专利名称：采用次级离子质谱法(sims)高灵敏度检测和定量生物分子的改进方法
技术领域：
本发明涉及采用同位素标记和次级离子质谱法检测和定量生物分子(例如DNA、RNA或蛋白质)的方法以及设计用于实施所述方法的阵列。
背景技术：
在六十年代早期，Castaing和Slodzian采用次级离子开发了质量过滤的发射离子显微术(mass-filtered emission ion microscopy),这是后来称为次级离子质谱法(SIMS)的技术的一部分。利用这种技术，一束离子(初级离子束)用作探针来将样品的表面原子层溅射到原子或原子簇中，其中一小部分原子被离子化。在SIMS设备中，这些次级离子根据质量分离，然后用于测定次级离子电流以产生例如，所分析表面的定量原子质量图像。SIMS已经成为半导体和表面科学研究、地质化学、有机材料的鉴定和宇宙化学中的主要工具。然而，在很长时间以来离子显微术仅被视为解决生命科学中的问题的一种边缘方法，这主要是由于其差的横向分辨率(1-0.5μπι)和不足的质量分离能力。技术和观念上的改进导致横向分辨能力和质量分辨率的显著进步，特别是由于采用精细聚焦的初级离子束。因此SIMS显微术变成很强大的成像工具。例如，Lechene等能够采用SIMS技术来使单个静纤毛(即耳蜗内细胞的机械感觉细胞器)成像(Lechene等，Journal of Biology，2006，5 :20)。在另一个实验中，他们能够研究在15N气氛中培养的细菌的固氮作用。采用SMS技术也使得Lechene等定位、定量并比较单细胞中和亚细胞结构中的固氮作用(Lechene等，Science 2007,317:1563)。因此，目前SMS技术已广泛用于使细胞或组织成像，且是强有力的诊断工具。SIMS技术也用于检测未标记DNA与肽核酸(PNA)微阵列的杂交(Brandt等，2003，Nucleic Acids Research, 31 :19)。在这些实验中，通过SIMS检测作为核酸的构成部分但在PNA中完全缺失的磷酸酯从而使PNA/DNA或PNA/RNA双链体显现可视化。本发明的目的在于提供采用SIMS技术来检测和定量样品中多种生物分子存在或不存在的方法。Brandt等描述的方法存在以下缺点(i)它只能应用于PNA探针或不包含磷酸酯的探针和(ii)它不允许定量探针/靶标的相互作用。在之前的专利申请中，申请人的目的在于提供可用于大量样品而采用SIMS技术检测和定量各样品中大量探针/靶标的相互作用的通用方法，所述相互作用的检测和定量通过计算探针/靶标的同位素比(参见图I)来确定。在本专利申请中，申请人的目的在于提供更精确的方法。事实上，发明人发现用不包含对应于用于标记探针的稀有同位素的常见次级离子的亲水聚合物涂覆阵列赋予该方法额外的优点，因为其阻止任何疏水性分子(例如存在于待测试样品中的核酸、肽或蛋白质)的非特异性吸附，并因此使背景最小化。
发明简述本发明涉及包含具有导电表面和多个离散区域的基本上平面的基底的阵列，所述离散区域包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针，其中所述阵列或离散区域用一种亲水聚合物涂覆，所述亲水聚合物不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子。根据一种实施方式，所述具有导电表面的基本上平面的基底是硅晶片。根据一个实施方式，所述不包含氮的亲水聚合物选自下组单糖、二糖、多糖和不包含氮的合成亲水聚合物。 根据一个实施方式，所述合成亲水聚合物是聚乙二醇。根据一个实施方式，所述探针用至少一种选自2H、13C、15N、170、180、33S、34S和36S的稳定的重同位素标记，或用至少一种选自3H和14C的不稳定同位素标记，或用至少一种选自79Br和81Br的外源同位素标记。 根据一个实施方式，所述阵列是微阵列，其中各离散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为 I μ m 至Ij 1000 μ m。根据一个实施方式，各离散区域是微孔，其包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。根据一个实施方式，所述阵列是纳米阵列，其中各离散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为Inm到lOOOnm。根据一个实施方式，各离散区域是纳米孔，其包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。根据一个实施方式，各微孔包含多个纳米孔，且所述纳米孔包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。本发明涉及用于检测和定量至少一个样品中至少一种生物分子的存在或不存在的方法，包括(a)使所述至少一个样品与如上所述的阵列接触，(b)洗涤并干燥所述阵列，(c)通过SIMS检测和计数常见次级离子以及相应的稀有次级离子。根据一个实施方式，待测试的各样品与阵列的一个或多个离散区域接触。根据一个实施方式，所述待测试样品是单细胞。根据一个实施方式，所述方法用于测定待测试样品的分子图谱，其中所述分子图谱是所述样品的转录组、蛋白质组、脂质组、代谢组、糖组和/或相互作用组的确定。根据一个实施方式，所述方法用于预测疾病倾向，或用于诊断需要的受试者的疾病。根据一个实施方式，所述方法用于监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的效力。根据一个实施方式，所述方法用于筛选治疗剂。
