专利名称：高选择性多组分检测糖类的分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器的研究与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及现场快速高选择性糖类检测技术领域，更具体地说是一种检测样品中 糖类的分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器的制备，本发明还涉及采用所述的分子识别荧 光纳米晶石英荧光传感器现场检测蔬菜，水果和食品样品中糖类的方法。
背景技术：
糖是自然界中存在数量最多、分布最广且具有重要生物功能的有机化合物。日常 食用的蔗糖、粮食中的淀粉、植物体中的纤维素、人体血液中的葡萄糖等均属糖类，而且从 细菌到高等动物的机体都含有糖类化合物。以植物体中含量最为丰富，其它生物则以葡萄 糖、淀粉等糖类为营养物质，从食物中吸收转变成体内的糖，通过代谢向机体提供能量，因 此糖类作为常见的食物成分.是人体能量的主要来源。同时糖类参与构成细胞膜和结缔组 织.参与神经系统的组成，维持正常的神经功能，所以说糖类是人体所需的重要营养物质。糖类虽然是人体不可缺少的，但若摄入过量，则有以下危害1.促进发胖过量的糖类进入人体后.除了供血糖的正常消耗外，还会在细胞内 转化为脂肪积存起来，使人发胖。而肥胖则是诱发冠心病、高血压、糖尿病和癌症的重要因 素，影响健康长寿。2.导致缺钙白糖的缺点在于变成葡萄糖时.要消耗大量的维生素B和钙，若过 量吃糖与各种甜食，则容易引发维生素Bl和钙的缺乏。3.影响儿童健康成长，对青少年的生长发育尤为不利。4.诱发龋齿儿童吃糖过多.特别是睡前吃糖或各种甜食，会影响口腔卫生，酸 性物质易侵蚀牙质.是诱发龋齿的重要原因。5.影响智力过量的糖进入血液后.在胰岛素的作用下，会促进脑神经细胞分泌 过多的色胺酸。色胺酸是合成催眠血清素的重要原料，含量增加会使人感到困倦、无精打 采，导致信息在大脑中传递迟缓，影响人的记忆和思维能力。6.影响视力眼球壁的正常弹力是靠维生素B，和钙等重要物质来维持的。近视 眼的发生与钙和铬的缺少有关。而摄入过多的糖.则易导致维生素B、钙和铬的缺乏。7.影响骨骼发育糖是不含钙的酸性物质，经常吃糖、甜食、巧克力或含糖饮料 等，会消耗大量的钙，不但会影响骨骼发育，还容易导致骨折。据报道，世界卫生组织经过对23个国家的全面调查.确认过量摄入糖是影响健康 长寿的重要原因。人口的死亡率曲线同糖的消耗量平行上升。糖吃得越多，死亡率越高。有 资料表明，长期吃高糖食物的人平均寿命要缩短20年。同时糖类食物在进入人体以后，经酶的水解作用，变成可被人体直接利用的单糖， 其中主要是葡萄糖。而进入血液循环以供给机体需要的葡萄糖即为临床上所指的血糖。血 糖浓度保持正常水平具有重要的生理意义。正常人在清晨空腹血糖浓度为80-120毫克％。 空腹血糖浓度超过130毫克％称为高血糖。正常人的血糖浓度在神经系统的调节下保持相对恒定的水平。血糖浓度如果经常超过正常水平，表示体内糖的利用发生紊乱；血糖浓度如 果过低，则中枢神经系统会发生严重的功能障碍，出现昏迷，即低血糖昏迷。高血糖患者不 能食用含糖量高的食物，而低血糖者可以食用含糖量高的食物来缓解低血糖症状。因此，食 物中糖类的检测具有非常重要的意义。建立一种高灵敏度和特异性的快速现场检测糖类的方法，便成为当前该研究领域 亟需解决的问题之一。目前已有的糖类检测方法主要包括酶法和非酶法等，但是这些检测 方法存在不足1.酶法分析是通过酶的专一性来提高分析的选择性，但酶的固定化以及酶活性的 保持限制了酶法的应用；2.非酶法分析主要利用糖类分子中醛基的还原性将某些物质还原，根据其吸光度 的变化等进行测定，由于这些方法将血液中的一小部分非糖还原性物质(如谷胱酰肽等) 也一起测出，使其测得值比真实的浓度偏高。3.