专利名称：使褪色的病理he切片恢复颜色的方法
技术领域：
本发明属于生物组织染色技术，涉及病理HE染色技术，尤其涉及使褪色的病理HE 切片恢复颜色的方法。
背景技术：
病理学教学包括理论教学和实习教学两大部分，二者在教学中的作用相辅相成， 平分秋色。在病理学实习教学中，病理常规HE切片是重要的教学工具。对病理学教学切片 要求所选病例典型，组织切片应完整、无皱褶、无摺叠、无破损，并且切片染色鲜艳，红蓝对 比鲜明，这样的教学切片才能发挥其在教学实践活动中应起的作用。但是，我系的教学切片 大多来源于上世纪六、七十年代的尸检标本。随着时间的推移，由于切片的年代久远，在实 践中，我们发现一些罕见、少见病例及一些典型的普通疾病病例的病理教学切片褪色，其中 主要是苏木素颜色的减退，有的切片的苏木素染色甚至完全褪色，整张切片呈现一片红色， 可想而知，这样的切片能有怎样的教学效果。而且，由于现代医疗水平的整体提高和科技的 进步，一些普通疾病得到治愈，这种病例标本难以获得，而一些罕见、少见病例的标本已经 很难，甚至不可能得到新的标本。探索一种促染方法，改善褪色教学切片的颜色，恢复其鲜 艳的红蓝对比颜色，使其发挥正常的教学作用，是本领域面临的一项重要课题。
发明内容
本发明的任务是提供一种使褪色的病理HE切片恢复颜色的方法。实现本发明任务的技术方案是本发明提供的使褪色的病理HE切片恢复颜色的方法，包括以下步骤步骤一用二甲苯溶解褪色的病理HE切片上的封片胶；步骤二 依次用无水酒精和95%酒精浸泡切片以置换切片组织中的二甲苯，然后 用自来水冲洗切片；步骤三将切片置于枸橼酸溶液中浸泡作染色前预处理，然后再用自来水冲洗切 片；步骤四对切片进行常规HE染色。步骤一所述的用二甲苯溶解褪色的病理HE切片上的封片胶的具体方法是将褪 色的病理HE切片浸泡于二甲苯中，3 4天后，去除盖玻片，如果有标签纸，同时去除标签 纸，再在二甲苯中继续浸泡一天。步骤二所述的依次用无水酒精和95%酒精浸泡切片以置换切片组织中的二甲苯， 然后用自来水冲洗切片的具体方法是将切片置于无水酒精中浸泡2小时，取出切片放入 新的无水酒精中继续浸泡30分钟，将切片取出后再放入95%酒精中浸泡10分钟，然后用自 来水冲洗切片。步骤三所述的将切片置于枸橼酸溶液中浸泡作染色前预处理，然后再用自来水冲 洗切片的具体方法是；将切片置于0. 08%枸橼酸溶液中浸泡10-20分钟，然后将切片取出用自来水冲洗10-20分钟。步骤四所述的对切片进行常规HE染色的具体方法是将切片在苏木素染色液中 浸泡10分钟，取出切片，用自来水冲洗，然后用盐酸酒精分化，再用自来水冲洗；然后将 切片浸泡于0. 5%氨水中30秒钟返蓝，用自来水冲洗切片，再将切片于0. 5%水伊红染色液 中浸泡5分钟，用自来水洗切片，然后将切片浸泡于无水酒精中2分种；取出切片，将其浸泡 于新的无水酒精中1分钟；取出切片，将该切片置于新的无水酒精中浸泡Imin ；取出切片， 再将该切片浸泡于二甲苯透明剂中2 5分钟，然后取出切片，置于通风橱中晾干，用中性 树胶封片。其中所述的用盐酸酒精分化的具体方法是将切片在盐酸酒精溶液中浸 泡30秒钟至1分种，褪去苏木素不应着色部分的颜色，使本来苏木素应该着色的成分更清 晰；其中所述的将切片于0. 5%水伊红染色液中浸泡5分钟后用自来水洗切片的具体方法 是将切片连同染色架在自来水中提拉数次，每次1至3秒钟。实验资料材料和方法1.材料1. 1筛选褪色教学切片急性肺淤血、肾炎褪色切片，见图1和图2。1.2试剂配制1. 2. IHarris 苏木素配制甲液苏木素(Hematoylin)Ig无水酒精IOml乙液硫酸铝钾20g蒸馏水200ml将甲、乙两液分别充分溶解(溶解硫酸铝钾时需要加热处理)，然后混合煮沸，缓 慢加入氧化汞并搅拌以加速散热，注意氧化汞加入后，会出现冒泡现象，此时注意防止液 体溢出，随即放入冷水浴中冷却，恢复至室温后过滤备用。使用前每IOOml染液中加入4ml 冰醋酸。1. 2. 20. 08%枸橼酸称取枸橼酸0. 8g溶于IOOOml蒸馏水中，完全溶解即可使用。1. 2. 30. 5%水伊红称取水溶性伊红5g，溶于IOOOml蒸馏水中，充分完全溶解即