图I :探针与其靶蛋白结合的SMS检测的原理示意图。生物分子(探针和靶标)破碎成原子水平(动态SIMS条件)。因此，各单对的探针/靶标产生数百个15N和14N原子(在真实实验中为CN-分子次级离子的形式)，其在SIMS分析仪中容易地计数(扩增)。1W15N同位素比增加的测量使得能够定量与抗体结合的那些靶蛋白。图2 :取决于探针或靶标是否被标记的DIR的增加或减少。图3 :15N的同位素分数。图4 :13C的同位素分数。图5 :抗体-靶标相互作用的SMS分析。Wtap，仅具有抗体(抗-CD34)的晶片；Wtap，具有抗体加上靶蛋白(CD34)的晶片；Wbsa，具有抗体加上对照蛋白(牛血清白蛋白) 的晶片。利用在NanoSMS 50中连续扫描(即在不同深度)获得检测同位素比(12C15N/(12C15N+12C14N))。图6 :抗体-靶标相互作用的平均值。Wtap，仅具有抗体(抗-⑶34)的晶片；Wtap，具有抗体加上靶蛋白(CD34)的晶片；Wbsa，含有抗体加上对照蛋白(牛血清白蛋白)的晶片。用NanoSIMS 50在各晶片上的抗体点中的四或五个不同位置扫描2_12次获得检测同位素比(12C15N/(12C15N+12C14N))。显示了平均值加上平均值的标准误。图7 :与根据以下实验4开发的与SMS相容的蛋白质芯片技术的原型。图8 :如实验4中所进行的同位素分数随靶分子量变化的曲线。发明详述定义如本发明所使用，术语“核酸”是指由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的聚合物，或合成制备的化合物，例如PNA，其可以类似于两个天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如，其可参与Watson-Crick碱基配对相互作用。如本发明所使用，术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸组成的聚合物。如本发明所使用，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。如本发明所使用，术语“寡核苷酸”表示长度为约10到100个核苷酸和最多200个核苷酸的单链核苷酸多聚体。如本发明所使用，术语“样品”涉及包含一种或多种目标组分的材料或材料混合物，其通常(尽管不是必须)是流体形式。术语“核苷”和“核苷酸”旨在包括不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基，而且包含经过修饰的其他杂环碱基的那些部分。这种修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷”和“核苷酸”包括不仅包含常规核糖和脱氧核糖，而且也包含其他糖的那些部分。修饰的核苷或核苷酸也包括糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素原子或脂族基团取代，或功能化为醚、胺等。如本发明所使用，术语“蛋白质”是指通过肽键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。如本发明所使用的，该术语是指任何尺寸、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。然而，通常，蛋白质长度为至少六个氨基酸。优选地，如果蛋白质是短肽，其长度至少为约10个氨基酸残基。蛋白质可以是天然存在的、重组的或合成的，或这些的任意组合。蛋白质也可以仅是天然存在的蛋白质或肽的片段。蛋白质可以是单个分子或可以是多分子复合物。术语蛋白质也可以适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。其中一个或多个氨基酸残基是“非天然”氨基酸(非对应于任何天然存在的氨基酸)的氨基酸聚合物包括在本发明的术语“蛋白质”内。短语“与固体支持体的表面结合的寡核苷酸”是指固定在固体基底表面上某点中的寡核苷酸或其模拟物(例如PNA)，其中所述基底可以具有各种构型，例如薄片、珠或其他结构。在某些实施方式中，此处使用的寡核苷酸特征的集合存在于相同平面支持体的表面上，例如以阵列的形式。术语“阵列”包括术语“微阵列”和“纳米阵列”。如下文所详细描写，阵列通常由与固体支持体表面结合的多个明显不同或不同的探针组成，也称为基底固定探针。在一个实施方式中，本发明的阵列是同阵列(homoarray)，其中本发明的阵列包含仅一种化学类型的探针，即仅核酸探针或者仅肽或蛋白质探针等。在另一个实施方式中，本发明的阵列是异阵列，其中本发明的阵列包含多种探针类型的混合物，例如核酸探针和蛋白质探针的混合物。术语“纳米孔”适用于其中探针结合的纳米尺度的区域。术语“微孔”适用于其中探针结合的微米尺度的区域。术语“纳米阵列装置”或NAD适用于微米尺度的特征(其可以单个芯片上的多个相同副本或不同形式存在)。NAD可以包含一组纳米孔或仅包含一组离散区域(不具有孔，但包含探针)，其本身可以在或不在微孔内。术语“常见次级离子”是指在SMS中产生和分析且不包含其组成元素的稳定(或不稳定)的稀有同位素或外源同位素(79BiN81Br)的那些离子。常见次级离子的实例包括12C、14N、32S、8°Br、160 等。术语“稀有次级离子”是指在SMS中产生和分析且包含用于标记探针和/或靶分子的比例的其组成元素的至少一种稳定(或不稳定)的稀有同位素或至少一种外源同位素的那些离子。稀有次级离子的实例包括13c、15n、13c14n、12c15n、13c15n。术语“背景常见次级离子”是指在SMS中产生和分析且以天然存在的比例(与用于标记探针和/或靶分子的比例相反)包含其组成元素的稳定(或不稳定)的稀有同位素的那些离子。以其天然比例的天然次级离子的实例包括比例为0.98538 0. 01096 O. 00362 0. 00004 的 12C14NV3C14NV2C15N-和 13C15N'应用于离散区域或微孔或纳米孔的术语“检测同位素比”或DIR是指由SIMS或由相关方法获得的常见次级离子数与常见离子数加上至少一种稀有次级离子数的总和的比例(例如 12C14N-/(12C14NV2C15N-)或 12C14N-/(12C14NV3C14N-)或 12C14N_/(12C14NV2C15NV3C14N-)或 12C14NV (12C14N_+12C15N_+13C14N_+13C15N_)或 12CV (12O13D 等)。图 2 显示取决于是否探针或靶标被标记的DIR的增加或减少。(如果探针和靶标都被例如不同的同位素标记，对于各特定情况必须算出DIR变化的方向)。
