专利名称：用于分析能量代谢中极性代谢物的方法
用于分析能量代谢中极性代谢物的方法本发明涉及极性代谢物的分析并提供了用于分析极性代谢物的方法，其包括在允许直接破坏生物样品所包含的细胞的条件下用包含相分离剂和挥发性中性铵盐的提取缓冲液提取生物样品，通过色谱法分离提取物所包含的极性代谢物，并分析所分离的极性代谢物。此外，考虑了用于淬灭包含细胞物质的生物样品的方法。极性代谢物诸如羧化代谢物或磷酸化代谢物占细胞的代谢组物的高达90 %。相应地，代谢组学，即代谢组物的系统和比较分析，在极大程度上涉及极性代谢物的分析。目前提供的用于代谢组学的分析技术主要是基于以液相色谱或气相色谱为基础的质谱或以液相色谱或气相色谱为基础的NMR(核磁共振)谱。在代谢组学中气相色谱的应用的缺点是必须将代谢物转换成气相而不未破坏分子。应用衍生化以改善所述的转换。然而，衍生化也具有一些缺点，因为人工衍生化能产生有时几乎与真实代谢物无法区分的代谢物。液相色谱既不需要转换成气相也不需要衍生化。然而，对于极性代谢物的分离是不太有效的。此外，由于生物样品中过多的蛋白质类、肽类和无机盐的存在，对于极性代谢物的分离效能通常被显著地降低。因此，期望的是把气相色谱的精确分离特性与能被应用于液相色谱的温和的条件结合。这样，将会避免上述的缺点。因此，虽然还没有用于代谢物的有效的提取和分析的方法，但却是迫切需要的。本发明涉及用于分析极性代谢物的方法包括i)在允许直接破坏生物样品所包含的细胞的条件下，用包含相分离剂和挥发性中性铵盐的提取缓冲液提取生物样品，ii)通过色谱法分离步骤i)中所获得的提取物所包含的极性代谢物，和iii)分析步骤ii)中所获得的分离的极性代谢物。本文所应用的术语“生物样品”是指包含来自所有生物来源的生物物质的样品。 应当理解的是生物物质应包括代谢物。生物样品所包含的优选的物质是细胞物质，诸如细胞或细胞碎片。因此，优选地，生物样品包含悬浮细胞、贴壁细胞或组织或它们的任何碎片。 优选的生物样品包含来自临床样品的生物物质，包括体液样品，优选血液、血浆、血清、淋巴液、汗液、唾液、泪液、精液、阴道液、粪便、尿液或脑脊液，或由例如通过活组织检查从细胞、组织或器官所获得的样品。还优选地，生物样品代表有机体的各种状况的一种，例如它可是源自健康的或患病的有机体，用药物治疗或未治疗的有机体等。还包括包含微生物诸如细菌或真菌或者植物、植物部分(诸如叶、茎、根或花)或植物种子的生物样品。本文所应用的术语“代谢物”是指小分子化合物，诸如代谢途径的酶的底物、所述途径的中间体或通过代谢途径所获得的产物。代谢途径为本领域所公知且可在种属之间不同。优选地，所述的途径至少包括三羧酸循环、呼吸链、光合作用、光呼吸作用、糖酵解、糖原异生、一磷酸己糖通路、氧化戊糖磷酸途径、脂肪酸产生和β -氧化、尿素循环、氨基酸生物合成途径、蛋白降解途径诸如蛋白酶体降解、氨基酸降解途径、脂质体、聚酮化合物(包括例如黄酮类和异黄酮类)、类异戊二烯(包括例如萜类、留醇类、留类、类胡萝卜素类、叶
4黄素类)、碳水化合物类、苯丙素类及衍生物、生物碱类、苯环类、吲哚类、吲哚-硫化合物、 卟啉类、花色素类、激素类、维生素类、辅因子诸如辅基或电子载体、木质素、葡萄糖异硫氰酸盐类、嘌呤类、嘧啶类、核苷类、核苷酸及相关的分子诸如tRNA、微小RNA(miRNA)或mRNA 的生物合成或降解。相应地，小分子化合物代谢物优选地由以下几类化合物组成醇类、烷烃类、烯烃类、炔烃类、芳香化合物、酮类、醛类、羧酸类、酯类、胺类、亚胺类、酰胺类、氰化物类、氨基酸类、肽类、硫醇类、硫代酸酯类、磷酸酯类、硫酸酯类、硫醚类、亚砜类、醚类，或上述化合物的组合或衍生物。在代谢物中的小分子可以是正常细胞功能、器官功能或动物生长、发育或健康以及植物生长所必需的初级代谢物。此外，小分子代谢物还包括具有重要生态功能的次级代谢物，例如使有机体适应其环境的代谢物。此外，代谢物不局限于所述的初级和次级代谢物还包括人工小分子化合物。所述的人工小分子化合物是源自外源性提供的小分子，其通过有机体施用或摄取，但不是上文定义的初级或次级代谢产物。