专利名称：腹泻性贝类毒素检测方法
技术领域：
本发明属于生物检测方法领域，尤其是涉及一种有着较高灵敏度的腹泻性贝类毒 素检测方法。
背景技术：
当前，我国用于腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning，DSP)的检 测方法主要有小鼠生物法及酶联免疫吸附检测法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)。小鼠生物法的检测原理贝类样品用丙酮、乙醚提取后，经减压蒸干，以吐 温-60生理盐水溶解后注射入小鼠腹腔，观察小鼠存活情况，计算其毒力。ELISA的检测原理测定的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对大田软海绵 酸(okadaic acid, OA) (DSP的主要成分)抗体的捕捉抗体，加入标准或样品溶液及OA酶标 记物，游离OA与OA酶标记物竞争OA抗体，同时OA抗体与捕捉抗体连接。洗涤后，将底物 和发色剂加入到孔中并且孵育。加入终止液后，在450nm波长下测定吸光度值。小鼠生物法是当前我国腹泻性贝类毒素的标准检测方法，但其不足之处显而易 见，如(1)动物使用带来的伦理问题，受到动物保护组织的强烈反对；(2)灵敏度低，可比 性和重复性差，检测结果与小鼠的品系、体重及状态等有关，难以形成统一的检测标准；(3) 准确性差，该方法只能检测出毒力的大小，无法确定毒素的成分和含量，容易因高浓度的锌 或不饱和脂肪酸的存在导致假阳性；(4)样品提取过程复杂。ELISA法主要存在以下不足(1)抗体往往只针对主要成分，其类似物可能会产生 交叉反应，从而出现假阳性或对毒性的估计不准确；(2)单克隆抗体的制备困难，试剂盒价 格昂贵；(3)我国目前尚无商品化ELISA试剂盒可售。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于细胞F-actin检测的腹泻性贝类毒素检测方法， 解决现有技术存在的缺陷。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种腹泻性贝类毒素检测方法，包括步骤A)研究腹泻性贝类毒素的主要成分大田软海绵酸(OA)的细胞毒性效应，通过 Cell Counting Kit_8试剂盒法、细胞形态学观察法及流式细胞术等方法，从细胞增殖、细 胞凋亡等方面探讨腹泻性贝类毒素的主要成分大田软海绵酸(OA)对HL-7702肝细胞毒性 效应； B)利用荧光染料鬼笔环肽能结合F-actin聚合体的原理，根据OA作用HL-7702肝 细胞的剂量_反应关系，选用不同浓度的OA染毒细胞，通过多功能酶标仪定量检测发现OA 能明显破坏HL-7702肝细胞的F-actin的聚合，从而建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin 解聚的标准曲线；
C)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，初步建立 腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测法，确定可能的检出限范围；D)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的三种成分麻痹性贝类毒素的主要成分石 房蛤毒素(saxitoxin，STX)、遗忘性贝类毒素的主要成分软骨藻酸(domoic acid, DA)、 虾夷扇贝毒素(yessotoxin, YTX)中的一种或者几种，分别以不同浓度(5、10、20、40、80、 160nmol/L)作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大 小确定该方法测定OA含量的特异性；E)同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别 进行腹泻性贝类毒素的检测，并进行结果比对，确定细胞F-actin检测法开展贝类样品检 测的实用性；F)对检测样品加标回收。更优的是所述步骤A)包括Al)待细胞生长至70-80%汇合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细 胞，离心后重悬使其密度达3-5 X IO5个/mL，接种l_2mL细胞悬液于事先铺盖玻片的6孔板 中，置于培养箱中培养；培养24h后，弃去培养基，分别使用5、10、20nmol/L OA染毒HL-7702 肝细胞，并设甲醇对照；OA染毒24h后，PBS洗涤2-3次，使用Oregon Green 5 Hphalloi din 荧光标记后，通过激光共聚焦显微镜进行观察荧光标记的F-actin ；A2)利用TECAN Infiite M1000多功能酶标仪定量检测OA作用细胞后F-actin解 聚效应大小，建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线。所述的步骤Al)染色包括All)加入 400-500 μ L3. 7% 甲醛溶液固定 IOmin ；Α12) PBS 洗涤 2-3 次，加入 600-800 μ L 0. 1% Triton X-100 透化 4_5min ；A13)PBS 洗涤 2-3 次，加入 PBS 稀释的 Oregon Green 514phalloidin 储液，避光 染色 15-20min ；A14)PBS洗涤2_3次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴甘油封存液的载玻片上。更优的是所述的步骤Al)染色包括All)加入 400-500 μ L3. 7% 甲醛溶液固定 IOmin ；Α12) PBS 洗涤 2-3 次，加入 600-800 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4_5min ；A13)PBS 洗涤 2-3 次，加入 PBS 稀释的 Oregon Green 514phalloidin 储液，避光 染色 15-20min ；A14)PBS洗涤2_3次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴甘油封存液的载玻片上。更优的是所述步骤A2) OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线A21)待细胞生长至70-80%汇合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细 胞，离心后重悬使其密度达3-5 X IO4个/mL，接种80-100 μ L细胞悬液于96孔黑板中，置于