术语“外源同位素”是指不是生物分子(探针和靶标)天然包含的、但已由用户添加至这些分子中的那些同位素。外源同位素可以经由标准化学或生物化学作用共价连接至生物分子。或者，外源同位素可以共价连接至本身与探针或靶标强烈相互作用或不明显降低探针对靶标的识别的分子上。外源同位素的实例包括79Br和81Br。术语“参照离散区域”是指其中探针(标记的或未标记的)未与待测试样品接触或其中不存在探针和靶标之间的特异性相互作用(即靶标不存在于待分析样品中)的离散区域、微孔或纳米孔。本发明
尽管以15N标记探针来实施本发明的方法，发明人发现用不包含对应于用于标记探针的稀有同位素(在这种情况下是氮C4N))的常见次级离子的亲水聚合物涂覆阵列产生了本发明方法的额外优点，因为其阻止存在于待测试样品中的任何疏水性分子(例如核酸、肽或蛋白质)的非特异性吸附，且因此使背景最小化。事实上，为了使背景最小化，本领域技术人员已经在常规方法中以牛血清白蛋白(BSA)或酪蛋白涂覆阵列。然而，发明人发现以BSA或酪蛋白涂覆阵列在本发明方法中增强了背景，因为其包含氮。因此，他们找到采用不包含对应于用于标记探针的稀有同位素的常见次级离子的亲水聚合物(例如聚乙二醇)来使背景最小化的另一种方法。不被任何理论束缚，发明人认为与亲水聚合物结合的大量水分子阻止疏水性分子的非特异性结合，从而使背景最小化。
支持材料和表面的性质本发明的一个目的是包含具有导电表面和多个离散区域的基本上平面的基底的阵列，所述离散区域可以是或不是孔的形式，包含用至少一种稀有的同位素(例如稳定的重或轻同位素或者不稳定同位素)或用至少一种外源同位素(例如79Br、81Br)标记的探针，其中所述阵列或离散区域用不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物涂覆。根据本发明，用于标记探针的稀有或外源同位素是检测待测试样品中的靶标的手段；因此，术语“不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物”等同于“不包含对应于用于检测靶标的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物”。根据本发明，具有导电表面的基本上平面的基底是硅晶片或由金、银、铝、铜、钼、钯或其他金属，或半导体(例如GaAs、InP)，或经处理使表面导电的其他材料(例如聚合物材料、聚合物涂覆的材料、超导材料、陶瓷、金属氧化物、二氧化硅等)制成的任何其他固体或半固体表面。在本发明的一个实施方式中，所述具有导电表面的基本上平面的基底与SMS相容。在本发明的优选实施方式中，所述SMS相容的具有导电表面的基本上平面的基底是娃晶片。根据本发明，当探针以15N标记时，术语“不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物”是指例如不包含氮，尤其是14N的聚合物。在另一个实施例中，当探针以33s、34s或36S标记时，其是指不包含硫，尤其是32S的聚合物。常见次级离子的实例包括mm · ·在本发明的一个实施方式中，本发明的所述亲水聚合物(即，其不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子)包含用于标记探针的至少一种所述稀有稳定同位素或外源同位素。例如，所述亲水聚合物可以仅包含13C作为碳原子(且无12C原子，因为其对应于常见次级离子)，和/或仅包含2H作为氢原子(且无1H原子，因为其对应于常见次级离子)，和/或仅包含15N作为氮原子(且无14N原子，因为其对应于常见次级离子)。根据本发明的一个实施方式，所述不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子的亲水聚合物可以选自下组单糖、二糖、多糖(例如葡聚糖)、化学修饰的多糖(例如羟甲基纤维素)和合成亲水聚合物(例如直链或支链聚乙烯醇)。所述亲水聚合物也可以是蛋白质，其是天然的或化学修饰的，象例如蛋白A。根据本发明的一个实施方式，所述合成亲水聚合物是聚乙二醇。聚乙二醇具有尤其是不含氮或硫的优点，因此当探针标记以15N或33S、34S和36S进行时，可优选使用聚乙二醇。根据本发明的一个实施方式，所述亲水聚合物涂覆在基本上平面的基底的整个表面上。根据这种实施方式，在整个表面上阻止了存在于待测试样品中的分子的非特异性结合，从而避免待测试分子的背景和非特异性结合。
