专利名称：一种微量植物鲜样中茉莉酸和茉莉酸甲酯的检测方法
技术领域：
本发明涉及测定方法，是一种针对微量植物鲜样中茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯 (MeJA)含量的检测方法。
背景技术：
茉莉酸类化合物包括JA、MeJA以及其它衍生物是广泛存在于植物体内的植物生 长调节物质。JA作为一类植物激素已得到国际学术界的公认，具有诱导植物防御基因的表 达，诱导多种次生代谢物的合成，抑制光合作用，促进呼吸作用、气孔关闭、叶片衰老脱落以 及果实成熟等广泛的生理功能。近年来研究表明JA是植物受外界刺激后反应最快的信号 分子，也是信号途径中的关键信号分子。目前植物中JA的研究已成为热点，而JA含量的测 定则是限制JA研究的技术瓶颈。JA和MeJA在植物组织中含量极微，挥发性很强，增加了对其进行提取和分析的困 难，要求分析手段具有很高的灵敏度和选择性。Albrecht等(199 运用酶联免疫法测定了 JA的含量，Baldwin等(1997)用氨丙基柱纯化样品，通过GC-MS技术测定了伤诱导植物中 JA的含量。酶联免疫法准确性较差，氨丙基柱不易回收利用，成本高。因此，急需采用微量 植物样品中JA和MeJA的提取纯化和测定新技术。
发明内容
本发明是克服原有检测技术中对样品需求量大，且操作繁琐、检测时间过长的不 足，提供一种微量植物鲜样中的JA和MeJA的检测方法。本发明用于对微量植物鲜样中JA 和MeJA的检测，具有分析成本低，分析速度快，灵敏度高，且有较好的可重复性和选择性， 能够较好的分离和获得JA和MeJA的检测峰，同时简化提取和纯化的步骤。本发明解决其技术问题所采用的技术方案主要包括如下步骤1)制备JA和MeJA 的提取纯化的反向碳十八固相萃取柱；幻采用固相萃取柱法提取和纯化植物鲜样中JA和 MeJA ；3)样品检测植物样品提取纯化后，LC-MS-MS检测其JA和MeJA含量。本发明所确定的固相萃取法为植物鲜样中JA和MeJA提取纯化最佳方法。所述 的JA和MeJA的提取纯化的固相萃取柱的制备，取内径为5. 6mm的SPE柱体，放入聚乙烯筛 板后，添加反向碳十八填料，平衡柱子后即可。所述的固相萃取柱法分离、纯化植物鲜样中 JA和MeJA，样品置于离心管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇浸提过夜，4800g离心 IOmin,取上清，剩余残渣用200 μ L 100%的甲醇浸提2h，4800g离心lOmin，取上清，合并两 次上清液。用3000 μ L超纯水稀释，过固相萃取柱，用200 μ L 20%甲醇和250 μ L 30%甲 醇分别洗脱后，用300 μ L 100%甲醇洗脱并收集茉莉酸及茉莉酸甲酯。所述的LC-MS-MS检 测样品中JA和MeJA含量，主要碎片离子为m/z 133 (JA)，m/zl51 (MeJA)，所述的色谱保留 时间分别为16. 27min和17. 19min。本发明的检测原理本发明中提取纯化方法——固相萃取法，采用固相萃取柱作 为分离媒介，通过小柱中的填料吸附目的物，采用梯度洗脱的方式，可以有效的去除杂质而保留目的物，并使样品回收率和重现性得到保障。本发明采用的串联质谱(LC-MS-MS)检测 限可达0. 03PPb (JA)和0. 075PPb (MeJA)，能够检测到微量样品中极低的JA和MeJA含量， 且分离效果明显好于HPLC，且HPLC需要较多量的样品才能检测到样品中的JA和MeJA，因 此，在很难获得大量植物样品(如拟南芥突变体等植物材料)的情况下，利用本发明建立的 固相萃取法分离和串联质谱法检测就可解决这一难题。本发明的效果是利用本发明对微量植物样品中的JA和MeJA的提取纯化液进行 LC-MS-MS分析，在20min中内可以完成测定，检测限可达0. 03PPb (JA)和0. 075PPb (MeJA)， 本法与HPLC法检测结果一致。本文对36例拟南芥突变体材料、127例水稻样品材料等的检 测表明，本方法获得的结果符合要求。本方法介绍的串联质谱检测是一种快速可靠的方法。 测定的条件经优化后，测定时间仅需要20min，预计测定成本100元左右，与HPLC法检测相 比，检测时间缩短30-40min，成本却基本一致，而且步骤也简化了很多。
图1是本发明不同提取纯化方法的比较图，图中A、B、C、D分别代表标准品，乙酸
乙酯萃取法，二氯甲烷萃取法，固相萃取柱法。图2是本发明的串联质谱检测新方法与高效液相色谱法测定样品中JA和MeJA结 果的比较，上图为串联质谱图谱，下图为高效液相色谱图谱。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述。一.试剂与仪器JA, MeJA标准品(Sigma，色谱纯，纯度为95% )，甲醇(德国默克，色谱纯)，石油 醚，乙酸乙酯，己烷，二氯甲烷(国产分析纯)，反向碳十八填料。Agilent 1100高效液相色谱仪，G1314A紫外检测器，美国Thermo TSQ Quantum Ultra串联质谱系统，配有自动进样器、柱温箱以及电喷雾离子源，Xcalibur 2. 0数据处理 系统。二、实施方法这种微量植物鲜样中JA(JA)及MeJA(MeJA)的检测方法，主要包括以下步骤来实 现1.制备JA和MeJA的提取纯化的反向碳十八固相萃取小柱；2.