专利名称：一种汞离子检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种重金属离子检测技术领域，尤其是涉及一种汞离子检测试纸条及其制备方法。
背景技术：
汞(Hg)，是常温下唯一的液态金属，属于重金属类别。近年来，人类对重金属汞的开采、冶炼、加工及商业制造活动日益增多，大量的汞进入大气、水、土壤中存留、积累和迁移。汞的毒性大，在生物体内和环境中残留时间长，严重威胁人类健康，故美国、欧盟、加拿大以及我国等许多国家和地区对食品、生活用品、环境中汞含量都做了严格限定，汞污染的监控已经成为重点关注的问题。自然界中的汞主要以离子形式(Hg2+)存在，故实现对汞离子的准确、灵敏、快速的现场检测非常重要。目前检测汞离子的方法主要有紫外一可见分光光度法、原子吸收光谱法、原子发射光谱法、ICP法、荧光光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法、重金属快速测定仪法、比色法、试纸条法等。紫外一可见分光光度法选择性差，检出限高；原子吸收光谱法、原子发射光谱法、ICP法、荧光光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法，准确度和灵敏度高，但均需使用特定的仪器，价格昂贵，操作繁琐，且要求检测人员具备一定的专业知识，分析成本高，无法应用于现场检测，难以普及；重金属快速测定仪法可应用于现场检测，但灵敏度不高、选择性差，样品预处理复杂；基于胶体金(AuNPS)和特异性DNA的比色法，该法灵敏度尚可、选择性好，但受样品基体干扰较为严重。与上述方法相比，试纸条法以其快速、简便而在现场检测中别具优势，但基于传统螯合显色剂的试纸条，选择性较差，灵敏度低，检测下限约为0. 1 lmg/L，无法达到国家标准检测要求(如饮用水<0. 01 mg/L)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于胶体金和特异性DNA的汞离子检测试纸条及其制备方法，该试纸条可以高灵敏度、高选择性地检测样品中的汞离子。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种汞离子检测试纸条，所述的试纸条由条形底板和在条形底板上依次搭接的样品垫、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫、特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫组成，所述的特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，所述的硝酸纤维膜上有用b-DNA包被直线式检测线T线和用链霉亲合素包被直线式质控线C线，所述的b-DNA的碱基与所述的特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配。所述的特异性DNA 探针的结构为 AuNPs-HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-bioti n，所述的 b-DNA 的结构为 5，-GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，。所述的样品垫为经0. 01 0. 05 mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡处理的玻璃纤维纸， 其中Tris-HCl缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，pH值为5. 0 8. 0。所述的特异性DNA探针溶液在所述的玻璃纤维结合垫上的喷涂量为2. 0 10. 0μ L/cm2,所述的特异性 DNA探针溶液为 20 70 μ g% HS-5‘ -TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，_biotin的DNA与0. 5 2 μ mol的胶体金结合后，溶于50 200 μ L的浓度为0. 01 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液中所得。所述的b-DNA 包被用量为 0.0003 0.003 μ mol/mm。所述的链霉亲合素包被用量为0. 01 0. 06 yg/mm。一种汞离子检测试纸条的制备方法，包括以下步骤
(1)样品垫的制备
将玻璃纤维纸用0.01 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡润湿后，在20°C 37°C下干燥4 12小时即得到样品垫，其中Tris-HCl缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，pH 值为5. 0 8. 0 ；
(2)涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫的制备
将玻璃纤维纸用0.01 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡润湿后，在20°C 37°C下干燥4 12小时后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均勻喷涂2. 0 10. 0 μ L的特异性DNA 探针溶液，在20°C 37°C下干燥2 5小时后，即得到涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫，所述的特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，所述的特异性DNA 探针的结构为 AuNPs-HS-5’ -TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3‘ -biotin，其中 Tris-HCl 缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，pH值为5. 0 8. 0 ；