微孔形式的离散区域本发明的另一个目的是作为上述的微阵列的微孔阵列，其中所述离散区域是包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针的微孔。所述微孔可以是任何形状，例如点、线、圆、正方形或三角形，且可以任何较大的图案排列，例如行和列、点阵、栅格等。这些微孔包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针。在本发明的一个实施方式中，本发明的微孔阵列包含10到100000个微孔，在另一个实施方式中包含10到25000个微孔，在另一个实施方式中包含100到10000个微孔且在另一个实施方式中包含1000到5000个微孔。在本发明的一个实施方式中，适当确定所述微孔的形状和尺寸以在各微孔中储存单细胞。在一个实施方式中，各微孔的长度、宽度或直径尺寸之一为Ιμπι到1000 μ m，在另一个实施方式中为I μ m到500 μ m,在另一个实施方式中为I μ m到200 μ m且在另一个实施方式中为Iym至Ij 100 μ m。在一个实施方式中，各微孔的深度为I μ m到ΙΟΟμ ，在另一个实施方式中为Ιμ 到50μ ，在另一个实施方式中为5μπι到20 μ m。各微孔之间的距离可以为25到5000 μ m，在另一个实施方式中为100到1000 μ m且在另一个实施方式中为50 μ m到150 μ m。微孔可以是任何形状例如它可以是圆筒形、非圆筒形如具有多个面的多面体，如平行六面体、六角柱、八角柱)、倒锥形、倒金字塔形，或它可以具有组合两种或更多种这些形状的形状。对于圆锥形和平行六面体形，微孔的底部通常为平面，但也可以是弯曲表面(凸面或凹面)。在本发明的一个实施方式中，带有该组微孔的基本上平面的导电表面可以成形为矩形固体或圆盘(尽管其他形状是可能的)，长度为1cm，宽度为Icm且厚度为约250 μ m。纳米孔形式的离散区域本发明的另一个目的是作为上述的纳米阵列的纳米孔阵列，其中所述离散区域是包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针的纳米孔。所述纳米孔可以是任何形状，例如点、线、圆、正方形或三角形，且可以任何较大的图案排列，例如行和列、点阵、栅格等。这些纳米孔包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素标记的探针。在本发明的一个实施方式中，本发明的纳米孔阵列包含10到100000个纳米孔，在另一个实施方式中包含10到25000个纳米孔，在另一个实施方式中包含100到10000个纳米孔且在另一个实施方式中包含1000到5000个纳米孔。
在一个实施方式中，各纳米孔的长度、宽度或直径尺寸之一为Inm到lOOOnm，在另一个实施方式中为5nm到500nm,在另一个实施方式中为IOnm到200nm且在另一个实施方式中为50nm到IOOnm。在一个实施方式中，各纳米孔的深度为Inm到lOOnm，在另一个实施方式中为Inm到50nm,在另一个实施方式中为5nm到20nm。各纳米孔之间的距离可以为10到lOOOnm，在另一个实施方式中为50到500nm且在另一个实施方式中为100到200nm。所述纳米孔可以是任何形状例如它可以是圆筒形、非圆筒形(例如具有多个面的多面体，如平行六面体、六角柱、八角柱)、倒锥形、倒金字塔形，或它可以具有组合两种或 更多种这些形状的形状。对于圆锥形和平行六面体形状，纳米孔的底部通常为平面，但也可以是弯曲表面(凸面或凹面)。在本发明的一个实施方式中，带有该组纳米孔的基本上平面的导电表面可以成形为矩形固体或圆盘(尽管其他形状是可能的)，长度为1cm，宽度为Icm且厚度为约250 μ m。不是孔形式的离散区域本发明的另一个目的是作为一组离散区域或图案单元的排列的阵列，其在基底上形成较大的图案。所述离散区域或图案单元可以是任何形状，例如点、线、圆、正方形或三角形，且可以任何较大的图案排列，例如行和列、点阵、栅格等。这些离散区域包含用至少一种稳定(或不稳定)的稀有同位素标记的探针。在本发明的一个实施方式中，本发明的阵列包含10到100000个离散区域，在另一个实施方式中包含10到25000个离散区域，在另一个实施方式中包含100到10000个离散区域且在另一个实施方式中包含1000到5000个离散区域。在一个实施方式中，本发明的阵列是微阵列。在该实施方式中，各离散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为Iym到1000 μ m，在另一个实施方式中为Iym到500 μ m，在另一个实施方式中为10 μ m到200 μ m且在另一个实施方式中为50 μ m到100 μ m。各离散区域之间的距离可以为10到1000 μ m，在另一个实施方式中为50到500 μ m且在另一个实施方式中为100 μ m至Ij 200 μ m。在本发明的一个实施方式中，本发明的阵列是纳米阵列。在该实施方式中，各离散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为Inm到lOOOnm，在另一个实施方式中为5nm到500nm，在另一个实施方式中为IOnm到200nm且在另一个实施方式中为50nm到100nm。各离散区域之间的距离可以为10到lOOOnm，在另一个实施方式中为50nm到500nm且在另一个实施方式中为 100 μ m |lj 200nm。在本发明的一个实施方式中，带有该组离散区域的膜或硅晶片可以成形为矩形固体或圆盘(尽管其他形状是可能的)，长度为Icm,宽度为Icm且厚度为约250 μ m。探针探针的化学性质和同位素组成在该实施方式中，与靶标(通常为构成细胞的生物分子，但甚至是病毒、细胞器或细胞本身)结合的探针可以由任何分子(生物的或非生物的)构成，例如核酸(寡核苷酸、DNA、RNA、PNA、适体)、肽或蛋白质(抗体、酶)、配体(抗原、酶底物、受体或受体的配体)、聚糖、脂质、聚胺、分子印记的聚合物、噬菌体、病毒或这些分子的组合。
优选地，探针是能够与其靶标分子特异性结合(例如经由非共价键)的分子，或与其靶标分子特异性相互作用(例如经由杂交，核酸就是这种情况)的分子。根据本发明，探针包含至少一种稳定或不稳定的稀有同位素在一个实施方式中，探针包含至少一种稳定的重同位素，例如2H、13C、15N、170、180、
