专利名称：一种碱性磷酸酶结合物的合成工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶结合物的制备方法，更具体地说，涉及一种新的碱性磷酸酶标记物的合成方法。
背景技术：
碱性磷酸酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物等中的酶。经常使用的碱性磷酸酶从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼，由多个同功酶组成。在适宜的缓冲液中，碱性磷酸酶可以催化水解硝基苯磷酸盐(PNP)、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯、3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷(AMPPD)等含磷酸根基团的显色底物和化学发光底物。鉴于此，碱性磷酸酶作为一种标记酶，广泛应用于临床免疫诊断中。碱性磷酸酶的结合物是通过化学合成的方法将碱性磷酸酶和待结合物结合在一起，也称酶标记物。免疫诊断中常用的酶结合物包括酶结合抗原、酶结合抗体和酶结合葡萄球菌蛋白A等。酶结合物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶结合物主要应用于免疫印迹杂交(Western blotting)、酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay, CLE ΙΑ)及免疫组化等免疫检测和定量分析。目前本领域中常用的酶结合物的合成方法主要有三种1.戊二醛交联法。戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与待结合物的氨基通过它而联结。碱性磷酸酶结合物一般用此法进行合成。合成方法分一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与待结合物的混合物中，反应后即得酶结合物。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与待结合物作用而形成酶结合物。也可先将待结合物与戊二醛作用，再与酶联结。但是，这种方法合成的碱性磷酸酶结合物的活性和结合率都不够理想，影响免疫分析的灵敏度。2.过碘酸盐氧化法。本方法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将辣根过氧化物酶分子表面的多糖氧化为很活泼的醛基，可与蛋白质上的氨基形成&1^€€氏碱而结合。这种方法的操作较为复杂，合成后酶和待结合物活性损失较多，也不适合碱性磷酸酶结合物的合成。3.琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联法。同时带有可与氨基反应的琥珀酰亚胺酯类和可与巯基反应的马来酰亚胺基团的异源双功能交联试剂常用于制备酶结合物。这种交联试剂常用的有4-(Ν-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)或其水溶性类似物4-(Ν-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)， 它们可通过活化酶分子的氨基得到带有马来酰亚胺基团的酶分子，酶分子上的马来酰亚胺基团可以和巯基化结合物上的巯基基团反应，最后得到酶结合物。该方法所用试剂昂贵，而且，待结合物通常会因为需经过巯基化处理，操作复杂。因此，有必要开发一种新的方法，合成具有更高结合率和活性的碱性磷酸酶结合物。发明概述
3
在第一个方面，本发明涉及一种合成碱性磷酸酶结合物的方法。仅仅是为了说明的目的，本发明方法可称为碳二亚胺法。本发明的方法包括以下步骤步骤a)，用碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺活化碱性磷酸酶分子的羧基，生成活性碱性磷酸酶酯；步骤b)， 任选调节体系PH至碱性，加入待结合物，使得碱性磷酸酶酯与待结合物的合成反应，生成碱性磷酸酶结合物。在第二个方面，本发明涉及使用本发明方法获得的碱性磷酸酶结合物。在第三个方面，本发明涉及用于碱性磷酸酶标记的试剂盒，其包括碳二亚胺，以及任选的pH调节剂。优选地，该试剂盒还包括指示操作者按照本发明方法进行操作的说明、 离心超滤管或两者。
图1图示了本发明方法的一个实施方案。图2是泌乳素浓度-发光值的线性拟合，其中使用本发明方法对已知浓度的泌乳素抗体进行标记，获得碱性磷酸酶-泌乳素抗体结合物，并测定其发光值。以泌乳素抗体浓度为X轴，以发光值为Y轴，以最小二乘法进行浓度-发光值的线性拟合。
具体实施例方式本文中使用的术语“碱性磷酸酶”是指能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，例如对来源于细菌中的ALP来说，其最适PH是8. 0，而对来源于牛的ALP则是8. 5。用于本发明的碱性磷酸酶可以是各种来源的碱性磷酸酶，包括但不限于自然提取和工程菌表达制备的碱性磷酸酶、表面糖基化处理或去糖基处理的碱性磷酸酶，以及其它基团修饰处理的碱性磷酸酶。所有合适的碱性磷酸酶都包括在本发明中。本文中使用的术语“碳二亚胺”是指具有含有N = C = N官能团的物质。本领域中公知，碳二亚胺是一类常用的失水剂，用于有机合成，其主要用于活化羧基，促使酰胺和酯的生成。可使用的碳二亚胺也是本领域公知的，包括但不限于二环己基碳二亚胺(DCC)、 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N，N' -二异丙基碳二亚胺(DIC)等。所有合适的碳二亚胺都包括在本发明中。本文中使用的术语“羟基琥珀酰亚胺”是指具有以下结构的物质
权利要求
1.一种合成碱性磷酸酶结合物的方法，所述方法包括a)用碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺活化碱性磷酸酶分子的羧基，生成活性碱性磷酸酶酯；b)加入待结合物，使得碱性磷酸酶酯与待结合物的合成反应，生成碱性磷酸酶结合物。
2.权利要求1的方法，其中步骤a)在酸性条件下进行，优选所述酸性条件为PH 4. 0-5. O0
3.权利要求1或2的方法，其中所述碳二亚胺选自二环己基碳二亚胺(DCC)、l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N，N' - 二异丙基碳二亚胺(DIC)；独立地所述羟基琥珀酰亚胺选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-磺酸化羟基琥珀酰亚胺。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤b)还包括调节体系至碱性，优选所述碱性条件为 PH 7. 5-9.0。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述方法在步骤b)之后还包括纯化处理；优选所述纯化处理选自超滤纯化、脱盐柱纯化、透析纯化、凝胶过滤纯化、Protein A或G亲和柱纯化和硫酸铵沉淀纯化。
6.一种根据权利要求1-5中任一项的方法获得的碱性磷酸酶结合物。
7.一种用于碱性磷酸酶标记的试剂盒，包括碳二亚胺和任选的羟基琥珀酰亚胺。
8.权利要求7的试剂盒，所述试剂盒还包括pH调节剂，所述pH调节剂包括用于步骤 a)的pH调节剂、用于步骤b)的pH调节剂或两者。
9.权利要求8的试剂盒，其中用于步骤a)的所述pH调节剂为酸或缓冲系统，优选所述酸选自脂肪族有机酸、芳香族有机酸和无机酸，所述缓冲系统选自2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES)缓冲系统、哌嗪-N，N’双乙磺酸)(PIPEQ缓冲系统和磷酸盐缓冲系统。
10.权利要求8或9的试剂盒，其中用于步骤b)的所述PH调节剂为碱，优选选自氢氧化钠和氢氧化钾。
11.权利要求7-10中任一项的试剂盒，所述试剂盒还包括指示操作者进行操作的说明、离心超滤管或两者。
全文摘要
本发明涉及碱性磷酸酶结合物的合成方法，包括步骤a)，用碳二亚胺活化碱性磷酸酶分子的羧基，生成活性碱性磷酸酶酯；步骤b)，加入待结合物，使得碱性磷酸酶酯与待结合物的合成反应，生成碱性磷酸酶结合物。
文档编号G01N33/535GK102269761SQ20101019264
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者张裕平, 李可, 钱纯亘 申请人:深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司