(3)特定包被的硝酸纤维膜的制备
用喷样仪将浓度为30 100 μ mol/L的b_DNA溶液均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25°C 37°C下干燥2 8小时，形成直线式检测线T线，用喷样仪将浓度为1 2 mg/L的链霉亲合素溶液沿与检测线T线平行的方向均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25°C 37°C下干燥 2 8小时，形成直线式质控线C线，即得到特定包被的硝酸纤维膜，其中所述的b-DNA的碱基与所述的特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配，所述的b-DNA的结构为 5， -GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，；
(4)将步骤(1)得到的样品垫，步骤(2)得到的涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫， 步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成3 10 mm 宽的细条，即得汞离子检测试纸条。所述的特异性DNA探针溶液的制备方法如下将20 70 μ g序列为HS_5，-TTTC ATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin 的 DNA 用 1 5 mL 的浓度为 0. 01 0. 05 mol/L Tris-HCl 缓冲液溶解，振荡混勻后，加入到1 mL浓度为0.5 2 mmol/L的胶体金溶液中，振荡混勻， 室温下温育5 M小时后，离心弃去上清液，加入50 200 μ L的浓度为0.01 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液溶解后，即得特异性DNA探针溶液，其中所述的Tris-HCl缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，所述的Tris-HCl缓冲液pH值为5. 0 8. 0，所述的磷酸盐缓冲液中含NaCl质量百分比为0. 5 1%，含十二烷基硫酸钠质量百分比为0. 01 0. 05%，所述的磷酸盐缓冲液pH值为5. 0 8. 0。所述的b-DNA溶液包被用量为1. 0 3. 0 μ L/cm,所述的b_DNA溶液的溶剂为浓度0. 01 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液中含NaCl质量百分比为0. 5 1%，含十二烷基硫酸钠质量百分比为0. 01 0. 05%,所述的磷酸盐缓冲液pH值为5. 0 8. 0。
5
所述的链霉亲合素溶液包被用量为1. 0 3. 0 μ L/cm，所述的链霉亲合素溶液的溶剂为浓度0. 01 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液中含NaCl质量百分比为0. 5 1%，含十二烷基硫酸钠质量百分比为0. 01 0. 05%，所述的磷酸盐缓冲液pH值为 5. 0 8. O0本发明提出的汞离子检测试纸条检测线上涂覆b-DNA，质控线上涂覆链霉亲和素，玻璃纤维结合垫上涂覆两端分别结合有胶体金和生物素的特异性DNA探针；在汞离子存在时，特异性DNA探针与检测线上的b-DNA发生T-Hg2+-T错配绞合而被捕获，其链端结合的胶体金聚集显色，达到检测汞离子之目的；特异性DNA探针链另一端修饰的生物素能和质控线上涂覆的链霉亲和素发生特异性结合，故过量的特异性DNA探针被捕获停留在质控线上，其链端结合的胶体金聚集显色，达到检测的质控目的。用该试纸条对样品液进行检测如果样品液中的汞离子浓度高于检测限时，检测线和质控线同时显示红色；如果样品液中不含汞离子或汞离子浓度低于检测限时，检测线不显色，质控线显示红色；如果质控线不显色，则检测无效。与现有技术相比，本发明的优点在于
(1)高灵敏度，检测限达0.005 mg/L，原因在于首先，特异性DNA的T-Hg2+-T错配对汞离子非常灵敏；其次，胶体金的摩尔吸光系数非常高，显色鲜明；再次，检测在试纸条上进行，是一个在白背景下的显色，人肉眼更加容易识别；最后，试纸条通过过滤和展开作用，能有效消除有色干扰物质对显色的影响；
(2 )高选择性，常见金属离子如此2+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、Fe2\ Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+ 对检测均无干扰。原因在于特异性DNA的T-Hg2+-T错配对汞离子具有高特异性的识别能力，其它金属离子的干扰可忽略；
(3)样品无需复杂预处理。原因在于特异性DNA可特异性识别汞离子，且可通过展开作用和试纸条本身的过滤能力，消除样品基体干扰；
(4)操作简单，检测时间短，仅需数分钟，原因在于仅需经简单的浸泡、展开，即可观察检测结果；
(5)检测成本低，每个试纸条制作成本约3元，原因在于试剂和材料用量极少，生产步
骤简单。综上所述，基于胶体金和特异性DNA的汞离子检测试纸条，该试纸条可以高灵敏度、高选择性地检测样品中的汞离子，且该试纸条的制备方法简单、易操作。
图1为本发明试纸条的结构示意图； 图2为本发明检测效果示意a 样品液中含高于检测限的汞离子； b 样品液中不含汞或汞离子含量低于检测限； c 检测无效；
图3为本发明检测实际样品的结果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1
