专利名称：麻痹性贝类毒素标准样品及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种贝类毒素标准样品及其制备方法和应用，具 体地说，涉及一种麻痹性贝类毒素标准样品及其制备方法和应用。
背景技术：
近年来贝类毒素已成为一个重要的公共卫生问题，已有多个国家对食品中贝毒限 量进行控制，WHO也发布了关于预防贝毒危害、保护公共卫生的草案。我国是海洋经济贝类 生产和出口大国，年产贝类约1100万吨，占世界总量70%。近10多年来，由于工业污染等 原因导致我国近海赤潮频发，严重影响了海洋水产养殖发展和出口贸易。欧盟自1995年发 生食用中国进口贝类中毒事件以后，对我国的贝类进口已采取无限期闭关；韩国、日本、美 国等国也对我国进口贝类及相关产品制定了严格的限制措施。贝类毒素已成为妨碍我国沿 海渔业经济发展的一大公害，贝类食品的安全是重大公共卫生问题，是制约我国海洋渔业 经济发展的一个重要因素。贝类毒素的种类很多，目前发现的主要有麻痹性贝类毒素(paralytic shellfishpoisoning, PSP)、腹泻性贝类毒素(DSP)、神经性贝类毒素(NSP)和记忆缺失性 贝类毒素(ASP)四大类。麻痹性贝类毒素PSP系因人误食含有这种毒素的贝类后引起以 外周神经系统麻痹为初始症状的中毒效应而得名，是毒性很强的一类毒素，作用机理和毒 性与河豚毒素相似，是一种神经肌肉麻痹剂，通过阻断细胞纳离子通道，造成神经系统传输 障碍而产生麻痹作用。对人的中毒量为300-3000MU，致死量为600 5000MU，潜伏期为 20分钟，其中石房蛤毒素是眼镜蛇毒素毒性的80倍，0. 54mg 0. 90mg足以使人致死，目 前尚无对症解药。自1992年爱尔兰北岛Whangarei港发生的贝类中毒事件首次被确认为 麻痹性贝类神经毒素以来，全世界每年都有该类毒素引起中毒事件的报道。目前，麻痹性 贝类毒素已成为世界上分布最广、事故发生频率最高、危害程度最大的一类毒素。该类毒 素主要是由甲藻类中的亚历山大藻(Alexandrium)以及膝沟藻属(Gonyaularx)、原甲藻 属(Prorocentrum)等一些形成赤潮的种类产生的一系列氨基甲酸脂类衍生物，为非结晶、 水溶性、高极性、不挥发的小分子物质。它们在酸性条件下稳定，碱性条件下发生氧化，毒 性消失，热稳定性好，不能被人的消化酶所破坏。PSP是一类剧毒杂环有机化合物，目前已 被分离出约有20多种，依基团的相似性分为三类，分别为(1)氨甲酰基类毒素(carbamoyl toxin)，如石房蛤毒素(STX)、新石房蛤毒素(neo-STX)和膝沟藻毒素(GTX) ； (2)氨甲酰 基-N-磺基类毒素(N-sulfo carbamoyl toxin)如 C1、C2、C3、C4、GTX_5、GTX_6 ； (3)去氨甲 酰基类毒素(decarbamoyl toxin简称dcSTX)，它们是以石房蛤毒素(Saxitoxin简称STX) 为骨架、因取代基不同而衍生出的多种化合物的统称，如图1所示，由于多叠六元环基本结 构衍生出的个别位置上基团的差别，各组分的毒性略有差别。目前，人们对赤潮及贝类毒素还无法进行有效的控制，因此预防和预报是减轻其 危害的有效手段。WHO推荐的最有效的预防方法是对水源或收获区域开展控制监测程序。 在贝类生产的各个环节，随时监测贝类毒素的变化是至关重要的。已经建立了很多检测PSP的方法，如生物检测法、免疫分析法、细胞毒性检测法及化学分析法等。受各种因素的 限制，现今最有效的，也是被各国官方普遍认可的贝毒检测方法仍是小鼠生物法。在我国的 国家标准和检验检疫行业标准中也是采用小鼠生物法，该方法需要使用大量的含有多组分 的PSP标准品满足质控和定量要求。但是，PSP标准品都是单组分的标准纯品，无基质，价 格相当昂贵，每个组分高达约6000元/lOOiig，此外，PSP为剧毒物质，世界各国对贝类毒素 的出入境和使用均有严格的管理规定。研制麻痹性贝类毒素实物标准样品可以满足对贝类 毒素标准样品不断日益扩大的市场需求，解决国内外贝类产品检测实验室的严重缺乏贝类 毒素标准样品的需求，对提高食品安全检测技术、解决技术壁垒、保障食品安全起到重大的 作用，同时也提高我国在国际上的影响力。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种麻痹性贝类毒素标准样品的制备方法。本发明的第二个目的在于提供由该方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品。本发明的第三个目的在于提供该麻痹性贝类毒素标准样品的应用。