专利名称：胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法
技术领域：
本发明涉及药品的质量检测方法，特别是一种胎盘多肽注射液的多肽含量测定方 法。
背景技术：
胎盘在《本草纲目》上称为紫河车，具有“安神养血、补气、益精、解毒、补血的作用 的功效，久服者，耳聪目明，须发黑，延年益寿，有夺造化之”。紫河车作为药用已有数百年 历史，且在不断延伸扩展。胎盘多肽注射液是以健康产妇的新鲜胎盘为原料，经先进的生物 技术获得的小容量生物制剂，含有多种营养素、生长因子及免疫因子等，这些大量的活性成 分帮助协调、提高自身免疫，增强新陈代谢，促进受损细胞和创伤的自我修复和愈合。具有 抗病毒、抗感染、抗过敏、抗突变、抗肿瘤、调节内分泌等治疗及预防保健作用。胎盘多肽注 射液不但在临床上用于多种疾病的治疗和预防，还广泛用于医学美容等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法， 该测定方法简便、快速、准确率高，适用于大生产中对胎盘多肽注射液中多肽含量控制，从 而确保了胎盘多肽注射液的疗效和临床应用的安全性。本发明是这样实现的胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，采用二辛可宁酸测 定法，以牛血清蛋白为对照制备对照品溶液，向对照品溶液中加入定量的碱性铜试液，测定 其吸光度，绘制标准曲线；按对照品溶液的方法制备胎盘多肽注射液的供试品溶液，并测定 其吸光度；通过标准曲线法测定胎盘多肽注射液中多肽的含量。牛血清蛋白的浓度为0. 15 0. 25mg/ml。配制碱性铜试液所用试药包含二辛可宁酸，无水碳酸钠，酒石酸钠，氢氧化钠，碳 酸氢钠，硫酸铜以及纯化水；配制方法为，将二辛可宁酸1. 8 2. 2g、无水碳酸钠3. 2 3. 8g、酒石酸钠0. 3 0. 35g、氢氧化钠0. 6 1. 0g以及碳酸氢钠1. 8 2. 0g分别加入到 175 185ml的纯化水中溶解，得到混合溶液，用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠调节混合溶液的 pH值至10. 75 11. 5，再加入纯化水使混合溶液的总体积至190 210ml作为甲液；取硫 酸铜0. 8 1. 2g，并加入纯化水溶解并稀释至20 30ml，作为乙液；临用前取50ml甲液和 lml乙液混勻，即得碱性铜试液。绘制标准曲线，精密量取牛血清蛋白对照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8及1. 0ml,分 别放置在具塞试管中，各加入纯化水至2. 0ml，再加入碱性铜试液4. 0ml混勻，在36. 5 37. 5°C的水浴中反应28 32min后，在常温下冷却至室温，测定吸光度，同时以空白溶液作 对照，绘制标准曲线。空白溶液的制备为，将纯化水2. 0ml及碱性铜试液4. 0ml混勻，并将其在36. 5 37. 5°C的水浴中反应28 32min后，在常温下冷却至室温，即得到空白溶液。测定所用的吸收波长为562nm。
胎盘多肽注射液的取用量为2. 0ml。为了确保本发明含量测定方法科学、合理、可行，对其进行了一系列的试验研究和 考察
一、仪器与试药
1、仪器紫外分光仪(^"ih/^ )，水浴锅(北京光明医疗器械厂)等。2、试药胎盘多肽注射液(贵阳黔峰生物制品有限责任公司)，牛血清蛋白(& 公司)，二辛可宁酸公司)，无水碳酸钠、酒石酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠和硫酸铜均为 国产分析纯，纯化水为自制。二、试验方法及结果 1、碱性铜试液配制
取二辛可宁酸2. 0g、无水碳酸钠3. 54g、酒石酸钠0. 32g、氢氧化钠0. 8g和碳酸氢钠 1. 9g，分别将它们加入180ml纯化水溶解，得到混合溶液，用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶液 调节混合溶液的PH值至11. 25，加水至200ml作为甲液；取硫酸铜1. 0g加纯化水溶解并稀 释至25ml作为乙液。临用前，取50ml甲液和lml乙液混勻，即得到试验所需的碱性铜试液。2、对照品溶液的制备
精密称取牛血清蛋白对照品10mg，置50ml量瓶中，加纯化水适量，溶解，稀释至刻度， 即得。3、标准曲线绘制及曲线方程
