用来源于一组对照参考数据的生化标志物和分布参数的水平。在一个实施方案中，多变量分析是多变量高其jf (Gaussian)分析。本文描述的技术还提供了存储上面描述的计算机程序的计算机程序记录介质。本文描述的发明包括用于评估孕妇中先兆子痫的风险或存在的试剂盒或商业包装。在一个实施方案中，试剂盒提供了 i)至少两种可检测的结合配偶体，其中每种可检测的结合配偶体与选自PlGF-I、P1GF-2和P1GF-3的单个PlGF同工型特异性结合。在一个具体实施方案中，试剂盒提供i)与P1GF-2特异性结合的可检测结合配偶体；和ii)与选自PlGF-I和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。在另一个具体实施方案中，试剂盒提供i)与P1GF-3特异性结合的可检测结合配偶体；和ii)与选自PlGF-I和P1GF-2的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。在实施方案中，可检测的结合配偶体是抗体或其抗原结合片段。在又一个具体的实施方案中，试剂盒提供i)至少一种抗体或其抗原结合片段，其与选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合；和ii)在测定中使用抗体或抗原结合片段的说明书。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段与PlGF同工型的环3结构结合。在一个具体的实施方案中，抗体或其抗原结合片段与成熟P1GF-2中的IM至144位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 6)结合，或与成熟P1GF-3中的114至185位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 7)结合。在具体实施方案中，抗体或其抗原结合片段与选自HSPGRQSPDMP⑶FRADA(SEQ ID NO 8)和 PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO 9)的 P1GF-3 序列结合。在下文中，本发明将借助于详细说明并参考一些工作例来进一步描述。附图简述
图1显示了妊娠13至37周时母体血清中P1GF_2、P1GF_3以及P1GF_1、P1GF_2和 P1GF-3组合的水平。图2描述了相匹配的病例-对照研究的结果，其中取自无先兆子痫的妊娠女性的样品(对照，在图中通过三角形表示)和取自后来在妊娠中发生先兆子痫的妊娠女性的样品(病例，在图中通过交叉形表示)，用检测P1GF-2同工型的方法来测量。图3描述了相匹配的病例-对照研究的结果，其中取自无先兆子痫的妊娠女性的样品(对照，在图中通过三角形表示)和取自后来在妊娠中发生先兆子痫的妊娠女性的样品(病例，在图中通过交叉形表示)，用检测P1GF-3同工型的方法来测量。图4描述了 PlGF家族和亲缘物的氨基酸序列；在前体中的1至18位氨基酸代表信号序列(下划线)；在前体中的214至234位氨基酸、在P1GF-2中的IM至144位氨基酸、和在P1GF-4中的196至216位氨基酸代表肝素结合结构域(斜体)；在前体中的132至 204位氨基酸、在P1GF-3中的114至185位氨基酸、和在P1GF-4中的114至185位氨基酸代表未知功能的结构域(粗体)。发明的详细说明本发明涉及确定孕妇先兆子痫发生风险的方法，确定孕妇是否患有先兆子痫的方法，以及用于评估先兆子痫的风险或存在的抗体和试剂盒。本发明还提供了用于这些确定的计算机程序。本文描述的是利用选择性检测同工型P1GF-2和P1GF-3的至少一种，任选与包括 PlGF同工型比如PlGF-I和P1GF-4在内的其它生化标志物一起检测，并将所述至少一种生化标志物的水平与从对照样品获得的值进行比较。样品中生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示该妇女中先兆子痫的风险或存在。在值的水平上，取决于具体测试的生物标志，所述差异可以增加或减少。以前出版的研究已经显示，较低水平的PlGF-I指示先兆子痫的发生。在这些研究中使用的测量方法看起来主要检测了 PlGF-I，但在至少一些病例中，与其它PlGF同工型有显著的交叉反应性(参见实施例幻。在按照本文描述选择性测定同工型P1GF-2和P1GF-3 的水平时，意外发现，样品中的P1GF-2水平相对于对照样品增加。另外发现，样品中P1GF-3 的水平相对于对照样品降低。如本文的描述，现在已经认识到，测量母体样品中特定的同工型PlGF可用于较好确定孕妇发生先兆子痫的风险。在实验室测试中，分析靶PlGF同工型可以提供更特异性的结果，因为可以减少或消除由于存在非靶PlGF同工型产生的背景信号。因此，相对于采用非选择性PlGF检测的实验室测试，通过检出率增加和假阳性率降低，将改进筛查性能。还认识到，对象样品中PlGF同工型的比、例如P1GF-2/P1GF-3和/或P1GF-2/P1GF-1相对于对照样品的差异，可以用作发生先兆子痫的风险增加的指示。如果需要，也可以使用PlGF 同工型例如P1GF-2或PlGF与另一种生化标志物的比。同工型P1GF-2和/或P1GF-3的选择性检测，任选与另一种PlGF同工型、例如 PlGF-I或P1GF-4或两者一起检测，可以与任何其它合适的生化标志物或用于评估先兆子痫发生风险的其它指示物相组合。这样的生化标志物，例如，选自PAPP-A、PAI-U PAI-2、 PlGF-I、P1GF-4、PP13、VEGF165b 和 ADAM-12。同工型P1GF-2和/或P1GF-3的选择性检测，任选与另一种PlGF同工型一起检测， 还可以与任何其它合适的用于评估先兆子痫发生风险的生物物理标志相组合。这样的生化标志物是，例如，血压和子宫动脉搏动指数。在本文使用时，术语“先兆子痫”是指部分以妊娠高血压和蛋白尿为特征的妊娠病。对于以前血压正常的妇女，PE典型被定义为有蛋白尿的妊娠高血压，严重的PE典型定义为严重的有蛋白尿的妊娠高血压。对于长期高血压的妇女，叠加PE典型定义为新发生的蛋白尿。可用于作出PE诊断的PE的方面可以根据不同的医疗组织设定的方针来分类。例如，根据国际妊娠高血压研究协会(International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy)的方针(Davey 等，Am. J. Obstet Gynecol ；158 ；892098, 1988)，妊娠高血压被描述为在相隔至少4h的两次记录中，舒张压在90mmHg以上，严重的高血压被描述为在相隔至少4h的两次记录中，舒张压至少IlOmmHg,或一次记录舒张压至少 120mmHg。