本发明的麻痹性贝类毒素标准样品的制备方法，包括以下步骤A)、将贝类样品、去杂质取贝肉；B)、在所述贝肉中加入蒸馏水及盐酸溶液，调节pH为1. 5 5. 0，均质、混勻后得到 勻浆液；C)、将所述勻浆液预冷后进行初次冷冻干燥得到粗样；D)、研磨所述粗样后过筛；E)、将过筛后的样品预冷后进行再次冷冻干燥得到标准样品；F)、封装所述标准样品；G)、检验所述标准样品的均勻性和稳定性；H)、对所述标准样品的PSP含量进行定值；其中，所述贝类样品包含PSP阳性的贝类样品。优选的，所述盐酸溶液的浓度为0. 1 0. 3mol/L ；所述步骤C中的预冷 温度为-196 °C -20°C，相应预冷时间为30min 24h ；所述步骤E中的预冷温度 为-196°C -20°C，相应预冷时间为lOmin 6h ；所述过筛的目数为30 60目。进一步的，本发明的制备方法，取PSP阴性的扇贝，将经步骤(A) ⑶后得到 的PSP阴性样品与过筛后的PSP阳性样品按比例混合后，置于-196°c -20°c相应预冷 lOmin 6h后进行再次冷冻干燥，彻底除去水分，进行封装得到麻痹性贝类毒素标准样品。此外，以PSP阴性的扇贝和PSP阳性的扇贝的贝肉为原料，采用本发明的制备方法 也可得到麻痹性贝类毒素标准样品。根据本发明，提供由上述制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品。根据本发明的制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品，其毒素组分包括C1、C2、 C3、C4、dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4、dcSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、STX、NEO ； PSP 含量为 40-1000MU/g。根据本发明的制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品，用于实验室间麻痹性贝 类毒素测试项目的能力验证活动，还用于定量或定性检测麻痹性贝类毒素，以及用于检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量控制与考核等。
本发明的麻痹性贝类毒素标准样品及其制备方法，填补国内外空白，原料成本低， 且制备方法简单，不涉及昂贵的工艺设备，得到的标准样品为实物标准样品，均勻稳定，易 保存，不仅解决了 PSP成分极易降解的难题，而且势必使得到的麻痹性贝类毒素标准样品 的价格远远小于目前市场上销售的麻痹性贝类毒素标准纯品的价格，确保贝毒检测的有效 性，有利于对贝毒有效监测。本发明的麻痹性贝类毒素标准样品可用于实验室间麻痹性贝 毒测试能力验证，用于定量或定性检测麻痹性贝类毒素，适合于食品、渔监、环保、质检、渔 业、卫生等各个部门使用，可促进水产养殖、加工和贸易发展，确保食品安全，将带来显著的 社会效益和经济效益。
图1为麻痹性贝类毒素的化学结构式。图2为本发明的麻痹性贝类毒素标准样品制备工艺流程图。图3(a) (ν)为本发明的麻痹性贝类毒素标准样品的LC-MS谱图。
具体实施例方式如图2所示，本发明的麻痹性贝类毒素标准样品的制备方法，包括以下步骤(A) 取样、去杂质；(B)酸化、勻浆；(C)初次冷冻干燥；(D)研磨、筛分；(E)再次冷冻干燥；(F) 封装；(G)均勻性和稳定性检验；(H)确定PSP含量。具体的，本发明的麻痹性贝类毒素标准样品的制备方法，包括以下步骤㈧取PSP阳性的扇贝，用清水将贝壳外表彻底洗净，切断闭壳肌，开壳，用重蒸馏 水淋洗内部去除泥沙及其他外来物等杂质，将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取 出全部贝肉；(B)将贝肉加入蒸馏水，及0. 1 0. 3mol/L盐酸溶液使pH在1. 5 5. 0，均质，混 勻得到勻浆液；(C)将勻浆液置于_196°C _20°C相应预冷30min 24h后进行初次冷冻干燥，得 到粗样；(D)将冻干后的粗样进行研磨、预粉碎、细磨后过30 60目筛；(E)将过筛得到的样品置于_196°C _20°C相应预冷IOmin 6h后进行再次冷冻 干燥，彻底除去水分得到标准样品；(F)在恒温恒湿、无菌操作间中，将上述方式获得的标准样品分装于无菌避光瓶中 封盖密封；(G)对样品的均勻性和稳定性检验是验证样品制备过程有效性的主要方法，对封 装后的标准样品进行均勻性和稳定性验证；(H)对标准样品的PSP含量进行定值。进一步的，本发明的制备方法，取PSP阴性的扇贝，将经步骤㈧ ⑶后得到 的PSP阴性样品与过筛后的PSP阳性样品按比例混合后，置于-196°c -20°c相应预冷 IOmin 6h后进行再次冷冻干燥，彻底除去水分后进行封装得到不同PSP含量的麻痹性贝 类毒素标准样品。