可使用。1. 2. 41%盐酸酒精分别取80%酒精10ml、浓盐酸990ml混勻即可。1. 2. 50. 5%氨水分别取氨水10ml、蒸馏水990ml混勻即可。2.方法(1)染片步骤1)脱胶即将褪色切片上的封片胶用二甲苯溶解，去除盖玻片，然后依次用无水 酒精、95%酒精置换切片组织中二甲苯的过程。将褪色切片置于染色架上，浸泡于二甲苯 中，3 4天后，去除盖玻片和标签纸，再换新的二甲苯中继续浸泡一天，然后取出切片，置 于无水酒精中浸泡2h后，将切片放入新的无水酒精中继续浸泡，30min后，取出切片，放入 95%酒精中浸泡lOmin，然后将切片置于自来水中流水冲洗；2)染色前预处理即将脱胶后的切片于0. 08%枸橼酸中浸泡作染色前预处理，将预处理时间设置为10至30min，然后取出切片流水冲洗10 20min ；3)常规HE染色。常规HE染色的具体方法是将待染切片置于苏木素染色液中 浸泡lOmin，取出切片，自来水冲洗；用盐酸酒精分化，自来水冲洗；然后将切片浸泡于 0. 5%氨水中约30sec返蓝，自来水冲洗；将切片浸泡于0. 5%水伊红染色液中5min后用自 来水洗；然后将切片浸泡于无水酒精中2min ；取出切片，将其浸泡于新的无水酒精中Imin ； 取出切片，将其浸泡于新的无水酒精中浸泡lmin;取出切片，将其浸泡于二甲苯透明剂中 2 5min;然后取出切片，置于通风橱中晾干，中性树胶封片。其中所述的用盐酸酒精 分化的具体方法是将切片该溶液中浸泡约30seC lmin，褪去苏木素不应着色部分的颜 色，使本来苏木素应该着色的成分更清晰；其中所述的将切片浸泡于0. 5%水伊红染色液 中5min后用自来水洗的具体方法是将切片连同染色架在自来水中提拉3至6次，每次2 秒。(2)染色分组将褪色切片按染色前预处理的时间长短分为四组，分别进行染色A组切片脱胶后不经染色前预处理，直接进行常规HE染色；B组切片脱胶后，用0. 08%枸橼酸溶液浸泡IOmin进行染色前预处理，然后取出 切片，自来水冲洗10 20min，再按照A组实验方法进行常规HE染色；C组切片脱胶后，用0. 08%枸橼酸溶液浸泡20min进行染色前预处理，然后取出 切片，自来水冲洗10 20min，再按照A组实验方法进行常规HE染色；D组切片用0. 08%枸橼酸溶液浸泡30min进行染色前预处理，然后取出自来水冲 洗10 20min，再按照A组实验方法进行常规HE染色。实验结果A组不经任何处理直接染色，结果有些细胞根本不着色，即使延长染色时间，着色 仍然很差，或者呈现核浆均着色，又不是很明显的蓝色，见图3 ；B组和C组经枸橼酸处理后， 苏木素着色力明显增强，此时特别注意，分化要到位，否则在胞浆可残留有苏木素的颜色， 影响伊红的着色，见图4、图5。这两组颜色鲜艳，红蓝对比鲜明。D组由于在枸橼酸中时 间最长，其苏木素着色力也最强，从苏木素染液中取出后，水洗片刻即已呈现蓝色，在盐酸 酒精中分化较久也很难达到理想的效果，并且对伊红着色有影响，见图6。本发明方法能有效改善褪色教学切片的颜色，使褪色切片恢复鲜艳的红蓝对比颜 色。常规HE染色的染色原理是正常情况下，组织细胞的胞核部分呈酸性，在溶液中 解离带负电荷，易被带正电荷的碱性染料所染；而细胞的胞浆表现为碱式电离，带有正电 荷，易被带负电荷的酸性染料着色。但是实际情况是胞浆物质的等电点是PH4. 