蛋白尿经常被描述为在24h中排出300mg或更高，或者如果没有24h收集的话，在中段或导管尿样本的试纸分析中，两次读数为更高。妇女一般在妊娠20周之前，被分类为以前血压正常或有长期高血压。了解先兆子痫并在本文中应该被定义为包含在和属于先兆子痫病的范畴内，所述范畴包括胎盘功能不全、胎儿宫内生长迟缓、早期流产、早产、 死胎和子痫。虽然不希望受到理论制约，但已经提出了胎儿宫内生长迟缓反映了孕妇身体对于应对先兆子痫状况的适应，这样允许胎儿存活。另一方面，早期流产和早产可以反映出孕妇身体对于应对先兆子痫状况的适应，这样允许孕妇存活。在这种情形下，宫内死亡是这种适应的失效。因此，本文描述的用于确定先兆子痫风险的方法包括、并且也可以用来确定先兆子痫范畴上先兆子痫病的风险。根据本发明的一个实施方案，用于确定孕妇发生先兆子痫风险的方法，包括i)测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。根据本公开内容的用于确定孕妇发生先兆子痫的风险或患有先兆子痫的方法，是一种体外方法。这是指该方法在孕妇(本文也称为患者或对象)的身体外进行。在使用本文描述的方法确定了妊娠个体发生先兆子痫的风险增加的情况下，所述个体可以从保健提供者接受治疗或生活方式建议。虽然先兆子痫没有广泛使用的疗法，但各种研究已经显示了用例如抗高血压药物诸如硫酸镁、阿司匹林、地西泮和苯妥英、以及营养增补剂诸如维生素D、钙和硒治疗的益处。可用于实施本文描述的方法的样品通常包括其中存在PlGF同工型的组织和流体。样品可以是包含选定的生化标志物的任何体液或组织样品。便于获得的典型样品是体液，例如从孕妇获得的血液和它的级分诸如血清和血浆、痰或尿。也可以使用从孕妇获得的组织样品，或从孕妇获得的细胞，包括已经置于细胞培养或在细胞培养中扩增的细胞。可用于本文描述的方法的其它示例性生物样品包括羊水、绒毛膜绒毛活检组织、胎盘活检组织和宫颈阴道液。另外，已经保存、例如通过冷冻或干燥(例如在血卡格式上)的样品，适合用于本文描述的方法中。实施例1描述了血清形式的母体血液的使用。样品的选择经常取决于检验标志的量的具体临床实验室可用的分析形式。例如，一些分析形式缺乏分析全血所需的灵敏度，使得临床实验室选择测试血液的级分，例如血清，或使用干血。在某些情况中，生物样品可以不止一次从孕妇收集，例如，当她的高血压和/或胎盘病症需要监测先兆子痫由于先验的风险而发生、显示出症状和/或其它因素时。本文描述的确定先兆子痫风险的方法，还可以用于监测正在经历高血压和/或胎盘病症的疗法或治疗的妊娠个体。如果需要，生化和/或生物物理标志的测试可以在家庭环境下实施，例如通过使用试纸生化测试形式和家用自动血压器。可以在妊娠的前三个月或第二个三个月期间、或在这两个三个月期间，执行PlGF 同工型和其它生化标志物的测定。然而，能够在妊娠的前12周内检测发生先兆子痫的高风险，将为保健提供者提供更多的来提供孕妇的防护策略。在妊娠早期完成风险评估往往是理想的，有时间进行衡量以防止或延迟PE病症在女性中发生。因此，根据本发明的一个实施方案，在妊娠的前三个月期间取样。这通常是指在妊娠的1至13周。根据本发明的另一个实施方案，在妊娠的第二个三个月取样。这通常是指在妊娠的14至沈周。先兆子痫可以早在妊娠20周发生，当它在妊娠大约32-34周之前发生时，通常被视为“早期先兆子痫”，而当它在妊娠大约32-34周后发生时，为“晚期先兆子痫”。早期先兆子痫与发病率增加相关，因此被认为是更重型的先兆子痫。本文描述的确定PE风险的方法可用于筛查“早期先兆子痫”和“晚期先兆子痫”。如本文所述，例如在实施例1中，在不到妊娠22周(含)、并且甚至不到妊娠13周期间，确定先兆子痫风险的方法是有效的。因此，为了在检测先兆子痫的方法中使用，可以在妊娠大约11至37周(含)、包括大约11至 20周(含)之间收集样品，更通常在大约20周之前、大约10周后前三个月之内、第二个三个月之内和第三个三个月之内。虽然从公众健康的远景而言，尽早测试往往是有益的策略， 但要理解，样品采集有时可能受实际情况的影响，例如女性耽搁到她的保健提供者处就诊， 直至相对较晚的妊娠周数。在一个实施方案中，本文描述的方法可以包括测定个体的血压。可以使用妊娠个体的收缩血压、舒张血压和平均动脉血压中的一种或多种。平均动脉压(MAP)是指在一个心动周期中的平均血压，其使用规定的程序，通过心输出量(CO)、全身血管阻力(SVR)和中央静脉压(CVP)来测定。保健提供者可以使用任何方法测量妊娠个体的血压，包括，例如触诊法、听诊法和示波法。也可以使用血压自动测量仪器。在一个实施方案中，本文描述的方法也可以包括测定子宫动脉搏动指数(PI)。“子宫动脉搏动指数”是指动脉血流速波形指数，其用来量化波形的搏动或振荡。已经发现在有舒张期逆流、即双向流的临床病例中，PI 特别有用。妊娠个体的PI可以使用任何已知的方法测量。例如，可以通过经阴道或经腹途径执行子宫动脉多普勒超声检查法。子宫动脉是第一个借助于颜色多普勒超声检查法鉴别的。然后可以使用脉冲波多普勒超声检查法获得波形。然后可以计算各种指标。例如，PI 可以按照峰值收缩流量减去终末期舒张流量除以平均流量来计算。虽然不希望受到理论制约，但有证据说明先兆子痫是母体螺旋动脉的滋养细胞不良浸润的后果。多普勒超声可以评估母体子宫动脉中的血流模式，并鉴别孕妇有滋养细胞不良浸润。本文描述的方法包括测定样品中PlGF同工型的水平或量。缩写“P1GF”是指胎盘生长因子。PlGF在1991年首次从人类妊娠期胎盘cDNA文库中克隆。其它组织例如心脏、肺、肌肉和脂肪组织中也已经检测到P1GF。PlGF属于蛋白质的血管内皮细胞生长因子 (VEGF)家族。它与VEGF-A具有大约50%的中等序列相似性。可变剪接产生了大小不同的四种同工型，其中PlGF-I和P1GF-2被认为是主要同工型。PlGF-I (SEQ ID NO 2)包含131 个氨基酸(MW 单体 14. 7kDa, 二聚体 29. 4kDa)。P1GF-2 (SEQ ID NO :3)包含 PlGF-I 而且插入了 21个氨基酸的肝素结合位点(MW单体17. 3kDa，二聚体34. 6kDa)。因此，全长P1GF-2 蛋白质的长度是152个氨基酸。P1GF-3(SEQ ID NO 4)包含PlGF-I和在C-端附近插入的 72个氨基酸(MW =单体22. 8kDa, 二聚体45. 6kDa)。因此，全长P1GF-3蛋白质的长度是203 个氨基酸。P1GF-4(SEQ ID NO 5)包含P1GF-3和插入的21个氨基酸的肝素结合位点(MW =单体26. 