专利名称：一种硫酸依替米星新的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种高效液相色谱分析方法，具体涉及一种基于柱前衍生化法，以十八烷基硅烷键合硅胶为分离填料的测定硫酸依替米星及其制剂的含量及有关物质的分析方法。
背景技术：
硫酸依替米星是我国独立开发的具有自主知识产权的半合成氨基糖苷类抗生素， 因为其具有抗菌谱广，耳肾毒性低，耐药性低等优点，而广泛应用于临床。长期以来，硫酸依替米星因为只有紫外吸收末端吸收难以用紫外检测器进行测定，所以只能通过生物效价法、旋光法等方法测定含量及有关物质。这些方法操作繁琐且准确度和可信度较低。目前已有通用型检测器对硫酸依替米星含量测定的一些研究，通用型检测器如示差折光检测器和蒸发光散射检测器虽然在依替米星含量测定上有优势，但由于它们灵敏度低专属性差， 重现性差，在依替米星有关物质测定上往往达不到满意的效果，而控制有关物质的量是硫酸依替米星质量控制的关键。也有文献报道过用柱前衍生化测定氨基糖苷类抗生素，但分离度达不到要求，衍生化试剂也各不相同，衍生化效率低。因此发明一种衍生化效率高、分离高效的能使用常规紫外可见光检测的分析方法，用于硫酸依替米星及其制剂的含量及有关物质检测，对于硫酸依替米星的生产和工艺开发都有非常积极的意义。
发明内容
本发明的目的是研究开发一种能对硫酸依替米星及其制剂的含量测定和有关物质测定的分析方法。本发明的具体技术方案如下一种基于柱前衍生化的硫酸依替米星及其制剂的含量及有关物质的高效液相色谱分析检测方法，其特点在于使用OPA溶液作为衍生化试剂， 3(T60°C避光水浴反应15 20min后，用高效液相色谱紫外-可见光检测器分析，具体高效液相色谱条件和参数为
1、有机相与水相的体积比为阳巧5 :45 25，有机相为甲醇或乙腈，水相为25%冰醋酸。2、水相含离子对试剂庚烷磺酸钠0. OIM^O. 03M,以氨水或醋酸铵调节pH范围为 2. 5 3. 5 ；
3、流速为0.5 1. Oml/min ；进样量为10 20 μ 1 ；
4、检测器为常规紫外-可见光检测器，检测波长为33(T350nm。与现有技术相比，本发明的优点和效果如下
1、本发明使用OPA溶液作为柱前衍生化试剂，并控温避光水浴，衍生化效率高，反应时间短。2、本发明通过以氨水或醋酸铵调节pH，水相和有机相比例控制在55 75 :45 25使各杂质和主峰分离度良好，分离时间较短，有利于在线高效分析检测硫酸依替米星含量和有关物质。3、本发明使用常规十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱和紫外-可见光检测器，具有分析简便，耐用性好的优点。4、本发明操作简单，分离效果好，利于硫酸依替米星质量控制和在线检测，利于硫酸依替米星工艺开发和质量提高。
具体实施方案实验器材及试剂
1、实验仪器
Agilent 1200 series, Chemstation 工作站
2、实验试剂
硫酸依替米星原料、硫酸依替米星注射剂、硫酸依替米星氯化钠大输液(无锡济民可信山禾药业)，依替米星对照品(中检所)，甲醇(色谱纯，Merck),乙腈(色谱纯，Merck)，氨水 (分析纯，国药)，冰醋酸(分析纯，国药)，醋酸铵(分析纯，国药)，超纯水(自制)。3、色谱条件
色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径圹ΙΟμπι，柱规格为 15(T250mmX4. 6 8. Omm。流动相甲醇或乙腈25%冰醋酸含0. OlM 0. 03M庚烷磺酸钠(以氨水或醋酸铵调节PH范围为2. 5^3. 5) =55 75 45^25 ；流速为0. 5^1. Oml/min ；进样量为 10^20 μ 1 ；检测器为常规紫外-可见光检测器，检测波长为33(T350nm。4、样品溶液配制
供试品溶液配制精密称取或量取供试品(原料、注射液、大输液)适量，用水配制成每 ml含依替米星0. 5mg的供试品，0. 22 μ m过滤，备用。对照品溶液配制精密称取对照品适量，用水配制成每ml含依替米星0.5mg。5、衍生化反应
OPA溶液配制取邻苯二醛1. Og，加甲醇5ml与0. 4M硼酸溶液(pH10. 4) 95ml，振摇使溶解，加硫乙醇酸anl，以45%氢氧化钠溶液调节pH至10. 4。衍生化反应精密量取供试品溶液或水(作为空白)4ml置IOml量瓶中，分别加异丙醇2ml和OPA溶液1. Oml,以异丙醇稀释至刻度，摇勻，3(T60°C避光水浴反应15 20min。实施例1
