专利名称：一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法
技术领域：
本发明涉及植物生物化学领域，特别是涉及川牛膝与其易混物种的鉴别方法。
背景技术：
川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan.的干燥根，又名甜牛膝， 大牛膝，白牛膝。川牛膝是著名的川产地道药材之一，主产于四川的天全、宝兴、汉源和金口 河等地。川牛膝性平，味甘，微苦，具有逐瘀通经，通利关节，利尿通淋等功效，临床用于治疗 血滞经闭，风湿痹痛，尿血血淋，跌打损伤，产后胞衣不下等症。早年有研究发现川牛膝在改 善微循环，抗炎，延缓衰老等方面均胜于怀牛膝。近年又发现川牛膝中分离的阿魏酸对非特 异性免疫、体液免疫和细胞免疫功能均有较强的促进作用。从川牛膝根中提取的牛膝多糖 (Achyranthes bidentata Polysaec-charzdes, ABP)还具有抗月中瘤的作用。因而，川牛膝 的研究和利用再次受到广泛关注。近年来地道的川牛膝品种已越来越少，大多被其同属植物头花杯苋和两者的杂种 所取代。头花杯苋为苋科植物头花杯苋Cyathula capitata(ffall. )Moq.的根，又名金沙牛 膝、头花蒽草、红牛膝等，在四川、云南常被混称川牛膝，其具有祛风除湿、祛瘀通经、强筋壮 骨等功效。由于杯苋属的植物之间很易杂交，川牛膝与头花杯苋由于杂交，退化的现象十分 严重。对于杂交牛膝(以下简称杂牛膝)，其成分、药理作用是否与川牛膝一致，尚未见报 道。怀牛膝为苋科牛膝属植物牛膝Achyranthes bidentata Blume的根，主产于河南、山东、 浙江地区。其性平，味苦、酸，主要功效是补肝肾，强筋骨，逐瘀通经，引血下行，用于治疗腰 膝酸软，筋骨无力，月经不调，四肢拘挛，炮制成炭能止血。以上所述的头花杯苋、杂牛膝和 怀牛膝为生产上川牛膝的易混物种。目前，对川牛膝与其易混物种头花杯苋、怀牛膝的鉴别方法主要有原植物鉴别、 药材外观性状鉴别、根横切面显微鉴别、茎纵切面显微鉴别、粉末显微鉴别、叶片同工酶分 析等。此外，有提取植株叶片DNA，采用RAPD、AFLP和ITS序列等分子标记技术对川牛膝、 头花杯苋以及怀牛膝进行鉴别的报道。以上鉴别方法不足之处在于(1)无论是原植物鉴别、药材外观性状鉴别、显微鉴 别还是分子标记技术鉴别，均未涉及川牛膝与其易混物种杂牛膝鉴别方法方面的报道，即 通过以上方法尚无法鉴别川牛膝与杂牛膝；(2)以上方法均无法在川牛膝播种前对其与易 混物种区分开，所需的试验材料必须是新鲜植株，新鲜叶片或是药材，即必须将种子播种下 去，至少出苗或成株乃至收获后才能对其进行鉴别。(3)上述有的鉴别方法实施比较复杂或 是成本较高，如RAPD、AFLP和ITS序列等分子标记技术。目前，尚无用SDS-PAGE电泳方法对川牛膝及其易混物种进行鉴别的报道。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述现有技术中存在的川牛膝与其易混物种的鉴别往 往只能在出苗或成株乃至收获后才能进行，许多方法实施复杂、成本高，且目前尚无有效鉴别川牛膝与杂牛膝的方法等问题，提供一种准确且简单易行的川牛膝与其易混物种的鉴别 方法。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤(1)在川牛膝 及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白；(2)SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定； (3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴定。具体地，步骤(1)所述的提取是指，取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室 温下提取2h，其间涡旋，然后将样品于沸水中煮4min，离心取上清备用。进一步地，步骤⑴所述提取缓冲液由以下成分组成62.5mmol/LTriS-HCL pH6. 8,2% (ff/V) SDS,10% (V/V)甘油，1.5% (ff/V)DTT,0. 002% (ff/V)溴酚兰，提取缓冲液 用量为每mg种子细粉加入5 μ L ；所述离心转速为8000rpm/min，时间为5min。