精密量取牛血清蛋白对照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分别置于具塞试管中，各加 入纯化水至2. 0ml，再加入碱性铜试液4. 0ml混勻，在37士0. 5°C水浴反应30士2min，在常温 下冷却至室温，同时以空白溶液作对照，按分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A) 在562nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品的量为横坐标绘制标准曲线，并 求出标准曲线方程。4、含量测定
精密量取胎盘多肽注射液2. 0ml，照标准曲线的制备项下的方法，加入碱性铜试液 4. 0ml混勻，在37 士 0. 5°C水浴反应30 士 2min，在常温下冷却至室温，在562nm的波长处测定 吸光度，自标准曲线或标准曲线方程中计算出胎盘多肽注射液的含量。5、线性关系考察
精密量取牛血清蛋白对照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分别置具塞试管中，加纯化 水至2. 0ml，再加入碱性铜试液4. 0ml混勻，37°C水浴准确反应30min，放冷至室温，同时以 空白溶液作对照，照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)在562nm的波长处测 定吸光度，以吸光度(y)为纵坐标，对照品的量(x)为横坐标，得回归方程y = 3. 1073x + 0. 0306(r = 0.9997)。结果见表1和图1，结果表明，牛血清蛋白在0. 0409 0. 2046mg范 围内线性关系良好。表1不同浓度对照品吸光度
精密量取同一批次(20071070)样品各1ml于9支试管中，分别加入浓度为0. 2046mg/ ml的对照品0.6ml，加纯化水0.4ml，制成回收样品。按上述测定方法进行测定，计算，结果 见表5。 表5回收率实验结果
6、精密度考察
精密量取牛血清蛋白对照品溶液(0. 2046mg/ml)0. 4ml，在上述条件下，重复测定5次， 记录吸光度值，结果见表2，牛血清蛋白RSD为0. 11%，说明有良好的精密度。表2精密度考察结果
7、稳定性考察
精密量取牛血清蛋白对照品溶液(0. 2046mg/ml)0. 4ml，在上述条件下，分别于第0、 60U20min进行测定，结果见表3，牛血清蛋白RSD为0. 71%，说明稳定性良好。表3稳定性考察结果
8、重复性试验
取同一批胎盘多肽注射液(20011070) 5份，按上述测定方法进行测定，记录吸光度值， 计算，结果见表4，胎盘多肽RSD为1. 08%，说明有良好的重现性。
表4重复性试验结果
5
10、样品含量测定
精密量取10批次胎盘多肽注射液各2ml，按上述测定方法进行测定，结果见表6。
表6胎盘多肽注射液含量测定结果
本发明的有益效果本发明建立了胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，该方法采用 二辛可宁酸测定法，即以牛血清蛋白为对照品，采用标准曲线法对胎盘多肽注射液中的多 肽成分进行含量测定。该方法精密度高，根据上述的各项试验结果中可以看出，本发明所选 用的碱性铜试液的各组分对胎盘多肽注射液的测试结果干扰性小，该碱性铜试剂明显针对 胎盘多肽注射液的检测具有专一性，整个测试的重现性好，准确度高，可有效测定胎盘多肽注射液的含量，从而确保其临床用药的有效性及安全性。
附图1为牛血清蛋白线性关系。下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的说明。
具体实施例方式本发明的实施例1 胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，采用二辛可宁酸测定 法，取二辛可宁酸2. 0g、无水碳酸钠3. 54g、酒石酸钠0. 32g、氢氧化钠0. 8g及碳酸氢钠