色谱条件色谱柱Phenomenex Gemini NX (150 X 4. 6mm，5 μ m)，流动相甲醇25%冰醋酸(含0. 02M庚烷磺酸钠，以氨水调pH至3. 0) =61 39，流速0. 8ml/min,进样量10 μ 1，检测波长330nm，进样物质供试品溶液与对照溶液。结果，依替米星及其有关物质均达到基线分离。实施例2
色谱条件色谱柱Agilent Zorbax C18 (250 X 6. 6mm，4 μ m)，流动相乙腈25%冰醋酸 (含0. 03M庚烷磺酸钠，以醋酸铵调pH至2. 5)=55 45，流速1. Oml/min,进样量15 μ 1，检测波长335nm，进样物质供试品溶液与对照溶液。结果，依替米星及其有关物质均达到基线分离。实施例3色谱条件色谱柱Diamonsil C18 (150 X 5. Omm，10 μ m)，流动相乙腈25%冰醋酸(含 0. OlM庚烷磺酸钠，以醋酸铵调pH至3. 5) =58:42，流速:0. 5ml/min，进样量20 μ 1，检测波长340nm，进样物质供试品溶液与对照溶液。结果，依替米星及其有关物质均达到基线分
1 O 实施例4
色谱条件色谱柱 Agilent Eclipse XDB C18 (150X4. 6mm，8 μ m)，流动相甲醇25% 冰醋酸(含0. 03M庚烷磺酸钠，以氨水调pH至2. 8)=70 30，流速:1. Oml/min,进样量20 μ 1， 检测波长350nm，进样物质供试品溶液与对照溶液。结果，依替米星及其有关物质均达到基线分离。
权利要求
1.一种高效液相色谱法测定硫酸依替米星及其制剂含量和有关物质的方法，其特征在于基于柱前衍生化法，以OPA为衍生化试剂，异丙醇为溶液，3(T60°C水浴避光加热，反应时间 15 20min。
2.根据权利要求1中所述测定硫酸依替米星及其制剂含量和有关物质的方法，其特征在于选用十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱。
3.根据权利要求1和2所述测定硫酸依替米星及其制剂含量和有关物质的方法， 其特征在于色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱，粒径Γιο μ m,柱规格为 150"250mmX4. 6 8. Omm。
4.根据权利要求1和2所述测定硫酸依替米星及其制剂含量和有关物质的方法，其特征在于流动相分为有机相和水相，有机相为甲醇或乙腈，水相为25%冰醋酸，其中有机相与水相的体积比为阳巧5 :45 25，等度或梯度洗脱。
5.根据权利要求1和2所述测定硫酸依替米星及其制剂含量和有关物质的方法， 其特征在于水相含离子对试剂庚烷磺酸钠0. 01M 0. 03M，以氨水或醋酸铵调节pH范围为 2 · 5 3 · 5 ο
6.根据权利要求1和2所述测定硫酸依替米星及其制剂含量和有关物质的方法，其特征在于流速为0. 5 1. Oml/min ；进样量为10^20 μ L·
7.根据权利要求1和2所述测定硫酸依替米星及其制剂含量和有关物质的方法，其特征在于检测器为常规紫外-可见光检测器，检测波长为33(T350nm。
全文摘要
本发明涉及一种测定硫酸依替米星原料及其制剂的含量和有关物质的检测方法。本发明采用柱前衍生化法，衍生化条件为取样品适量浓度4ml加OPA溶液1ml以异丙醇稀释至10ml，30~60℃水浴避光加热，即得衍生化溶液。发明采用高效液相色谱法，色谱条件为十八烷基硅烷键合硅胶填料色谱柱，粒径4~10μm，柱规格为150~250mm×4.6~8.0mm；流动相分为有机相和水相，其中有机相与水相的体积比为55~7545~25，有机相为甲醇或乙腈，水相为25%冰醋酸含离子对试剂庚烷磺酸钠0.01M~0.03M，以氨水或醋酸铵调节pH范围为2.5~3.5；流速为0.5~1.0ml/min；进样量为10~20μl；检测器为常规紫外-可见光检测器，检测波长为330~350nm。本发明使用常规检测器和高效液相色谱仪，可以实现在线检测硫酸依替米星及其制剂的含量和有关物质，方法简便可行，准确可靠。
文档编号G01N30/02GK102565208SQ20101061036
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者杨春艳, 钱小燕, 陈环 申请人:无锡济民可信山禾药业股份有限公司, 江西济民可信集团有限公司