具体地，步骤(2)所述SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为 3%的SDS-PAGE不连续分离系统进行电泳。进一步地，步骤(2)所述的SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度 为3 %的SDS-PAGE不连续分离系统，恒压500V，指示剂在浓缩胶时电流为40mA，指示剂进入 分离胶时，电流调为60mA，进行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30min停止电泳。再进一步地，步骤(2)所述的分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为3%的SDS-PAGE 不连续分离系统是指(1)浓度为15%的分离胶蒸馏水4. 6mL，40%丙烯酰胺3. 75mL, 2%甲叉双丙稀酰胺0. 52mL,分离胶缓冲液(pH = 8. 9) ImL, 10%过硫酸胺0. 09mL, TEMED 4. 2μ L，其中分离胶缓冲液由溶解378g Tris、25g SDS、95g硼酸，加蒸馏水定溶至2. 5L制 备而成；(2)浓度为3%的浓缩胶蒸馏水3. 7mL，40%丙烯酰胺0. 375mL，2%甲叉双丙稀酰 胺 0. 2mL,浓缩胶缓冲液 0. 62mL, 10% SDS 0. 05mL, 10%过硫酸胺 0. 05mL, TEMED5 μ L，其中 浓缩胶缓冲液由1. Omol/L Tris-HCL(pH6. 8)，10% (V/V) SDS制备而成；(3)电泳缓冲液分 离胶缓冲液稀释10倍。具体地，步骤(2)所述染色是指，每块胶用300mL染色液染色过夜；所述脱色是指， 将凝胶板用蒸馏水漂洗数次，加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清 晰为止；所述固定，是指于固定液(冰醋酸水=1 9)中保存，其中染色液由0.3g考马 斯亮蓝R_250、135mL甲醇、30mL冰醋酸和135mL水制备而成，脱色液由37. 5mL冰醋酸，25mL 甲醇加水至500mL制备而成本发明的最优选方案是，一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，包括以下步骤(1)在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白，其中，所述的提取 是指，取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室温下提取2h，其间涡旋，然后将样品于 沸水中煮4min，离心取上清备用；所述提取缓冲液由以下成分组成62. 5mmol/L Tris-HCL pH6. 8,2% (ff/V) SDS,10% (V/V)甘油，1.5% (ff/V)DTT,0. 002% (ff/V)溴酚兰，提取缓冲液 用量为每mg种子细粉加入5 μ L ；所述离心转速为8000rpm/min，时间为5min ；(2) SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定，其中，SDS-PAGE电泳是指，在SDS-PAGE不 连续分离系统，恒压500V，指示剂在浓缩胶时电流为40mA，指示剂进入分离胶时，电流调为 60mA,进行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30min停止电泳，所述的SDS-PAGE不连续分离系 统是指
①浓度为15%的分离胶蒸馏水4. 6mL，40%丙烯酰胺3. 75mL,2%甲叉双丙稀酰 胺0. 52mL,分离胶缓冲液(ρΗ8· 9) ImL, 10%过硫酸胺0. 09mL, TEMED4. 2 μ L，其中分离胶缓 冲液由溶解378g Tris、25g SDS、95g硼酸，加蒸馏水定溶至2. 5L制备而成；②浓度为3%的浓缩胶蒸馏水3. 7mL，40%丙烯酰胺0. 375mL,2%甲叉双丙稀酰 胺 0. 2mL,浓缩胶缓冲液 0. 62mL, 10% SDS 0. 05mL, 10%过硫酸胺 0. 05mL, TEMED 5 μ L，其中 浓缩胶缓冲液由 1. Omol/L Tris-HCL (pH6. 