2kDa, 二聚体52. 4kDa)。因此全长P1GF-4的长度是2 个氨基酸。图4归纳了 PlGF家族和亲缘物的氨基酸序列。在前体SEQ ID N0:1(登记号 P49763)中，1至18位氨基酸代表信号序列，132至203位氨基酸代表未知功能的结构域， 和前体中的214至234位氨基酸代表肝素结合结构域。在P1GF-2(SEQ ID N0:3)中，1 至144位氨基酸代表肝素结合结构域(SEQ ID NO :6)。在P1GF_3(SEQ ID NO 4)中，114至 185位氨基酸代表未知功能的结构域(SEQ ID NO :7)，本文称为“环3”。在P1GF_4(SEQ ID NO 5)中，114至185位氨基酸代表环3，196至216位氨基酸代表肝素结合结构域。“测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型”是指选定的同工型通过特异性评估从孕妇获得的样品和对照样品中所提到的同工型水平的方法来测定。样品中存在的生化标志物的水平或量可以使用适于测量生物样品中蛋白质的任何分析形式来测定。用于该目的的通用分析形式是免疫分析，包括，例如酶免疫分析(EIA)诸如酶放大免疫分析技术(EMIT)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、IgM抗体捕获ELISA (MAC ELISA)和微粒子酶免疫分析(MEIA)；毛细管电泳免疫分析(CEIA)；放射免疫分析(RIA)；免疫放射分析(IRMA)；荧光偏振免疫分析 (FPIA)；解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)和化学发光分析(CL)。本发明的方法在本文中通过使用同工型特异性的DELFIA夹心免疫分析作举例说明。DELFIA是非均相时间分辨荧光分析法，其在使用增强步骤的方案中包括测量发自镧系元素螯合物的信号。该方法用于测量特定同工型P1GF-1、P1GF_2和P1GF-3。所述分析中的捕获抗体是生物素化的，检测抗体是铕标记的。在这些分析中可以使用PlGF同工型特异性抗体，可以是商业单克隆抗体或定制的抗体。为了制备识别P1GF-3并且基本上不识别 PlGF-I或P1GF-2的抗体，将动物用包含肽的抗原免疫，所述肽含有选自P1GF-3的环3的氨基酸序列(氨基酸 HSPGRQSPDMPGDFRADAPSFLPraRSLPMLFRMEWGCALTGSQSAVWPSSPVPEEIPRMH PGRNGKKQQRK ；SEQ ID NO :7)。产生 P1GF-3 选择性抗体(相对于 P1GF-2 和 P1GF-3)的具体氨基酸序列包括 HSPGRQSPDMPGDFRADA(SEQ ID NO :8)和 PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO: 9)。市场上可买到的P1GF-1、P1GF_2或P1GF-3蛋白质可以用作PlGF同工型标准品。测量可以通过时间分辨荧光计，采用厂家设定的DELFIA方案来执行测定样品中多肽和其它生物标志的量的典型分析形式包括使用对照多肽，尤其当对这些多肽的量的水平进行定量时。市场上可买到的蛋白质，例如P1GF-1、P1GF-2、P1GF_3 和其它生物标志，可以在测量生化标志物水平的分析中用作标准品。或者，用于例如在原核和真核生物体系中表达蛋白质的方法、和合成多肽的方法是众所周知的。全长蛋白质和其片段可以用作标准品来定量测定从孕妇获得的样品中生物标志的水平。PlGF同工型的核苷酸序列是已知的，并在科学论文中公开=PlGF-I =Maglione等1991. Isolation of a human placenta cDNA coding for a protein related to the vascular permeability factor (编码与血管通透因子相关的蛋白的人类胎盘cDNA的分离)；P1GF-2 =Hauser等，A heparin-binding form of placental growth factor(P1GF-2) is expressed in human umbilical vein endothelial cells and in placenta(13^ ^^ ^^Inii^feixISi1 (P1GF-2)在人类脐静脉内皮细胞和胎盘中表达)；P1GF-3 :Cao等(1997) Placental growth factor-identification and characterization of a novel isoform generated by RNA alternative splicing(胎盘生长因子通过RNA可变剪接产生的新的同工型的鉴别和表征)。这些序列为本领域技术人员提供了表达PlGF多肽的指导，供本文描述的方法使用。“对照样品”在这里是指在妊娠的相同三个月期或孕龄时从对象获得的样品，其中所述妊娠被证实有涉及先兆子痫的特定结果。典型地，“对照样品”已被证实没有发生先兆子痫(参见本文实施例)，但是可以使用被证实发生了先兆子痫的对照样品。该术语在这里被定义成包括一个或多个样品，以便对照样品可以是从群体获得的一组样品。妊娠对照的选择可以通过生物物理参数、例如母体年龄、体重指数、种族和孕龄，与先兆子痫病例匹配。“发生先兆子痫的风险增加”是指对象(孕妇)发生先兆子痫的似然性在高于未发生PE的孕妇对照组的水平上。简单地说，本文描述的确定孕妇先兆子痫风险的方法的示例性版本可以通过从所述孕妇取得血样来执行。需要的话，可以处理血液，制备血浆或血清。对选定的PlGF亚单位的分析将使用对于PlGF同工型、例如P1GF-2或P1GF-3有选择性的抗体，采用标准免疫分析进行。实例是利用酶联免疫吸附分析(ELISA)，其中在试样中的显色强度与存在的标志物浓度成正比。根据该测试，可以计算PlGF同工型的水平。需要的话，这种水平可以独立用于风险算法，或与其它标志物的水平相结合。为了设计风险算法，可以使用对假定的PE 的％发病率进行调节的数据集的标准逻辑回归分析。为了确定生化标志物的量是否大于或小于正常值，要测定存在于来自相关群体的母体生物样品中的生化标志的正常量。相关的群体可以根据可以影响标志的正常(未受患的)量的任何特征来定义。为了确定先兆子痫的风险，可以在先兆低风险的基础上建立相关的群体。一旦知道了正常的标志量，可以将测定的标志进行比较，并使用标准统计方法确定差异的显著性。当在测定的标志量和正常量之间的差异有统计显著性时，被测个体将有发生先兆子痫的显著风险。将样品中选定的生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较。