33S、34S 和 36S。 在另一个实施方式中，探针包含至少一种不稳定同位素，例如3H和14C,在另一个实施方式中，探针包含至少一种外源同位素，例如79Br和81Br。探针的连接或接枝探针连接或接枝到阵列上由本领域公知的技术实现。探针可吸附、物理吸附、化学吸附或共价连接至阵列上。平版印刷打印也可以用于使探针以图案化方式直接或间接地转移和吸收到表面上。例如，探针的连接可通过将官能团引入到表面上以形成所述表面和待接枝探针之间的化学反应而实现。羧基(COOH)是最为人所知的用于接枝的官能团。化学键在来自蛋白质的氨基和羧基官能团之间生成。丙烯酸或共聚化的乙烯基硅烷和马来酸酐也可用于采用例如I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐产生作为间隔基以将蛋白质接枝到表面上的硅-COOH底物。在本发明的一个实施方式中，探针连接或接枝到阵列上经由涂覆到阵列上的亲水聚合物的功能化而实现。例如，在本发明的一个实施方式中，阵列涂覆有用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)功能化的聚乙二醇以允许探针接枝。这一接枝具有实施非常简单的优点。探针的识别在其中多种不同探针连接至阵列的一个实施方式中，探针经由包含所述探针的离散区域的位置或坐标来识别。样品的性质和来源根据本发明的方法，待测试样品可从细胞、组织、器官、体液(例如血清、血浆、精液、滑液、脑脊液、血液或尿液)、细胞培养物、水(例如污水、淡水、近岸海水、地下水)……分离。根据本发明的方法，待测试样品可以包含核酸(寡核苷酸、DNA、RNA、PNA)、肽或蛋白质(抗体、酶)、配体(抗原、酶底物、受体或受体的配体)、聚糖、脂质、聚胺、噬菌体、病毒或其组合。因此待测试生物分子可以是核酸(寡核苷酸、DNA、RNA、PNA)、肽或蛋白质(抗体、酶、朊病毒)、配体(抗原、酶底物、受体或受体的配体)、聚糖、脂质、聚胺、噬菌体、病毒或其组合。探针的标记根据本发明的方法，探针或靶标(即存在于待测试样品中的生物分子)用稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记。在一个实施方式中，探针或靶标可以用至少一种稳定的稀有同位素例如2H、13C、15n、17o、18o、33s、34s 和 36S 标记。在另一个实施方式中，探针或靶标可以用至少一种不稳定同位素，例如3H和14C标记。在另一个实施方式中，探针或靶标可以用至少一种外源同位素，例如79Br和81Br标记。标记的探针可以通过体内和体外两种技术获得在体外标记的情况中，I)聚合酶链反应用于产生标记的寡核苷酸，2)肽合成用于产生标记的肽，3)体外转录/翻译用于产生标记的RNA和标记的蛋白质，4)反转录用于产生标记的cDNA，5)化学合成用于产生标记的PNA。
在体内标记的情况中，原核或真核细胞生长在包含营养物(例如NH4C1、葡萄糖和氨基酸)的培养基中，所述营养物用2H、13C、15N、170、180、33S、34S和36S的组合标记或用3h、14c或其他具有长的半衰期的不稳定同位素的组合标记。因此这些细胞产生标记的探针(例如抗体或噬菌体或核酸或蛋白质或糖或其他细胞成分)。当将要标记靶标(即存在于待测试样品中的生物分子)时，通常细胞生长在包含营养物(例如NH4C1、葡萄糖和氨基酸)的培养基中，所述营养物用2H、13C、15N、170、180、33S、34S和36S的组合或用3H和14C的组合标记。因此这些细胞产生标记的生物分子。样品与阵列之间的接触在本发明方法的一个实施方式中，使待测试样品与包含多种不同探针的阵列(微阵列或纳米阵列)接触。在另一个实施方式中，当将要测试多个样品时，各样品与微孔阵列的一个或多个微孔接触。在另一个实施方式中，当待测试样品的数目和多样性对应于单细胞的数目和多样性时，使经由适当的方法获得的各单细胞的内容物与微孔阵列的一个微孔接触。探针和靶标之间的相互作用的条件然后样品在允许探针存在于阵列上以与靶生物分子相互作用的条件下与阵列接触。然后在通常不存在常见12C和14N同位素的多种缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)中进行探针与其靶标的结合。在以纯水小心洗涤(优选在低温下以限制探针从其靶标解离)以去除盐(其可能在干燥步骤形成结晶)、未结合分子和大的细胞碎片后，阵列在无灰尘的气氛中在真空烘箱中或通过冻干干燥。通过SMS及其他相关技术检测根据本发明的方法，计数稀有和常见次级离子的数目以获得检测同位素比允许检测探针/ IE标二重体。在一个实施方式中，探针/靶标二重体通过动态次级离子质谱法(D-SMS)检测。在另一个实施方式中，探针/靶标二重体通过飞行时间次级离子质谱法(TOF-SIMS)检测。次级离子质谱法(SIMS)允许基于在初级离子能量束的撞击下从固体样品的表面(Inm-I μ m深度)提取的次级离子的质谱分析来分析无机和有机材料的表面组成。分子在D-SIMS中被初级离子束通过动态D-SMS完全破碎成其组成原子或通过ToF-SMS部分破碎成分子片段(例如氨基酸)。SMS相关技术例如激光S匪S也可以用于检测探针/靶标相互作用。在本发明方法的一个实施方式中，连接至阵列的探针用稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记。在这一实施方式中，待测试样品具有仅以其天然比例(或甚至低于这些比例)包含这些稀有同位素的生物分子。探针/靶标相互作用的存在通过比较由各离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者其中不存在标记的探针和靶标之间的特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标记探针和未标记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的背景检测同位素比来确定。因此，在探针标记而靶标未标记的情况下，如果由一个离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比明显优于由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比，则揭示探针/靶标相互作用的存在。