8), 10% (V/V) SDS 制备而成；③电泳缓冲液分离胶缓冲液稀释10倍；所述适宜电压是指，恒压500V ；适宜电流是指，指示剂在浓缩胶时电流为40mA，指 示剂进入分离胶时，电流调为60mA ；适当时间是指，前沿指示剂迁移至板底后30min停止电 泳；染色是指，每块胶用300mL染色液染色过夜；所述脱色是指，将凝胶板用蒸馏水漂 洗数次，加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止；所述固定，是 指于固定液(冰醋酸水=1 9)中保存，其中染色液由0.3g考马斯亮蓝R-250、135mL甲 醇、30mL冰醋酸和135mL水制备而成，脱色液由37. 5mL冰醋酸，25mL甲醇加水至500mL制 备而成；(3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴别。SDS-PAGE电泳方法是根据蛋白分子量的不同而分离蛋白。SDS-PAGE电泳方法的 不连续分离系统，其电泳迁移率主要取决于相对分子量的大小，而与所带电荷和分子形状 无关，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而与连续 分离系统相比，其条带清晰度及分辨率更佳。SDS-PAGE不连续分离系统技术中，待鉴别物质 不同，在选择具体的分离胶、浓缩胶时，存在差异。目前，对于川牛膝及其易混物种的蛋白质 分子量等尚无报道。本发明通过大量研究，选择了合适的SDS-PAGE不连续分离系统，并将 其应用于川牛膝及其易混物种的种子蛋白鉴别中，成功地通过电泳谱带将川牛膝与其易混 物种，尤其是杂牛膝区分开。与现有技术相比，本发明的有益效果是(1)直接用种子进行鉴别，省去大量的播 种、田间管理、取样和收获的时间，节省土地资源；(2)利用种子直接进行蛋白的提取、分 离，提取方法简便、效率高，电泳条件成熟，谱带清晰，无需使用任何分析软件，直接观察鉴 别；(3)通过谱带完全能将川牛膝及其易混物种，包括头花杯苋、怀牛膝，尤其是杂牛膝区 分开；(4)可在一张胶片上同时鉴定同一材料多粒种子或多个材料，直观易辨，重复性好， 稳定性好，有利于实验批量操作。关于本发明的有关术语解释=SDS-PAGE电泳是指十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝 胶电泳，Tris-HCL指三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，SDS指十二烷基磺酸钠，DTT指二硫苏糖醇， TEMED指四甲基二乙胺。
图1是川牛膝、头花杯苋、杂牛膝与怀牛膝的种子蛋白电泳图谱。图1第1-3泳道 为怀牛膝，第4-6泳道为头花杯苋，第7-9泳道为川牛膝，第10泳道为空白，第11泳道为 Marker，第12-14泳道为杂牛膝，第15泳道为Marker，第16-18泳道为川牛膝，第19泳道为 空白，第20-22泳道为头花杯苋。
图2是川牛膝、头花杯苋每种材料取7粒种子进行的重复试验。第1-7泳道为川 牛膝，第8泳道为空白，第9-15泳道为头花杯苋。图3是川牛膝、杂牛膝每种材料取7粒种子进行的重复试验。第1-7泳道为川牛 膝，第8泳道为Marker，第9-15泳道为杂牛膝。图4是11份不同来源地的川牛膝、头花杯苋和杂牛膝的种子蛋白电泳图谱。第1 泳道为重庆奉节太和川牛膝，第2泳道为重庆奉节长安川牛膝，第3、4泳道为四川乐山金口 河川牛膝，第5泳道为四川雅安天全思经川牛膝、第6泳道为四川雅安宝兴蜂桶寨川牛膝； 第8泳道为Marker ；第7、9泳道为四川雅安宝兴中岗杂牛膝、第10泳道为四川乐山金口河 杂牛膝、第11、12泳道为四川雅安天全新沟杂牛膝；第13泳道为四川雅安宝兴民治头花杯 苋、第14泳道为四川乐山金口河头花杯苋、第15泳道为四川雅安天全小河头花杯苋。图5是不同贮藏方式的川牛膝种子蛋白电泳图谱。第1-3泳道为干燥器贮藏，第 5-7泳道为-20°C贮藏，第9-11泳道为常规袋存，第4、8泳道为空白。图6是不同生长年限和不同贮藏年限材料的种子蛋白电泳图谱。第1-3泳道为 四川乐山金口河一年生川牛膝，第4-6泳道为四川乐山金口河三年生川牛膝，第7泳道为 Marker，第8-10泳道为四川雅安宝兴头花杯苋(2008年贮藏)，第11-13泳道为四川雅安宝 兴头花杯苋(2009年贮藏)。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上 述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括 在本发明的范围内。