例如， 人工小分子化合物可以是通过动物的代谢途径从药物所获得的代谢产物。此外，代谢物还包括肽类、寡肽类、多肽类、寡核苷酸类和多聚核苷酸类，诸如RNA或DNA。更优选地，代谢物的分子量为50Da(道尔顿)至30，OOODa，最优选地小于30，OOODa、小于20，OOODa、小于 15，OOODa、小于 10，OOODa、小于 8，OOODa、小于 7，OOODa、小于 6，OOODa、小于 5，OOODa、小于 4，OOODa、小于 3，OOODa、小于 2，OOODa、小于 1，OOODa、小于 500Da、小于 300Da、小于 200Da、 小于lOODa。优选地，代谢物无论如何具有至少50Da的分子量。然而，依据本发明的代谢物的分子量最优选为50Da至1，500Da。在代谢物中，本发明面对的是极性代谢物，即为极性的小分子化合物。从生物样品提取诸如极性代谢物的分子是已公知的方法，其是基于利用分子的溶解性差别。感兴趣的分子可被提取出来，即溶解在提取缓冲液中，并因此从生物来源中移走。可以理解的是基于提取缓冲液的化学性质，可溶解不同种类的分子，并因此从生物样品物质中分离。本发明的方法，特别是设想从生物样品中提取极性代谢物。提取可以连续的或分批的方法进行。以生物样品为例，提取方法优选有机械破坏生物样品所包含的生物物质的帮助。这样的帮助优选允许短的和有效的提取时间，优选地小于40秒，小于30秒，小于20秒。这可通过已公知的均勻化技术实现，诸如通过例如pestilling或珠磨进行的细胞研磨，例如Jastfr印(MP生物医学，德国)。应用于本发明方法中的提取缓冲液包含相分离剂，即对于使分子分离至不同相 (诸如极性分子的相和非极性分子的相)中具有促进和/或改善能力的化合物。优选地，本发明方法所应用的相分离剂包含卤化溶剂。优选地，卤化溶剂具有大于 l.Olg/cm3(在20°C)的密度。更优选地，卤化溶剂选自二氯甲烷、氯仿或四氯乙烯，更优选地，卤化溶剂是二氯甲烷。相分离剂是高度疏水的，且优选地密度高于水，诸如二氯甲烷是本发明方法中优选的。这些相分离剂能够沉淀样品中的蛋白质，并因此有助于优选的基于离心方法的蛋白质干扰物的去除，否则其会干扰代谢物的后续的分析。此外，通过相分离剂的相分离是有利的，因为由于高浓度盐干扰物会使有机溶剂在水溶液中的溶解度降低。除了卤化溶剂外，相分离剂优选地还包含低级烷的醇。优选地，所述的醇是乙醇、 甲醇或异丙醇，且最优选乙醇。卤化溶剂和低级烷的醇存在于相分离剂中，优选地以3 1至1 1的比率、且优选地以2 1比率存在。然而，还优选地，相分离剂也可基本上由卤化溶剂构成。
此外，提取缓冲液包含挥发性的生性铵盐。本文所涉及的挥发性中性铵盐是可通过冷冻干燥方法升华的铵盐。优选地，所述的挥发性中性铵盐是乙酸铵、甲酸铵或碳酸氢铵。最优选地，所述中性铵盐是乙酸铵。尤其是乙酸铵促进极性和非极性代谢物的分离，因为仅极性代谢物能溶解于本发明的含有乙酸铵的提取缓冲液中。依据所要进行的用于分析代谢物的分析的类型，分离极性代谢物与非极性代谢物是必需的或有帮助的。这特别是应用于如果将分析含蛋白质的样品的情况下。优选地，提取缓冲液包含浓度至少为0. 5M的所述的挥发性中性铵盐。更优选地，浓度在0.75M至1.8M之间，且最优选浓度为1.5M。应理解的是浓度可包括优选在加或减15%、10%或5%的范围内的较小的偏差。在本发明方法中中性(即非碱性的)挥发性铵盐的应用优于碱性挥发性铵盐诸如碳酸铵，因为这样的碱性盐可能改变样品的代谢组成，例如通过裂解磷酸化的代谢物诸如CoA-酯而使之改变。 在本发明方法中所应用的挥发性中性铵盐，优选地充当包含离子化代谢物和蛋白质的复合物的竞争剂。由于所述的铵盐的离子交换的性质，所述特定的高浓度中性铵盐允许所述的离子化代谢物-蛋白质的复合物解离，并因此增加离子化即极性代谢物的收率。提取缓冲液优选还包含其他组分诸如溶剂、稳定剂，或依据提取物的进一步应用， 还包含用于测定的标准物质。应用于提取缓冲液中优选的标准物质在本说明书中的其他部分更详细地说明。