本发明一种汞离子检测试纸条，如图1所示，包括条形底板1和在条形底板上依次搭接的样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4和吸水垫5 组成，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该硝酸纤维膜上有用 b-DNA包被直线式检测线T线6和用链霉亲合素包被直线式质控线C线7，所述的b_DNA的碱基与所述的特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配。在此具体实施例中，特异性DNA探针的结构为AuNPs-HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTG ATTC-3，-biotin, b-DNA 的结构为 5，-GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，；样品垫为经 0. 01 0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡处理的玻璃纤维纸，其中Tris-HCl缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，PH值为5. 0 8. 0 ；特异性DNA探针溶液在所述的玻璃纤维结合垫上的喷涂量为2.0 10.0 yL/cm2，该特异性DNA探针溶液为20 70yg序列为HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin 的 DNA 与 0. 5 2 μ mol 的胶体金结合后，溶于 50 200 μ L的浓度为0. 01 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液中所得；b_DNA包被用量为0. 0003 0. 003 μ mol/mm ；链霉亲合素包被用量为0. 01 0. 06 μ g/mm ；吸水垫为一种吸水纸(型号为 SX27或CH27)，吸水纸贴在条形底板的末端，吸水垫也可以为玻璃纤维膜SB08或BT50。实施例2
本发明汞离子检测试纸条基于胶体金和特异性DNA检测汞离子，在汞离子存在时，特异性DNA探针与检测线上的b-DNA发生T-Hg2+-T错配绞合而被捕获，其链端结合的胶体金聚集显色，达到检测汞离子之目的；特异性DNA探针链另一端修饰的生物素能和质控线上涂覆的链霉亲和素发生特异性结合，故过量的特异性DNA探针被捕获停留在质控线上，其链端结合的胶体金聚集显色，达到检测的质控目的，如图2所示，a 样品液中含高于检测限的汞离子；b 样品液中不含汞或汞离子含量低于检测限；c 检测无效；其具体制备方法如下
1、溶液配制
1.1 0. 5 2mmol/L胶体金溶液的配制
a.0. 5 2mmol/L HAuCl4 溶液的配制称取 0. 0205 0. 0822 g 的 HAuCl4 · 4H20,用蒸馏水定容至IOOmL容量瓶中，待用；
b.38. 8mmol/L柠檬酸钠溶液的配制称取1. 1407 g柠檬酸钠，用蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，待用；
c.用王水(盐酸与硝酸按体积比3:1的比例混合而成)浸泡200mL两颈烧瓶、搅拌子、 玻璃塞和冷凝管10 25分钟后，洗净备用；
d.取IOOmL的0.5 2mmol/L的HAuCl4溶液加入两颈烧瓶中，烧瓶的一个口接冷凝管，另一个口用塞子塞住，搅拌，加热，回流。当溶液开始回流时，打开塞子，快速加入10 50 mL的38. 8 mmol/L的柠檬酸钠溶液后塞住塞子，继续剧烈搅拌、加热回流20分钟，停止加热，继续搅拌冷却至室温，即制得胶体金溶液，4°C条件下保存制备好的胶体金溶液；
1. 2 Tris-HCl缓冲液配制
0.01 0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液的制备方法称量 0. 7880 3. 9398 g Tris-HCl 置于1 L烧杯中，加入400mL的去离子水溶解，再加入0.234 2.；34 g NaCl和0. 030 0. 298 g KC1，使NaCl 的浓度为 0. 01 0. 1 mol/L、KCl 的浓度为 0. 001 0. 01 mol/L，溶解混勻后，加入适量的蔗糖，使蔗糖的质量百分比浓度为1 10%，用酸碱溶液调节TriS-HCl 缓冲液pH至5. 0 8. 0 ；
1、3 0.01 ~ 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液的配制
按物质的量比为1 1称取0. 3 1. 5 g NaH2PO4 · 2H20和0. 355 1. 775 g Na2HPO4 · 2H20置于1 L烧杯中，加入400mL的去离子水溶解，再加入NaCl和十二烷基硫酸钠，使该磷酸盐缓冲液中含NaCl质量百分比为0. 5 1%，含十二烷基硫酸钠质量百分比为 0. 01 0. 05%，用酸碱溶液调节磷酸盐缓冲液pH值为5. 0 8. 0 ；
2、样品垫2的制备
将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡0. 5 1小时润湿后，在20°C 37°C下干燥4 12小时即得到样品垫2;
3、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3的制备
a.将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡0.5 1小时润湿后，在20°C 37°C下干燥4 12小时，即得封闭处理过的玻璃纤维纸；