样品中生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫的风险增加。差异是指所述值的统计显著性差异。存在任何同工型的“水平增加或降低”是指任何特定同工型的水平统计上显著地偏离对照样品中同样同工型的水平，高于或低于对照样品中的水平。为了在先兆子痫的例行筛查中分析单个样品的测量结果，首先需要对照群体的数据。该数据通过测量许多样品、优选每一孕周100个以上样品的选定的PlGF同工型而获得。 选定的同工型的实测浓度然后优选进行IoglO转变，来制作高斯生物差异的分布。随后，针对对照数据的每一孕周确定每种选定的同工型的中位数浓度和标准差。然后，任何单个样品的结果可以与适当的中位数浓度相比，以确定选定的同工型的浓度是否不同于它们的正常值。这种比较可以用作计算患者先兆子痫风险的基础或作为作出先兆子痫诊断的基础。还可以进行匹配的病例-对照研究，以证明生化标志物例如PlGF同工型的性能。 在这样的研究中，使用生理参数与先兆子痫病例群体匹配的对照群体。因此，可以使用稍有不同的方法来计算这样的研究与例行筛查相比的结果。这种研究在实施例1中举例说明。根据本公开内容，如果得到至少一种以下观察结果，则孕妇发生PE的风险增加1.样品中P1GF-2的水平相对于对照样品增加；2.对象样品中P1GF-3的水平相对于对照样品降低；3.确定P1GF-2/P1GF-3的比，观察对象样品中的比相对于对照样品的差异。典型地，所述比是增加的；4.确定P1GF-2/P1GF-1的比，观察对象样品中的比相对于对照样品的差异。典型地，所述比是增加的。特别是在妊娠的第二个三个月期间，观察到所述比增加。本文描述的方法可以与测定一种或多种生化标志物相组合，所述标志选自 PAPP-A, PAI-1、PAI-2、P1GF-1、P1GF-4、ADAM-12, PP13 和 VEGF165b。在本文使用时，术语“PAPP-A”是指锌结合金属蛋白酶(metzincin metalloproteinase)，其已知被称为妊娠相关的血浆蛋白A并具有与GenBank登录号 AAH78657同源的氨基酸序列。在本文使用时，术语“PP13”是指胎盘蛋白13，亦称半乳糖凝集素-13，其具有与GenBank登录号NP_037400同源的氨基酸序列。在本文使用时，术语“PAI-1”是指纤溶酶原激活物抑制剂1，亦称PAI和内皮纤溶酶原激活物抑制剂，并与 UniProt登录号P05121同源的氨基酸序列。在本文中使用时，术语“PAI-2”是指纤溶酶原激活物抑制剂2，亦称胎盘纤溶酶原激活物抑制剂、单核细胞精氨酸-丝氨酸蛋白酶抑制剂和尿激酶抑制剂，并具有与UniProt登录号P05120同源的氨基酸序列。在本文中使用时， 术语ADAM-12是指含解整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白12，亦称解联蛋白酶-α，并具有与UniProt登录号043184同源的氨基酸序列。在本文中使用时，术语“VEGF 16 ”是指血管内皮生长因子剪接变体165b，并具有与UniProt登录号P15692-8同源的氨基酸序列。当一种或多种生化标志物与对照对象的相同生化标志物相比较时，孕妇生化标志物的测量值相对于对照增加或降低，指示发生先兆子痫的风险增加。本文描述的方法也可以与测定一种或多种生物物理标志相组合，所述生物物理标志选自血压和子宫动脉搏动指数。当一种或多种生物物理标志与对照对象的相同生物物理标志相比较时，孕妇生物物理标志的测量值相对于对照增加或降低，指示发生先兆子痫的风险增加。本文描述的检测方法也可以用于诊断先兆子痫。证实孕妇患有先兆子痫典型地可以在妊娠第二个三个月或第三个三个月期间进行，例如在妊娠的20至40周，在一些情况下甚至在20周之前。根据本发明的另一个实施方案，提供了确定孕妇是否患有先兆子痫的方法，方法包括i)测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中对象样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫。根据本公开内容，如果得到至少一种以下观察结果，则孕妇患有PE 1.从对象获得的样品中P1GF-2的水平相对于对照样品中P1GF-2的水平增加；2.从对象获得的样品中P1GF-3的水平相对于对照样品中P1GF-3的水平降低；3.观察到从对象获得的样品中P1GF-2/P1GF-1的比相对于对照样品有差异；4.观察到从对象获得的样品中P1GF-2/P1GF-3的比相对于对照样品有差异。典型地，在从对象获得的样品中，P1GF-2/P1GF-1的比和P1GF-2/P1GF-3的比相对于对照样品均增加。确定孕妇是否患有PE在妊娠20-40周期间进行。确定孕妇是否患有先兆子痫的方法可以与选自PAPP-A、PAI-I、PAI-2、PP13、 VEGF165b, PlGF-I和P1GF-4的一种或多种生化标志物相组合。本文描述的方法也可以与测定一种或多种生物物理标志相组合，所述生物物理标志例如血压和子宫动脉搏动指数。根据本发明的另一个实施方案，提供了计算机程序，其在电脑上运行时，引起计算机执行确定孕妇是否有发生先兆子痫的风险或确定所述病症存在的过程，其中所述过程包括输入通过下列方法获得的至少一种生化标志物的测量值1)分析从孕妇获得的样品中的一种或多种生化标志物，其中至少一种生化标志物
13选自 P1GF-2 和 P1GF-3 ；ii)将样品中所述一种或多种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较，其中样品中一种或多种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫；和iii)根据比较结果，确定先兆子痫风险的定量评价。计算机程序还可以包括分析选自PAPP-A、PAI-l、PAI-2、ADAM-12、PP13、VEGF165b、 PlGF-I和P1GF-4的至少一种生化标志物。计算机程序还可以包括输入通过测定对象的一种或多种生物物理标志获得的至少一种生物标志的测量值；将对象的一种或多种生物物理标志与对照对象的相同生物物理标志相比较，其中对象中所述一种或多种生物物理标志的测量值相对于对照增加或降低， 指示发展先兆子痫的风险增加。根据所比较的一种或多种生化标志物和所比较的一种或多种生物物理标志的结果，确定先兆子痫风险的定量评价。计算机程序还可以包括使用选自血压和子宫动脉搏动指数的生物物理标志。确定先兆子痫风险的定量评价包括使用多变量分析确定先兆子痫的似然性。多变量分析包括使用来源于对照参考数据组的生化标志物和分布参数的水平。