实施例1采用本发明的方法对川牛膝、头花杯苋、杂牛膝和怀牛膝的种子蛋白图谱进行比 较，每份材料用三十粒以上种子进行重复试验。川牛膝采自四川省雅安市宝兴县蜂桶寨乡 新康村，头花杯苋采自四川省乐山市金口河区永胜乡，杂牛膝采自四川省雅安市天全县新 沟乡大顶坪，怀牛膝由中国医学科学院药用植物研究所提供，采自河南省。具体操作步骤如 下1、种子蛋白的提取分别取川牛膝、头花杯苋、杂牛膝和怀牛膝单粒种子研磨成细 粉后，按 Img样品加入 5μ L提取缓冲液[62. 5mmol/L Tris-HCLpH6. 8, 2% (ff/V) SDS,10% (V/V)甘油，1.5% (W/V)DTT，0.002% (ff/V)溴酚兰]于室温下提取2h，其间涡旋几次。将 蛋白质样品于沸水中煮4min，8000rpm/min离心5min，取上清35 μ L点样。2、不连续分离系统的制备分离胶缓冲液(2. 5L)溶解378g Tris, 25g SDS，95g 硼酸，加蒸馏水定溶至2. 5L，pH = 8. 9 ；浓缩胶缓冲液1. Omol/LTris-HCL, pH = 6. 8，10% (V/V)SDS ；电泳缓冲液分离胶缓冲液稀释10倍。聚丙烯酰胺凝胶组成如表1所示表1聚丙烯酰胺凝胶组成
权利要求
一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤(1)在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白；(2)SDS PAGE电泳，再染色、脱色、固定；(3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴别。
2.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤(1)所述 的提取是指，取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室温下提取2 h，其间涡旋，然后将 样品于沸水中煮4 min，离心取上清备用。
3.根据权利要求2所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，所述提取缓 冲液由以下成分组成62. 5 mmol/L Tris-HCL pH6. 8,2% (ff/V) SDS, 10% (V/V)甘油，1.5% (W/V) DTT，0. 002% (ff/V)溴酚兰，提取缓冲液用量为每mg种子细粉加入5 μ L ；所述离心 转速为8000 rpm/min，时间为5 min。
4.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)所述 的SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为3%的SDS-PAGE不连续分离系统 进行电泳。
5.根据权利要求4所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)所述 的SDS-PAGE电泳是指，在分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为3%的SDS-PAGE不连续分离系 统，恒压500 V，指示剂在浓缩胶时电流为40 mA，指示剂进入分离胶时，电流调为60 mA，进 行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30 min停止电泳。
6.根据权利要求5所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，所述的分离 胶浓度为15%，浓缩胶浓度为3%的SDS-PAGE不连续分离系统是指(1)浓度为15%的分离胶蒸馏水4.6 mL，40%丙烯酰胺3. 75 mL, 2%甲叉双丙稀酰胺 0. 52 mL,分离胶缓冲液(pH8. 9)1 mL, 10%过硫酸胺0. 09 mL, TEMED 4. 2 μ L，其中分离胶 缓冲液为溶解378 g Tris,25 g SDS,95 g硼酸，加蒸馏水定溶至2. 5 L制备而成；(2)浓度为3%的浓缩胶蒸馏水3.7 mL,40%丙烯酰胺0. 375 mL, 2%甲叉双丙稀酰胺 0.2 mL，浓缩胶缓冲液 0. 62 mL, 10% SDS 0. 05 mL，10% 过硫酸胺 0. 05 mL, TEMED 5 yL，其 中浓缩胶缓冲液由1.0 mol/L Tris-HCL (pH6. 8)，10% (V/V) SDS制备而成；(3)电泳缓冲液分离胶缓冲液稀释10倍。