以上几种方法对于糖类的检测和分析，一般都存在检测成本高、检测过程复杂、 结果不准确、不适于现场快速检测等缺点，因此不能满足实际检测的需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种样品处理简单、检测速度快、灵敏度高、特 异性强，选择性强，无试剂需求，检测糖类的分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器的制备及 检测糖类的方法。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的一种检测糖类的分子 识别荧光纳米晶石英荧光传感器制备方法，其特征是包括以下步骤(1)制备高量子产率的不同粒径的荧光纳米晶，并将其进行纯化处理，配制成单分 散溶液；(2)选择能与糖类相互作用的识别体；(3)在催化剂存在下表面修饰荧光纳米晶；(4)设计制作梳子多探针结构的石英片和密封的石英荧光激发皿，皿内装有短波 发射的饱和荧光试剂；(5)利用层层自组装表面修饰技术等，将改性后的荧光纳米晶修饰到石英片表面 上，制作多探头分子识别荧光纳米晶石英荧光感受器；(6)检测时，将修饰有多层改性荧光纳米晶膜的梳形石英片置于密封石英激发皿 发射光路中，制得所述多探针分子识别荧光纳米晶石英荧光感受器；(7)用稀盐酸洗涤检测后的石英片，将吸附的糖类洗涤下来，以进行下一次的测 定，实现重复利用。本发明所述改性的荧光纳米晶修饰到石英片表面包括以下步骤(1)将所用石英片用0. lmol/L H202/H2804溶液清洗，然后用二次蒸水彻底清洗数 次，吹干；(2)将清洗并干燥的石英片用APTS/甲苯溶液处理lOmin，用甲苯清洗，吹干，放入 Cd/TGA溶液处理5min，用二次水清洗一遍，氩气吹干。(3)将制备的改性荧光纳米晶溶液超声处理10-30min，得到分散的荧光纳米晶溶液；(4)将步骤⑵中处理好的石英片浸入经步骤(3)处理过的荧光纳米晶溶液中；(5)将步骤中制备的修饰石英片用二次蒸水彻底清洗数次，吹干；(6)重复步骤(2)至步骤(5)过程3-6次，制得所述荧光纳米晶修饰的石英片。本发明还包括以下步骤将修饰有荧光纳米晶的梳形石英片放置24h后使用。本发明所述为CdTe荧光纳米晶溶液、CdSe荧光纳米晶溶液。本发明所述荧光试剂为7-氨基-4-甲基香豆素、羟基香豆素、粒蓝相似物、4， 4' - 二异硫氰酸基_2，2' -二苯乙烯磺酸二钠、荧光增白剂134、甲基绿焦宁苯乙烯或芘。本发明所述催化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁 二酰亚胺。本发明所述糖类识别体为对氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、3-氰基苯硼酸、2-氟苯 硼酸、4-乙氧基苯硼酸、3-硝基苯硼酸、3-甲基苯硼酸、对乙基苯硼酸。一种现场高选择性同时检测糖类的方法，其特征是包括如下步骤将按上述任意 一种方法制得的改性荧光纳米晶修饰的梳形石英片置于密封石英荧光激发皿的发射光路 中，并配合手提式荧光分光光度计，对简单浆化的蔬菜、水果和食品样品中的糖类进行检 测。本发明的有益效果1.分子识别糖类荧光纳米晶石英荧光传感器制备方法，利用了荧光纳米晶的高选 择性，将荧光纳米晶材料连接到石英片表面制备荧光纳米晶石英荧光传感器，使得所制备 的糖类荧光纳米晶石英荧光传感器具有更高的灵敏性、选择性和检测范围。2.本发明的梳形石英片是具有多探针结构的石英片，可以同时检测多种糖类。利 用量子点的颜色多样性可将多种FAs同时区分。修饰后的梳形石英可直接浸入到液体样品 或简单浆化的固体样品中进行识别，无需任何其他特殊试剂，使得检测步骤更加简单，更易 于非专业人士操作。3.将表面层层修饰技术应用到荧光纳米晶石英荧光传感器的制备当中，使得荧光 纳米晶增效的分子识别糖类荧光纳米晶石英荧光传感器的制备具有可控性，提高了石英荧 光传感器的灵敏度、选择性和准确性。4.本发明所用的石英荧光激发皿内装有特定的饱和荧光试剂，利用荧光纳米晶的 宽带激发特性，激发皿可同时激发所有荧光纳米晶，并且光源是一均勻的面光源，进一步提 高了石英荧光传感器的准确性和灵敏度。5.本发明所得到的荧光纳米晶连接到石英片上的糖类荧光纳米晶石英荧光传感 器，在荧光纳米晶上同时接入对目标分子相互作用的识别体，可以实现样本中糖类的高特 异性、高灵敏度、多组分快速检测。