培养箱中培养；Α22)培养24h后，弃去培养基，分别使用 1. 25,2. 5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒 HL-7702肝细胞，同时设甲醇对照和空白对照，各试验组设6个复孔；A23) OA染毒24h后，PBS洗涤2_3次，对其进行染色，使用TECAN InfiniteMlOOO多功能酶标仪进行激发波长和发射波长的3D扫描；A24)可信区内选择最大相对荧光单位值对应的波长即为最佳激发波长和最佳发 射波长，分别为Ex = 511nm, Em = 529nm ；最佳激发波长和最佳发射波长条件下，进行荧光 强度的扫描；A25)以OA浓度为横坐标，解聚率为纵坐标，建立半对数坐标，建立OA诱导 HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线。更优的是所述的步骤B)中，使用甲醇溶剂进行贝类样品的提取时甲醇的浓度为 1-4%。本发明与现有技术相比，存在如下优点和有益效果本发明建立的细胞F-actin检测法与小鼠生物法相比(1)以细胞为实验对象，避免了实验动物的使用，符合3R原则；(2)灵敏度高；(3) 特异性较好；(4)重复性好；(5)样品提取简便，基质效应低。本发明建立的细胞F-actin检测法与ELISA法相比(1)不存在抗体的交叉反应性，特异性较好；(2)检测限达到2. 01 μ g/100g，低于 ELISA法的检测限(10 μ g/100g)，灵敏度更高。
图1为本发明实施例中不同浓度OA处理HL-7702肝细胞的激光共聚焦显微镜扫 描结果；图 Ι-a 为对照；图 l_b 为 5nmol/L ；图 l_c 为 IOnmol/L ；图 l_d 为 20nmol/L ；图2为本发明实施例中OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线；图3为本发明实施例中其他三种贝类毒素对HL-7702肝细胞F-actin检测法的影 响示意图；图4为本发明实施例中甲醇对HL-7702肝细胞F-actin检测法的影响。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明实施例1建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线本实施例以HL-7702肝细胞为研究对象，使用OA标准品进行DSP细胞检测方法的研究。使用Oregon Green 514phalloidin荧光标记F-actin后，使用激光共聚焦显微 镜进行观察。实验方法待细胞生长至80%汇合度，0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬(密 度为5 X IO5个/mL)，接种2mL细胞悬液于事先铺盖玻片的6孔板中，置于培养箱中培养。培 养24h后，弃去培养基，分别使用5、10、20nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，设甲醇对照。OA 染毒24h后，PBS洗涤2次，参照Phallotoxins (Cat. No. 07465)的方法进行染色。主要步骤为(1)加入400 μ L3. 7%甲醛溶液固定IOmin ；(2) PBS 洗涤 2 次，加入 800 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4min ；
(3)PBS 洗涤 2 次，加入 490 μ LPBS 及 10 μ LOregon Green 514phalloidin 储液， 避光染色20min ；(4)PBS洗涤2次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴90%甘油封存液的载玻片 上，使用激光共聚焦显微镜进行观察并成像。结果如图1所示，Oregon Green 514phalloidin荧光标记的F-actin呈纤维状， 各试验组细胞均有纤维状物质能显示绿色荧光，但试验组细胞随着OA浓度的增加，绿色荧 光强度明显减弱。由于Oregon Green 514phalloidin仅与聚合态的F-actin特异性结合， 因此在OA的作用下，细胞F-actin存在解聚现象。利用TECAN Infiite M1000多功能酶标仪定量检测OA作用细胞后F-actin解聚 效应大小，建立用于检测DSP的细胞F-actin检测法。实验方法待细胞生长至80%汇合度，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离心后重悬 (密度为5 X IO4个/mL)，接种100 μ L细胞悬液于96孔黑板中，置于培养箱中培养。培养 24h后，弃去培养基，分别使用1. 25,2. 5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞， 同时设甲醇对照和空白对照，各试验组为6个复孔。OA染毒24h后，PBS洗涤2次，参照 Phallotoxins (Cat. No. 07456)的方法进行染色。主要步骤为(1)加入100 μ L3. 7%甲醛溶液固定IOmin ；(2) PBS 洗涤 2 次，加入 200 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4min ；(3) PBS洗涤 2 次，加入95μ LPBS及 5μ L Oregon Green 514phalloidin 储液，避 光染色20min ；(4) PBS洗涤2次，TECAN Infinite M1000多功能酶标仪进行激发波长和发射波长 的3D扫描；(5)最佳激发波长和最佳发射波长条件下，进行荧光强度的扫描。实验结果TECAN Infinite M1000多功能酶标仪进行激发波长和发射波长的3D扫描，可信区 内选择最大相对荧光单位值对应的波长即为最佳激发波长和最佳发射波长(Ex = 511nm, Em = 529nm)。以OA浓度为横坐标，解聚率为纵坐标，建立半对数坐标，如图2所示。从图 中可看出，OA可明显导致HL-7702细胞F-actin的解聚，且解聚率与OA浓度在2. 5 40nM 范围内具有线性关系(R2 = 0. 993)。SPSS 13. 0统计学软件进行单因素方差分析，OA浓度 低至1. 25nM时，与对照组相比，差异不具有统计学意义(P > 0. 05)。表1不同浓度OA对荧光强度值的影响