应理解的是本发明也涉及如上详述的提取缓冲液。步骤i)中的生物样品的提取原则上能在低于提取缓冲液的沸点的任意温度进行。优选地，温度低于95°C，提取更优选在低于-20°C的低温进行，这是为了避免或降低酶的活性或为了减少在化学上改变(例如降解)样品中代谢物的化学反应。优选地，在-20 至_80°C的提取温度进行提取。特别优选的温度是在-25至-80°C，-30°C至_80°C，-35°C 至-80 "C，-40 "C 至-80 "C，-45 V 至-80 V，-50 V 至-80 V，-55 V 至-80 V，-60 V 至-80 °C，-65 °C 至-80 "C，-70 "C 至-80 "C，且更优选地温度是-70 °C、_71 °C、-72 °C、-73 °C、~7 4°C、-75 °C、-76 °C、-77 °C、-78 °C、-79 °C、或-80 °C。在本发明方法中通过常规的色谱技术分离所提取的极性代谢物。优选的技术包括毛细管电泳(CE)，阳离子、阴离子交换色谱，离子排阻色谱，反相色谱，正相色谱，亲水作用色"1普(hydrophilic liquid interaction chromatography)，免疫亲禾口色谱，液才目色i普 (LC)或气相色谱(GC)以及高压液相色谱(HPLC)或超高压液相色谱(UPLC)。最优选地，通过UPLC或HPLC完成分离。对于UPLC应用，在约400至1000巴的工作压力、更优选地580 至750巴的工作压力优选应用< 2. 0 μ m尺寸的C18颗粒。UPLC的应用可实现具有高灵敏度的快速分离(小于半小时)且比通常的HPLC方法分离更多的异构体。此外，无机盐与需要的极性代谢物被更好地色谱分离。更多的优势是减少色谱峰的拖尾，尤其对于酮基羧酸 (ketocarbonic acid)或多羟基酸是如此，以及由于更好的信噪比而改善检测限。然后对所分离的极性代谢物进行分析，以测定它们的化学性质和/或用以测定它们的结构。所述的分析可通过测定极性代谢物的物理或化学性质进行，随后可将其与已知分子的性质进行比较。基于所述的比较，可由于与已知分子匹配的性质而鉴定代谢物。此夕卜，通过应用本发明的方法可定量地或半定量地测定存在于样品中的代谢物的量。用于分析极性代谢物的优选的技术是基于质谱或基于NMR的技术。优选地，应用质谱，特别是气相色谱质谱(GC-MQ，液相色谱质谱(LC-MQ，直接注入式质谱或傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR-MS)，毛细管电泳质谱(CE-MQ，高效液相色谱偶联质谱 (HPLC-MS)，四级杆质谱，任意按顺序偶联质谱，诸如ESI-MS-MS或MS-MS-MS，电感耦合等离子质谱(ICP-MQ，裂解质谱(Py-MQ，离子迁移质谱或飞行时间质谱(TOF)。所述的技术在例如Nissen，Journal of Chromatography A，703，1995 :37-57, US 4，540，884 或 US 5，397，894中公开，其公开内容在此弓I入本文作为参考。最优选地，应用UPLC和ESI-MS/MS。作为备择项或除了质谱技术之外，以下技术也可被用于代谢物的测定核磁共振 (NMR)、磁共振成像(MRI)、傅里叶变换红外分析(FT-IR)、紫外(UV)光谱、折射指数(RI)、荧光检测、放射化学检测、电化学检测、光散射(LS)、分散拉曼光谱或火焰离子化检测(FID)。 这些技术为本领域的技术人员所公知且可被直接应用。此外，也可通过特定的化学或生物检验分析极性代谢物。所述的检验应包括可以特异地检测样品中代谢物的手段。优选地，所述的手段能够特异地识别代谢物的化学结构， 或者基于其与其他化合物反应的能力或其引起在生物读出系统上的响应(例如诱导报告基因)的能力能够特异地鉴定代谢物。能够特异地识别代谢物化学结构的手段优选是抗体或特异地与化学结构相互作用的其他蛋白质，诸如受体或酶。特异性抗体例如可通过本领域已公知的方法利用代谢物作为抗原而获得。