专利名称：分析物检测试验的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析物检测的领域。更特别地，本发明涉及使用基于回音壁模式(WGM) 的试验进行生物传感并且快速而灵敏地检测分析物。
背景技术：
本说明书中作者参考的出版物的书目详细内容在描述的结尾处集中按字母顺序
全A屮
口 QQ ο本说明书中对任何现有技术的参考不是并且不应当认为是该现有技术形成任何国家的公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。单片共振器中的环路光学模式称为“回音壁模式”(WGM)或“形态依赖性共振”(MDR)。这样的模式或共振是通过来自共振器边界的全内反射支持的封闭光轨迹(直立光波)。通过球形电介质腔表面内的近-全内反射限制特定发射剖面的直立光波时，产生了 WGM(Moller 等，Applied Physics Letters 83(13) :2686-2688,2003) WGM技术详细描述于国际专利申请No.W02005/116615中，在此将其引入作为参考。WGM技术部分是基于荧光团能够产生与众不同的WGM特征的现象预测的。将荧光团结合至量子点上，通过扩散使量子点进入微粒中或可以在其制备过程中掺入。荧光团的类型不受限制，并且可以是例如有机染料、基于稀土的生光团、各种形态和组成的半导体纳米晶体、磷光体或照亮时发射光的其他材料。然后将这种荧光团或其混合物结合微球体颗粒。当目标分析物与固定于微球体颗粒上的结合伴侣相互作用时，WGM特征产生变化，因此能够检测结合事件。WGM只允许从颗粒中发射出来的特定波长的光。这种现象的结果是来自例如荧光团的常见宽发射(IO-IOOnm宽)条带受到限制并显示为一系列有效地对应于颗粒内光的直立模式图型的锐锋形。WGM特征对微球体颗粒表面的变化非常敏感，并且当微球体颗粒与其环境中的分析物或分子相互作用时，WGM特征发生变化。不同来源样品中的稀有分析物的检测需要灵敏、通用且实际的检测方法。需要设计提高WGM的灵敏度、通用性和实用性的方法，用于分析物的检测。
发明内容
本发明提供了一种基于回音壁模式(WGM)检测试验的灵敏方法和试剂，特别是， 用于检测样品中的分析物。 特别地，本发明的目的是描述一种方法，通过该方法，利用WGM对环境的敏感性， 可以常规地检测任何介质(液体或气体)中的未标记分析物。关于液体和气体，包括水溶液和生物缓冲液以及空气。本发明的方法和试剂一部分是基于意想不到的确定具有荧光团的微球体涂层本身，与使用离散的量子点相反，增强了基于WGM的检测的灵敏度。在另一部分中，颗粒(如， 在其表面上具有功能化的化学基团的颗粒)的选择提高了量子点或直接荧光团涂层发生时的灵敏度。在另一部分中，选择相对于在其中进行试验的介质而具有较高折射率的颗粒。 在一个实施方案中，微球体颗粒具有高于1. 40的折射率。因此，本发明的一个方面提供了介质中分析物检测的方法，该方法包括将覆盖荧光团的微球体和多个配体接受WGM检测工具，以鉴定一个或多个配体与配体结合分析物之间的结合事件。在另一个方面中，本发明提供了介质中分析物检测的方法，该方法包括将微球体和多个配体接受WGM检测工具，以鉴定一个或多个配体与配体结合分析物之间的结合事件，其中微球体具有高于包含覆盖荧光团的分析物的介质的折射率。在一个实施方案中，微球体颗粒具有高于1. 40的折射率。本发明的另一个方面提供了检测分析物和配体之间的结合事件的方法，其包括步骤(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受 WGM检测工具，以检测结合事件。本发明的另一个方面包括，用于检测介质中的分析物的方法，包括步骤(i)将多个分析物的配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒，其中如果微球体颗粒是蜜胺甲醛，则其可以与荧光团偶联或包含量子点；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；(ii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下， 将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iii)将微球体颗粒接受回音壁模式(WGM)检测工具，以检测结合事件。在特定的实施方案中，通过化学部分，如使用叠氮化物、炔、胺、醛、硫酸盐或硫醇、 羧基、羧酸盐和/或羟基，将微球体颗粒官能化。在一个方面中，微球体颗粒是胺-醛颗粒， 如但不限于，蜜胺颗粒或蜜胺甲醛颗粒。因此，本发明的另一个方面提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的官能化微球体颗粒；(ii)将官能化的微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将官能化的微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。在特定的实施方案中，本发明提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的胺-醛微球体颗粒；(ii)将胺-醛微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将胺-醛微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将胺-醛微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。在最特别的实施方案中，胺-醛颗粒是蜜胺甲醛颗粒。