多变量分析优选是多高斯变量分析。本发明还提供存储本文描述的计算机程序的计算机程序记录介质。本发明提供用于评估孕妇发生先兆子痫的风险或先兆子痫的存在的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含i)至少两种可检测的结合配偶体，其中每种可检测的结合配偶体与选自P1GF-1、P1GF-2和P1GF-3的单个PlGF同工型特异性结合。在另一个实施方案中，试剂盒可以包括i)与P1GF-2特异性结合的可检测结合配偶体；和ii)与选自PlGF-I 和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。在又一个实施方案中，试剂盒可以包括i)与P1GF-3特异性结合的可检测结合配偶体；和ii)与选自PlGF-I和P1GF-2 的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。用于本文描述的试剂盒的可检测结合配偶体可以是，例如，抗体或其抗原结合片段。也可以使用用于检测蛋白-蛋白相互作用的其它结合配偶体。本发明还提供评估孕妇发生先兆子痫的风险或先兆子痫的存在的试剂盒。试剂盒可以包括i)至少一种抗体或其抗原结合片段，其与选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合；和ii)在测定中使用抗体或抗原结合片段的说明书。说明书是指如何使用抗体或抗原结合片段进行测定的方针。说明书中可以提供试剂体积、温育时间、反应条件等。抗体或其抗原结合片段可以与同工型的特定结构结合，所述特定结构可以是其中的氨基酸的线性序列、折叠多肽的氨基酸序列、和任何翻译后修饰。在一个实施方案中，对 P1GF-2有选择性的抗体或抗原结合片段可以与成熟P1GF-2中IM至144位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 6)结合。在一个实施方案中，对P1GF-3有选择性的抗体或抗原结合片段可以与成熟P1GF-3中114至185位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 7)结合。本文描述的方法涉及使用实验室测试程序选择性检测PlGF的同工型。这样的测试将使用能够选择性检测PlGF同工型的试剂。这样的试剂不会显著检测非靶PlGF同工型、完整PlGF和其它分子。能够选择性检测PlGF同工型的示例性试剂是对mGF-1、P1GF-2、P1GF-3, P1GF-4或其它PlGF同工型有选择性的抗体。选定的同工型水平的评估使用例如免疫方法进行，其中抗体与选定的同工型特异性结合。可以选择性产生针对完整同工型的抗体，并选择特异性针对同工型的特定结构例如环3结构的那些抗体。或者，可以产生针对每种同工型的同工型特定结构、例如环3结构的抗体。制备和表征抗体的方法在本技术领域是公知的(参见，例如Harlow和Lane，1988 Harlow, Ε. & Lane, D. Antibodies :A Laboratory Manual.(抗体实验室手册)Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，1988，pl4 (在此引为参考)。生成mAbs的方法通常沿着与制备多克隆抗体相同的路线开始。简单说，多克隆抗体通过用一种或多种PlGF蛋白同工型免疫动物、并从该免疫动物收集抗血清来制备。可以使用大范围的动物种类来生产抗血清。典型的用于生产抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。MAbs容易通过使用公知的技术制备，例如在美国专利No. 4，196，265中例举的那些技术，在此引为参考。 典型地，所述技术包括用选定的免疫原组合物免疫合适的动物。免疫组合物以有效刺激产生抗体细胞的方式施用。啮齿类动物例如小鼠和大鼠是普遍使用的动物，但是，使用兔子、绵羊或蛙细胞也是可能的。本文描述的是能够将特定同工型相互区分开的具体PlGF 同工型特异性抗体。妊娠个体发生先兆子痫的风险可以根据在患者群体研究中收集的临床数据，使用统计分析从生化标志物的量来确定。有多种统计方法用于将表征妊娠个体的参数、例如生化标志物的量进行组合，以获得风险评价。似然法O^alomaki和Haddow，Am. J. Obstet. Gynecol. 156,460-3(1987))和线性判别函数法(Norgarrd-Pedersen 等 Clin. Genet. 37， 35-43(1990))通常用于这一目的。因而，本文描述的用于确定风险的方法可以基于使用众所周知的统计方法，其中截止值或MoM用于确定风险。为了概述风险确定的示例性方法，似然法的基本原理在于参数(例如生化标志物的量)的群体分布对于'未患的'和'患的'组是已知的。因此，对于任何给定的参数(标志的量和血压读数)，可以计算'未患的'和'患的'的成员的似然性。根据群体平均数和标准差，似然性作为参数的高斯高度计算。,似然比'是使用'未患的'和'患的'群体参数计算的高度比，并且相对于先前的风险，是患病风险增加的表示。利用通过使用已知方法的临床种群研究衍生的公式，可以计算女性具有先兆子痫或怀有染色体异常的胎儿的先验似然性(其是与先前的风险相关的统计表示，在下文中描述)。这些先验似然性可以使用似然比修改，以导出可以用于先兆子痫风险评价的后验似然性。使用似然法预测胎儿有染色体异常的风险的详细说明可以应用于预测先兆子痫的风险，并且在例如"Screening for Down' s Syndrome (唐氏综合征筛查)，“J. G. Grudzinskas，T. Chard，M. Chapman 和 H. Cuckle编著；Cambridge University Press出版，1994)中阐述。也可以使用本文描述的方法，使用观察到的似然比分布来确定风险(参见，例如，Spencer等Arm. Clin. Biochem.， 29,506-18(1992))ο作为确定孕妇发生先兆子痫风险的方法的例子，可以从已知已经患有先兆子痫的妇女群体收集样品。分析这些样品以确定一种或多种PlGF同工型的水平。所测定的 PlGF同工型水平然后将典型地变为特定针对同样孕龄、母体重量、种族、吸烟状态、受孕方法和同等性的妊娠的多个预期正态中位数(MoM)。然后使用众所周知的统计回归方法用于风险计算(参见，例如Draper等Applied Regression Analysis (3th ed.)(应用回