此外，以PSP阴性的扇贝和PSP阳性的扇贝的贝肉为原料，采用本发明的制备方法 也可得到麻痹性贝类毒素标准样品。在本发明中，按GB/T 5009.213-2008贝类中麻痹性贝类毒素的测定方法，对扇贝 中的PSP含量进行确定实验，采用的新鲜扇贝的PSP含量> 4MU/g，说明是PSP阳性的样品， 采用的新鲜扇贝的PSP含量< 4MU/g，说明是PSP阴性的样品。以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下 实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常 规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 取PSP阳性的扇贝，其PSP含量为46. 2MU/g，用清水将贝壳外表彻底洗 净，切断闭壳肌，开壳，用蒸馏水淋洗内部去除泥沙及其他外来物等杂质，将闭壳肌和连接 在胶合部的组织分开，仔细取出全部贝肉，加入蒸馏水，及0. 18mol/L盐酸溶液使pH为3， 均质，混勻后置于_80°C预冻至少4小时，采用真空冷冻干燥机(CHRiST Epsilon 2-6D)进 行初次冷冻干燥得到PSP阳性样品，之后进行组织研磨，预粉碎，采用高铝瓷球磨机细磨， 过40目筛后置于-80°C预冻至少4小时，再次进行冷冻干燥，彻底除去水分。在恒温恒湿、 无菌操作间中，将上述方式获得的扇贝冻干粉分装于经160°C干热处理2小时的洁净的5ml 棕色西林瓶中封盖密封。实施例2-5重复实施例1中的制备过程，不同之处仅在于原料的PSP含量、盐酸浓 度、PH、预冷温度、预冷时间及过筛目数，具体实验条件如表1所示。表1实施例2-5的实验条件 采用LC-MS检测实施例1-5制备的样品，结果表明所含毒素组分相同。具体的， 以实施例1制备的标准样品为例，经LC-MS检测，如图3所示，麻痹性贝类毒素标准样品的毒素组分包括 Cl、C2、C3、C4、dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4、dcSTX、GTXl、GTX2、GTX3、 GTX4、GTX5、STX、ΝΕΟ。实施例6均勻性和稳定性检验6. 1样品的均勻性试验随机抽取实施例1制备的16瓶样品，每瓶样品中取做3次重复性检测的样料3组。 采用GB/T 5009. 213-2008中的小鼠生物法测试，分析标准样品的PSP含量，以鼠单位表示。 所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测 试方法和仪器在较短时间内测试。检测结果用单因素多水平方差分析方法进行均勻性评价，采用以下单因素多水平 方差分析用统计学公式，结果如表2和表3所示。为检验样品的均勻性，抽取i个样品，每个样品在重复条件下测试j次。
η 每个样品的测试平均值 全部样品测试的总平均值 测试总次数 样品间平方和坏均方 样品内平方和 自由度= m-1f2 = N-m统计量F比= 表2单因素多水平方差分析结果 表3样品均勻性试验方差分析结果 以上结果可知当α = 0.05，= 15，f2 = 32，查F分布表，F临界值为1.99，因 F比为1. 70 < F临界值1. 99，表明样品内及样品间无显著性差异，说明实施例1制得的标 准样品是均勻的，能够满足质控等实验要求。采用上述相同方法，验证实施例2-5制得的标准样品的均勻性，F比分别为1. 75， 1. 69，1. 46，1. 65均小于F临界值1. 99，表明实施例2_5制得的标准样品内及样品间无显著 性差异，说明标准样品是均勻的，能够满足质控等实验要求。6. 2样品的稳定性检验按照时间间隔前密后疏的抽样原则，分别按下列时间随机选取用于稳定性测试的 包装好的实施例1制备的样品第0、10、20、30、40天，以及第3个月、6个月、9个月。每次 选取3个样品进行测试。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均 勻性测试相同。采用直线模型对检测结果的进行评价，使用如下统计学公式，结果如表4所示。