b.将20 70 μ g 序列为 HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin 的 DNA 用 1 5mL的上述Tris-HCl缓冲液溶解，振荡混勻后，加入到ImL上述配制的胶体金溶液中，振荡混勻，室温下温育5 M小时后，离心弃去上清液，加入50 200 μ L的上述磷酸盐缓冲液溶解后，即得特异性DNA探针溶液，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该特异性 DNA 探针的结构为 AuNPs-HS-5’ -TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3’ -biotin ；
c.用喷样仪取上述所得特异性DNA探针溶液，在每平方厘米的、封闭处理过的玻璃纤维纸上均勻喷涂2. 0 10. 0 μ L，20°C 37°C下干燥2 5小时后，即得涂覆特异性DNA 探针的玻璃纤维结合垫3;
4、特定包被的硝酸纤维膜4的制备
用喷样仪将浓度为30 100 μ mol/L的b_DNA溶液均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25V 37°C下干燥2 8小时，形成直线式检测线T线6，用喷样仪将浓度为1 2 mg/L的链霉亲合素溶液沿与检测线T线6平行的方向均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25°C 37°C下干燥2 8小时，形成直线式质控线C线7，即得到特定包被的硝酸纤维膜4 ；其中b-DNA溶液包被用量为1. 0 3. 0 μ L/cm,该b-DNA溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，链霉亲合素溶液包被用量为1. 0 3. 0 μ L/cm,该链霉亲合素溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，其中b-DNA的碱基与特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配，该b_DNA 的结构为 5，-GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，；
5、汞离子检测试纸条制备
在条形底板1上依次搭接样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4、吸水垫5，在条形底板的两端分别粘上不干胶纸，其中带有箭头的不干胶纸贴在样品垫和结合垫的连接处上，箭头标明了浸入的最大深度，最后将试纸裁剪成 3 10 mm宽的细条，即得汞离子检测试纸条，检测时将箭头标明的一端浸入样品溶液中， 靠吸水垫的吸水作用，使待测样品依次通过涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4，达到检测的目的。
实施例3本发明一种汞离子检测试纸条，如图1所示，包括条形底板1和在条形底板1上依次搭接的样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4和吸水垫5组成，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该硝酸纤维膜上有用b-DNA包被直线式检测线T线6和用链霉亲合素包被直线式质控线C线7，其中 b-DNA的碱基与特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配，其制备方法具体包括以下步骤
1、溶液配制同实施例2
2、样品垫2的制备
将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡0. 7小时润湿后，在30°C下干燥8小时即得到样品垫2;
3、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3的制备
a.将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡0.7小时润湿后，在30°C下干燥8小时，即得封闭处理过的玻璃纤维纸；
b.将50 μ g 序列为 HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin 的 DNA 用 3 mL 的上述 Tris-HCl缓冲液溶解，振荡混勻后，加入到1 mL上述配制的胶体金溶液中，振荡混勻，室温下温育15小时后，离心弃去上清液，加入100 μ L的上述磷酸盐缓冲液溶解后，即得特异性 DNA探针溶液，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该特异性DNA 探针的结构为 AuNPs-HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin ；
c.用喷样仪取上述所得特异性DNA探针溶液，在每平方厘米的封闭处理过的玻璃纤维纸上均勻喷涂6. 0 μ L，30°C下干燥3小时后，即得涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫 3 ；
4、特定包被的硝酸纤维膜4的制备
用喷样仪将浓度为60 μ mol/L的b-DNA溶液均勻喷涂于硝酸纤维膜上，30°C下干燥6 小时，形成直线式检测线T线6，用喷样仪将浓度为1. 5 mg/L的链霉亲合素溶液沿与检测线 T线6平行的方向均勻喷涂于硝酸纤维膜上，30°C下干燥6小时，形成直线式质控线C线7， 即得到特定包被的硝酸纤维膜4 ；其中b-DNA溶液包被用量为2. 0 μ L/cm,该b_DNA溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，链霉亲合素溶液包被用量为2. 0 μ L/cm，该链霉亲合素溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，其中b-DNA的碱基与特异性DNA 探针之间的碱基可形成T-Hg2+-T错配，该b-DNA的结构为5，-GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，；