6.本发明的分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器的特异性强，样品中其它非特异 性分子对检测结果无影响；灵敏度高，可以达到ng级；检测速度快，完成一个基本检测过程 仅需2-3分钟的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选，无需任何试剂，成本低， 检测1个样品仅需分钱，而且可以实现重复利用。7.荧光纳米晶石英荧光传感器检测糖类方法，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测。
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细描述。附图为梳形石英片表面修饰过程及检测原理示意图。
具体实施例方式实施例1 (单糖，如葡萄糖和半乳糖)一种检测葡萄糖和乳糖分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器制备方法，包括以下 步骤(1)两种不同粒径CdTe荧光纳米晶溶液制备在队保护下，将Te粉溶于NaBH4中 制备iTe前驱体，然后与CdCl2 · 2. 5H20和TGA反应液反应，调节pH，制的水溶性两种不同粒 径的CdTe量子点溶液；(2)选择能与葡萄糖作用的识别体对氨基苯硼酸；选择能与半乳糖作用的识别体 3-氨基苯硼酸；(3)分别取两种不同粒径的CdTe荧光纳米晶溶液20 μ L，超声分散20min。葡萄 糖识别体对氨基苯硼酸，催化剂1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐PBS缓冲 溶液和N-羟基丁二酰亚胺PBS缓冲溶液，对应粒径的CdTe荧光纳米晶点溶液，搅拌三小 时，得到表面修饰的荧光纳米晶；半乳糖识别体3-氨基苯硼酸，催化剂1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐PBS缓冲溶液和N-羟基丁二酰亚胺PBS缓冲溶液，对应粒径 的CdTe荧光纳米晶点溶液，搅拌三小时，得到表面修饰的荧光纳米晶；(4)如图所示，设计制作两探针梳形石英片。采用层层修饰法将按上述方法制备的 改性荧光纳米晶分别修饰至两探针梳形石英片的探针表面上，每一根探针修饰一种FAs的 改性荧光纳米晶，形成修饰有识别葡萄糖和半乳糖荧光纳米晶的梳形石英片；(5)如图所示，将修饰有葡萄糖和半乳糖荧光纳米晶的梳形石英片在液体样品或 简单浆化的固体样品中浸泡anin后，置于石英荧光激发皿发射光路中，构成分子识别同时 检测葡萄糖和半乳糖荧光纳米晶石英荧光传感器。将制得分子识别葡萄糖和半乳糖荧光纳 米晶石英荧光传感器配合手提式荧光仪，对食品样品溶液中的葡萄糖和半乳糖进行检测；(6)检测后，用稀盐酸洗涤分子识别葡萄糖和半乳糖荧光纳米晶的梳形石英片，将 吸附的葡萄糖和半乳糖洗脱掉，以进行下次测定，实现重复利用。实施例2 ( 二糖，如麦芽糖，蔗糖和乳糖)一种检测麦芽糖、蔗糖和乳糖分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器制备方法，包 括以下步骤(1)三种不同粒径Cdk量子点溶液制备在N2保护下，将％粉溶于TOP中制备 Se前驱体，将S粉溶于TOP中制备S前驱体，然后与制得的Cd(OA)2,反应，油酸作为稳定剂 的条件下，制的三种不同粒径的CcKe量子点溶液；(2)选择能与麦芽糖作用的识别体3-氰基苯硼酸；选择能与蔗糖作用的识别体 2-氟苯硼酸；选择能与乳糖作用的识别体4-乙氧基苯硼酸；(3)分别取两种不同粒径的CcKe荧光纳米晶溶液20 μ L，超声分散20min。