1.9g，分别将它们加入180ml纯化水中溶解，得到混合溶液，用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶 液调节混合溶液的PH值至11. 25，加水至200ml作为甲液；取硫酸铜1. 0g加纯化水溶解并 稀释至25ml作为乙液；临用前，取50ml甲液和1ml乙液混勻，得到碱性铜试液；精密称取 牛血清蛋白对照品10mg，置50ml量瓶中，加入纯化水使牛血清蛋白对照品溶解，稀释至量 瓶的刻度，即制成浓度为0. 2mg/ml的牛血清蛋白对照品溶液；精密量取牛血清蛋白对照品 溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分别置于具塞试管中，各加入纯化水至2. 0ml ；分别向每个 具塞试管中加入4. 0ml的碱性铜试液混勻，在37士0. 5°C水浴反应30士2min，在常温下冷却 至室温；同时用纯化水至2. 0ml与碱性铜试液4. 0ml按上述步骤制成空白溶液作对照，按分 光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)在562nm的波长处测定吸光度，以吸光度为 纵坐标，对照品的量为横坐标绘制标准曲线，求出标准曲线方程；精密量取胎盘多肽注射液
2.0ml，照标准曲线的制备项下的方法，加入碱性铜试液4. 0ml混勻，在37士0. 5°C水浴反应 30士2min，在常温下冷却至室温，在562nm的波长处测定吸光度，自标准曲线或标准曲线方 程中计算出胎盘多肽注射液的含量。实施例2 胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，采用二辛可宁酸测定法，取二辛 可宁酸1. 8g、无水碳酸钠3. 2g、酒石酸钠0. 3g、氢氧化钠0. 6g及碳酸氢钠1. 8g，分别将它 们加入175ml的纯化水中溶解，得到混合溶液，用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶液调节混合 溶液的PH值至10. 75，加纯化水至190ml作为甲液；取硫酸铜0. 8g加纯化水溶解并稀释 至20ml作为乙液；临用前，取50ml甲液和1ml乙液混勻，得到碱性铜试液；精密量取牛血 清蛋白对照品7. 5mg，置50ml量瓶中，加入纯化水使牛血清蛋白对照品溶解，稀释至量瓶的 刻度即制成浓度为0. 15mg/ml的牛血清蛋白对照品溶液；精密量取牛血清蛋白对照品溶液 0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分别置于具塞试管中，各加入纯化水至2. 0ml ；分别向每个具塞 试管中加入4. 0ml的碱性铜试液混勻，在37士0. 5°C水浴反应30士2min，在常温下冷却至 室温；同时用空白溶液作对照，按分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)在562nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品的量为横坐标绘制标准曲线，求出标准曲 线方程；精密量取胎盘多肽注射液2. 0ml，照标准曲线的制备项下的方法，加入碱性铜试液 4. 0ml混勻，在37 士 0. 5°C水浴反应30 士 2min，在常温下冷却至室温，在562nm的波长处测定 吸光度，自标准曲线或标准曲线方程中计算出胎盘多肽注射液的含量。实施例3 胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，采用二辛可宁酸测定法，取二 辛可宁酸2. 2g、无水碳酸钠3. 8g、酒石酸钠0. 35g、氢氧化钠1. 0g及碳酸氢钠2. 0g，分别 将它们加入185ml的纯化水中溶解，得到混合溶液，用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠溶液调节混合溶液的PH值至11. 5，加纯化水至210ml作为甲液；取硫酸铜1. 2g加水溶解并稀释至 30ml作为乙液；临用前，取50ml甲液和1ml乙液混勻，得到碱性铜试液；精密量取牛血清 蛋白对照品12. 5mg，置50ml量瓶中，加入纯化水使牛血清蛋白对照品溶解，稀释至量瓶的 刻度即制成浓度为0. 25mg/ml的牛血清蛋白对照品溶液；精密量取牛血清蛋白对照品溶液 0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0ml，分别置于具塞试管中，各加入纯化水至2. 0ml ；分别向每个具塞 试管中加入4. 0ml的碱性铜试液混勻，在37士0. 5°C水浴反应30士2min，在常温下冷却至 室温；同时用空白溶液作对照，按分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)在562nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，对照品的量为横坐标绘制标准曲线，求出标准曲 线方程；精密量取胎盘多肽注射液2. 0ml，照标准曲线的制备项下的方法，加入碱性铜试液 4. 0ml混勻，在37 士 0. 5°C水浴反应30 士 2min，在常温下冷却至室温，在562nm的波长处测定 吸光度，自标准曲线或标准曲线方程中计算出胎盘多肽注射液的含量。