5 5. 0，胞 浆的实际pH值为6. 7 6. 8，因此，胞浆物质处于一种碱性环境中，表现为酸式电离，带有负 电荷，这时亦可被带正电荷的碱性染料染色。这样的话，胞核和胞浆最终将难以区分。我们 知道，胞核的等电点为3. 3，我们若将染液的pH值调整为在3. 3以上，4. 7以下，使胞浆处于 一种酸性环境中，表现为碱式电离，而使胞核处于一种碱性环境中，表现为酸式电离，带有 负电荷，这样就可将二者用不同的染料染色而区分开。基于此种设想，将已处理好的褪色组 织切片于染色前在PH值为4. O的0. 08%枸橼酸溶液中浸泡，达到使切片组织酸化，人为地 制造一种使组织在染液中呈现碱式电离，增强苏木素染液的着色能力，实现褪色切片颜色 恢复的目的。
图1 急性肺淤血褪色切片，图片中苏木素染料着色的细胞核蓝色几乎不可见，呈 现一片红色。图2 肾炎褪色切片，图片中苏木素染料着色的细胞核蓝色几乎不可见，呈现一片 红色。图3 急性肺淤血直接复染切片，按照实验方法A直接进行HE染色，细胞核对苏木 素的着色力较弱。图4 急性肺淤血按方法B复染切片，按照实验方法B和C进行HE染色，红蓝颜色 对比鲜明。图5 肾炎按方法B复染切片，按照实验方法B和C进行HE染色，红蓝颜色对比鲜 明。图6 按方法D复染切片，按照实验方法D进行HE染色，即使在盐酸酒精中分化很 长时间也难以达到理想的染色效果。
具体实施例方式1.材料1. 1筛选褪色教学切片急性肺淤血、肾炎褪色切片(见图1、图2)1. 2试剂配制1. 2. IHarris 苏木素配制甲液苏木素(Hematoylin) Ig无水酒精IOml乙液硫酸铝钾20g蒸馏水200ml将甲、乙两液分别充分溶解(溶解硫酸铝钾时需要加热处理)，然后混合煮沸，缓 慢加入氧化汞并搅拌以加速散热(注意氧化汞加入后，会出现冒泡现象，此时注意防止液 体溢出)，随即放入冷水浴中冷却，恢复至室温后过滤备用。使用前每IOOml染液中加入4ml 冰醋酸。1. 2. 20. 08%枸橼酸称取枸橼酸0. 8g溶于IOOOml蒸馏水中，完全溶解即可使用。1. 2. 30. 5%水伊红称取水溶性伊红5g，溶于IOOOml蒸馏水中，充分完全溶解即
可使用。1. 2. 41%盐酸酒精分别取80%酒精10ml、浓盐酸990ml混勻即可。1. 2. 50. 5%氨水分别取氨水10ml、蒸馏水990ml混勻即可。2.方法(1)染片步骤1)脱胶即将褪色切片上的封片胶用二甲苯溶解，去除盖玻片，然后依次用无水 酒精、95%酒精置换切片组织中二甲苯的过程。将褪色切片置于染色架上，浸泡于二甲苯 中，3 4天后，去除盖玻片和标签纸，再换新的二甲苯中继续浸泡一天，然后取出切片，置 于无水酒精中浸泡，2小时后，将切片放入新的无水酒精中继续浸泡，30分钟后，取出切片，
6放入95%酒精中浸泡10分钟，然后将切片置于自来水中流水冲洗；2)染色前预处理即将脱胶后的切片浸泡于0. 08%枸橼酸中浸泡作染色前预处 理，将预处理时间设置为10 20分钟，然后取出切片流水冲洗10 20分钟；3)常规HE染色将待染切片置于苏木素染色液中浸泡10分钟，取出切片，自来水 冲洗，用盐酸酒精分化，自来水冲洗；然后将切片浸泡于0. 5%氨水中约30sec返蓝，自 来水冲洗；将切片浸泡于0. 5%水伊红染色液中5min后用自来水洗；然后将切片浸泡于无 水酒精中2分钟；取出切片，将其浸泡于新的无水酒精中1分钟；取出切片，将其浸泡于新 的无水酒精中浸泡1分钟；取出切片，将其浸泡于二甲苯透明剂中2 5分钟；然后取出切 片，置于通风橱中晾干，中性树胶封片。其中所述的用盐酸酒精分化的具体方法是将 切片该溶液中浸泡约30秒钟 1分钟，褪去苏木素不应着色部分的颜色，使本来苏木素应 该着色的成分更清晰；其中所述的将切片浸泡于0. 5%水伊红染色液中5min后用自来水洗 的具体方法是将切片连同染色架一起在自来水中提拉4次，每次2秒种。3.结果经本发 明方法处理后的切片颜色鲜艳，红蓝对比鲜明，见图4、图5。