斜率的估计值A 截距的估计值: 估计I3l的标准偏差 式中 表4样品稳定性检查结果 结果表明，自由度为η-2和P = 0. 95 (95%置信水平)的分布t_因子等于2. 45。由于Ib1I < ta95,n_2 · S(Id1)故斜率不显著的，即未观测到不稳定性，验证实施例1制得的标准样品的稳定性 良好。采用上述相同方法，验证实施例2-5制得的标准样品的稳定性，斜率均不显著，未 观测到实施例2-5制得的标准样品不稳定性，表明实施例2-5制得的标准样品稳定性良好。实施例7PSP含量的定值标准样品研制过程中采用GB/T 5009. 213-2008贝类中麻痹性贝类毒素的测定方 法进行样品的定量检测。采用8个实验室对实施例1的标准样品的PSP含量进行合作定值。对经过均勻性 和稳定性检验合格的样品，随机抽取40瓶，分别分发到8家参加定值试验的实验室，分别由 各实验室选派具有丰富操作经验的试验员，按照统一的试验程序对样品进行PSP含量的检测试验，结果如表5所示。8个实验室的定值数据采用夏皮罗一威尔克(Shapir0-Wilk)检 验法考察其正态性。在近似符合正态性的前提下，再经Grubb’ s法检验确认每个实验室均 不存在异常值，用科克伦(Cochran)检验各实验室定值数据是否等精度，结果表明所有的 数据均通过检验，各实验室测试精度一致。最终确定实施例1中制备的PSP标准样品由8 个实验室测定的均值为698MU/g，采用标准值士扩展不确定度的方式表示定值结果PSP含 量698士13MU/g。表5合作定值实验室测试结果 采用上述相同方法，对实施例2-5的标准样品的PSP含量进行合作定值，采用标准 值士扩展不确定度的方式表示，分别为43士2MU/g、157士9MU/g、383士 15MU/g、990士 IlMU/进一步的，为节约的目的，以及生产更多标准样品，采用PSP阴性样品进行“稀 释”。具体的，取PSP阴性的扇贝，将经步骤(A) (D)后得到的PSP阴性样品与过筛后的 PSP阳性样品混合后，置于_196°C _20°C相应预冷IOmin 6h后进行再次冷冻干燥，彻底 除去水分得到标准样品后进行封装得到麻痹性贝类毒素标准样品。此外，以PSP阴性的扇贝和PSP阳性的扇贝的贝肉为原料，采用本发明的制备方法 也可得到麻痹性贝类毒素标准样品。实施例8麻痹性贝类毒素标准样品应用8. 1麻痹性贝类毒素标准样品用于实验室间能力验证活动将采用本发明的制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品用于实验室间麻痹性 贝类毒素测试项目的能力验证活动，考察各实验室及人员的检测能力。首先将麻痹性贝类毒素标准样品分发给相应实验室1-10及其人员，提供标准操 作指导，然后进行实验，报告检测结果(鼠单位表示)，用稳健统计法对各实验结果进行评 价，即用Z比分数反映各实验室数据是否离群，用来判别实验室能力，结果如表6所示。其中，Z比分数计算公式为Z =(实验室平均值_中位值)/标准四分位距判断标准|Z|彡2，满意结果；2 < |Z| <3，可疑结果；|Z|彡3，不满意或离群的结果。如表6所示，实验室2、3、4、6、7和8的Z彡2，为满意结果，说明实验室2、3、4、 6、7和8具备检测能力，实验室5和10的I Z I彡3，为不满意或离群的结果，说明实验室5和10不具备检测能力，而实验室1和9的|Z| <3且|Z| >2为可疑结果。对于报告可疑 或离群结果的实验室，应查找原因，提出相应的整改措施，提高检测水平。结果显示制备的 PSP标准样品达到了试验要求，能够有效的保证实验室内麻痹性贝类毒素实物盲样比对测 试质量控制活动，用于实验室间麻痹性贝类毒素测试项目的能力验证活动，可有效保障贝 毒检测的准确性。表6能力验证活动结果 8. 2麻痹性贝类毒素标准样品用于定量检测经实施例8. 1验证，实验室7的|Ζ| ( 2且与其他实验室相比，|Ζ|最小，最具备 检测能力。将实施例2-5制备的标准样品发放给实验室7，按如下操作步骤，对实施例2-5 制备的标准样品进行定量检测精确称取一定量的标准样品，移入烧杯中，用20mL、0. 18mol/L盐酸溶液分几次反 复冲洗西林瓶，最终一并合并到烧杯中制备成混悬样本，之后再加入20mL蒸馏水，充分混 合，调节pH为3. 5。此时样品混悬液作为一个整体样品按照GB/T 5009. 213-2008标准方 法进行检测，即将混合物加热，并徐徐煮沸5min，冷却至室温，调节pH至3. 5，调节过程中 可逐滴加入5mol/L氢氧化钠溶液调整pH，加碱时速度要慢，同时需不断搅拌，防止局部碱 化破坏毒素。将该混合液移到量筒中，定容到40mL，4000rpm离心5min，取上清液作为待测 液(原液)，待测液应在24小时内完成动物染毒实验。若小鼠的死亡时间小于5min，则要 稀释待测原液后，再注射另一组小鼠(3只)，直到得到5min 7min的死亡时间。