7.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，步骤(2)所述 染色是指，每块胶用300 mL染色液染色过夜；所述脱色是指，将凝胶板用蒸馏水漂洗数次， 加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止；所述固定，是指于固 定液(冰醋酸？？水=1:9)中保存；其中染色液由0.3 g考马斯亮蓝R-250、135 mL甲醇、30 mL冰醋酸和135 mL水制备而成，脱色液由37.5 mL冰醋酸，25 mL甲醇加水至500 mL制备 而成。
8.根据权利要求1所述的川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤(1)在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白，其中，所述的提取是指， 取单粒种子研磨成细粉，加入提取缓冲液于室温下提取2 h，其间涡旋，然后将样品于沸水 中煮4 min，离心取上清备用；所述提取缓冲液由以下成分组成62. 5 mmol/L Tris-HCL ρΗ6·8，2% (ff/V) SDS, 10% (V/V)甘油，1.5% (ff/V)DTT,0. 002% (W/V)溴酚兰，提取缓冲液 用量为每mg种子细粉加入5 μ L ；所述离心转速为8000 rpm/min,时间为5 min ；(2)SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定，其中，SDS-PAGE电泳是指，在SDS-PAGE不连 续分离系统，恒压500 V，指示剂在浓缩胶时电流为40 mA，指示剂进入分离胶时，电流调为 60 mA，进行电泳，前沿指示剂迁移至板底后30 min停止电泳，所述的SDS-PAGE不连续分离 系统是指①浓度为15%的分离胶蒸馏水4.6mL，40%丙烯酰胺3.75 mL，2%甲叉双丙稀酰胺 0. 52 mL,分离胶缓冲液(pH8. 9)1 mL, 10%过硫酸胺0. 09 mL, TEMED 4. 2 μ L，其中分离胶 缓冲液由溶解378 g Tris,25 g SDS,95 g硼酸，加蒸馏水定溶至2. 5 L制备而成；②浓度为3%的浓缩胶蒸馏水3.7 mL，40%丙烯酰胺0.375 mL，2%甲叉双丙稀酰胺 0.2 mL，浓缩胶缓冲液 0. 62 mL, 10% SDS 0. 05 mL，10% 过硫酸胺 0. 05 mL, TEMED 5 yL，其 中浓缩胶缓冲液由1.0 mol/L Tris-HCL (pH6. 8)，10% (V/V) SDS制备而成；③电泳缓冲液分离胶缓冲液稀释10倍；染色是指，每块胶用300 mL染色液染色过夜；所述脱色是指，将凝胶板用蒸馏水漂洗 数次，加入脱色液反复脱色，至凝胶的蓝色背景褪清、蛋白质谱带清晰为止；所述固定，是指 于固定液(冰醋酸？？水=1:9)中保存，其中染色液由0.3 g考马斯亮蓝R-250、135 mL甲醇、 30 mL冰醋酸和135 mL水制备而成，脱色液由37. 5 mL冰醋酸，25 mL甲醇加水至500 mL 制备而成；(3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴别。
全文摘要
本发明公开了一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，涉及植物生物化学领域。为解决川牛膝生产用种混杂，以及川牛膝及其易混物种的鉴别往往只能在出苗或成株乃至收获后才能进行且实施复杂、成本高，目前尚无有效鉴别川牛膝与杂牛膝的方法等问题，本发明提供了一种川牛膝与其易混物种的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤(1)在川牛膝及其易混物种的种子中提取溶于稀酸的谷蛋白；(2)SDS-PAGE电泳，再染色、脱色、固定；(3)种子蛋白电泳谱带的分析与鉴定。本发明的方法准确且简单易行，并能有效鉴定杂交牛膝与川牛膝。
文档编号G01N27/447GK101933960SQ20101028198
公开日2011年1月5日 申请日期2010年9月15日 优先权日2010年9月15日
发明者侯凯, 刘千, 吴卫, 潘红梅, 王元彪, 蔡文国, 邵金凤, 陈鹊, 陈黎 申请人:四川农业大学