权利要求
一种使褪色的病理HE切片恢复颜色的方法，包括以下步骤步骤一用二甲苯溶解褪色的病理HE切片上的封片胶；步骤二依次用无水酒精和95％酒精浸泡切片以置换切片组织中的二甲苯，然后用自来水冲洗切片；步骤三将切片置于枸橼酸溶液中浸泡作染色前预处理，然后再用自来水冲洗切片；步骤四对切片进行常规HE染色。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一所述的用二甲苯溶解褪色的病理 HE切片上的封片胶的具体方法是将褪色的病理HE切片浸泡于二甲苯中，3 4天后，去除 盖玻片，再在二甲苯中继续浸泡一天。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二所述的依次用无水酒精和95%酒 精浸泡切片以置换切片组织中的二甲苯，然后用自来水冲洗切片的具体方法是将切片置 于无水酒精中浸泡2小时，取出切片放入新的无水酒精中继续浸泡30分钟，将切片取出后 再放入95%酒精中浸泡10分钟，然后用自来水冲洗切片。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三所述的将切片置于枸橼酸溶液中 浸泡作染色前预处理，然后再用自来水冲洗切片的具体方法是；将切片置于0. 08%枸橼酸 溶液中浸泡10-20分钟，然后将切片取出用自来水冲洗10-20分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤四所述的对切片进行常规HE染色的 具体方法是将切片在苏木素染色液中浸泡10分钟，取出切片，用自来水冲洗，然后用 盐酸酒精分化，再用自来水冲洗；然后将切片浸泡于0. 5%氨水中30秒钟返蓝，用自来水冲 洗切片，再将切片于0. 5%水伊红染色液中浸泡5分钟，用自来水洗切片，然后将切片浸泡 于无水酒精中2分种；取出切片，将其浸泡于新的无水酒精中1分钟；取出切片，将该切片 置于新的无水酒精中浸泡Imin ；取出切片，再将该切片浸泡于二甲苯透明剂中2 5分钟， 然后取出切片，置于通风橱中晾干，用中性树胶封片。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的用盐酸酒精分化的具体方法 是将切片在盐酸酒精溶液中浸泡30秒钟至1分种，褪去苏木素不应着色部分的颜色， 使本来苏木素应该着色的成分更清晰。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将切片于0.5%水伊红染色液中浸泡5分 钟后用自来水洗切片的具体方法是将切片连同染色架在自来水中提拉数次，每次1至3秒 钟。
全文摘要
本发明提供了一种使褪色的病理HE切片恢复颜色的方法，将褪色的病理HE切片浸泡于二甲苯中，3～4天后，去除盖玻片和标签纸，再在二甲苯中继续浸泡一天，置于无水酒精中浸泡2小时，再置于新的无水酒精中浸泡30分钟，然后再用95％酒精浸泡10分钟，用自来水冲洗后于枸橼酸溶液中浸泡10-20分钟，取出用自来水冲洗约20分钟，然后进行常规HE染色。经本发明方法处理过的褪色的病理HE切片，颜色鲜艳，红蓝对比鲜明。
文档编号G01N1/30GK101923019SQ20101023814
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月27日 优先权日2010年7月27日
发明者倪娟, 敖启林, 瞿智玲, 苏铁芬 申请人:华中科技大学