本文所涉及的抗体包括多克隆和单克隆两种抗体，及它们的片段，诸如能结合抗原或半抗原的Fv，Fab和F(ab)2片段。本发明也包括人源化杂交抗体，其中显示需要的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列结合。此外，包括单链抗体。供体序列通常至少包括供体的结合抗原的氨基酸残基，但是也可包括供体抗体的其他结构上和/或功能上相关的氨基酸残基。通过本领域已公知的方法可制备所述的杂交体。能够特异地识别代谢物的合适的蛋白质优选是在所述的代谢物的代谢转化中所涉及的酶。所述的酶可利用代谢物作为底物或可转化底物为代谢物。此夕卜，所述的抗体可被用作基础来产生特异地识别代谢物的寡肽。这些寡肽例如应包含针对所述代谢物的酶结合区或口袋。基于合适的抗体和/或酶的测定法可以是RIA(放射免疫分析)、ELISA (酶联免疫吸附分析)、夹心酶免疫检测、电化学发光夹心免疫分析(ECLIA)、 离解-增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)或固相免疫检测。此外，也可基于代谢物与其他化合物反应的能力鉴定代谢物，即通过特异的化学反应。而且，代谢物也可由于其引起得到在生物读出系统响应的能力而被分析。生物响应可以读出而被检测，指示包含在样品中的代谢物的存在和/或量。生物响应可以是例如诱导基因表达或者细胞或有机体的表型响应。本发明的方法应当优选地通过自动化辅助。例如，在提取和/或分离过程中的样品处理或前处理可通过机器人自动化操作。数据处理和比较优选由合适的计算机程序和数据库辅助。本文前述的自动化使本发明的方法可以应用于高通量方法中。有利地，已在阐述本发明的研究中发现本发明的方法可以从生物样品中有效地提取极性代谢物。特别是，在低温进行提取防止了生物分子的降解，这是由于降低了总体的化学和/或生物反应性，例如使酶保持非活化。如上所述在提取缓冲液中相分离剂的应用导致水相凝固点降低、蛋白质的变性和有效的沉淀以及将疏水性的酶和亲水性的(极性的) 代谢物分离在不同的相中。此外，已惊奇地发现以高浓度加入挥发性的中性铵盐由于其离子交换性质而显著提高提取率。此外，在后期阶段可将所述的挥发性中性铵盐从提取物中去除，因此，不影响极性代谢物的分析。
在本发明方法的优选的实施方案中在步骤ii)之前通过以下的步骤处理提取物a)将水相旋转离心，b)将步骤a)中所获得的上清液冷冻干燥，和c)将步骤b)中所获得的冷冻干燥物溶解在包含离子对生成剂的分析缓冲液中。具体而言，如果如上述进行基于MS的极性代谢物的分析，上述的步骤a)至C)是优选进行的。水相的旋转离心有效地从水相中保留的极性代谢物去除细胞碎片。优选地， 通过应用0.2μπι至5μπι(标称截流)的膜过滤器旋转过滤进行旋转离心。然后将包含提取缓冲液的极性代谢物和极性组分、诸如挥发性中性铵盐的旋转离心步骤的上清液或过滤液，通过标准方法冷冻干燥。该方法还通过升华去除了挥发性的中性铵盐，因此，其不可能影响随后的极性代谢物的色谱分离或分析的步骤。将产生的冷冻干燥物溶解于用于代谢物的色谱分离和分析的分析缓冲液中。在本发明方法中所应用的分析缓冲液应当包含离子对生成剂。优选地，所述的离子对生成剂是三丁基铵阳离子、三乙基铵阳离子、三丙基铵阳离子或正己基铵阳离子。这些离子对生成剂可以以游离胺形式获得，然后将其通过质谱相容性酸活化，诸如乙酸或甲酸。优选地，分析缓冲液具有中性至弱酸性ρΗ，更优选ρΗ在6. 0至6. 8之间，最优选 6. 4 至 6. 8。在下文描述了上述方法的优选实施方案的具体方面。在本发明方法的优选的实施方案中，生物样品是细胞悬浮液。在进行本发明方法之前(即步骤i)之前)，优选地淬灭生物样品，即直接抑制酶的活性和抑制由于例如氧化的化学修饰。然而，所述淬灭方法通过引起从细胞内“放出”细胞内的代谢物而不影响代谢组成，在特别是要分析细胞内代谢物的情况下是合乎需要的。特别是，对于悬浮细胞，淬灭方法是关键的。