因此，本发明提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤 (i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将蜜胺甲醛微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将蜜胺甲醛微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和 (iv)将蜜胺甲醛微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。当颗粒是蜜胺甲醛时，颗粒还可以包含量子点。因此，本发明的另一个方面是提供用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤(i)将多个配体锚定一群包含荧光团覆盖的量子点的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具， 以检测结合事件。本发明的另一个方面提供了用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤(i)将多个配体锚定一群具有高于包含分析物的介质的折射率的微球体颗粒，微球体颗粒编码荧光团；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。本发明的再另一个方面提供了检测分析物的方法，该方法包括将至少一群微球体颗粒接触推定包含分析物的样品，其中微球体颗粒群内的每个颗粒包含应答红外线激励发射可见光辐射的荧光团和分析物的固定化推定结合伴侣，其中每个颗粒群具有限定的WGM 特征，其中分析物与固定化结合伴侣的结合导致至少一群微球体颗粒的WGM特征发生变化，这表示了分析物的存在。在一个实施方案中，分析物或其各自的配体包含选自核酸；蛋白；肽；抗体；脂质； 碳水化合物；和任何小分子或化学个体的分子，包括细胞(例如，癌细胞)、细菌和病毒。在特定的实施方案中，与微球体颗粒锚定的配体是核酸分子，待检测的分析物是互补核酸分子。在另一个实施方案中，核酸配体或分析物是包含单链DNA序列的DNA分子。本发明的另一个方面提供了一种方法的用途，该方法包括步骤(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品，并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受试验制备中的WGM检测工具，以检测分析物和配体之间的结合事件。在进一步的实施方案中，微球体可以是循环利用的。此外，试验可以在任何介质中进行，如空气或其他气体，或在液相中，如水溶液、生物缓冲液或复合的生物流体。在另一个方面中，本发明提供了一种试剂盒，其包含荧光团偶联的微球体颗粒和多个用于与其锚定的配体，用于通过WGM检测工具来检测配体和分析物之间的结合事件。在特定的实施方案中，试剂盒包含荧光团偶联的微球体颗粒，多个配体已经与其结合。当颗粒是蜜胺甲醛时，荧光团可以覆盖在有机染料或量子点上。在进一步的方面中，本发明提供了包含WGM检测工具的生物传感器，其中生物传感器是包含粉末来源、光源、样品操纵室和分光光度计的自给装置。
核苷酸和氨基酸序列通过序列识别号(SEQ ID NO)来表示。SEQ ID NO用数字对应于序列识别号<400>1(SEQ ID NO :1)、<400>2(SEQ ID NO :2)等。表1中提供了序列识别号的概括。在权利要求之后提供了序列表。表1中提供了贯穿本说明书中所用的序列识别号的概括。表 1序列识别号的概括
权利要求
1.一种用于检测介质中的分析物的方法，包括步骤(i)将多个分析物的配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒，其中如果微球体颗粒是蜜胺甲醛，则其可以与荧光团偶联或包含量子点；( )将微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；( )在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iii)将微球体颗粒接受回音壁模式(WGM)检测工具，以检测结合事件。
2.如权利要求1的方法，其中微球体颗粒包含选自以下的材料蜜胺或其衍生物；硅石；乳胶；氧化钛；二氧化锡；氧化钇；氧化铝；其他二价金属氧化物；钙钛矿和其他压电金属氧化物；PLGA ；蔗糖和琼脂糖。
3.如权利要求2的方法，其中微球体颗粒包含蜜胺甲醛。
4.如权利要求1的方法，其中选择相对于其中进行检测的介质具有更高折射率的微球体颗粒。
5.如权利要求4的方法，其中微球体颗粒具有高于1.40的折射率。
6.如权利要求1至5任一项的方法，其中介质是液相或气相。
7.如权利要求1至6任一项的方法，其中液相是水溶液、缓冲液或生物流体，气相是空气。
8.如权利要求1的方法，其中分析物或其各自的配体包含选自以下的分子核酸；蛋白；肽；抗体；脂质；碳水化合物；细菌；病毒；细胞和任何小分子或化学实体。
9.如权利要求8的方法，其中分析物或其各自的配体包含核酸。
10.如权利要求8的方法，其中核酸包含单链DNA。
11.如权利要求10的方法，其中通过用限制性核酸内切酶和/或核酸外切酶消化双链 DNA来制备单链DNA。
12.如权利要求11的方法，其中限制性核酸内切酶是1型限制性核酸内切酶。
13.如权利要求11的方法，其中核酸外切酶是λ核酸外切酶。
14.如权利要求10的方法，其中从RNA:DNA杂交分子制备单链DNA。
15.如权利要求14的方法，其中RNA:DNA杂交分子包含与通过逆转录制备的信使RNA 杂交的DNA。
16.如权利要求14的方法，其中RNA是病毒RNA。
17.如权利要求1的方法，其中分析物或配体源自获自生物、工业、实验室或环境来源的分离样品。
18.如权利要求17的方法，其中样品包含矿物、合成的、真核生物的、原核生物的或病毒来源的材料。
19.一种方法在制造检测分析物和配体之间的结合事件的试验中的用途，该方法包括步骤(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的微球体颗粒，其中如果微球体颗粒是蜜胺甲醛，则其可以与荧光团偶联或包含量子点；(ii)将微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv)将微球体颗粒接受WGM检测工具。
20.一种用于检测分析物和配体之间的结合事件的方法，包括步骤(i)将多个配体锚定一群荧光团偶联的或量子点标记的蜜胺甲醛微球体颗粒；(ii)将蜜胺甲醛微球体颗粒接触阴性对照样品并测定基线光谱；(iii)在一定的时间和足以促进分析物及其各自的配体之间的结合事件的条件下，将蜜胺甲醛微球体颗粒接触推定含有分析物的样品；和(iv) 将蜜胺甲醛微球体颗粒接受WGM检测工具，以检测结合事件。
全文摘要
快速且灵敏的分析物检测试验是基于荧光标记的微球体颗粒的回音壁模式。将分析物(如核酸)的配体锚定颗粒。荧光标记可以包含荧光团或量子点。在后一种情况中，颗粒可以包含蜜胺甲醛。试验可以用于检测含水样品中的分析物。
文档编号G01N33/551GK102272597SQ200980153782
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月20日 优先权日2008年11月21日
发明者E·努希杰, K·F·伯特, P·马尔瓦尼 申请人:墨尔本大学, 惠研生物系统公司