权利要求
一种腹泻性贝类毒素检测方法，包括步骤A)培养人HL 7702肝细胞，选用不同浓度的大田软海绵酸(okadaic acid，OA)染毒细胞，检测OA作用细胞后F 肌动蛋白(F actin)解聚效应大小，从而建立OA诱导HL 7702肝细胞F actin解聚的标准曲线；B)根据HL 7702肝细胞的F actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分石房蛤毒素(saxitoxin，STX)、软骨藻酸(domoic acid，DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin，YTX)中的一种或几种，分别以不同浓度作用HL 7702肝细胞，通过检测其破坏HL 7702肝细胞F actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性。
2.如权利要求1所述的腹泻性贝类毒素检测检测方法，还包括步骤D)同步使用小鼠生物法、ELISA法及细胞F-actin检测法对采集的贝类样品分别进行 腹泻性贝类毒素检测，并进行结果比对；F)对检测样品加标回收。
3.如权利要求1或者2所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是所述步骤C)选用 不同浓度石房蛤毒素(saxitoxin, STX)、(domoic acid, DA)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin, YTX)中的一种或几种浓度分别为5、10、20、40、80、160nmol/L。
4.如权利要求1 3任一项所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是所述步骤A)包括Al)待细胞生长至70-80%汇合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞， 离心后重悬使其密度达3-5 X IO5个/mL，接种l_2mL细胞悬液于事先铺盖玻片的6孔板 中，置于培养箱中培养；培养18_24h后，弃去培养基，分别使用5、10、20nmol/L OA染毒 HL-7702肝细胞，并设甲醇对照；OA染毒18_24h后，PBS洗涤2_3次，使用Oregon Green 514phalloidin荧光标记后，通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记的F-actin ；A2)利用TECAN Infiite M1000多功能酶标仪定量检测OA作用细胞后F-actin解聚效 应大小，建立OA诱导HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线。
5.如权利要求4所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是所述的步骤Al)染色包括All)加入400-500 μ L3. 7%甲醛溶液固定IOmin ；Α12) PBS 洗涤 2-3 次，加入 600-800 μ L0. 1% Triton X-100 透化 4_5min ；A13)PBS洗涤2-3次，加入PBS稀释的Oregon Green 514phalloidin储液，避光染色 15-20min ；A14)PBS洗涤2-3次，将6孔板中的盖玻片取出倒扣于滴甘油封存液的载玻片上。
6.如权利要求4所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是所述步骤A2)0A诱导 HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线A21)待细胞生长至70-80%汇合度，用0. 125-0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，离 心后重悬使其密度达3-5 X IO4个/mL，接种80-100 μ L细胞悬液于96孔黑板中，置于培养 箱中培养；Α22)培养24h后，弃去培养基，分别使用1. 25、2. 5、5、10、20、40、80nmol/L OA染毒HL-7702肝细胞，同时设甲醇对照和空白对照，各试验组设6个复孔；A23) OA染毒24h后，PBS洗涤2_3次，对其进行染色，使用TECAN InfiniteMlOOO多功 能酶标仪进行激发波长和发射波长的3D扫描；A24)可信区内选择最大相对荧光单位值对应的波长即为最佳激发波长和最佳发射波 长，分别为Ex = 511nm, Em = 529nm ；最佳激发波长和最佳发射波长条件下，进行荧光强度 的扫描；A25)以OA浓度为横坐标，解聚率为纵坐标，建立半对数坐标，建立OA诱导HL-7702肝 细胞F-actin解聚的标准曲线。
7.如权利要求1或者2所述的腹泻性贝类毒素检测方法，其特征是使用甲醇溶剂进 行贝类样品的提取，所述甲醇的浓度为1_4%。
全文摘要
本发明公开了一种腹泻性贝类毒素检测方法，包括步骤A)建立大田软海绵酸(okadaic acid，OA)诱导HL-7702肝细胞F-肌动蛋白(F-actin)解聚的标准曲线；B)根据HL-7702肝细胞的F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围；C)选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一种或几种作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性。本发明所述的检测方法，具有优点(1)以细胞为实验对象，避免了实验动物的使用，符合3R原则；(2)灵敏度高；(3)特异性较好；(4)重复性好；(5)样品提取简便，基质效应低。
文档编号G01N1/30GK101975768SQ20101026683
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月27日 优先权日2010年8月27日
发明者刘建军, 庄志雄, 彭朝琼, 袁建辉, 黄海燕, 黄爱君, 黄薇 申请人:深圳市疾病预防控制中心