权利要求
一种胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，其特征在于采用二辛可宁酸测定法，以牛血清蛋白为对照制备对照品溶液，向对照品溶液中加入定量的碱性铜试液，测定其吸光度，绘制标准曲线；按对照品溶液的方法制备胎盘多肽注射液的供试品溶液，并测定其吸光度；通过标准曲线法测定胎盘多肽注射液中多肽的含量。
2.根据权利要求1所述的胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，其特征在于牛血清 蛋白的浓度为0. 15 0. 25mg/ml。
3.根据权利要求1所述的胎盘多肽注射液的含量测定方法，其特征在于配制碱性铜 试液所用试药包含二辛可宁酸，无水碳酸钠，酒石酸钠，氢氧化钠，碳酸氢钠，硫酸铜以及纯 化水；配制方法为，将二辛可宁酸1. 8 2. 2g、无水碳酸钠3. 2 3. 8g、酒石酸钠0. 3 0. 35g、氢氧化钠0. 6 1. 0g以及碳酸氢钠1. 8 2. 0g分别加入到175 185ml的纯化水 中溶解，得到混合溶液，用氢氧化钠溶液或碳酸氢钠调节混合溶液的PH值至10. 75 11. 5， 再加入纯化水使混合溶液的总体积至190 210ml作为甲液；取硫酸铜0. 8 1. 2g，并加 入纯化水溶解并稀释至20 30ml，作为乙液；临用前取50ml甲液和1ml乙液混勻，即得碱 性铜试液。
4.根据权利要求1所述的胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，其特征在于绘制标 准曲线，精密量取牛血清蛋白对照品溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8及1. 0ml，分别放置在具塞试管 中，各加入纯化水至2. 0ml，再加入碱性铜试液4. 0ml混勻，在36. 5 37. 5°C的水浴中反应 28 32min后，在常温下冷却至室温，测定吸光度，同时以空白溶液作对照，绘制标准曲线。
5.根据权利要求4所述的胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，其特征在于空白溶 液的制备为，将纯化水2. 0ml及碱性铜试液4. 0ml混勻，并将其在36. 5 37. 5°C的水浴中 反应28 32min后，在常温下冷却至室温，即得到空白溶液。
6.根据权利要求1或4所述的胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，其特征在于测 定所用的吸收波长为562nm。
7.根据权利要求1所述的胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，其特征在于胎盘多 肽注射液的取用量为2. 0ml。
全文摘要
本发明公开了一种胎盘多肽注射液的多肽含量测定方法，采用二辛可宁酸测定法，以牛血清蛋白为对照制备对照品溶液，向对照品溶液中加入定量的碱性铜试液，测定其吸光度，绘制标准曲线；按对照品溶液的方法制备胎盘多肽注射液的供试品溶液，并测定其吸光度；通过标准曲线法测定胎盘多肽注射液中多肽的含量。该方法精密度高，选用的碱性铜试剂的各组分对胎盘多肽注射液的测试结果干扰性小，该碱性铜试剂明显针对胎盘多肽注射液的检测具有专一性，整个测试的重现性好，准确度高，可有效测定胎盘多肽注射液的含量，从而确保其临床用药的有效性及安全性。
文档编号G01N33/68GK101893638SQ201010245588
公开日2010年11月24日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者刘智, 张秋生, 沈国华, 高翔 申请人:贵州益康制药有限公司