15归分析)Wiley :New York, NY, 1998 ；禾P Cuckle HS 等，Estimating a woman s risk of having a pregnancy associated with Down' s syndrome using her age and serum alphafetoprotein level (使用女性的年龄和血清甲胎蛋白水平评价其妊娠具有与唐氏综合征有关的风险).Br. J Obstet Gynacol 1987 ;94 :387-402 ；和上面的其它参考文献)。以前的报告表明，母体血液中的PlGF水平可以用作唐氏综合征的预报因子。因此预计检测母体样品中一种或多种特定的PlGF同工型，可以用于检测胎儿染色体异常。下列编号的段落各简明地界定了本发明的一种或多种示例性变体1.确定孕妇发生先兆子痫风险的方法，包括i)测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。2.根据1的方法，其中测定P1GF-2的水平，并且其中样品中P1GF-2的水平相对于对照样品的增加指示发生先兆子痫的风险增加。3.根据1或2的方法，其中测定P1GF-3的水平，并且其中对象样品中P1GF-3的水平相对于对照样品的降低指示发生先兆子痫的风险增加。4.根据1至3任一项的方法，其中确定P1GF-2/P1GF-3的比的差异，并且其中从对象样品中的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。5.根据1至4任一项的方法，其中测定P1GF-3的水平，并且其中对象样品中 P1GF-3的水平相对于对照样品的降低指示发生先兆子痫的风险增加。6.根据1至5任一项的方法，其中测定P1GF-2的水平，并且其中对象样品中 P1GF-2的水平相对于对照样品的增加指示发生先兆子痫的风险增加。7.根据1至6任一项的方法，其中至少一种生化标志物选自PAPP-A、PAI_1、 PAI-2、PlGF-I 和 ADAM-12。
8.根据1至7任一项的方法，其中测定PlGF-I的水平，并且其中对象样品中 PlGF-I的水平相对于对照样品的降低指示发生先兆子痫的风险增加。9.根据1至8任一项的方法，其中确定P1GF-2/P1GF-1的比，并且其中对象样品中的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。10.根据1至9任一项的方法，其中样品从对象的妊娠前三个月期间获得。11.根据1至10任一项的方法，其中样品从对象的妊娠第二个三个月期间获得。12.根据至11任一项的方法，还包括测定孕妇的一种或多种生物物理标志，将一种或多种生物物理标志中的每一种与对照对象的相同生物物理标志相比较，其中孕妇每种生物物理标志的测量值相对于对照的增加或降低，指示发展先兆子痫的风险增加。13.根据1至12任一项的方法，其中生物物理标志选自血压和子宫动脉搏动指数。14.确定孕妇是否患有先兆子痫的方法，包括i)测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型；ii)将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中对象样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫。15.根据14的方法，其中进行至少一种下列观察从对象获得的样品中P1GF-2的水平相对于对照样品中P1GF-2的水平增加；和从对象获得的样品中P1GF-3的水平相对于对照样品中P1GF-3的水平降低。16.根据14或15的方法，其中从对象获得的样品中P1GF-2/P1GF-1的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。17.根据14至16任一项的方法，其中从对象获得的样品中P1GF-2/P1GF-3的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。18.根据14至17任一项的方法，其中样品在孕妇妊娠的20_40周期间获得。19.计算机程序，其在电脑上运行时，引起计算机执行确定孕妇中先兆子痫的风险或存在的过程，所述过程包括输入通过下列方法获得的至少一种生化标志物的测量值1)分析从孕妇获得的样品中的一种或多种生化标志物，其中至少一种生化标志物选自 P1GF-2 和 P1GF-3 ；ii)将样品中所述一种或多种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较，其中样品中一种或多种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫；和iii)根据比较结果，确定先兆子痫风险的定量评价。20.根据19的计算机程序，还包括分析选自PAPP-A, PAI-U PAI-2、PlGF-I和 ADAM-12的至少一种生化标志物。21.根据19或20的计算机程序，还包括输入通过测定对象的一种或多种生物物理标志获得的至少一种生物标志的测量值；将对象的一种或多种生物物理标志与对照对象的相同生物物理标志相比较，其中对象中一种或多种生物物理标志的测量值相对于对照的增加或降低，指示发生先兆子痫的风险增加；和根据比较的一种或多种生化标志物和比较的一种或多种生物物理标志的结果，确定先兆子痫风险的定量评价。22.根据19至21任一项的计算机程序，其中生物物理标志选自血压和子宫动脉搏动指数。23.根据19至22任一项的计算机程序，其中确定先兆子痫风险的定量评价包括使用多变量分析确定先兆子痫的似然性，并且其中多变量分析包括使用来源于对照参考数据组的生化标志物和分布参数的水平。24.根据19至23任一项的计算机程序，其中所述多变量分析是多变量高斯分析。25.计算机程序记录介质，其存储根据19至M任一项的计算机程序。26.评价孕妇中先兆子痫的风险或存在的试剂盒，其包含i)至少两种可检测的结合配偶体，其中每种可检测的结合配偶体与选自P1GF-1、 P1GF-2和P1GF-3的单个PlGF同工型特异性结合。