采用固相萃取柱法提取和纯化植物鲜样中JA和MeJA ；3. LC-MS-MS检测样品中JA和MeJA含量。本方法检测实例 对标准品中JA和MeJA回收率的检测用移液器移取JA和MeJA标准品各1 μ L于 1. 5mL离心管中，用100%甲醇定容至lmL，配制成混合标准母液，然后分别取适量混合标准 母液配制成1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL3个浓度的标准溶液。反向碳十八固相萃取柱的制备取内径为5. 6mm的SPE柱体，放入聚乙烯筛板后， 添加反向碳十八填料，平衡柱子后即可。取测定过的植物样品两份，其中一份加入lOOng/mL的JA和MeJA的混合标样，另 一份不加标样。在1.5mL离心管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇，混勻后浸提过夜，
44800g离心lOmin，取上清液于一新离心管中，剩余残渣用200 μ L 100 %的甲醇浸提浊， 4800g离心lOmin，取上清，合并两次上清液，移入一新5mL离心管中。用3000 μ L超纯水稀 释提取液，过固相萃取柱，用200 μ L 20%甲醇和250yL 30%甲醇分别洗脱后，用300 μ L 100%甲醇洗脱并收集JA及MeJA，进行检测。根据峰面积计算JA和MeJA的回收率，结果表 明本方法的回收率分别达到92. 48% (JA)和94. 3% (MeJA)。对拟南芥突变体材料中JA和MeJA的检测取拟南芥鲜样0. 5000g，于1. 5mL离心 管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇，混勻后浸提过夜，4800g离心lOmin，取上清液于 一新离心管中，剩余残渣用200 μ L 100%的甲醇浸提池，4800g离心lOmin，取上清，合并两 次上清液，移入一新5mL离心管中。用3000 μ L超纯水稀释提取液，过固相萃取柱，用200 μ L 20%甲醇和250 μ L 30%甲醇分别洗脱后(流动相条件见表1)，用300 μ L 100%甲醇洗脱 并收集JA及MeJA，LC-MS-MS检测，20min内完成，五次测定并根据峰面积计算的JA和MeJA 的浓度平均值分别为16. 096士2. 103和3. 443士 1. 976。结果表明，本检测方法可以对微量 拟南芥鲜样中的JA和MeJA进行快速检测。表1 JA和MeJA检测的流动相条件
时间0.1% 甲酸(％)甲醇(％)流速(mL Tiiin-1)090100.2190100.21010900.21510900.21690100.22890100.权利要求
1.一种微量植物新鲜样品中茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的检测方法，其特征在 于包括以下步骤(1)制备JA和MeJA提取纯化的反向碳十八固相萃取柱；(2)固相萃取柱法分离、纯化植物鲜样中JA和MeJA；(3)LC-MS-MS检测样品中JA和MeJA含量。
2.根据权利要求1所述的JA和MeJA提取纯化反向碳十八固相萃取柱的制备，其特征 在于采用固相萃取柱。取内径为5. 6mm的SPE柱体，放入聚乙烯筛板后，添加反向碳十八 填料，平衡柱子后即可。
3.根据权利要求1所述的固相萃取柱法分离、纯化植物鲜样中JA和MeJA，其特征在 于样品置于离心管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇浸提过夜，4800g离心lOmin，取 上清，剩余残渣用200 μ L 100%的甲醇浸提ai，4800g离心lOmin，取上清，合并两次上清 液。用3000 μ L超纯水稀释，过固相萃取小柱，用200 μ L 20%甲醇和250 μ L 30%甲醇分 别洗脱后，用300yL 100%甲醇洗脱并收集茉莉酸及茉莉酸甲酯。
4.根据权利要求1所述的LC-MS-MS检测样品中JA和MeJA含量，其特征在于所述 的主要碎片离子为m/z 133 (JA)，m/zl51 (MeJA)，所述的色谱保留时间分别为16. 27min和 17.19min。
全文摘要
本发明涉及一种基于固相萃取和串联质谱的微量植物鲜样中茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的检测方法，主要包括如下步骤来实现1)制备JA和MeJA的提取纯化的反向碳十八固相萃取小柱；2)采用固相萃取柱法提取和纯化植物鲜样中JA和MeJA；3)样品检测植物样品提取纯化后，LC-MS-MS检测其JA和MeJA含量。本发明的效果是反向碳十八固相萃取柱适合JA和MeJA的分离纯化，可实现二者的同时提取纯化；同时，基于串联质谱的高灵敏性，能在较短时间内对复杂样品中的JA和MeJA进行分离检测，并获得比以往检测方法相同或更好的结果，且具有操作简便、结果可靠和样品需求量低等优点，从而实现微量植物鲜样中JA和MeJA的高灵敏测定。
文档编号G01N30/72GK102135528SQ20101010106
公开日2011年7月27日 申请日期2010年1月26日 优先权日2010年1月26日
发明者李合松, 童建华, 肖浪涛, 蔺万煌, 黄志刚 申请人:湖南农业大学