5、汞离子检测试纸条制备
在条形底板1上依次搭接样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4、吸水垫5，在条形底板的两端分别粘上不干胶纸，其中带有箭头的不干胶纸贴在样品垫2和玻璃纤维结合垫3的连接处上，箭头标明了浸入的最大深度，最后将试纸裁剪成7 mm宽的细条，即得汞离子检测试纸条。
实施例4
本发明一种汞离子检测试纸条，如图1所示，包括条形底板1和在条形底板上依次搭接的样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4和吸水垫5 组成，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该硝酸纤维膜上有用 b-DNA包被直线式检测线T线6和用链霉亲合素包被直线式质控线C线7，其中b-DNA的碱基与特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配，其制备方法具体包括如下步骤
1、溶液配制同实施例2
2、样品垫2的制备
将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡1小时润湿后，在37°C下干燥12小时即得到样品垫2;
3、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3的制备
a.将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡1小时润湿后，在37°C下干燥4 12 小时，即得封闭处理过的玻璃纤维纸；
b.将70 μ g 序列为 HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin 的 DNA 用 5 mL 的上述 Tris-HCl缓冲液溶解，振荡混勻后，加入到1 mL上述配制的胶体金溶液中，振荡混勻，室温下温育M小时后，离心弃去上清液，加入200 μ L的上述磷酸盐缓冲液溶解后，即得特异性DNA探针溶液，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该特异性 DNA 探针的结构为 AuNPs-HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin ；
c.用喷样仪取上述所得特异性DNA探针溶液，在每平方厘米的、封闭处理过的玻璃纤维纸上均勻喷涂10. 0 μ L，37°C下干燥5小时后，即得涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3 ；
4、特定包被的硝酸纤维膜4的制备
用喷样仪将浓度为ΙΟΟμπιοΙ/L的b-DNA溶液均勻喷涂于硝酸纤维膜上，37°C下干燥8 小时，形成直线式检测线T线6，用喷样仪将浓度为2 mg/L的链霉亲合素溶液沿与检测线T 线6平行的方向均勻喷涂于硝酸纤维膜上，37°C下干燥8小时，形成直线式质控线C线7， 即得到特定包被的硝酸纤维膜4;其中b-DNA溶液包被用量为3.0 yL/cm，该b-DNA溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，链霉亲合素溶液包被用量为3. 0μ L/cm，该链霉亲合素溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，其中b-DNA的碱基与特异性DNA探针之间的碱基可形成T-Hg2+-T错配，该b-DNA的结构为5，-GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，；
5、汞离子检测试纸条制备
在条形底板1上依次搭接样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4、吸水垫5，在条形底板的两端分别粘上不干胶纸，其中带有箭头的不干胶纸贴在样品垫2和玻璃纤维结合垫3的连接处上，箭头标明了浸入的最大深度，最后将试纸裁剪成10 mm宽的细条，即得汞离子检测试纸条。
实施例5
本发明一种汞离子检测试纸条，如图1所示，包括条形底板1和在条形底板上依次搭接的样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4和吸水垫5 组成，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该硝酸纤维膜上有用 b-DNA包被直线式检测线T线6和用链霉亲合素包被直线式质控线C线7，其中b-DNA的碱基与特异性DNA探针之间的碱基可形成T-Hg2+-T错配，其制备方法具体包括如下步骤
1、溶液配制同实施例2
2、样品垫2的制备
将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡0. 5小时润湿后，在20°C下干燥4小时即得到样品垫；
103、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3的制备
a.将玻璃纤维纸用上述Tris-HCl缓冲液浸泡0.5小时润湿后，在20°C下干燥4小时，即得封闭处理过的玻璃纤维纸；
b.将20 μ g 序列为 HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin 的 DNA 用 1 mL 的上述Tris-HCl缓冲液溶解，振荡混勻后，加入到1 mL上述配制的胶体金溶液中，振荡混勻，室温下温育5小时后，离心弃去上清液，加入50 μ L的上述磷酸盐缓冲液溶解后，即得特异性DNA探针溶液，该特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，该特异性 DNA 探针的结构为 AuNPs-HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin ；