27.根据沈的试剂盒，其包含i)与P1GF-2特异性结合的可检测结合配偶体，和ii)与选自PlGF-I和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。28.根据26或27的试剂盒，其包含i)与P1GF-3特异性结合的可检测结合配偶体，和ii)与选自PlGF-I和P1GF-2的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。29.根据沈至观任一项的试剂盒，其中可检测的结合配偶体是抗体或其抗原结合片段。30.评价孕妇中先兆子痫的风险和存在的试剂盒，其包含i)至少一种抗体或其抗原结合片段，其与选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合；ii)在测定中使用抗体或抗原结合片段的说明书。31.根据沈至30任一项的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与PlGF同工型的环3结构结合。32.根据沈至31任一项的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与成熟P1GF-2中的IM至144位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 6)结合，或与成熟P1GF-3中的114至185 位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 7)结合。33.根据沈至32任一项的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与选自 HSPGRQSPDMPGDFRADA(SEQ ID NO 8)和PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO 9)的P1GF-3序列结合。
实施例实施例1本实施例描述母体血清中P1GF-2的水平在发生先兆子痫的对象中增加，同时母体血清中P1GF-3的水平在发生先兆子痫的对象中降低。为了测量(a)PlGF-2 ;(b)PlGF-3 ；和(C)P1GF_1、P1GF_2 和 P1GF-3 的组合，建立了 PlGF同工型专门的DELFIA夹心分析。在从后来发生先兆子痫的孕妇和未患先兆子痫的孕妇获得的血清中，测量PlGF 同工型。从每位妇女两次抽取血样一次在妊娠的前三个月期间，第二次在第二个三个月期间。将血液管离心并收集和等分血清。这些等分样储存在_20°C。选择的未受患的妊娠对照组通过生物物理参数例如母体年龄、体重指数、种族和孕龄与先兆子痫妊娠病例进行匹配。P1GF-2和P1GF-3浓度在分开的分析中从八个不同的先兆子痫病例样品和16个匹配的对照样品中测量。从这些结果完成统计分析。在这些分析中，PlGF同工型特异性抗体是商业单克隆抗体或定制抗体。分析中的捕获抗体是生物素化的，检测抗体用DELFIA铕螯合物标记。在200 μ 1体积中0. 2 μ g生物素化的同工型特异性抗体在链亲和素包被的微量滴定板中25°C温育30min。洗涤后，添加 100 μ 1血清妊娠样品或者PlGF标准品，温育2小时。PlGF标准品是商业P1GF-1、P1GF-2 或P1GF-3蛋白。孔再次洗涤并添加在200 μ 1体积中的0. 2 μ g Eu-抗P1GF，温育1小时。 孔洗涤后，添加增强溶液，产生Eu信号。通过时间分辨荧光计(Victor 2)，使用厂家设定的DELFIA Eu方案，在615nm执行测量。图1 显示的浓度中，(a)PlGF-2 为“X”; (b)P1GF-3 为正方形；和(c)P1GF-1、P1GF_2 和P1GF-3为三角形。在各例中测量的PlGF同工型浓度(pg/ml血清)，在未患先兆子痫的女性中随着妊娠发展而增加，直至大约30周，然后浓度最终开始减少。图2描述了相匹配的病例-对照研究的结果，其中取自妊娠的、无先兆子痫的女性的样品(对照，在图中通过三角形表示)和取自后来在妊娠中发生先兆子痫的妊娠女性的样品(病例，在图中通过交叉形表示)，用检测P1GF-2同工型的方法来测量。选择的对照通过她们的生物物理参数(母体年龄，体重指数，种族和孕龄)与病例匹配。目测检查的结果表明，在妊娠的第一个和第二个三个月期间，从病例样品测量的浓度与对照样品相比升高。图3描述了相匹配的病例-对照研究的结果，其中取自无先兆子痫的妊娠女性的样品(对照，在图中通过三角形表示)和取自后来在妊娠中发生先兆子痫的妊娠女性的样品(病例，在图中通过交叉形表示)，用检测P1GF-3同工型的方法来测量。选择的对照通过她们的生物物理参数(母体年龄，体重指数，种族和孕龄)与病例匹配。目测检查的结果表明，从病例样品测量的浓度在妊娠的前三个月期期间与对照样品相比基本相同，但在妊娠
的第:
.水个月期期间与对照样品相比明显较低。当分析匹配的病例对照研究的结果时，P1GF-2和P1GF-3同工型的测量浓度经 Iogltl转变，以作出生物变异的高斯分布。然后，分别计算前三个月(孕龄1-13周)和第二个三个月(孕龄1446周)在先兆子痫病例和对照群体的样品中P1GF-2和P1GF-3同工型的Iogltl浓度的中位数、平均值和标准差。最后，计算先兆子痫病例群体的中位数与对照群体的中位数的差异是对照群体的标准差的多少倍。这些计算的结果归纳在表1A(P1GF_2) 和 lB(PlGF-3)中。表 IA
权利要求
1.确定孕妇发生先兆子痫风险的方法，包括i)测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型； )将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。
2.权利要求1的方法，其中测定P1GF-2的水平，并且其中样品中P1GF-2的水平相对于对照样品的增加指示发生先兆子痫的风险增加。
3.权利要求2的方法，其中测定P1GF-3的水平，并且其中对象样品中P1GF-3的水平相对于对照样品的降低指示发生先兆子痫的风险增加。
4.权利要求1的方法，其中确定P1GF-2/P1GF-3比的差异，并且其中对象样品中的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。
5.权利要求1的方法，其中测定P1GF-3的水平，并且其中对象样品中P1GF-3的水平相对于对照样品的降低指示发生先兆子痫的风险增加。
6.权利要求5的方法，其中测定P1GF-2的水平，并且其中对象样品中P1GF-2的水平相对于对照样品的增加指示发生先兆子痫的风险增加。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中至少一个生化标志物选自PAPP-A，、ΡΑΙ-1、ΡΑΙ-2、 PlGF-I 禾口 ADAM-12。
8.权利要求7的方法，其中测定PlGF-I的水平，并且其中对象样品中PlGF-I的水平相对于对照样品的降低指示发生先兆子痫的风险增加。
9.权利要求1的方法，其中确定P1GF-2/P1GF-1的比，并且其中在对象样品中所述比相对于对照样品的差异指示发展先兆子痫的风险增加。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中从妊娠前三个月期间的对象获得样品。