按下式计算结果
X =中位数CMUX40mLX稀释倍数/标准样品重量g式中X-每g样品中PSP的含量，单位MU/g ；中位数CMU-检测样品受试组小鼠的中位数校正鼠单位；采用上述方法定量检测实施例2-5的标准样品的PSP含量，结果分别为40. 3MU/g、 160MU/g、379MU/g、998. 5MU/g。进一步的，将采用本发明的制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品还可以用于 检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量控制与考核等。本发明人经过广泛而深入的研究，以含麻痹性贝类毒素的虾夷扇贝做基质，采用 本发明的制备方法制备标准样品，不易破坏和降解麻痹性贝类毒素成分结构和含量，填补 国内外空白，原料成本低，且制备方法简单，不涉及昂贵的工艺设备，得到的标准样品为实 物标准样品，均勻稳定，易保存，用于实验室间麻痹性贝毒测试能力验证、定量或定性检测 麻痹性贝类毒素，确保贝毒检测的有效性，有利于对贝毒有效监测。本发明的麻痹性贝类毒 素标准样品适合于食品、渔监、环保、质检、渔业、卫生等各个部门使用，可促进水产养殖、力口 工和贸易发展，确保食品安全，将带来显著的社会效益和经济效益。
权利要求
一种麻痹性贝类毒素标准样品的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤A)、将贝类样品、去杂质取贝肉；B)、在所述贝肉中加入蒸馏水及盐酸溶液，调节pH为1.5～5.0，均质、混匀后得到匀浆液；C)、将所述匀浆液预冷后进行初次冷冻干燥得到粗样；D)、研磨所述粗样后过筛；E)、过筛后的样品预冷后进行再次冷冻干燥得到标准样品；F)、封装所述标准样品；G)、检验所述标准样品的均匀性和稳定性；H)、对所述标准样品的PSP含量进行定值；其中，所述贝类样品包含PSP阳性的贝类样品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸溶液的浓度为0.lmol/L 0.3mol/L。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C中的预冷温度 为-196 V -20 °C，相应预冷时间为30min 24h ；所述步骤E中的预冷温度 为-196°C -20°C，相应预冷时间为lOmin 6h。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述过筛的目数为30 60目。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品。
6.如权利要求5所述的麻痹性贝类毒素标准样品，其特征在于，所述标准样品的毒素 组分包括 CI、C2、C3、C4、dcGTXl、dcGTX2、dcGTX3、dcGTX4、dcSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、 GTX5、STX、NE0。
7.如权利要求5所述的麻痹性贝类毒素标准样品，其特征在于，所述标准样品的PSP含 量为 40 1000MU/g。
8.根据权利要求1 4中任一项所述的制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品的应 用，其特征在于，用于实验室间麻痹性贝类毒素测试项目的能力验证活动。
9.根据权利要求1 4中任一项所述的制备方法制备的麻痹性贝类毒素标准样品的应 用，其特征在于，所述标准样品用于定量或定性检测麻痹性贝类毒素。
全文摘要
本发明公开了一种麻痹性贝类毒素标准样品及其制备方法和应用，通过将PSP阳性的贝类原料酸化、匀浆后初次冷冻干燥得到粗样，将粗样研磨过筛后再次冷冻干燥后制得，具有较好的均匀性和稳定性，可用于实验室间麻痹性贝类毒素测试项目的能力验证活动及定性、定量检测麻痹性贝类毒素，也可用于检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量控制与考核。本发明原料成本低，且制备方法简单，得到的标准样品为实物标准样品，均匀稳定，易保存，有利于对贝毒有效监测。
文档编号G01N1/28GK101858833SQ20101017953
公开日2010年10月13日 申请日期2010年5月21日 优先权日2010年5月21日
发明者曹际娟, 王秋艳, 赵昕, 郑江 申请人:王秋艳;曹际娟