麦芽糖识别体对3-氰基苯硼酸，催化剂1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐PBS缓冲溶 液和N-羟基丁二酰亚胺PBS缓冲溶液，对应粒径的CcKe荧光纳米晶点溶液，搅拌三小时， 得到表面修饰的荧光纳米晶；蔗糖识别体2-氟苯硼酸，催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐PBS缓冲溶液和N-羟基丁二酰亚胺PBS缓冲溶液，对应粒径的Cdk荧 光纳米晶点溶液，搅拌三小时，得到表面修饰的荧光纳米晶；乳糖识别体4-乙氧基苯硼酸， 催化剂1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐PBS缓冲溶液和N-羟基丁二酰亚胺 PBS缓冲溶液，对应粒径的CcKe荧光纳米晶点溶液，搅拌三小时，得到表面修饰的荧光纳米曰曰曰；(4)如图所示，设计制作三探针梳形石英片。采用层层修饰法将按上述方法制备的 改性荧光纳米晶分别修饰至三探针梳形石英片的探针表面上，每一根探针修饰一种FAs的 改性荧光纳米晶，形成修饰有识别麦芽糖、蔗糖和乳糖荧光纳米晶的梳形石英片；(5)如图所示，将修饰有麦芽糖、蔗糖和乳糖荧光纳米晶的梳形石英片在液体样品 或简单浆化的固体样品中浸泡anin后，置于石英荧光激发皿发射光路中，构成分子识别同 时检测麦芽糖、蔗糖和乳糖荧光纳米晶石英荧光传感器，将制得分子识别麦芽糖、蔗糖和乳 糖荧光纳米晶石英荧光传感器配合手提式荧光仪，对食品样品溶液中的麦芽糖、蔗糖和乳 糖进行检测；(6)检测后，用稀盐酸洗涤分子识别麦芽糖、蔗糖和乳糖荧光纳米晶的梳形石英 片，将吸附的麦芽糖、蔗糖和乳糖洗脱掉，以进行下次测定，实现重复利用。实施例3 (多糖，如纤维素，淀粉和糖原)一种检测纤维素、淀粉和糖原分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器制备方法，包 括以下步骤(1)两种不同粒径CdTe荧光纳米晶溶液制备在队保护下，将Te粉溶于NaBH4中 制备iTe前驱体，然后与CdCl2 · 2. 5H20和TGA反应液反应，调节pH，制的水溶性两种不同粒 径的CdTe量子点溶液；(2)选择能与纤维素作用的识别体3-硝基苯硼酸；选择能与淀粉作用的识别体 3-甲基苯硼酸；选择能与糖原作用的识别体对乙基苯硼酸；(3)分别取两种不同粒径的CdTe荧光纳米晶溶液20 μ L，超声分散20min。纤维 素识别体对3-硝基苯硼酸，催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐PBS缓 冲溶液和N-羟基丁二酰亚胺PBS缓冲溶液，对应粒径的CdTe荧光纳米晶点溶液，搅拌三 小时，得到表面修饰的荧光纳米晶；淀粉识别体3-甲基苯硼酸，催化剂1-(3-二甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐PBS缓冲溶液和N-羟基丁二酰亚胺PBS缓冲溶液，对应粒径 的CdTe荧光纳米晶点溶液，搅拌三小时，得到表面修饰的荧光纳米晶；糖原识别体对乙基 苯硼酸，催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐PBS缓冲溶液和N-羟基丁 二酰亚胺PBS缓冲溶液，对应粒径的CdTe荧光纳米晶点溶液，搅拌三小时，得到表面修饰的 荧光纳米晶。(4)如图所示，设计制作三探针梳形石英片。采用层层修饰法将按上述方法制备的 改性荧光纳米晶分别修饰至三探针梳形石英片的探针表面上，每一根探针修饰一种FAs的 改性荧光纳米晶，形成修饰有识别纤维素、淀粉和糖原荧光纳米晶的梳形石英片。(5)如图所示，将修饰有纤维素、淀粉和糖原荧光纳米晶的梳形石英片在液体样品或简单浆化的固体样品中浸泡anin后，置于石英荧光激发皿发射光路中，构成分子识别同 时检测纤维素、淀粉和糖原荧光纳米晶石英荧光传感器。将制得分子识别纤维素、淀粉和糖 原荧光纳米晶石英荧光传感器配合手提式荧光仪，对食品样品溶液中的纤维素、淀粉和糖 原进行检测。 (6)检测后，用稀盐酸洗涤分子识别纤维素、淀粉和糖原荧光纳米晶的梳形石英 片，将吸附的纤维素、淀粉和糖原洗脱掉，以进行下次测定，实现重复利用。
权利要求