11.权利要求1-9任一项的方法，其中从妊娠第二个三个月期间的对象获得样品。
12.权利要求1的方法，还包括测定孕妇的一种或多种生物物理标志，将一种或多种生物物理标志中的每一种与对照对象的相同生物物理标志相比较，其中孕妇每种生物物理标志的测量值相对于对照的增加或降低，指示发展先兆子痫的风险增加。
13.权利要求12的方法，其中生物物理标志选自血压和子宫动脉搏动指数。
14.确定孕妇是否患有先兆子痫的方法，包括i)测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，其中至少一种生化标志物是选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型； )将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较；其中对象样品中所述至少一种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫。
15.权利要求14的方法，其中进行至少一种下列观察从对象获得的样品中P1GF-2的水平相对于对照样品中P1GF-2的水平增加；和从对象获得的样品中P1GF-3的水平相对于对照样品中P1GF-3的水平降低。
16.权利要求14或15的方法，其中从对象获得的样品中P1GF-2/P1GF-1的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。
17.权利要求14或15的方法，其中从对象获得的样品中P1GF-2/P1GF-3的比相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。
18.权利要求14-17任一项的方法，其中从妊娠20-40周期间的孕妇获得样品。
19.计算机程序，其在电脑上运行时，引起计算机执行确定孕妇中先兆子痫的风险或存在的过程，所述过程包括输入通过下列方法获得的至少一种生物标志物的测量值；1)分析从孕妇获得的样品中的一种或多种生化标志物，其中至少一种生化标志物选自 P1GF-2 和 P1GF-3 ； )将样品中所述一种或多种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较，其中样品中一种或多种生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示先兆子痫；和iii)根据比较结果，确定先兆子痫风险的定量评价。
20.权利要求19的计算机程序，还包括分析选自PAPP-A、PAI-UPAI-2、PlGF-I和 ADAM-12的至少一种生化标志物。
21.权利要求19或20的计算机程序，还包括输入通过测定对象的一种或多种生物物理标志获得的至少一种生物标志的测量值；将对象的一种或多种生物物理标志与对照对象的相同生物物理标志相比较，其中对象中一种或多种生物物理标志的测量值相对于对照的增加或降低，指示发生先兆子痫的风险增加；和根据比较的一种或多种生化标志物和比较的一种或多种生物物理标志的结果，确定先兆子痫风险的定量评价。
22.权利要求21的计算机程序，其中生物物理标志选自血压和子宫动脉搏动指数。
23.权利要求19至22任一项的计算机程序，其中确定先兆子痫风险的定量评价包括使用多变量分析确定先兆子痫的似然性，并且其中多变量分析包括使用来源于对照参考数据组的生化标志物和分布参数的水平。
24.权利要求22的计算机程序，其中所述多变量分析是多变量高斯分析。
25.计算机程序记录介质，其存储权利要求19至M任一项的计算机程序。
26.评价孕妇中先兆子痫的风险或存在的试剂盒，其包含i)至少两种可检测的结合配偶体，其中每种可检测的结合配偶体与选自P1GF-1、 P1GF-2和P1GF-3的单个PlGF同工型特异性结合。
27.权利要求沈的试剂盒，其包含i)与P1GF-2特异性结合的可检测结合配偶体，和ii)与选自PlGF-I和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。
28.权利要求沈的试剂盒，其包含i)与P1GF-3特异性结合的可检测结合配偶体，和ii)与选自PlGF-I和P1GF-2的PlGF同工型特异性结合的可检测结合配偶体。
29.根据权利要求沈至观任一项的试剂盒，其中可检测的结合配偶体是抗体或其抗原结合片段。
30.评价孕妇中先兆子痫的风险和存在的试剂盒，其包含i)至少一种抗体或其抗原结合片段，其与选自P1GF-2和P1GF-3的PlGF同工型特异性结合； )抗体或抗原结合片段在测定中的使用说明书。
31.根据权利要求沈或30的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与PlGF同工型的环 3结构结合。
32.根据权利要求沈或31的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与成熟P1GF-2中的 IM至144位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 6)结合，和/或与成熟P1GF-3中的114至185 位氨基酸之间的序列(SEQ ID NO 7)结合。
33.根据权利要求32的试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段与选自 HSPGRQSPDMPGDFRADA(SEQ ID NO 8)和PEEIPRMHPGRNGKKQQRK(SEQ ID NO 9)的P1GF-3序列结合。
全文摘要
本发明涉及确定孕妇发生先兆子痫风险的方法。所述方法包括i)测定从孕妇获得的样品中一种或多种生化标志物的水平，和ii)将样品中所述至少一种生化标志物的水平与对照样品中相同生化标志物的水平进行比较。样品中生化标志物的水平相对于对照样品的差异指示发生先兆子痫的风险增加。同工型生化标志物优选是PlGF-2和PlGF-3。本发明还涉及确定孕妇是否患有先兆子痫的方法，以及评价先兆子痫的风险或存在的试剂盒。另外，本发明还涉及用于这些确定的计算机程序。
文档编号G01N33/68GK102224422SQ200980146549
公开日2011年10月19日 申请日期2009年11月20日 优先权日2008年11月20日
发明者乔纳森·B·卡米歇尔, 佩蒂·胡尔斯凯宁, 塔加·阿霍拉, 海尼·弗朗, 缇姆·科皮玛吉, 马克·N·波布罗 申请人:Ntd实验室公司, 沃莱克公司, 珀金埃尔默健康科学公司