例如，在探针用13C标记的情况下，如果对于相同的仪器设置由一个离散区域、微孔或纳米孔获得的探测同位素比12C/(12C+13C)(或者可选择地，12C14N/(12C14N+12C15N))优于由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比，则揭示探针/靶标相互作用的存在。因此，在探针未标记而靶标标记的情况下，如果由一个离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比明显次于由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比，则揭示探针/靶标相互作用的存在。例如，在探针用13C标记的情况下，如果对于相同的仪器设置由一个离散区域、微孔或纳米孔获得的12C/(12C+13C)次级离子比(或者可选择地，12C14N/(12C14N+12C15N))次于由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的这一次级离子比，则揭示探针/靶标相互作用的存在。因此，在探针和靶标用相同的一种或多种同位素标记的情况中，如果由一个离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比明显不同于由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的检测同位素比，则揭示探针/靶标相互作用的存在。根据本发明，探针或靶标也可以用其组成元素的一种以上稳定或不稳定的稀有同位素或者外源同位素标记。例如，探针或靶标可以用13C和15N标记。探针的多重标记例如13C15N对于使背景最小化特别有用。根据本发明，在靶标以稳定(或不稳定)的稀有同位素标记的情况中，各种实验条件(例如有和没有药物处理)可由各条件的不同标记方式来区分。检测和定量方法本发明的一个目的是用于检测和定量至少一种样品中至少一种生物分子的存在或不存在的方法，包括(a)使至少一个所述样品在允许存在于阵列上的探针与靶生物分子相互作用的条件下与阵列接触，阵列上存在的探针或样品中存在的生物分子以至少一种稳定(或不稳定)的稀有同位素标记，(b)洗涤并干燥阵列，(c)通过SIMS检测并计数常见次级离子以及相应的稀有次级离子。
这允许测定DIR。然后将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的DIR与由参照离散区域、微孔或纳米孔获得的DIR相比较；DIR的显著变化(参见图2)是存在(检测到)探针/靶标相互作用的证据。此外，DIR的精确测定允许定量探针和靶标之间的相互作用的数目。DIR的精确测定在溅射最大量的材料从而获得常见和稀有次级离子的良好计数统计后获得。为计算每一离散区域(微孔或纳米孔或甚至是离散区域内的样品单元区域)与探针相互作用的靶标数目，必须了解a)离散区域的表面上探针的密度和b)在单个探针和单个靶标中各目标同位素的原子数目。然后这种知识允许对随每一离散区域的靶标数目变化的DIR作图。本发明的应用根据另一个实施方式，所述用于检测和定量至少一个样品中至少一种生物分子的存在或不存在的方法允许测定所述样品的分子图谱，其意味着测定所述样品的转录组、蛋白质组、脂质组、代谢组、糖组或相互作用组，或允许测定单细胞中的生物分子及其相互作用。应用于分子图谱 根据本发明的一个实施方式，用于检测和定量样品中至少一种生物分子的存在或不存在的方法旨在提供所述样品的分子图谱。在一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是基因组序列，从而允许测定所述样品中的基因组变异。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是RNA，从而允许测定所述样品的转录组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是蛋白质，从而允许测定所述样品的蛋白质组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是脂质，从而允许测定所述样品的脂质组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是代谢物，从而允许测定所述样品的代谢组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是糖基化蛋白质，从而允许测定所述样品的糖组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是与至少一种特异性探针相互作用的蛋白质，从而允许测定所述样品的相互作用组。应用于单细胞根据本发明的另一个实施方式，用于在单细胞水平检测和定量至少一种生物分子的存在或不存在的方法旨在提供单细胞水平的分子图谱。在一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是基因组序列，从而允许测定单细胞水平的基因组变异。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是RNA，从而允许测定单细胞水平的转录组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是蛋白质，从而允许测定单细胞水平的蛋白质组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是脂质，从而允许测定单细胞水平的脂质组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是代谢物，从而允许测定单细胞水平的代谢组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是糖基化蛋白质，从而允许测定单细胞水平的糖组。