1.一种检测糖类的分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器制备方法，其特征是包括以下 步骤(1)制备高量子产率的不同粒径的荧光纳米晶，并将其进行纯化处理，配制成单分散溶液；(2)选择能与糖类相互作用的识别体；(3)在催化剂存在下表面修饰荧光纳米晶；(4)设计制作梳子多探针结构的石英片和密封的石英荧光激发皿，皿内装有短波发射 的饱和荧光试剂；(5)利用层层自组装表面修饰技术等，将改性后的荧光纳米晶修饰到石英片表面上，制 作多探头分子识别荧光纳米晶石英荧光感受器；(6)检测时，将修饰有多层改性荧光纳米晶膜的梳形石英片置于密封石英激发皿发射 光路中，制得所述多探针分子识别荧光纳米晶石英荧光感受器；(7)用稀盐酸洗涤检测后的石英片，将吸附的糖类洗涤下来，以进行下一次的测定，实 现重复利用。
2.本发明所述糖类识别体为对氨基苯硼酸、3-氨基苯硼酸、3-氰基苯硼酸、2-氟苯硼 酸、4-乙氧基苯硼酸、3-硝基苯硼酸、3-甲基苯硼酸、对乙基苯硼酸。
3.根据权利要求1所述的多探针分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器的制备方法，其 特征是所述的将改性的荧光纳米晶修饰到石英片表面包括以下步骤(1)将所用石英片用0.lmol/L H2O2M2SO4溶液清洗，然后用二次蒸水彻底清洗数次，吹干；(2)将清洗并干燥的石英片用APTS/甲苯溶液处理lOmin，用甲苯清洗，吹干，放入Cd/ TGA溶液处理5min，用二次水清洗一遍，氩气吹干；(3)将制备的改性荧光纳米晶溶液超声处理10-30min，得到分散的荧光纳米晶溶液；(4)将步骤O)中处理好的石英片浸入经步骤C3)处理过的荧光纳米晶溶液中；(5)将步骤中制备的修饰石英片用二次蒸水彻底清洗数次，吹干；(6)重复步骤( 至步骤( 过程3-6次，制得所述荧光纳米晶修饰的石英片。
4.根据权利要求1所述的多探针量子点分子印迹石英传感器的制备方法，其特征是 所述的梳形石英片为长方形，探针数为2 4个探针。所述的密封荧光激发皿为长方体形 石英皿，内装有饱和的短波发射荧光试剂7-氨基-4-甲基香豆素、羟基香豆素、粒蓝相似 物、4，4' - 二异硫氰酸基_2，2' -二苯乙烯磺酸二钠、荧光增自剂134、甲基绿焦宁二苯乙 烯或芘。
5.根据权利要求2所述的分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器的制备方法，其特征 是所述催化剂为1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺。
6.根据权利要求1所述的多探针分子识别荧光纳米晶石英荧光传感器制备方法，其特 征是多探针荧光纳米晶修饰的石英片是通过密封石英激发皿表面的插槽安装到激发皿表 面的。
7.一种现场高选择性同时检测糖类的方法，其特征是包括如下步骤将按权利要求1 方法制得的多探针荧光纳米晶石英传感器安装到手提式荧光光度计上，对液体食品或简单 浆化的固体食品样品中的糖类进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种分子识别多组分同时检测糖类的荧光纳米晶石英荧光传感器及其检测糖类的方法。分子识别荧光纳米晶梳形石英片制备方法，包括以下步骤选择糖类对应的识别体；制备荧光纳米晶及按照文献对荧光纳米晶进行表面修饰；利用层层累积表面修饰技术，将改性的荧光纳米晶修饰到梳形石英片不同探针的表面上。一种多组分同时检测糖类的方法，包括如下步骤将修饰好的石英片侵入到简单浆化的食品样品溶液中，然后将其安装到密封石英皿上，对样品中的糖类进行检测。本发明的特异性强，灵敏度高；检测时间短；成本低。荧光检测糖类方法，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录。
文档编号G01N21/64GK102042975SQ20101052418
公开日2011年5月4日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者于京华, 孙秀锦, 张丛丛, 张晓娜, 朱元娜, 王寿梅, 王珊, 葛磊 申请人:济南大学