c.用喷样仪取上述所得特异性DNA探针溶液，在每平方厘米的、封闭处理过的玻璃纤维纸上均勻喷涂2. 0μ L，20°C下干燥2小时后，即得涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫 3 ；
4、特定包被的硝酸纤维膜4的制备
用喷样仪将浓度为30 μ mol/L的b-DNA溶液均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25°C下干燥2 小时，形成直线式检测线T线6，用喷样仪将浓度为1 mg/L的链霉亲合素溶液沿与检测线T 线6平行的方向均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25°C下干燥2小时，形成直线式质控线C线7，即得到特定包被的硝酸纤维膜4;其中b-DNA溶液包被用量为1.0 μ L/cm，该b_DNA溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，链霉亲合素溶液包被用量为1. 0μ L/cm，该链霉亲合素溶液的溶剂为上述步骤1配制的磷酸盐缓冲液，其中b-DNA的碱基与特异性DNA探针之间的碱基可形成T-Hg2+-T错配，该b-DNA的结构为5’ -GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3’ ；
5、汞离子检测试纸条制备
在条形底板1上依次搭接样品垫2、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫3、特定包被的硝酸纤维膜4、吸水垫5，在条形底板的两端分别粘上不干胶纸，其中带有箭头的不干胶纸贴在样品垫2和玻璃纤维结合垫3的连接处上，箭头标明了浸入的最大深度，最后将试纸裁剪成3mm宽的细条，即得汞离子检测试纸条。实施例6
按照实施例2制备汞离子检测试纸条，分别检测混合溶液(含in32+、Cd2+、Mg2+、Ca2+、i^2+、 Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+，各离子浓度均为 1 mg/L)、0· 01 mg/L Hg2+溶液，结果分别如图 3 所示，a为混合溶液检测结果示意图，b为0.01 mg/L Hg2+溶液检测结果示意图，说明本发明汞离子检测试纸条具有高灵敏度和高选择性。实施例7
试纸条在制备汞离子测试卡中的应用，测试卡包括塑料卡和汞离子检测试纸条，此塑料卡是一个用塑料制备的卡，由上下两片可以嵌合在一起的卡壳组成，上片除了有一个滴加样品液的孔之外，还标有C、T，T表示检测线的位置，C表示质控线的位置。使用该汞离子测试卡只需将其插入测试样品液中，该过程操作简单，检测时间短，仅需数分钟，并且检测成本低，每个试纸条制作成本约3元，样品也无需复杂预处理。上述是对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不仅限于上述实施例。
权利要求
1.一种汞离子检测试纸条，其特征在于所述的试纸条由条形底板和在条形底板上依次搭接的样品垫、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫、特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫组成，所述的特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，所述的硝酸纤维膜上有用b-DNA包被直线式检测线T线和用链霉亲合素包被直线式质控线C线，所述的 b-DNA的碱基与所述的特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配。
2.根据权利要求1所述的一种汞离子检测试纸条，其特征在于所述的特异性DNA探针的结构为 AuNPs-HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin,所述的 b_DNA 的结构为 5， -GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，。
3.根据权利要求2所述的一种汞离子检测试纸条，其特征在于所述的样品垫为经 0. 01 0. 05mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡处理的玻璃纤维纸，其中Tris-HCl缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，PH值为5. 0 8. 0。
4.根据权利要求2所述的一种汞离子检测试纸条，其特征在于所述的特异性DNA探针溶液在所述的玻璃纤维结合垫上的喷涂量为2. 0 10. 0 μ L/cm2，所述的特异性DNA探针溶液为 20 70 μ g 序列为 HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3，-biotin 的 DNA 与 0. 5 2 μ mol的胶体金结合后，溶于50 200 μ L的浓度为0. 01 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液中所得。
5.根据权利要求2所述的一种汞离子检测试纸条，其特征在于所述的b-DNA包被用量为 0. 0003 0. 003 ymol/mm。
6.根据权利要求2所述的一种汞离子检测试纸条，其特征在于所述的链霉亲合素包被用量为0. 01 0. 06 μ g/mm。