在另一个实施方式中，待检测和定量的生物分子的多样性是与至少一种特异性探针相互作用的蛋白质，从而允许测定单细胞水平的相互作用组。应用于疾病本发明的另一个目的是所述用于检测和定量样品中至少一种生物分子或在单细胞水平检测和定量至少一种生物分子的方法在以下方面的用途-预测疾病倾向，或用于诊断受试者的疾病，-筛选治疗剂， -监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的效力。本发明的另一个目的是用于预测疾病倾向或用于诊断受试者的疾病的方法。该方法包括(a)使至少一种从所述受试者中分离的样品在允许存在于阵列上的探针与已知与所述疾病相关或在所述疾病中差异表达的靶生物分子相互作用的条件下与阵列接触，阵列上存在的探针以至少一种稳定(或不稳定)的稀有同位素标记，(b)洗涤并干燥阵列，(c)通过SMS检测并计数常见次级离子及相应的稀有次级离子，其中探针和靶标之间的相互作用的数目通过将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的DIR与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者由其中不存在探针和靶标之间的特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标记探针和未标记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的DIR相比较来定量，(d)将所述表达谱与标准谱相比较，其中已知与所述疾病相关或在所述疾病中差异表达的所述至少一种生物分子的存在/不存在或增加/减少指示发生疾病或存在疾病的可能性。在一个实施方式中,所述受试者是哺乳动物。在优选的实施方式中，所述受试者是人。根据本发明的方法，待测试样品可从受试者的细胞、组织、器官或体液(例如血清、血浆、精液、滑液、脑脊液、血液或尿液)分离。样品可来源于疾病细胞或组织。例如，所述细胞或组织可被病原体(例如HIV、流感、疟疾、肝炎、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒)感染。在一个实施方式中，所述细胞或组织被病毒性或细菌性病原体感染。在另一个实施方式中，所述疾病是癌症。在另一个实施方式中，所述疾病是神经退行性疾病，例如帕金森病、阿尔茨海默病或多发性硬化。在本发明的一个实施方式中，所述方法旨在预测癌症倾向或用于诊断受试者的癌症。在本发明的另一个实施方式中，所述方法旨在预测细菌性疾病的倾向或诊断细菌性疾病。在本发明的另一个实施方式中，所述方法旨在预测病毒性疾病的倾向或诊断病毒性疾病。本发明的另一个目的是用于筛选治疗剂的方法，包括(a)以至少一种目标治疗剂培养细胞，
(b)使至少一个分离自所述培养物的样品在允许存在于阵列上的探针与靶生物分子相互作用的条件下与阵列接触，阵列上存在的探针以至少一种重同位素或不稳定同位素标记，(C)洗涤并干燥阵列，(d)通过SMS检测并计数常见次级离子及相应的稀有次级离子，其中探针和靶标之间的相互作用的数目通过将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的DIR与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者由其中不存在探针和靶标之间的特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标记探针和未标记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的DIR相比较来定量，(e)将所述表达谱与标准谱相比较,其中特定生物分子的增加或减少指示所述治疗剂的效力。本发明的另一个目的是用于监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的效力的方法，所述方法包括(a)使至少一个分离自所述受试者的样品在允许存在于阵列上的探针与靶生物分子相互作用的条件下与阵列接触，阵列上存在的探针以至少一种重同位素或不稳定同位素标记，(b)洗涤并干燥阵列，(c)通过SMS检测并计数常见次级离子及相应的稀有次级离子，其中探针和靶标之间的相互作用的数目通过将由各离散区域、微孔或纳米孔获得的DIR与由参照离散区域、微孔或纳米孔或者由其中不存在探针和靶标之间的特异性相互作用(即待分析样品中不存在靶标)或其中存在未标记探针和未标记靶标之间的特异性相互作用的离散区域获得的DIR相比较来定量，(d)在治疗受试者期间的不同时间从所述样品获得至少一种生物分子的表达谱，(e)将所述表达谱与标准谱相比较，其中已知与所述疾病相关或在所述疾病中差异表达的所述生物分子的增加或减少指示所述治疗剂治疗受试者的效力。
实施例在以下描述中，没有给出详细方案的所有实验根据标准方案进行。包括以下实施例来说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解，公开在以下实施例中的技术代表由发明人发现能在本发明实施中起很好作用的技术，且因此可被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开的内容，本领域技术人员应理解在不离开本发明精神和范围的前提下，可对所公开的具体实施方式
进行许多变化并仍然获得同样或类似的结果。实验I:该实验显示SMS技术允许定量地检测含有同位素标记的蛋白质和不同量的未标记分子的混合物中13C同位素的比例。同位素标记和稀释