因此，本发明还涉及淬灭包含细胞物质的生物样品的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含由包含丙二醇或乙二醇的预先冷却的淬灭溶液组成的下层相、由惰性相分离剂组成的疏水的中间相、和由生物样品组成的上层相的离心瓶，其中下层相比中间相具有更高的密度，且中间相比上层相具有更高的密度，和b)使该瓶离心以使生物样品所包含细胞物质从上层相转移至下层相。优选地，丙二醇是或包含1，2_丙二醇。还优选地，惰性相分离剂是包含密度1. 01 < P <1.04(在20°C)的疏水性液体，且更优选惰性相分离剂是或包含硅油。由于离心，悬浮细胞将会直接从上层相(例如培养基或缓冲液)转移至预先冷却的淬灭溶液存在的下层相中。疏水性的中间相不与上层相或下层相混溶，并保持与这两相分离并最小化上层相和下层相的扩散过程和混合。优选地，下层相具有-20至-80的温度。此外，特别优选的温度是-25 至-80 "C、-30 "C 至-80 "C、-35 V 至-80 V、-40 V 至-80 V、-45 V 至-80 V、-50 V 至-80°C、-55° 至-80"C >60° 至-80°C、-65°C至-80"C、-70"C至-80"C，更优选地，温度是 -70 °C、-71 °C、-72 °C、-73 °C、-74°C、-75 °C、-76 °C、-77 °C、-78 °C、-79 °C、或-80 °C。此外，在上述方法的另一个优选的实施方案中，在离心后从疏水性的中间相去除上层水相并将同位素标记的标准物质加入到下层相。将所述的同位素标记的标准物质应用于回收率的测定和涉及本发明方法的各个实验的比较。优选地，同位素标记的标准物质是优选微生物细胞、更优选来自于酵母或细菌培养物的细胞提取物，它们在存在同位素标记的底物和/或同位素标记的铵盐的人工培养基中生长。底物优选用1V标记。优选地，同位素标记的底物是被均勻标记的U13C-葡萄糖或U13C-谷氨酸，而铵来源是1N氯化铵或1N硫酸铵。该提取物是特别有利的，因为各种类别的生物上重要的分子都存在于其中，不过却带有同位素标记，这可将其与来源于生物样品中的非标记的形式区分开。因此，能够以低成本有效地避免考虑到不同类别的分子而如此昂贵并复杂的标准物质的产生。依据步骤i)去除用于保持水相和淬灭溶液相的分离所加入的疏水性中间相。应该理解的是上述的用于淬灭的方法可被优选地应用于上述分析极性代谢物的方法中，特别是在悬浮细胞被作为生物样品研究的情况下如此。因此，在用于分析极性代谢物的本发明方法的步骤i)之前，依据上述的方法将细胞悬浮液淬灭。在本发明方法的另一个优选的实施方案中，生物样品是生长在膜上的贴壁细胞的培养物。本文所应用的术语“膜”是指任意固体支持物，其可在不同瓶之间转移并允许细胞贴壁并在其上生长。合适的膜是本领域已公知的且包括Track edge膜和任意种类适合用于贴壁细胞的培养的亲水性或疏水性支持物。更优选地，依据本发明的方法所应用的膜是 Track edge膜。有利地是所述的膜在提取过程中被破坏，因此将贴壁细胞释放而无须刮、费力的消化或其他干扰有效淬灭的操作。优选地，在步骤i)之前，通过直接将膜转移至具有-20至-80°C温度的如上文所定义的提取缓冲液中而将生长在所述膜上的贴壁细胞的培养物淬灭。对于提取缓冲液而言的特别优选温度是-25 至-80°C、_30°C至-80°C、-:35°C至 _80°C、_40°C至 _80°C、_45°C 至-80°C、-50°C至-80°C、-55° 至-80°C、60° 至-80°C、_65°C至-80°C、-70°C至 _80°C， 更优选地，温度是 _70°C、-71°C、-72°C、-73°C、-74°C、-75°C、-76°C、-77°C、-78°C、-79°C、 或-80°C。还优选地，在步骤i)之前，通过直接将膜转移至液氮中而将生长在所述膜上的贴壁细胞的培养物淬灭。在所述的转移时，直接应用约-196°C的温度。通过将膜转移进入容器并在液氮中冷冻膜并因此应用约-196°C的温度，可优选地实现转移。或者，在步骤i)之前将包含贴壁细胞的培养物的膜用清洗缓冲液冲洗以清除膜上源自介质中的细胞外组分。 