7.一种汞离子检测试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)样品垫的制备将玻璃纤维纸用0.01 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡润湿后，在20°C 37°C下干燥4 12小时即得到样品垫，其中Tris-HCl缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，pH 值为5. 0 8. 0 ；(2)涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫的制备将玻璃纤维纸用0. 01 0. 05 mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡润湿后，在20°C 37°C下干燥4 12小时后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均勻喷涂2. 0 10. 0 μ L的特异性DNA 探针溶液，在20°C 37°C下干燥2 5小时后，即得到涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫，所述的特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，所述的特异性DNA 探针的结构为 AuNPs-HS-5’ -TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3‘ -biotin，其中 Tris-HCl 缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，pH值为5. 0 8. 0 ；(3)特定包被的硝酸纤维膜的制备用喷样仪将浓度为30 100 μ mol/L的b_DNA溶液均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25°C 37°C下干燥2 8小时，形成直线式检测线T线，用喷样仪将浓度为1 ang/L的链霉亲合素溶液沿与检测线T线平行的方向均勻喷涂于硝酸纤维膜上，25°C 37°C下干燥2 8小时，形成直线式质控线C线，即得到特定包被的硝酸纤维膜，其中所述的b-DNA的碱基与所述的特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配，所述的b-DNA的结构为 5， -GTTTCTTCTTTGGTTTGATT-3，。
8.(4)将步骤(1)得到的样品垫，步骤(2)得到的涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫，步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成3 10 mm宽的细条，即得汞离子检测试纸条。
9.根据权利要求7所述的一种汞离子检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的特异性DNA探针溶液的制备方法如下将20 70 μ g序列为HS-5，-TTTCATTCCTTTGTTGATTC-3 ，-biotin的DNA用1 5mL的浓度为0. 01 0. 05 mol/L Tris-HCl缓冲液溶解，振荡混勻后，加入到ImL浓度为0. 5 2mmol/L的胶体金溶液中，振荡混勻，室温下温育5 M小时后，离心弃去上清液，加入50 200μ L的浓度为0.01 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液溶解后，即得特异性DNA探针溶液，其中所述的Tris-HCl缓冲液含蔗糖的质量百分比为1 10%，所述的Tris-HCl缓冲液pH值为5. 0 8. 0，所述的磷酸盐缓冲液中含NaCl质量百分比为0. 5 1%，含十二烷基硫酸钠质量百分比为0. 01 0. 05%，所述的磷酸盐缓冲液pH值为 5. 0 8. 0。
10.根据权利要求7所述的一种汞离子检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的 b-DNA溶液包被用量为1. 0 3. 0 μ L/cm,所述的b_DNA溶液的溶剂为浓度0. 01 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液中含NaCl质量百分比为0. 5 1%，含十二烷基硫酸钠质量百分比为0. 01 0. 05 %，所述的磷酸盐缓冲液pH值为5. 0 8. 0。
11.根据权利要求7所述的一种汞离子检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的链霉亲合素溶液包被用量为1. 0 3. 0 μ L/cm，所述的链霉亲合素溶液的溶剂为浓度0. 01 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液中含NaCl质量百分比为0. 5 1%，含十二烷基硫酸钠质量百分比为0. 01 0. 05 %，所述的磷酸盐缓冲液PH值为5. 0 8. 0。
全文摘要
本发明一种汞离子检测试纸条及其制备方法，特点是试纸条由条形底板和在条形底板上依次搭接的样品垫、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫、特定包被的硝酸纤维膜和吸水垫组成，特异性DNA探针一端结合有胶体金，其另一端结合有生物素，硝酸纤维膜上有用b-DNA包被直线式检测线T线和用链霉亲合素包被直线式质控线C线，该b-DNA的碱基与特异性DNA探针的碱基之间可形成T-Hg2+-T错配，制备方法包括将依次制备的样品垫、涂覆特异性DNA探针的玻璃纤维结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫搭接成型，并粘贴于底板上，裁成3～10mm宽的细条，即得汞离子检测试纸条，优点是该试纸条可以高灵敏度、高选择性地检测样品中的汞离子。
文档编号G01N33/558GK102207502SQ201110073819
公开日2011年10月5日 申请日期2011年3月25日 优先权日2011年3月25日
发明者李敏, 杨飞, 段静, 王邃, 郝婷婷, 郭智勇 申请人:宁波大学