一种基于H¹NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法

专利名称：一种基于H¹NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及原发性胆汁肝硬化。具体提供了一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法。
背景技术：
原发性胆汁性肝硬化(Primary Biliary Cirrhosis,PBC)是一类由自身免疫机制介导的、以肝内小胆管进行性、非化脓性炎症为特征的慢性胆汁淤积性疾病。最近在北美人群中展开的调查显示PBC在普通人群中的年发病率(annualincidence)为30. 3/1000000, 其中男性和女性的年发病率分别为10. 4/1000000和48. 4/1000000，且近年来其患病率 (prevalence)有逐年增长的趋势。PBC发病的原因在于环境和遗传因素的联合作用导致机体发生针对肝脏的自身免疫性反应，其中最主要的抗原就是位于线粒体内膜的丙酮酸脱S酶复合体 E2 亚基(E2subunit of the pyruvate dehydrogenase enzyme complex, PDC-E2)。由于肝脏长期的自身免疫性反应而导致胆汁淤积和肝硬化，甚至肝功能衰竭。虽然熊脱氧胆酸(UDCA)在一定程度上可以延缓疾病的进展，肝移植也可以挽救部分晚期PBC 患者的生命，但是调查显示，自诊断成立开始，PBC的五年生存率只有80%左右，低于健康对照组的存活率。在过去的几十年来，虽然人们探索PBC发病机制的努力从未中断，但对于 PBC发病的具体分子机制仍然有诸多未解之谜。代谢组学的定义是定量分析机体的某一器官、组织或者细胞在特定的时间和环境中所有低分子量代谢物浓度的一种科学。近年来，由于核磁共振、高效液相色谱仪/质谱、 气相色谱/质谱等各种高通量技术的飞速发展，代谢组学被广泛地应用于疾病发病机制的研究中。参与外周血物质代谢是肝脏的重要生理功能之一，因此肝脏疾病可能会影响外周血或者尿液中的代谢物的变化，比如，有学者通过气相色谱/质谱(gas chromatography/ mass spectrometry)发现肝癌患者尿液中有103种代谢物与健康个体不同，这些物质都是潜在的肝癌标志物，还有学者通过核磁共振法也发现肝癌患者外周血的代谢物谱存在明显异常。本发明提供了一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法。为研究 PBC的诊疗提供了一些新的标志物，同时也为其发病机制的研究提供了新的思路。

发明内容
本发明的目的是提供一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法。 本发明是这样实现的，主要包括如下流程步骤1，样本收集与制备，肝功能测试；步骤2，对原始数据进行提取、对齐与归一化；步骤3，主成分(PCA)分析；步骤4，正交偏最小二乘法_判别分析(OPLS-DA)；步骤5，引起组间差异的代谢物的寻找；
步骤6，统计检验。本发明的优点在于本发明提供的分析方法为原发性胆汁肝硬化代谢物的分析研究提供了一种新途径和方法，本方法设计合理可行，为研究PBC的诊疗提供了一些新的标志物，同时也为其发病机制的研究提供了新的思路。


图1 一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法流程
具体实施例方式本发明所述，一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法，本发明将以原发性胆汁性肝硬化患者外周血的代谢组学分析为例，说明本方法得具体实施步骤步骤1，样本收集与制备，肝功能测试；所有PBC患者均为首诊患者，在血液标本采集前未接受任何医学处理，未合并各种病毒性肝炎。肝硬化的诊断标准是基于肝脏活解、影像学表现、实验室检查结果、临床表现以及HBV感染病史。静脉抽取空腹血液5ml，室温下放置30min以便血液凝固，900gr/min 离心IOmin后收集血清置于-80°C保存。肝功能的测试，包括谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶 (AST)，白蛋白，Y-谷氨酰基转移酶(GGT)，总胆红素均在罗氏P800自动生化分析仪生化仪上完成。凝血酶原时间(PT)的检测在Thrombdyzer BERR型凝血仪上完成(ISI = 1. 10)。步骤2，H1NMR技术检测，对原始数据进行提取、对齐与归一化；所有谱图在进行傅立叶变换前均乘以增宽因子为IHz的指数窗函数以提高信噪比。使用TopSpin软件(V3. 0,Bruker Biospin,Germany)对每个样本的谱图进行了傅立叶变换，相位调整，基线校正及定标(以标乳酸在1. 33ppm处的谱峰作为参比)。积分区间为 0. 5-9. Oppm,积分间距为0. 005ppm,并去掉6. 20-4. 40ppm 一段由于水峰影响的区间。对谱图的有效信号区域进行分段积分，相对于整个谱图的有效面积部进行归一化处理。步骤3，主成分(PCA)分析；使用SIMCA-P+ 软件(V10. 0，Umetrics AB, Umea, Sweden)对归一化后的数据进行模式识别多变量分析，主成分分析使用中心化换算(mean center scaling)的数据标度换算方式，并通过得分图的形式进行了总结。 步骤4，正交偏最小二乘法_判别分析(OPLS-DA)；OPLS-DA使用自适换算(unit variance scaling)的数据标度换算方式。步骤5，引起组间差异的代谢物的寻找；找出各代谢物相应的相关系数，对有统计意义的代谢物进行进一步归纳。在载荷图中，将每一个变量的载荷值与其标准差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换。然后与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起组间差异的代谢物。步骤6，统计检验。所有数据均以均值士标准差的形式表示，临床特征的比较中，计数资料多组数据之间的比较采用方差分析，组内比较采用LSD-t法。两组数据的比较采用t检验，计量资料的比较采用卡方检验。所有的统计均在SPSS 11.0中完成，P <0.05被认为是有意义。本方法得特征本方法对基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物提供了一种新方法，为研究PBC的诊疗提供了一些新的标志物，同时也为其发病机制的研究提供了新的思路。 以上是对本发明的描述而非限定，基于本发明思想的其它实施方式，均在本发明的保护范围之中。
权利要求
1. 一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法，其特征在于该方法包括有如下步骤步骤1，样本收集与制备，肝功能测试；步骤2，对原始数据进行提取、对齐与归一化；步骤3，主成分(PCA)分析；步骤4，正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)；步骤5，引起组间差异的代谢物的寻找；步骤6，统计检验。
全文摘要
本发明提供一种基于H1NMR技术分析原发性胆汁肝硬化代谢物的方法，属于生物技术领域，涉及原发性胆汁肝硬化。本发明主要包括如下流程步骤1，样本收集与制备，肝功能测试；步骤2，对原始数据进行提取、对齐与归一化；步骤3，主成分(PCA)分析；步骤4，正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)；步骤5，引起组间差异的代谢物的寻找；步骤6，统计检验。本发明的优点在于本发明提供的分析方法为原发性胆汁肝硬化代谢物的分析研究提供了一种新途径和方法，本方法设计合理可行，为研究PBC的诊疗提供了一些新的标志物，同时也为其发病机制的研究提供了新的思路。
文档编号G01N24/08GK102323286SQ20101054538
公开日2012年1月18日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者刘瑜 申请人:上海聚类生物科技有限公司