随后，如上所述将膜淬灭。在本发明方法的另一个优选的实施方案中，所述的生物样品是组织样品。优选地，也在步骤i)之前在-20至-80°C温度下通过直接冷冻组织而将所述的组淬灭。用于淬灭的特别优选温度是-25 至-80°C、_30°C至-80°C、-:35°C至 _80°C、_40°C至 _80°C、_45°C 至-80°C、-50°C至-80°C、-55° 至-80°C、60° 至-80°C、_65°C至-80°C、-70°C至 _80°C， 更优选地，温度是 _70°C、-71°C、-72°C、-73°C、-74°C、-75°C、-76°C、-77°C、-78°C、-79°C、 或-80°C。还优选地，在步骤i)之前，可通过直接将组织转移至液氮中，例如通过应用约_196°C的温度，实现所述的淬灭。将上文涉及的所有参考文献的全部的公开内容以及其在上文明确提及的特定的公开内容引入本文作为参考。附图
图1显示用于分析生物样品中极性代谢物的方法的工作流程。图2分别表明ADP和ATP提取率增加两倍，且辅酶A和乙酰辅酶A的提取率增加 5至12倍，且当所应用的乙酸铵缓冲液的浓度从等渗条件增加至1500mM时，对于烟酰胺二核苷酸提取率增加最多3倍。图3显示组织样品(人胰腺)——5mg称重样品的冷冻干燥的提取物代表性的色谱图(上面第一个色谱图(3A)显示总的XIC(提取离子流色谱图)(MRM(多反应监测)的 XIC (80 对)87. 0/43. Oamu (原子质量单位)，预期 RT (保留时间)4. 9，ID 肝 26neu wiff 样品21(10uL-C4)的PYR(焦谷氨酸)(涡轮喷雾))，第二个色谱图(3B)显示氧化还原和能量(MRM 的 XIC (80 对)305. 8/143. Oamu，预期 RT 4. 7，ID 26neu wiff 样品 21 (10uL_C4) 的GSH(谷胱甘肽)(涡轮喷雾))，第三个色谱图(3C)显示TCA(三羧酸循环)(MRM的XIC(80 对)191. 0/73. Oamu，预期 RT 9. 7，ID 肝 26neu wiff 的样品 21 (10uL_C4)的 ISOCIT (涡轮喷雾))，第四个色谱图(3D)显示糖酵解(MRM的XIC(80对)169. 0/97. Oamu，预期RT 6. 6，ID 肝^neu wiff的样品21 (10uL_C4)的DHAP (磷酸二羟丙酮)(涡轮喷雾))。强度 (cps)在y_轴显示，保留时间(分钟，min)在χ-轴显示。图4显示基于实测的细胞内的U13C葡萄糖/U12C-葡萄糖的比率的在极性代谢物提取物中U13C的相对富集量；(A)常规淬灭方法，(B)通过密度离心淬灭。现在通过下文的实施例阐述本发明，该实施例并非意在限制本发明的范围。
实施例实施例1 淬灭和提取a)细胞悬浮液将350 μ L 1，2-丙二醇加入到许多预装填了 5个钢珠并冷却至_80°C提取瓶中。 此后，在_80°C贮存前在每个瓶中加入350 μ L硅油直到下一步应用。将1毫升典型体积的细胞水悬浮液小心加至油层上部且立即将样品在15000*g和0°C离心2分钟。然后，直接将样品放置在干冰上并去除上层相。此后，加入包含有1. 5M乙酸铵的水溶液的提取缓冲液
)、同位素标记的细胞提取物)和二氯甲烷(_80°C )。在低温条件下经过珠磨过程在一步20秒内可实现细胞破裂、蛋白质变性和代谢物提取(应用!^astft 印M设备，MP生物医学公司)。在上述的条件下经过离心完成相分离。为了完全去除任何细胞碎片，应用上述的条件通过0. 2 μ m过滤材料经旋转过滤将上层的极性相滤过。滤液部分用水稀释，冷冻在-80°C，并随后冷冻干燥。b)贴壁细胞培养物将结合具有膜底部的插入物的培养皿用于培养贴壁细胞系(例如=Tracked edge 膜，Nunc公司)。为进行细胞取样，将膜剖离并转移至预装填了五个钢珠和二氯甲烷和乙醇 2 1混合物(_80°C )的提取瓶中。为进行提取，加入1. 5M乙酸铵的水溶液)和同位素标记的细胞提取物G°C)。应用a)中所述的相同的珠磨程序，将细胞和膜完全破碎。应用a)中所述的离心条件去除蛋白质、细胞碎片和膜残留物并将样品分离成上层、极性相和下层、非极性相。收集上层相并按照a)所述进行后续操作。c)组织样品为进行组织取样，直接将组织冷冻在液氮温度并随后冷冻干燥。随后，用二氯甲烷