同位素标记的分子通常以包含保护剂和防腐剂例如甘油(12C的源)和叠氮化钠(14N的源)的缓冲液提供。这些试剂用于保持透析膜(如由Millipore提供的)。以下实验的目的是测定去除它们所需要的透析条件。蛋白质从在其中唯一可得的氮是15N的基本培养基中生长的大肠杆菌提取。采用SMS，发现这些蛋白质的同位素分数是97. 8% +0. 02%。20 μ g的这些标记蛋白质在水中在未洗涤或预先洗涤的Millipore透析膜上透析6小时。图3显示透析溶液中15N的同位素分数。经洗涤膜的同位素分数水平类似于对照(97.9% +0.02% )，而未洗涤膜(包含污染物氮)的同位素分数水平较低(92. 1%+1.4%)0因此，预洗涤透析膜恢复初始的同位素分数。也从在其中唯一的可得的碳是13C的培养基中生长的细菌中提取蛋白质。如SMS测量的，这些蛋白质的同位素分数是86%+0.5%。然后将这些蛋白质溶解在水中，且使它 们的第二溶液制备成10%甘油的最终浓度。图4显示这些溶液中13C的同位素分数。加入甘油将同位素分数降低至78% +2%，但初始分数(86% +2% )通过随后去除甘油的透析而恢复。实验2 该实验显示同位素标记的寡核苷酸(探针)可以采用PCR技术和不包含氮化合物(其作为污染物可能干扰“定义”部分中所描述的DIR测量)的非常规缓冲液来制备。用硼砂缓冲液减少氮污染介绍生物学的许多方法使用Tris基缓冲剂。这种有机分子是优秀的缓冲剂，且其不导致钙盐或镁盐的沉淀。然而，对于我们的方法，Tris具有包含14N并且对DNA(及其他大分子)具有强亲合性的缺点。这一缺点的产生是因为这种14N是取决于精确测量由15N探针和14N靶标杂交而产生的15N/(14N+15N)比的我们的方法中的重要污染物。制备不含污染物氮的DNA的两种途径是i)在缓冲液中使用Tris并在DNA制备后将其去除，或ii)使用无Tris的缓冲液。因为第一种方法需要耗时、浪费且昂贵的纯化方法，我们采用第二种方案来提供用于PCR(聚合酶链反应)的适当pH和浓度条件。尽管据我们所知，没有文献描述硼砂缓冲液用于PCR中，我们使用硼砂缓冲液，一种不含氮且保持与Tris缓冲液相同的pH值的无机缓冲液。材料和方法PCR 法
化学剂初始浓度体积最终浓度
硼砂缓冲液0.08M Π 20mM
KCl Μ2Γ5 50mM
MgCl225mM42mM
dNTPIOmM2 OmM
权利要求
1.包含具有导电表面和多个离散区域的基本上平面的基底的阵列，所述离散区域包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针，其中所述阵列或离散区域用一种亲水聚合物涂覆，所述亲水聚合物不包含对应于用于标记探针的稀有或外源同位素的常见次级离子。
2.包含具有导电表面和多个离散区域的基本上平面的基底的阵列，所述离散区域包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针，其中所述阵列或离散区域用一种亲水聚合物涂覆，所述亲水聚合物包含用于标记探针的至少一种所述稀有稳定同位素或外源同位素。
3.如权利要求I或2所述的阵列，其中所述具有导电表面的基本上平面的基底是硅晶片。
4.如权利要求I至3任一项所述的阵列，其中所述亲水聚合物选自下组单糖、二糖、多糖、合成亲水聚合物和蛋白质。
5.如权利要求4所述的阵列，其中所述合成亲水聚合物是聚乙二醇。
6.如权利要求I至5任一项所述的阵列，其中所述探针用至少一种选自2H、13C、15N、170、180、33S、34S和36S的稳定的重同位素标记，或用至少一种选自3H和14C的不稳定同位素标记，或用至少一种选自79Br和81Br的外源同位素标记。
7.如权利要求I至6任一项所述的阵列，其中所述阵列是微阵列，其中各离散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为Ium到1000 iim。
8.如权利要求7所述的阵列，其中各离散区域是微孔，其包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。
9.如权利要求I至6任一项所述的阵列，其中所述阵列是纳米阵列，其中各离散区域的长度、宽度或直径尺寸之一为Inm到lOOOnm。
10.如权利要求9所述的阵列，其中各离散区域是纳米孔，其包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。
11.如权利要求8所述的阵列，其中各微孔包含多个纳米孔，且所述纳米孔包含用至少一种稳定或不稳定的稀有同位素或外源同位素标记的探针。
12.用于检测和定量至少一个样品中至少一种生物分子的存在或不存在的方法，包括 (a)使所述至少一个样品与权利要求I至11任一项所述的阵列接触， (b)洗涤并干燥所述阵列， (C)通过SIMS检测和计数所述常见次级离子以及相应的稀有次级离子。
13.如权利要求12所述的方法，其中待测试的各样品与阵列的一个或多个离散区域接触。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述待测试样品是单细胞。
15.如权利要求12至14任一项所述的方法，用于测定待测试样品的分子图谱，其中所述分子图谱是所述样品的转录组、蛋白质组、脂质组、代谢组、糖组和/或相互作用组的测定。
16.如权利要求12至14任一项所述的方法，用于预测疾病倾向，或用于诊断需要的受试者的疾病，或用于监测施用于受试者以治疗疾病的治疗剂的效力，或用于筛选治疗剂。
全文摘要
本发明涉及采用SIMS来检测并定量样品中多种生物分子的存在或不存在的改进方法以及用于所述方法的阵列。
文档编号G01N23/225GK102640000SQ201080046969
公开日2012年8月15日 申请日期2010年9月15日 优先权日2009年9月15日
发明者A·德洛纳, C·里波尔, G·勒让, V·诺里斯 申请人:国立鲁昂大学