10和乙醇2 1的混合物(_80°C )覆盖3-5mg的干燥组织。最后，加入1. 5M乙酸铵的水溶液 (4°C )和同位素标记的细胞提取物)。样品按照b)所述进行后续操作。实施例2 同位素标记的细胞提取物的产生在产朊假丝酵母(Candida utilis)(保藏在DSMZ sp. 2361)的酵母培养物在摇瓶中在不合氨基酸的YNB (酵母氮源基础)最小培养基(Sigma)中的U13C-D-葡萄糖(10g/l) 上生长。为了维持需氧条件，利用定轨摇床将瓶子在180rpm，28°C摇动。通过在1000*g和 4°C离心200ml酵母培养物O^lcon管)实现细胞的收集。随后采用由0. 15M乙酸铵和IOg/ 1 U13C-D-葡萄糖组成的洗涤缓冲液和随后的离心而洗涤细胞两次。应用7.5ml2 1 (ν/ ν) 二氯甲烷/乙醇溶液(_80°C )淬灭细胞沉淀物。通过加入2. 5ml 1. 5M乙酸铵的水溶液至所淬灭的样品中在如a)中所述的低温条件下进行提取。在提取后，在如a)所述的条件下将样品离心并收集包含U13C-标记的代谢物的上层相并储存在_80°C直至下一步应用。实施例3 色谱法分离应用超高压离子对液相色谱IP-UPLC对磷酸化的和/或羧化的极性代谢物进行色谱分离。用溶剂A(去离子水)和溶剂B(50%乙腈，50%水(ν/ν))进行色谱梯度洗脱，而保持恒定的柱流速0. 4mL/min和柱温45°C。将挥发性的添加剂三丁基胺加入到两个洗脱剂中并且应用冰乙酸将PH值调节至6. 2以得到形成离子对的三丁基铵阳离子。将冷冻干燥的样品溶解在小体积的洗脱剂A中，然后将1至20μ L的提取物进样。实施例4:质谱应用负离子模式电喷雾串联质谱(-ESI-MSMS)评价由UPLC分离的极性代谢物。依据称为的预定或选择多反应监测的模式(sMRM)操作串联MSMS，而用单位分辨率进行的特定的质量调节(unique mass adjustments)是确定的。通过不同的质量信号区分各个代谢物的同位素标记的和未标记的形式。实施例5 通过应用高浓度的挥发性提取缓冲液增加提取率实施例5证明通过应用高浓度的挥发性乙酸铵缓冲液用于细胞组织的提取增加了若干代谢物的提取率。在随后的冷冻干燥步骤中去除所加入的挥发性缓冲液，而不易挥发的磷酸化代谢物被保留。因此，与常规的条件相比，使细胞组织接触高盐缓冲液使得许多与蛋白质结合的代谢物更大程度地释放出来。该发现对于样品中低丰度的代谢物具有特别重要的意义。除此之外，增加烟酰胺类(nicotineamides)的提取率大大影响了 NADPH的氧化形式和还原形式之间的比率，其用于指示细胞或样品中提供的还原当量(图2)。实施例6 代表性的色谱图实施例6说明了冷冻干燥组织的代表性的色谱图。在低温条件下提取前，用 U13C-标记的酵母提取物修正(amend) 5mg干样品。图3显示通过负模式ESI-MSMS应用预定多反应监测的测定的70个质量信号(mass trace)(标记的/未标记的)的色谱图。根据样品的天然丰度或标记的酵母，质量丰度的范围包括三个数量级。除了总模式(XIC)之夕卜，描述了三个广泛质量提取物，其分别用于指示能量代谢、三羧酸循环(TCA)和糖酵解。实施例7 通过由密度梯度离心的淬灭提高对酶活性的抑制使产朊假丝酵母培养物(sp. 2361)在应用IOg L-I未标记的D-葡萄糖的YNB培养基中生长，并在光学密度4.0 (600nm，Icm光通过)时收集。为了评价由于淬灭方法所导致的偏差，将培养物
(A)迅速地通过0. 2 μ m过滤器，并在通过冷溶剂淬灭前，用含IOg L-1U13C-标记的D-葡萄糖的150mM乙酸铵缓冲液洗涤，和(B)通过应用密度梯度离心方法直接淬灭，而用等量的U13C-D-葡萄糖修正 (amend) 1,2-丙二醇相。应用标准的淬灭方法(例如过滤和快速细胞洗涤)，糖酵解中间体、两种三羧酸循环的酸及戊糖磷酸途径的代谢物呈现显著的13C富集。相反地，通过所述新的密度梯度方法淬灭所述酵母细胞，在糖酵解的及其他的中间体中不存在13C富集根本上证实了糖酵解酶完全失活(图4)。
权利要求
1.用于分析极性代谢物的方法，其包括i)在允许直接破坏生物样品所包含的细胞的条件下，用包含相分离剂和挥发性中性铵盐的提取缓冲液提取生物样品， )通过色谱法分离步骤i)中所获得的提取物所包含的极性代谢物，和iii)分析步骤ii)中所获得的分离的极性代谢物。
2.权利要求1的方法，其中所述的相分离剂包含二氯甲烷。
3.权利要求1或2的方法，其中所述的挥发性铵盐是乙酸铵、甲酸铵或碳酸氢铵。
4.权利要求1至3中任意一项的方法，其中所述的挥发性中性铵盐的浓度至少为 0. 5M。
5.权利要求1至4中任意一项的方法，其中步骤i)中所述的提取生物样品在-20 至_80°C的提取温度进行。
6.权利要求1至5中任意一项的方法，其中在步骤ii)之前通过下面的步骤处理所述提取物a)将水相旋转离心，b)将步骤a)中所获得的上清液冷冻干燥，和c)将步骤b)中所获得的冷冻干燥物溶解在包含离子对生成剂的分析缓冲液中。
7.权利要求1至6中任意一项的方法，其中所述的离子对生成剂是三丁基铵阳离子、三乙基铵阳离子、三丙基铵阳离子或正己基铵阳离子。
8.权利要求1至7中任意一项的方法，其中所述的色谱法是UPLC或HPLC。
9.权利要求1至8中任意一项的方法，其中所述的分析步骤iii)中所获得的分离的极性代谢物包括质谱法。
10.权利要求9的方法，其中质谱法是ESI-MS/MS。
11.权利要求1至10中任意一项的方法，其中所述的生物样品是细胞悬浮液。
12.用于淬灭包含细胞物质的生物样品的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含由包含丙二醇或乙二醇的淬灭溶液组成的下层相、由惰性相分离剂组成的中间相、和由生物样品组成的上层相的离心瓶，其中下层相比中间相具有更高的密度，且中间相比上层相具有更高的密度，和b)使该瓶离心以使生物样品所包含细胞物质从上层相转移至下层相。
13.权利要求12的方法，其中所述的下层相具有-20至_80°C的温度。
14.权利要求12或13的方法，其中在离心后从下层相中去除上清液并将同位素标记的标准物质加入到下层相。
15.权利要求11的方法，其中，在步骤i)之前，如权利要求12至14中任意一项所定义的那样将所述细胞悬浮液淬灭。
16.权利要求1至10中任意一项的方法，其中所述的生物样品是生长在膜上的贴壁细胞的培养物。
17.权利要求16的方法，其中，在步骤i)之前，通过直接将膜转移至具有-20至-80°C 温度的如权利要求1至4中任意一项所定义的提取缓冲液中而将生长在所述膜上的贴壁细胞的培养物淬灭。
18.权利要求16的方法，其中，在步骤i)之前，通过直接将膜转移至液氮中而将生长在所述膜上的贴壁细胞的培养物淬灭。
19.权利要求1至10中任意一项的方法，其中所述的生物样品是组织样品。
20.权利要求18的方法，其中，在步骤i)之前，通过直接将组织冷冻至-20至-80°C的温度或通过应用液氮而将所述组织淬灭。
全文摘要
本发明涉及极性代谢物的分析并提供了用于分析极性代谢物的方法，其包括在允许直接破坏生物样品所包含的细胞的条件下用包含相分离剂和挥发性中性铵盐的提取缓冲液提取生物样品，通过色谱法分离提取物所包含的极性代谢物，并分析所分离的极性代谢物。此外，本发明还涉及用于淬灭包含细胞物质的生物样品的方法。
文档编号G01N30/02GK102472741SQ201080030208
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月7日 优先权日2009年7月8日
发明者G·巴尔克, M·多斯特勒, R·洛塞, S·卡瓦略, T·B·沃克 申请人:巴斯夫植物科学有限公司